JP2007135416A - 新規乳酸菌及びこれを用いたγ−アミノ酪酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】グルタミン酸及び/又はその塩類から、γ−アミノ酪酸を効率よく生成し、かつγ−アミノ酪酸を高濃度で含有する組成物を製造する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】
グルタミン酸及び/又はその塩類を添加した培地に、新規乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスUAS−4株又はラクトバチルス・ブレビスUAS−6を接種し培養し、グルタミン酸及び/又はその塩類を複数回添加すること及び/又は培地のpHを4.0〜6.0に調整することで、γ−アミノ酪酸を効率よく生産する。さらに、得られた発酵液をろ過、カラム精製することで、γ−アミノ酪酸を高含有する組成物を得る。
【選択図】なし
【解決手段】
グルタミン酸及び/又はその塩類を添加した培地に、新規乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスUAS−4株又はラクトバチルス・ブレビスUAS−6を接種し培養し、グルタミン酸及び/又はその塩類を複数回添加すること及び/又は培地のpHを4.0〜6.0に調整することで、γ−アミノ酪酸を効率よく生産する。さらに、得られた発酵液をろ過、カラム精製することで、γ−アミノ酪酸を高含有する組成物を得る。
【選択図】なし
Description
本発明は、γ−アミノ酪酸産生能をもつ新規乳酸菌株、その乳酸菌を用いたγ−アミノ酪酸の製造方法及びγ−アミノ酪酸高含有組成物の製造方法に関する。
γ−アミノ酪酸(γ−amino butyric acid、以下、GABAと略す。)は生物界に微量ながら広く存在する非タンパク質構成アミノ酸であり、ヒトにおいては脳内で神経伝達物質として働くことが知られている。食品素材としてのGABAは血圧降下作用、精神安定作用、脳機能改善作用、更年期障害症状緩和作用、中性脂肪増加抑制作用等の健康維持意識の高い現代人にとって有効な生理作用を有している。その上、GABAはヒトが多量に摂取しても副作用が無いので、安全性の面でも有利であり、食事療法が効果的な生活習慣病、特に高血圧症を予防する成分として食品に付加させる開発が多くなされている。
そのようなものとして、米胚芽、米糠、小麦胚芽などの中に元来含まれる酵素の作用を利用してGABA富化穀物を製造する技術(例えば、特許文献1及び2参照)、トマト、カボチャ等の野菜などの中に含まれる酵素の作用を利用してGABA富化組成物を製造する技術(例えば、特許文献3〜5参照)、茶葉を嫌気処理することによってGABA含量の高い茶葉を製造する技術(例えば、特許文献6参照)などが報告されている。
また、一部の微生物がグルタミン酸からGABAを生産する能力に優れていることが知られており、GABAを乳酸菌で製造する技術(例えば、特許文献7、8、10、11及び12)や麹菌で製造する技術(例えば、特許文献9参照)、などが報告されている。これらの中でも乳酸菌はGABAの生産効率が良く、例えばラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(特許文献11)、ラクトバチルス・ヒルガルディー(L.hilgardii)(特許文献8)、ラクトバチルス・プランタラム(L.plantarum)(特許文献7、10)、ラクトバチルス・ラクチス(L.lactis)(特許文献12)などが開示されている。
一方で、本発明者らは、アスパラガスは種々の野菜、果物の中においてもGABAが著しく多く含まれており、グルタミン酸からGABAに変換する酵素も多く持っていることを見出し既に特許出願した(特願2004−301557号、特願2005−164107号)。
特許第2590423号公報
特開2004−159617号公報
特公平7−12296号公報
特公平7−14333号公報
特開2001−252091号公報
特許第3038373号公報
特開2001−352940号公報
特開2003−70462号公報
特開平11−103825号公報
特許2704493号公報
特開2004−215529号公報
特開2001−120179号公報
しかしながら、これまで開示されていた微生物はGABAの生産効率は低く、例えばラクトバチルス・プランタラムで最終的に培養液の2質量%以下(特許文献7、10)、ラクトバチルス・ブレビスでは1.1質量%程度(特許文献11)、ラクトバチルス・ラクティスでは1質量%以下であった(特許文献12)。これまで開示されている乳酸菌で最も効率よくGABAを生産できると考えられるラクトバチルス・ヒルガルディーでさえも48時間後では培養液の4.8質量%、72時間後で5.1質量%であった(特許文献8)。従来知られていた乳酸菌では純度を高くするには長時間が必要で、培地からGABAを含有する粉末や濃縮物を製造した場合、最高でも20質量%程度にしかならなかった。このようにGABA含量が少ない組成物は製造効率が悪いのみならず、飲食品に配合する際に味質や臭いの変化が問題になっていた。
