CN103058877A - 一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,将含有谷氨酸及通过谷氨酸酶转化生产的GABA的料液经膜过滤、离心澄清或者板框过滤后,通过热浓缩或者膜浓缩制成1%-90%(w/w)浓度的水溶液,调节该水溶液pH2-11,在0-100℃条件下,进入装填专用色谱介质的色谱柱,以水或者调节到特定pH的水作洗提剂洗提,分别收集洗提液和残留液,获得纯GABA和谷氨酸两种产物,实现GABA和谷氨酸的高效分离,同时对GABA还有脱色的效果。与现有技术相比,本发明具有操作简单、成本低廉、分离度高、绿色环。
Description
技术领域
本发明涉及一种氨基酸分离技术,属于生化分离领域,尤其是涉及一种使用色谱技术分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid,GABA),又称氨酪酸,是一种天然存在的非蛋白质组成氨基酸,其分子式为NH2CH2CH2CH2COOH,相对分子质量为103.1,熔点202℃(在快速加热下分解),易溶于水,微溶于热乙醇,不溶于其他有机溶剂。γ-氨基丁酸在自然界中微量存在于动物脑髓和植物的胚芽体内,如脑组织中的含量约为0.1-0.3mg/g,糙米中含有35mg/kg,豆叶中含量为40mg/kg。GABA是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质,约50%的中枢神经突触部位以GABA为递质。在人体大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑中起重要作用,并对机体的多种功能具有调节作用。当人体内GABA缺乏时,会产生焦虑、不安、疲倦、忧虑等情绪。一般长久处于高压力族群,竞争环境人群、运动上班等,都很容易缺乏GABA需要及时补充以便舒缓情绪。
化学合成法多见于专利文献的报道,成本较高,得率较低,并且在生产工艺中使用危险溶剂,甚至是有毒溶剂。因此化学合成法制备的GABA不能用于食品,也不能认为是一种天然的食品添加剂。生物合成法GABA应用纯粹的微生物(公认安全菌--乳酸菌或者酵母菌)技术,通过筛选优良高产的安全菌种,发酵生产GABA制剂,可以认为是天然食品添加剂。而且据报告显示,生物合成法GABA虽然纯度不高,但生物体对GABA的吸收性却比纯度高的化学合成法GABA高很多。因此可见,作为新资源食品的GABA生物发酵法制备的才是最安全健康的。
生物发酵法制备,一般以谷氨酸为原料,通过酶或者乳酸菌、酵母菌等微生物转化为GABA,在转化后料液中一般含有为转化完全的谷氨酸原料、盐分等杂质,需要通过下游技术进一步分离纯化。一般采用的方法有电渗析、离子交换、有机溶剂内结晶等方式。
采用水相体系电渗析法脱出盐分和谷氨酸精制GABA,存在以下缺陷:由于GABA的水溶液在膜中循环时其逃逸率会大大增加,又因随谷氨酸和盐的去除其溶液的pH变化较大,因此GABA在水中的离解会大大增加,电渗析过程中GABA的损失率较大。而且,电渗析方法脱除谷氨酸和盐分需要消耗大量电能。
CN101863783公开了一种从谷氨酰胺脱羧酶酶解液中分离纯化γ-氨基丁酸(GABA)的方法,该方法包括以下步骤:富含GABA的谷氨酰氨脱羧酶酶解液进入膜分离系统进行过滤澄清,浓缩到2-10倍时,加透析水透析,最终滤液量为1-3倍酶解液量;将滤液泵入离子交换系统脱盐,脱盐液进入脱色树脂或活性炭柱脱色,脱色后的清液通过蒸发器浓缩,再经过干燥或结晶及重结晶,得到GABA产品。与现有技术相比,本发明的分离纯化工艺简单、合理,工序短,操作方便,分离得到的GABA纯度高、颜色浅、分散性好,总收率高;具有运行成本低、过滤精度高、浓缩倍数高、酶浓缩物浓度高等优点,有利于酶浓缩物的重复利用或固化资源化利用,避免了二次污染。然而,该方法通过离子交换将GABA纯化,脱除谷氨酸和其他盐分,尽管离子交换方法高校、收率高,但是离子交换系统再生会产生大量废酸、碱,一般含有为5-7%的盐分,并且pH值偏高或者偏低,并且含有部分有机酸、氨基酸产生的COD,不利于废水的处理。
CN101928736公开了一种γ-氨基丁酸分离纯化工艺,该工艺步骤较多,并且在95%的乙醇溶液中结晶纯化,造成大量的有机溶剂废液,及时采用蒸馏回收乙醇,也需要消耗大量的能源,并且结晶法一般需要在低温下养晶,也额外消耗大量电能。