本発明者らは上記した課題について鋭意検討した結果、野菜より分離した乳酸菌がグルタミン酸からGABAを効率よく生産できることを見出し、更には生産されたGABAを簡便に高純度化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、グルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩を含む培地で増殖するに従い、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積する能力を有する乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスUAS−4(Lactobacillus brevis UAS−4)(FERM AP−20710)を要旨とするものである。また、別の本発明は、グルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩を含む培地で増殖するに従い、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積する能力を有するラクトバチルス・ブレビスUAS−6(Lactobacillus brevis UAS−6)(FERM AP−20711)を要旨とするものである。
また、別の本発明は、グルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩を含む培地で前記のラクトバチルス・ブレビスUAS−4又は前記の請求項2記載のラクトバチルス・ブレビスUAS−6を培養し、培養液中に蓄積したγ−アミノ酪酸を回収することを特徴とするγ−アミノ酪酸の製造方法を要旨とするものである。また、別の本発明は、前記のラクトバチルス・ブレビスUAS−4又は前記のラクトバチルス・ブレビスUAS−6を増殖させた培地に、培地に対して10〜20質量%のグルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩を一度に、又は分割して添加し、pHを4.0〜6.0に保持しながら20〜35℃で培養することを特徴とするγ−アミノ酪酸の製造方法を要旨とするものである。
また、別の本発明は、グルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩を含む培地で前記のラクトバチルス・ブレビスUAS−4又は前記のラクトバチルス・ブレビスUAS−6を培養し、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積させた後、培養液から菌体を除去し、濃縮後乾燥してγ−アミノ酪酸を40質量%以上にすることを特徴とするγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法を要旨とするものである。さらに、別の本発明は、グルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩を含む培地で前記のラクトバチルス・ブレビスUAS−4又は前記のラクトバチルス・ブレビスUAS−6を培養し、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積させた後、培養液から菌体を除去し、イオン交換樹脂を用いて精製を行いγ−アミノ酪酸を固形分にして90質量%以上にすることを特徴とするγ−アミノ酪酸高含有組成物の製造方法を要旨とするものである。
さらに、別の本発明は、前記したγ−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸含有組成物又はγ−アミノ酪酸高含有組成物のいずれかを含有することを特徴とする飲食品を要旨とするものである。
本発明によれば、高濃度のGABA含有組成物を安全な微生物を用いて短時間に容易に得ることができる。また、本発明のGABA含有組成物は高濃度であるために飲食品に配合する場合も少量で効果が期待でき、飲食品の味に悪影響を及ぼすことがない。また、GABAの作用により、血圧降下、リラックス、ストレス緩和、更年期障害症状改善、不眠改善、利尿、腎機能改善、肝機能改善等の効果が期待できる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のラクトバチルス・ブレビスUAS−4及びラクトバチルス・ブレビスUAS−6は、以下の表1の様な性質を有する。
本発明のラクトバチルス・ブレビスUAS−4及びラクトバチルス・ブレビスUAS−6は、以下の表1の様な性質を有する。
UAS−6株については、L−アラビノースの資化性が陰性であり、一般的なL.brevisがL−アラビノースを良好に資化することから鑑みると、この株に特徴的な性質である。また、UAS−4株及びUAS−6株のいずれも、後述するようにグルタミン酸又はグルタミン酸塩からγ−アミノ酪酸の産生能が従来公知のラクトバチルス・ブレビスと比較して顕著に高いことから、新規な乳酸菌であると判断し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託手続を行い、UAS−4株は、受領番号FERM AP−20710として、またUAS−6株は、受領番号FERM AP−20711として、平成17年11月11日に受領された。
次に、本発明のγ−アミノ酪酸の製造方法について説明する。
本発明のγ−アミノ酪酸の製造方法は、上記したUAS−4株又はUAS−6株を用いるところに特徴を有する。UAS−4株、UAS−6株を増殖させる培地には本発明の効果を損なわない限り、従来公知のあらゆる培地を使用することができる。かかる培地としては、乳酸菌の培養に一般的なGYP培地(D−グルコース1質量%、ペプトン0.5質量%、酵母エキス1質量%、酢酸ナトリウム3水和物0.2質量%、ツイン80 0.05質量%、硫酸マグネシウム7水和物0.02質量%、硫酸マンガン4水和物10ppm、硫酸鉄7水和物10ppm、塩化ナトリウム10ppm)、FYP培地(GYP培地の糖がD−フルクトースになったもの)の他、市販のGAM培地(日水製薬社製)、MRS培地(Difco社製)等を使用することもできるし、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、魚肉エキス、大豆分解物、ペプトン、ポリペプトン、ポテト浸出液等を単独で又は2種以上を水に溶解させた培地を使用することもできる。また、UAS−4株及びUAS−6株は野菜から分離された株であり、野菜ジュース等を培地として用いたり、添加することでも良好に増殖させることができる。
本発明で用いられる培地中の糖としては、上記した市販培地に含まれるD−グルコース、D−フルクトースなどのほかに、UAS−4株又はUAS−6株が資化性を有するものであればいかなる物も使用できる。かかる糖としては例えば、D−ガラクトース、L−アラビノース(UAS−4株のみ)、D−キシロース、マルトース、スクロース、D−リボース、メリビオース等であり、好ましくはD−グルコース、D−フルクトース、D−ガラクトース、D−キシロース、マルトースであり、さらに好ましくはD−グルコース、D−フルクトース、マルトースである。
本発明の製造方法では、上記した培地にグルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩を含ませることが必要である。ここで用いられるグルタミン酸塩としてはいかなるものでもよいが、食品添加物となっており、水への溶解性に優れるグルタミン酸ナトリウムが好ましい。グルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩の含有量は培地中に通常0.1質量%〜40質量%であればよく、0.2質量%〜25質量%が好ましく、3質量%〜20質量%がさらに好ましい。0.1質量%より少なければ得られるGABAの量が少なくなり、40質量%より多ければグルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩が残存してしまうか、全量GABAに変換されたとしても長時間かかるので好ましくない。
培地中に含ませるグルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩は、乳酸菌を植菌して培養する培養開始時に上記した量が含まれていてもよく、また培養開始後に1回で全量添加する、あるいは培養の途中で複数回に分けて添加してもよい。作業性の面では1回で全量添加することが好ましいが、急激なpHの上昇を引き起こすため、これを防ぐためには少量ずつ添加することが好ましく、その場合は2回〜10回、さらに好ましくは2回〜5回に分けて添加するのがよい。
本発明の製造方法においては、上記した培地にUAS−4株又はUAS−6株を接種して培養を開始する。この際、少量の菌体を接種することで増殖させることができるが、短期間で菌体濃度を上昇させる為には、前培養した菌液を接種することが好ましい。かかる前培養した菌液を接種する量としては、本培養の培地量の10000分の1〜2分の1であり、1000分の1〜10分の1が好ましく、200分の1〜30分の1がさらに好ましい。この範囲より接種量が少なければ、菌体濃度の増加に時間がかかる問題があり、この範囲より多ければもはや前培養の時点で大きなスケールになっており、本培養を行う必要性がないということである。
本発明における培養条件としては、嫌気条件下でも好気条件下でもよいが、増殖の際には若干好気条件にした方がよい。そのためには、例えばバブリングや速い攪拌等を行う必要は無く、緩やかに攪拌する程度でよい。
培養温度としては、本発明の効果を損なわない限り限定されないが、通常5℃〜45℃であり、好ましくは15℃〜40℃であり、さらに好ましくは20℃〜35℃である。培養温度がこの温度範囲より高くても低くても著しく増殖速度が劣る傾向にある。
また、培養液のpHは通常4.0〜6.0に調整することが好ましく、4.5〜5.5に調整することがより好ましい。pHがこの範囲を外れると、乳酸菌が有するグルタミン酸脱炭酸酵素の活性が低下し、GABAの産生速度が低下する傾向がある。pH調整に用いる薬品はいかなるものも使用でき、例えば塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、酢酸、酪酸、乳酸、蟻酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、クエン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア水等が挙げられる。本発明ではGABAの産生に応じてpHは上昇する傾向になり調整は主に酸を添加して行うため、これらの中で好ましくは、塩酸、リン酸、酢酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸であり、さらに好ましくは塩酸、乳酸、酢酸である。
上記のようにしてUAS−4株又はUAS−6株の培養を行えば、通常5時間〜5日間、好ましくは7時間〜24時間で菌体濃度が増加してくる。菌体濃度が増加したことを知る方法としては、菌液の濁度を測定することが好ましい。菌液の濁度は、500nm〜720nm、好ましくは600nm〜660nmの吸光度を測定して評価する方法であり、菌体濃度が増加した状態とは、菌体が入っていない培地のこの波長での吸光度を0とした場合に、菌液の濁度が1.0以上となっている状態である。
本発明の製造方法においては、グルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩を添加して2日以内に、好ましくは24時間以内に、さらに好ましくは10時間以内に、グルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩の90%以上がGABAに変換されることになる。GABAへの変換率は添加したグルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩の量に依存するものであり、グルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩の添加量が少なければ短時間で全量をGABAに変換することができる。