CN101812486公开一种γ-氨基丁酸发酵液的脱盐方法,其方法为:(1)将短乳杆菌活化后,以10%的接种量接种于3L发酵培养基中,32℃培养36-72h;并于12h和24h分别补入1.5mol和0.7mol的L-谷氨酸钠;整个发酵过程用10N的硫酸控制pH 5.0;(2)将发酵液4℃离心除去菌体,在上清液中加入2%的活性炭,于80℃脱色30min,过滤回收滤液;(3)加热浓缩上述滤液,当开始瀑沸时立即停止加热,冷却后加入冰乙酸溶解浓缩物,当固形物不再溶解时,过滤回收滤液。该工艺消耗大量的有机溶剂乙酸,乙酸的回收成为工艺的瓶颈。
综上所述,现有GABA分离提纯方法存在酸碱溶液、有机溶液消耗量大、电力消耗大、运行成本高、操作较复杂、产生大量的废酸碱、对环境污染严重等不足。亟待一种不消耗酸碱、低能耗、工艺简单、环境友好的新型技术的出现来解决现有技术的问题。
色谱技术目前已经广泛应用于物质的定性、定量分析(例如高效液相色谱HPLC)以及果葡糖浆的大规模工业化分离,是一种清洁高效的分离技术。但由于色谱技术对物质的分离是基于色谱填料对物质的吸附力的差异来分离不同的物质,所以针对具体分离目标物质的专用色谱介质的开发和研制是制约色谱技术发展的瓶颈问题和难点。目前国内外仍然没有采用色谱技术高效分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的报道,其主要原因是因为色谱柱内装填的对γ-氨基丁酸和谷氨酸吸附力差异显著的专用色谱介质的筛选非常困难,相关的色谱分离条件选择难度较大,无法实施工业化应用。氨基酸具有两性解离特性,在一定pH值范围内,谷氨酸和γ-氨基丁酸的解离程度不同,氨基酸所带的电荷不同,本发明基于这一技术原理,筛选或合成具有离子选择性的高性能特种分离离子交换树脂,使该树脂对两种解离程度不同的氨基酸选择性吸附力显著不同,则可以使两种氨基酸在色谱柱内的保留时间显著不同,最终使两种物质得以分离。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作简单、成本低廉、分离度高、绿色环保的利用色谱分离Г-氨基丁酸和谷氨酸的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,包括以下步骤:
将含有谷氨酸的通过酶转化生产的GABA料液经膜过滤、离心澄清或板框过滤,再通过热浓缩或者膜浓缩制成1%-90%(w/w)浓度的水溶液,调节该水溶液pH为2-11,在0-100℃条件下,进入装填专用色谱介质的色谱柱,采用洗提剂洗提,分别收集洗提液和残留液,获得纯GABA和谷氨酸两种产物,实现GABA和谷氨酸的高效分离,同时对GABA还有脱色的效果。
作为优选的实施方式,所述的色谱柱的柱径高比为1∶0.2-1∶60。
作为优选的实施方式,所述的色谱柱内装填的筛选的对γ-氨基丁酸和谷氨酸吸附力差异显著的色谱介质。本技术控制氨基酸溶液的pH值在一定范围内,使得具有两性解离的谷氨酸和γ-氨基丁酸的解离程度不同,氨基酸所带的电荷不同,采用具有离子选择性的高性能特种分离离子交换树脂,使该树脂对两种解离程度不同的氨基酸选择性吸附力显著不同,进而在色谱柱内的保留时间显著不同,最终使两种物质得以充分分离。
作为更加优选的实施方式,筛选得到的色谱介质为树脂强酸型阳离子树脂、钙型阳离子树脂、弱酸型阳离子树脂、镁型阳离子树脂、钠型阳离子树脂、钾型阳离子树脂、铵型阳离子树脂和锂型阳离子树脂、氨基酸阳离子树脂或有机阳离子树脂。
作为优选的实施方式,所述的色谱柱进行色谱分离的形式包括真实移动床色谱、模拟移动床色谱、间歇式色谱的色谱柱或固定床色谱。
作为优选的实施方式,所述的色谱柱的反应温度在0-100℃,采用恒温色谱方式或变温色谱方式。
作为优选的实施方式,所述的水溶液经可以提供氢离子的有机酸、无机酸或提供氢氧根离子的无机碱、有机碱调节pH值,选择但不限于柠檬酸、醋酸、乳酸、磷酸、H2SO4、HCl溶液、NaOH、KOH或氨水。
作为优选的实施方式,所述的水溶液进入色谱柱的进料量为0.05BV-5BV。
作为优选的实施方式,所述的洗提剂包括去离子水、脱盐水或蒸馏水或者调节pH值到2-11的水,洗提的流速为0.1BV/h-5BV/h。
作为优选的实施方式,所述的含有谷氨酸的通过酶转化生产的GABA料液中GABA和谷氨酸两者的质量比例为99∶1-1∶99。