本発明の製造方法によって培養液中に蓄積したGABAは、その培養液そのままでも種々の用途に用いることができるが、菌体を除去して培養上清を用いるか培養上清を濃縮、乾燥してGABA含有組成物として用いることが好ましい。また、培養上清に晶析、イオン交換等の処理を施してGABAの純度を向上させてGABA高含有組成物として用いることもできる。
培養液から菌体を除去するには、従来公知の方法で行えばよく、例えばフィルタープレス、ブフナー漏斗、遠心ろ過器、遠心分離機、デカンタ等を使用することができる。
GABAが蓄積した培養液を濃縮するには、従来公知の濃縮装置を使用することができ、例えばエバポレーター、濃縮缶の他、エバポール(大河原製作所)、ウォールウェッター(関西化学機械製作)等が挙げられる。
GABAが蓄積した培養液を乾燥するには、従来公知の乾燥装置を使用することができ、例えば真空凍結乾燥機、真空棚式乾燥機、温風乾燥機、真空ニーダー、リボコーン乾燥機、ドラムドライヤー、振動流動乾燥機、スプレードライヤー等が挙げられる。乾燥させる液は培養液そのままでも良いし、濃縮した物でも良いが、固形分濃度5〜70質量%、好ましくは5〜50質量%、さらに好ましくは10〜40質量%まで濃縮したものを使用することが好ましい。
上記のように乾燥させたものは粉砕して粉末状にすることもできる。粉砕には従来公知の粉砕機が使用でき、例えば乳鉢、ブレンダーミキサー、カッターミル、ハンマーミル、ジェットミル、フェザーミル等が挙げられる。
乾燥したもののGABA濃度は、産生したGABAの量、添加したグルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩の量にもよるが、通常40質量%以上となり、多いときでは45質量%以上となる。
GABA含有組成物中のGABAの濃度をさらに向上させるために、さらなる精製を行ってもよく、かかる精製方法としては、晶析、限外ろ過、イオン交換、活性炭処理、クロマト分離等が挙げられる。これらの中で、限外ろ過、イオン交換樹脂、活性炭処理が好ましい。
晶析による精製は、従来公知の方法を用いることができ、例えば濃縮した後に冷却して結晶を析出させる方法や、有機溶媒を加えて結晶を析出させる方法などが挙げられる。中でもGABAは水への溶解度が非常に高いことから、固形分濃度50〜90質量%、好ましくは60〜90質量%、さらに好ましくは65〜85質量%まで濃縮した水溶液に、有機溶媒を水溶液に対して1000分の1等量〜2等量、好ましくは100分の1等量〜1等量、さらに好ましくは10分の1等量〜2分の1等量導入して、結晶を析出させることができる。かかる有機溶媒のうち好ましい例としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、n−プロパノール、n−ブタノール、イソブタノール、tert−ブタノール、アセトン、ヘキサン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド等が挙げられ、さらに好ましい例としてはエタノールである。析出した結晶は従来公知の方法で分離すれば良く、例えば遠心ろ過機、ブフナー漏斗、フィルタープレス等を使用することができる。
限外ろ過による精製は、高分子量の成分を除去することができるものであり、目的とするGABA純度になるように分画分子量を選定することができる。限外ろ過膜の分画分子量は好ましくは1000〜200000であり、さらに好ましくは3000〜10000である。この範囲より低ければ精製に時間がかかる問題があり、この範囲より高ければGABA純度が向上しない問題がある。
イオン交換樹脂により精製は、従来公知の方法を用いることができるが、好ましくはイオン交換樹脂塔を用いた精製である。イオン交換樹脂としては陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂いずれも使用することができる。例えば陽イオン交換樹脂を用いる時には酸でH型に変換したところに培養液を通液してGABAを樹脂に吸着させ、アルカリを通液してGABAを溶離させる方法が好適に使われる。また陰イオン交換樹脂を用いる時にはアルカリでOH型に変換したところに培養液を通液してGABAを樹脂に吸着させ、酸を通液してGABAを溶離させる方法が好適に使われる。イオン交換樹脂としては陽イオン交換樹脂が好ましく、特に強酸性陽イオン交換樹脂が好ましい。
イオン交換樹脂の好ましい例としては、三菱化学「ダイヤイオン」シリーズのSK1B、SK102、SK104、SK106、SK110、SK112、SK116、PK208、PK212、PK216、PK220、PK228、室町ケミカル「ダウエックス」シリーズの50W×2、50W×4、50W×8、50W×12、マラソンC、マラソンHSC、モスフィアー650C、HCR−W2、HGR−W2、88、MAC−3、HCR−S、ムロマックC102Na、オルガノ「アンバーライト」シリーズのIR120B、IR12、200CTなどが挙げられ、これらの中でも特にダイヤイオンSK1B、SK104、PK208、ダウエックス50W×8、ムロマックC102Na、アンバーライトIR120Bが好ましい。
本発明において好適に使用できる強酸性陽イオン交換樹脂の使用量は、添加したグルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩に対して2倍量〜20倍量、好ましくは3倍量〜15倍量、さらに好ましくは5倍量〜10倍量である。この範囲より少なければ吸着されずにGABAが流出する問題があり、この範囲より多ければ再生、溶出に多量の溶液が必要となる問題がある。
陽イオン交換樹脂を使用する場合は例えば以下の様な方法で精製することができる。まず、従来公知の方法でH型に再生したイオン交換樹脂に、GABAを産生させた培養液をSV=0.01〜5、好ましくはSV=0.1〜4、さらに好ましくはSV=1〜3の速度で通液してGABAを吸着させる。その後、カラム容量の0.2〜20倍量、好ましくは0.5〜10倍量、さらに好ましくは1〜5倍量の脱イオン水を上記と同様の速度で通液して洗浄する。その後、0.01規定〜2規定、好ましくは0.01規定〜1規定、さらに好ましくは0.1規定〜0.5規定のアルカリ水溶液を上記と同様の速度で通液してGABAを溶出させ、回収する。ここでGABAの溶出に使用するアルカリとしては特に限定されないが、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、アンモニア水、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、酢酸ナトリウム水溶液等が使用でき、これらの中でも水酸化ナトリウム水溶液、アンモニア水が好ましく、アンモニア水がより好ましい。
陰イオン交換樹脂を使用する場合は、例えば以下の様な方法で精製することができる。まず、従来公知の方法でOH型に再生したイオン交換樹脂に、GABAを産生させた培養液をSV=0.01〜5、好ましくはSV=0.1〜4、さらに好ましくはSV=1〜3の速度で通液してGABAを吸着させる。その後、カラム容量の0.2〜20倍量、好ましくは0.5〜10倍量、さらに好ましくは1〜5倍量の脱イオン水を上記と同様の速度で通液して洗浄する。その後、0.01規定〜2規定、好ましくは0.01規定〜1規定、さらに好ましくは0.1規定〜0.5規定の酸性水溶液を上記と同様の速度で通液してGABAを溶出させ、回収する。ここでGABAの溶出に使用する酸としては特に限定されないが、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、酢酸、シュウ酸等が使用でき、これらの中でも塩酸、硫酸、酢酸が好ましく、塩酸、酢酸がより好ましい。
活性炭処理による精製は、従来公知の方法を使用でき、活性炭をGABAを含む培養液の中に投入して攪拌するバッチ法、活性炭をカラムに充填してその中に培養液を通液するカラム法のいずれの方法でもよい。
例えばバッチ法で活性炭処理を行う場合は、活性炭は表面積が大きいものの方が効率が良く、例えば二村化学工業(株)製の太閤SA1000、太閤KS、太閤A、武田薬品(株)製のカルボラフィン、強力白鷺、精製白鷺、特製白鷺、白鷺A、白鷺M、三菱化学(株)製のダイヤソーブF、三井製薬工業(株)製の三井PM−KI、三井PM−KO、三井PM−SX、三井PM−FZ、三井PM−SAY、クラレケミカル(株)製のクラレコールPK等が挙げられ、これらの中で太閤SA1000、カルボラフィン、精製白鷺、三井PM−SX、三井PM−FZが好ましく、太閤SA1000、カルボラフィンがより好ましい。活性炭処理後には活性炭を分離するが、この分離にはフィルタープレス、ブフナー漏斗を用いたろ過等従来公知のろ過技術を用いることができる。
例えばカラム法で活性炭処理を行う場合は、通液時に圧力がかかる為ある程度粒度が大きい活性炭を使用することが好ましく、例えば、二村化学工業(株)製の太閤FC、太閤FCS、武田薬品(株)製の粒状白鷺LHc、粒状白鷺KL、三菱化学(株)製のダイアホープS60、ダイアホープS70、ダイアソーブW、三井製薬工業(株)製の三井MM−CBS、三井BM−WA、クラレケミカル(株)製のクラレコールGLC等が挙げられ、これらの中で太閤FCS、粒状白鷺KL、三井BM−WA、クラレコールGLCが好ましく、粒状白鷺KL、三井BM−WAがより好ましい。
活性炭の使用量は本発明の効果を損なわない限り限定されないが、バッチ法で活性炭処理を行う場合には、培養液の固形分に対して、1質量%〜50質量%であり、5質量%〜30質量%が好ましく、10質量%〜25質量%がさらに好ましい。この範囲より活性炭量が少なければ十分に脱色効果が得られない可能性があり、この範囲より活性炭量が多くてももはや脱色効果が向上するものではなく、攪拌が難しくなり、ろ過時にロスが出る可能性がある。
カラム法で活性炭処理を行う場合には、培養液の固形分に対して20質量%〜500質量%であり、50質量%〜400質量%が好ましく、100質量%〜300質量%がさらに好ましい。この範囲より活性炭量が少なければ十分に脱色効果が得られない可能性があり、この範囲より活性炭量が多くてももはや脱色効果が向上するものではなく、水押し量が多くなったりロスが出る可能性がある。
活性炭処理の時間は本発明の効果を損なわない限り限定されないが、バッチ法では攪拌しながら10分〜24時間であり、20分〜5時間が好ましく、30分〜2時間がさらに好ましい。活性炭処理の時間がこの範囲より短いと十分に脱色されない可能性が有り、この範囲より長くてももはや脱色効率が向上するものではない。カラム法での培養液の流速はSV=0.1〜10であり、SV=0.3〜5が好ましく、SV=1〜3がさらに好ましい。培養液の流速がこの範囲より大きければ十分に脱色されない可能性が有り、この範囲より小さくとももはや脱色効率が向上するものではなく、いたずらに処理時間がかかるだけである。
次に、本発明の飲食品について説明する。
本発明の飲食品は、上記した本発明により得られたGABA及び/又はGABA含有組成物又はGABA高含有組成物それ自体あるいは既存の飲料又は食品にこれらを含ませることにより得ることができる。また、味質の改善等のために、本発明の効果を損なわない範囲で糖類、糖アルコール類、塩類、油脂類、アミノ酸類、有機酸類、果汁、野菜汁、香料、アルコール類、グリセリン等を添加することができる。