与现有技术相比,本发明使用以色谱分离为核心的分离方法,该法首次基于GABA和谷氨酸分离领域,具有选择性高,分离度高,工艺简单,GABA纯度高,谷氨酸可以作为产品收集且浓度较高的特点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,可以采用以下操作步骤实现GABA和谷氨酸的分离:
(1)将含有谷氨酸的通过酶转化生产的GABA料液经膜过滤、离心澄清或板框过滤,再通过热浓缩或者膜浓缩制成1%-90%(w/w)浓度的水溶液;
(2)利用提供氢离子的有机酸、无机酸或提供氢氧根离子的无机碱、有机碱调节水溶液的pH值为2-11,可以采用柠檬酸、醋酸、乳酸、磷酸、H2SO4、HCl溶液、NaOH、KOH或氨水来调节pH值;
(3)控制流量为0.05BV-5BV,将经过pH值调节的水溶液导入装填专用色谱介质的色谱柱中,采用的色谱柱的柱径高比为1∶0.2-1∶60,在色谱柱内装填的专用色谱介质为筛选出的对γ-氨基丁酸和谷氨酸吸附力差异显著的色谱介质,可以是树脂强酸型阳离子树脂、钙型阳离子树脂、弱酸型阳离子树脂、镁型阳离子树脂、钠型阳离子树脂、钾型阳离子树脂、铵型阳离子树脂和锂型阳离子树脂、氨基酸阳离子树脂或有机阳离子树脂,进行色谱分离,分离的形式包括真实移动床色谱、模拟移动床色谱、间歇式色谱的色谱柱或固定床色谱,色谱柱的分离温度为0-100℃,采用恒温色谱方式或变温色谱方式进行分离处理;
(4)经过色谱柱进行色谱分离后,利用去离子水、脱盐水或蒸馏水或者调节pH值到2-11的水作为洗提剂对进行洗提,洗提的流速为0.1BV/h-5BV/h,分别收集洗提液和残留液,获得纯GABA和谷氨酸两种产物,实现GABA和谷氨酸的高效分离,同时对GABA还有脱色的效果。
下面采用含有具体实验数据以及反应参数的实例对本申请进行进一步的描述,但这只是对本申请的描述,并不会限制本申请的保护范围,本领域的技术人员应该知道,凡是涉及到本申请所公开的技术内容的任何其它形式的技术方案,都是本申请所保护的范围。
实施例1
将谷氨酸的酶转化生产的GABA料液经膜过滤,使用纳滤膜浓缩到20%(w/w)浓度,用氨水调pH到7.5;根据色谱柱的体积规格,按照径高比为1∶1填充钙型阳离子色谱树脂,控制柱温在10℃,进料量为0.05BV,恒温色谱分离;用去离子水作为洗提剂,控制温度在10℃和流速为1.0BV/h条件下进行洗提;分别收集洗提液和残留液,分别获得脱色的GABA和谷氨酸两种产品的水溶液,两物质分离率达98%(w/w)以上,GABA的脱色率达到96%以上。
实施例2
将谷氨酸的酶转化生产的GABA料液经板框过滤,使用热浓缩到80%(w/w)浓度,用NaOH调pH到8;根据色谱柱的体积规格,按照径高比为1∶30填充锂型阳离子色谱树脂,控制柱温在40℃,进料量为0.1BV,恒温色谱分离;用去离子水调节pH到8作为洗提剂,控制温度在40℃和流速为2.0BV/h条件下进行洗提;分别收集洗提液和残留液,分别获得脱色的GABA和谷氨酸两种产品的水溶液,两物质分离率达99%以上,GABA的脱色率达到98%以上。
实施例3
将谷氨酸的酶转化生产的GABA料液经板框过滤,使用热浓缩到60%(w/w)浓度,用KOH调pH到10;根据色谱柱的体积规格,按照径高比为1∶40填充氨型阳离子色谱树脂,控制柱温在50℃,进料量为0.3BV,恒温色谱分离;用去离子水调节pH到7作为洗提剂,控制温度在50℃和流速为0.5BV/h条件下进行洗提;分别收集洗提液和残留液,分别获得脱色的GABA和谷氨酸两种产品的水溶液,两物质分离率达90%以上,GABA的脱色率达到81%以上。
实施例4
将谷氨酸的酶转化生产的GABA料液经板框过滤,使用热浓缩到60%(w/w)浓度,用HCl调pH到5;根据色谱柱的体积规格,按照径高比为1∶10填充谷氨酸型阳离子色谱树脂,控制柱温在80℃,进料量为0.02BV,恒温色谱分离;用去离子水调节pH到5作为洗提剂,控制温度在80℃和流速为0.2BV/h条件下进行洗提;分别收集洗提液和残留液,分别获得脱色的GABA和谷氨酸两种产品的水溶液,两物质分离率达80%以上,GABA的脱色率达到88%以上。
实施例5
将谷氨酸的酶转化生产的GABA料液离心澄清,使用膜浓缩到10%(w/w)浓度,用氨水调pH到11;根据色谱柱的体积规格,按照径高比为1∶25填充镁型阳离子色谱树脂,控制柱温在80℃,进料量为3BV,恒温色谱分离;用去离子水调节pH到11作为洗提剂,控制温度在80℃和流速为1.3BV/h条件下进行洗提;分别收集洗提液和残留液,分别获得脱色的GABA和谷氨酸两种产品的水溶液,两物质分离率达88%以上,GABA的脱色率达到72%以上。