本発明の飲食品のベースとなる飲料又は食品としては、特に限定されず例えば飲料は清涼飲料水、アルコール類、果汁飲料、野菜汁飲料、乳飲料、炭酸飲料、コーヒー飲料、アルコール類等であることが好ましく、また食品はカプセル、グミ、キャンデー、錠剤、顆粒、ドリンク等の形状をしたサプリメントであってもよいし、通常の食事として摂る食品であってもよい。
本発明の飲食品に含ませるGABA含有組成物又はGABA高含有組成物の量としては、特に限定されないが、1日当たりに摂取する量がGABAとして10〜500mgになるように配合することが好ましい。この範囲より少ない場合は効果が望めない可能性があり、この範囲より多い場合はもはや効果の増大は見込めない可能性がある。本発明の飲食品に含ませるGABA含有組成物の形態は特に限定されず、飲料、グミ、キャンデーなどにおいては液体状の物を、錠剤、顆粒、カプセルなどにおいては粉末状の物を使用するなどすればよい。
本発明において、GABA、アミノ酸の含有量は、以下の方法により求められた値である。すなわち、高速液体クロマトグラフィー法(HPLC法)により以下の条件で測定し、蛍光検出器を用いて検出した。
HPLC:島津製作所(株)製LC−9A
カラム:Shim−pack ISC−07/S1504
移動相:0.2規定クエン酸ナトリウム緩衝液(pH2.2)
流速:0.3ml/分
温度:55℃
反応液:オルト−フタルアルデヒド
検出波長:励起波長348nm、蛍光波長450nm
HPLC:島津製作所(株)製LC−9A
カラム:Shim−pack ISC−07/S1504
移動相:0.2規定クエン酸ナトリウム緩衝液(pH2.2)
流速:0.3ml/分
温度:55℃
反応液:オルト−フタルアルデヒド
検出波長:励起波長348nm、蛍光波長450nm
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本実施例中のGABA、アミノ酸の含有量は前記した方法で測定した。
実施例1
1.0重量%のグルタミン酸ナトリウムを含有するGYP培地5Lに、前培養したラクトバチルス ブレビス UAS−4の菌体懸濁液100mLを添加して30℃、20rpm、通気無しの条件で培養を開始した。培養開始から1日後に、40質量%グルタミン酸ナトリウム水溶液を2.5L添加し、同時に2倍濃度のGYP培地2.5Lを追加して総量を10Lとし、その後は6N塩酸を適時添加してpHを4.8±0.5に維持しながら同条件で培養を続けた。培養液量を10Lとしてから40時間経過した後の培養液を遠心し、上清をHPLC分析してグルタミン酸ナトリウム、GABAの量を測定した結果、4.40質量%のGABA濃度であり、96%の変換率でGABAが生成していた。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところGABAを55%含有する淡褐色の粉末が960g得られた。
1.0重量%のグルタミン酸ナトリウムを含有するGYP培地5Lに、前培養したラクトバチルス ブレビス UAS−4の菌体懸濁液100mLを添加して30℃、20rpm、通気無しの条件で培養を開始した。培養開始から1日後に、40質量%グルタミン酸ナトリウム水溶液を2.5L添加し、同時に2倍濃度のGYP培地2.5Lを追加して総量を10Lとし、その後は6N塩酸を適時添加してpHを4.8±0.5に維持しながら同条件で培養を続けた。培養液量を10Lとしてから40時間経過した後の培養液を遠心し、上清をHPLC分析してグルタミン酸ナトリウム、GABAの量を測定した結果、4.40質量%のGABA濃度であり、96%の変換率でGABAが生成していた。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところGABAを55%含有する淡褐色の粉末が960g得られた。
実施例2
実施例1において、ラクトバチルス ブレビス UAS−4に代えてラクトバチルス ブレビス UAS−6を使用した以外は同様にして、GABAを製造した。40時間経過した後の培養液上清の分析を行った結果、4.40質量%のGABA濃度であり、96%の変換率でGABAが生成していた。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところGABAを54%含有する淡褐色の粉末が978g得られた。
実施例1において、ラクトバチルス ブレビス UAS−4に代えてラクトバチルス ブレビス UAS−6を使用した以外は同様にして、GABAを製造した。40時間経過した後の培養液上清の分析を行った結果、4.40質量%のGABA濃度であり、96%の変換率でGABAが生成していた。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところGABAを54%含有する淡褐色の粉末が978g得られた。
実施例3
1.0重量%のグルタミン酸ナトリウムを含有するGYP培地5Lに、前培養したラクトバチルス ブレビス UAS−4の菌体懸濁液100mLを添加して30℃、20rpm、通気無しの条件で培養を開始した。培養開始から1日後に、39質量%のグルタミン酸ナトリウムを溶解した2倍濃度のGYP培地5Lを追加して総量を10Lとし、その後は6N塩酸を適時添加してpHを4.8±0.5に維持しながら同条件で培養を続けた。培養液量を10Lとしてから48時間経過した後の培養液を遠心し、上清をHPLC分析してグルタミン酸ナトリウム、GABAの量を測定した結果、7.75質量%のGABA濃度であり、91%の変換率でGABAが生成していた。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところGABAを62%含有する淡褐色の粉末が1615g得られた。
1.0重量%のグルタミン酸ナトリウムを含有するGYP培地5Lに、前培養したラクトバチルス ブレビス UAS−4の菌体懸濁液100mLを添加して30℃、20rpm、通気無しの条件で培養を開始した。培養開始から1日後に、39質量%のグルタミン酸ナトリウムを溶解した2倍濃度のGYP培地5Lを追加して総量を10Lとし、その後は6N塩酸を適時添加してpHを4.8±0.5に維持しながら同条件で培養を続けた。培養液量を10Lとしてから48時間経過した後の培養液を遠心し、上清をHPLC分析してグルタミン酸ナトリウム、GABAの量を測定した結果、7.75質量%のGABA濃度であり、91%の変換率でGABAが生成していた。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところGABAを62%含有する淡褐色の粉末が1615g得られた。
実施例4
実施例3において、ラクトバチルス ブレビス UAS−4に代えてラクトバチルス ブレビス UAS−6を使用した以外は同様にして、GABAを製造した。48時間経過した後の培養液上清の分析を行った結果、7.88質量%のGABA濃度であり、93%の変換率でGABAが生成していた。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところGABAを63%含有する淡褐色の粉末が1624g得られた。
実施例3において、ラクトバチルス ブレビス UAS−4に代えてラクトバチルス ブレビス UAS−6を使用した以外は同様にして、GABAを製造した。48時間経過した後の培養液上清の分析を行った結果、7.88質量%のGABA濃度であり、93%の変換率でGABAが生成していた。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところGABAを63%含有する淡褐色の粉末が1624g得られた。
実施例5
実施例3において、48時間以降も引き続き培養を続けた場合、60時間後にはグルタミン酸ナトリウムが完全に消費され、8.46質量%のGABA濃度であり、GABAへの変換率が100%となった。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところ、GABAを70%含有する淡褐色の粉末が1572g得られた。
実施例3において、48時間以降も引き続き培養を続けた場合、60時間後にはグルタミン酸ナトリウムが完全に消費され、8.46質量%のGABA濃度であり、GABAへの変換率が100%となった。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところ、GABAを70%含有する淡褐色の粉末が1572g得られた。
比較例1
実施例3において、ラクトバチルス ブレビス UAS−4に代えてラクトバチルス ブレビス NBRC12005株を使用した以外は同様にして、GABAを製造した。48時間経過した後の培養液上清の分析を行った結果、6.60質量%のGABA濃度であり、グルタミン酸ナトリウムのGABAへの変換率は78%と低いものであった。この時点で培養上清を凍結乾燥、粉砕したところ、GABAを44%しか含有しない淡褐色の粉末が1950g得られた。
実施例3において、ラクトバチルス ブレビス UAS−4に代えてラクトバチルス ブレビス NBRC12005株を使用した以外は同様にして、GABAを製造した。48時間経過した後の培養液上清の分析を行った結果、6.60質量%のGABA濃度であり、グルタミン酸ナトリウムのGABAへの変換率は78%と低いものであった。この時点で培養上清を凍結乾燥、粉砕したところ、GABAを44%しか含有しない淡褐色の粉末が1950g得られた。
実施例6
実施例3で得られた培養液を遠心し、培養液上清をH型に再生したイオン交換樹脂ダイヤイオンSK−1B(三菱化学製)7LにSV=2の流速で通液した。その後イオン交換水21Lを通液し、0.5規定アンモニア水60LをSV=2の流速で通液してGABAを溶離した。アンモニア水流出液を回収し、エバポレーターで固形分濃度30%まで濃縮し、これを凍結乾燥、粉砕した結果、GABAを98%含有する乳白色の粉末が1001g得られた。
実施例3で得られた培養液を遠心し、培養液上清をH型に再生したイオン交換樹脂ダイヤイオンSK−1B(三菱化学製)7LにSV=2の流速で通液した。その後イオン交換水21Lを通液し、0.5規定アンモニア水60LをSV=2の流速で通液してGABAを溶離した。アンモニア水流出液を回収し、エバポレーターで固形分濃度30%まで濃縮し、これを凍結乾燥、粉砕した結果、GABAを98%含有する乳白色の粉末が1001g得られた。
実施例7
実施例3で得られた培養液を遠心し、培養液上清に太閤活性炭SA1000を350g導入し、1時間攪拌した。その後活性炭はブフナー漏斗にADVANTEC東洋製No.5Cのろ紙を敷き、珪藻土でプレコートしてろ過した。得られた活性炭処理液を、エバポレーターで固形分濃度30%まで濃縮し、これを凍結乾燥、粉砕した結果、GABAを71%含有する淡黄色の粉末が1428g得られた。
実施例3で得られた培養液を遠心し、培養液上清に太閤活性炭SA1000を350g導入し、1時間攪拌した。その後活性炭はブフナー漏斗にADVANTEC東洋製No.5Cのろ紙を敷き、珪藻土でプレコートしてろ過した。得られた活性炭処理液を、エバポレーターで固形分濃度30%まで濃縮し、これを凍結乾燥、粉砕した結果、GABAを71%含有する淡黄色の粉末が1428g得られた。
実施例8
実施例7において、活性炭処理後濃縮した液を、7LのダイヤイオンSK−1BにSV=1で通液した。その後イオン交換水21Lを通液し、0.5規定アンモニア水60LをSV=2の流速で通液してGABAを溶離した。アンモニア水流出液を回収し、エバポレーターで固形分濃度30%まで濃縮し、これを凍結乾燥、粉砕した結果、GABAを99%含有する白色の粉末が983g得られた。