实施例6
将谷氨酸的酶转化生产的GABA料液(55%(w/w)GABA,41%(w/w)谷氨酸)膜过滤,使用纳滤膜浓缩到45%(w/w)浓度,用柠檬酸调pH3到;根据色谱柱的体积规格,按照径高比为1∶7填充GABA型阳离子色谱树脂,控制柱温在70℃,进料量为0.8BV,恒温色谱分离;用去离子水作为洗提剂,控制温度在70℃和流速为0.7BV/h条件下进行洗提;分别收集洗提液和残留液,分别获得脱色的GABA和谷氨酸两种产品的水溶液,两物质分离率达96%以上,GABA的脱色率达到92%以上。
实施例7
将谷氨酸的酶转化生产的GABA料液(35%(w/w)GABA,65%(w/w)谷氨酸)膜过滤,使用反渗透膜浓缩到48%(w/w)浓度,用乳酸调pH2.5到;根据色谱柱的体积规格,按照径高比为1∶36填充钙型阳离子色谱树脂,控制柱温在19℃,进料量为0.6BV,恒温色谱分离;用去离子水作为洗提剂,控制温度在19℃和流速为0.7BV/h条件下进行洗提;分别收集洗提液和残留液,分别获得GABA和谷氨酸两种产品的溶液,两物质分离率76%以上,GABA的脱色率达到66%以上。
实施例8
将谷氨酸的酶转化生产的GABA料液(75%(w/w)GABA,25%(w/w)谷氨酸)板框过滤,使用纳滤膜浓缩到18%(w/w)浓度,用磷酸调pH4.5到;根据色谱柱的体积规格,按照径高比为1∶16填充钠型阳离子色谱树脂,控制柱温在39℃,进料量为1.7BV,恒温色谱分离;用去离子水作为洗提剂,控制温度在39℃和流速为2.5BV/h条件下进行洗提;分别收集洗提液和残留液,分别获得脱色的GABA和谷氨酸两种产品的水溶液,两物质分离率96%以上,GABA的脱色率达到85%以上。
实施例9
一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,包括以下步骤:
将GABA和谷氨酸质量比例为99∶1的通过酶转化生产的GABA料液经膜过滤处理,再通过热浓缩或者膜浓缩制成1%(w/w)浓度的水溶液,利用柠檬酸调节该水溶液pH为2,在0℃条件下,控制流量为0.05BV将水溶液导入装填有钙型阳离子树脂的色谱柱,色谱柱的柱径高比为1∶0.2,然后采用去离子水洗提,洗提的流速为0.1BV/h,分别收集洗提液和残留液,获得纯GABA和谷氨酸两种产物,实现GABA和谷氨酸的高效分离,同时对GABA还有脱色的效果。
实施例10
一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,包括以下步骤:
将GABA和谷氨酸质量比例为1∶99的通过酶转化生产的GABA料液经离心澄清处理,再通过热浓缩或者膜浓缩制成90%(w/w)浓度的水溶液,利用氨水调节该水溶液pH为11,在100℃条件下,控制流量为5BV将水溶液导入装填有铵型阳离子树脂的色谱柱,色谱柱的柱径高比为1∶60,然后采用pH值为11的水洗提,洗提的流速为5BV/h,分别收集洗提液和残留液,获得纯GABA和谷氨酸两种产物,实现GABA和谷氨酸的高效分离,同时对GABA还有脱色的效果。
本发明提供使用以色谱分离为核心的分离方法,分离的GABA纯度高,可用于食品生产,对于谷氨酸副产物也可以回收利用,而且色谱树脂无需再生,洗提剂为水,树脂可多次使用,所消耗的电能仅仅用于泵送洗提剂,电力消耗低,生产成本低,是真正意义的低碳环保、零污染、操作简单、成本低廉的分离方法。
Claims (10)
1.一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
将含有谷氨酸的通过酶转化生产的GABA料液经膜过滤、离心澄清或板框过滤,再通过热浓缩或者膜浓缩制成1%-90%(w/w)浓度的水溶液,调节该水溶液pH为2-11,在0-100℃条件下,进入装填专用色谱介质的色谱柱,采用洗提剂洗提,分别收集洗提液和残留液,获得纯GABA和谷氨酸两种产物,实现GABA和谷氨酸的分离并对GABA进行脱色。
2.根据权利要求1所述的一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,其特征在于,所述的色谱柱的柱径高比为1∶0.2-1∶60。
3.根据权利要求1所述的一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,其特征在于,所述的色谱柱内装填的是筛选的对γ-氨基丁酸和谷氨酸吸附力差异显著的色谱介质。