実施例7において、活性炭処理後濃縮した液を、7LのダイヤイオンSK−1BにSV=1で通液した。その後イオン交換水21Lを通液し、0.5規定アンモニア水60LをSV=2の流速で通液してGABAを溶離した。アンモニア水流出液を回収し、エバポレーターで固形分濃度30%まで濃縮し、これを凍結乾燥、粉砕した結果、GABAを99%含有する白色の粉末が983g得られた。
実施例9
実施例8において、ダイヤイオンSK−1Bに代えて、強酸性陽イオン交換樹脂ムロマックC102Na(室町ケミカル製)を使用した以外は同様にして、GABAの精製を行い、GABAを99%含有する白色の粉末を970g得た。
実施例8において、ダイヤイオンSK−1Bに代えて、強酸性陽イオン交換樹脂ムロマックC102Na(室町ケミカル製)を使用した以外は同様にして、GABAの精製を行い、GABAを99%含有する白色の粉末を970g得た。
実施例10
緑茶150mlに実施例3で得られたGABA含有粉末100mgを添加したところ、室温においても速やかに溶けた。このように作ったGABA含有緑茶の色、臭い、味質は全く変わらず、美味しく飲める飲料であった。
緑茶150mlに実施例3で得られたGABA含有粉末100mgを添加したところ、室温においても速やかに溶けた。このように作ったGABA含有緑茶の色、臭い、味質は全く変わらず、美味しく飲める飲料であった。
実施例11
実施例10において、実施例3で得られたGABA含有粉末の代わりに実施例4、6、7、8で得られたGABA含有粉末をそれぞれ添加したが、いずれも実施例10と同様に、室温で速やかに溶け、色、臭い、味質に全く影響を及ぼさず、美味しく飲める飲料であった。
実施例10において、実施例3で得られたGABA含有粉末の代わりに実施例4、6、7、8で得られたGABA含有粉末をそれぞれ添加したが、いずれも実施例10と同様に、室温で速やかに溶け、色、臭い、味質に全く影響を及ぼさず、美味しく飲める飲料であった。
実施例12
実施例8で得られた高純度のGABA粉末を200μm以下に粉砕した微粉末200g、乳糖100g、デキストリン100g、ナタネ硬化油30g、ステアリン酸マグネシウム2g、水70gを混合し、打錠機で250mg/個で打錠し、GABA含有錠剤を1700個作った。錠剤は雑味が無く飲みやすいものであった。
実施例8で得られた高純度のGABA粉末を200μm以下に粉砕した微粉末200g、乳糖100g、デキストリン100g、ナタネ硬化油30g、ステアリン酸マグネシウム2g、水70gを混合し、打錠機で250mg/個で打錠し、GABA含有錠剤を1700個作った。錠剤は雑味が無く飲みやすいものであった。
Claims (7)
- グルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩を含む培地で増殖するに従い、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積する能力を有する乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスUAS−4(Lactobacillus brevis UAS−4)(FERM AP−20710)。
- グルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩を含む培地で増殖するに従い、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積する能力を有するラクトバチルス・ブレビスUAS−6(Lactobacillus brevis UAS−6)(FERM AP−20711)。
- グルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩を含む培地で請求項1記載のラクトバチルス・ブレビスUAS−4又は請求項2記載のラクトバチルス・ブレビスUAS−6を培養し、培養液中に蓄積したγ−アミノ酪酸を回収することを特徴とするγ−アミノ酪酸の製造方法。
- 請求項1記載のラクトバチルス・ブレビスUAS−4又は請求項2記載のラクトバチルス・ブレビスUAS−6を増殖させた培地に、培地に対して10〜20質量%のグルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩を一度に、又は分割して添加し、pHを4.0〜6.0に保持しながら20〜35℃で培養することを特徴とするγ−アミノ酪酸の製造方法。
- グルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩を含む培地で請求項1記載のラクトバチルス・ブレビスUAS−4又は請求項2記載のラクトバチルス・ブレビスUAS−6を培養し、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積させた後、培養液から菌体を除去し、濃縮後乾燥してγ−アミノ酪酸を40質量%以上にすることを特徴とするγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法。
- グルタミン酸及び/又はグルタミン酸塩を含む培地で請求項1記載のラクトバチルス・ブレビスUAS−4又は請求項2記載のラクトバチルス・ブレビスUAS−6を培養し、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積させた後、培養液から菌体を除去し、イオン交換樹脂を用いて精製を行いγ−アミノ酪酸を固形分にして90質量%以上にすることを特徴とするγ−アミノ酪酸高含有組成物の製造方法。
- 請求項3及び/又は4記載のγ−アミノ酪酸、請求項5記載のγ−アミノ酪酸含有組成物又は請求項6記載のγ−アミノ酪酸高含有組成物のいずれかを含有することを特徴とする飲食品。
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