4.根据权利要求3所述的一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,其特征在于,筛选得到色谱介质为树脂强酸型阳离子树脂、钙型阳离子树脂、弱酸型阳离子树脂、镁型阳离子树脂、钠型阳离子树脂、钾型阳离子树脂、铵型阳离子树脂和锂型阳离子树脂、氨基酸阳离子树脂或有机阳离子树脂。
5.根据权利要求1所述的一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,其特征在于,所述的色谱柱进行色谱分离的形式包括真实移动床色谱、模拟移动床色谱、间歇式色谱的色谱柱或固定床色谱。
6.根据权利要求1所述的一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,其特征在于,所述的色谱柱的反应温度在0-100℃,采用恒温色谱方式或变温色谱方式。
7.根据权利要求1所述的一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,其特征在于,所述的水溶液经可以提供氢离子的有机酸、无机酸或提供氢氧根离子的无机碱、有机碱调节pH值,选择但不限于柠檬酸、醋酸、乳酸、磷酸、H2SO4、HCl溶液、NaOH、KOH或氨水。
8.根据权利要求1所述的一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,其特征在于,所述的水溶液进入色谱柱的进料量为0.05BV-5BV。
9.根据权利要求1所述的一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,其特征在于,所述的洗提剂包括去离子水、脱盐水或蒸馏水或者调节pH值到2-11的水,洗提的流速为0.1BV/h-5BV/h。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的一种利用色谱分离γ-氨基丁酸和谷氨酸的方法,其特征在于,所述的含有谷氨酸的通过酶转化生产的GABA料液中GABA和谷氨酸两者的质量比例为99∶1-1∶99。
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《中国粮油学报》 20110825 嵇豪 等 D001阳离子交换树脂分离红曲霉发酵液中gamma-氨基丁酸的研究 第95-99页 1-10 第26卷, 第8期 * |
《浙江大学硕士学位论文》 20060915 李向平 发酵液中gamma-氨基丁酸提取工艺研究 第1-65页 1-10 , * |
《精细化工》 20090815 卢卫国 等 离子交换法分离提取谷氨酸转化液中的gamma-氨基丁酸 第776-780页 1-10 第26卷, 第8期 * |
卢卫国 等: "离子交换法分离提取谷氨酸转化液中的γ-氨基丁酸", 《精细化工》, vol. 26, no. 8, 15 August 2009 (2009-08-15), pages 776 - 780 * |
嵇豪 等: "D001阳离子交换树脂分离红曲霉发酵液中γ-氨基丁酸的研究", 《中国粮油学报》, vol. 26, no. 8, 25 August 2011 (2011-08-25), pages 95 - 99 * |
李向平: "发酵液中γ-氨基丁酸提取工艺研究", 《浙江大学硕士学位论文》, 15 September 2006 (2006-09-15), pages 1 - 65 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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CN103713077B (zh) * | 2013-12-26 | 2015-12-30 | 晨光生物科技集团股份有限公司 | 高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法 |
CN107266326A (zh) * | 2017-07-07 | 2017-10-20 | 沧州信联化工有限公司 | 一种γ‑氨基丁酸的纯化方法 |
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