CN103713077B - 高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法，其测定步骤为：（1）γ-氨基丁酸的提取：将称取的红曲样品加到水中，超声提取，离心收集上清液；（2）醇沉：在上清液中加入乙醇和盐溶液进行醇沉处理，离心收集醇沉上清液；（3）酶处理：醇沉上清液脱除溶剂，然后加入复合酶制剂进行酶处理；（4）脱色素处理：将酶处理后的浓缩液上柱吸附，树脂吸附、氨水洗脱；洗脱液用微孔滤膜过滤，所得过滤液即为待检测液；（5）所述待检测液经柱前衍生化处理，即可采用液相色谱法测定。本方法采用醇沉、酶处理、脱色素处理，有效去除γ-氨基丁酸中的杂质含量，降低检测过程中的干扰，有效的提升检测准确性，检测结果可靠稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种红曲成分的测定方法，尤其是一种高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法。
背景技术
γ-氨基丁酸（γ-aminobuyricacid，GABA）是广泛存在于动植物体内的一种具有生理活性的非蛋白质氨基酸，具有调节心血管活动和心律失常以及营养神经细胞等多种生理功能。随着研究的深入，GABA已经发展成为一种新型的功能性因子，并逐渐应用于医药、食品和饲料工业中。红曲菌(Monascussp．)是我国传统的食品发酵微生物，能产生丰富的酶类、色素以及多种生理活性物质，在食品着色、酿造、医疗保健等方面得到较广泛应用。动物和临床试验表明，红曲菌的发酵产物红曲具有很强的降血压作用，GABA被认为是其降压的主要成分。
目前常用的GABA检测方法有薄层色谱、纸层析法、比色法、氨基酸分析仪测定、毛细管电泳-电化学检测、高效液相色谱法。各种方法均有其优缺点，其中薄层层析方法灵敏度高、检测方便，但是检测耗时比较长；纸电泳法成本较低，无需昂贵的试剂以及仪器，缺点是需要控制温度、pH以及滤纸本身性质等的影响，操作过程繁琐；纸层析法简单有效费用低廉，缺点是精密度不高，检测时间较长；氨基酸分析仪检测准确、简便省时、稳定性好，缺点是设备昂贵、对样品的纯度要求很高，测定条件需要严格控制；毛细管电泳法灵敏度高、成本低、试剂用量少，但是操作过程过于复杂；高效液相色谱法精确度和灵敏度均很高，可满足大部分科研和生产过程中检测的需要。
高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）检测GABA需要使用衍生化试剂处理，所使用的衍生化试剂主要有邻苯二甲醛（OPA）、2,4-二硝基氟苯（FDNB）、异硫氰酸苯酯（PITC）以及6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）等，其中使用OPA衍生GABA，操作简单，反应迅速抗干扰能力强，且毒性较小，是比较理想的衍生化试剂。但由于红曲产品中成分复杂、杂质较多，干扰检测效果的因素较多，因造成检测结果准确性较低、偏差较大，不太稳定可靠。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可有效减少杂质对检测的干扰，增加检测准确性的高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的测定步骤为：（1）γ-氨基丁酸的提取：将称取的红曲样品加到水中，超声提取，离心分离收集上清液；
（2）醇沉：在上清液中加入乙醇和无机盐溶液进行醇沉处理，离心分离得到醇沉上清液；
（3）酶处理：醇沉上清液脱除溶剂，然后加入复合酶制剂进行酶处理；
（4）脱色素处理：将酶处理后的浓缩液上柱吸附，树脂吸附、氨水洗脱；洗脱液用微孔滤膜过滤，所得过滤液即为待检测液；
（5）所述待检测液经柱前衍生化处理，即可采用液相色谱法测定。
本发明所述步骤（1）中，红曲样品加到10～30倍体积超纯水中，超声提取1～4h；所述提取和分离步骤重复2～5次，合并上清液。
本发明所述步骤（2）中，上清液加入1～2倍体积的乙醇和1/5～1/10体积的5wt%～10wt%无机盐溶液，在-10℃～4℃静置处理10～30min。所述无机盐为醋酸钾、醋酸铵或硫酸铵。
本发明所述步骤（3）中，复合酶制剂为蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和果胶酶的混合物；酶处理温度为25～55℃，pH为3.5～9.0，静置处理30～60min。
本发明所述步骤（4）中，层析柱的柱床高为15～20cm，采用0.2～2mol/L的氨水洗脱。
本发明所述步骤（5）中，采用邻苯二甲醛和β-巯基乙醇为衍生化试剂进行柱前衍生。所述待检测液中加入1～8倍体积衍生化试剂，避光混合1～5min进行衍生，然后微孔滤膜过滤。
本发明所述步骤（5）中液相色谱法的测定步骤为：首先采用液相色谱检测一系列具有梯度浓度的γ-氨基丁酸标准溶液，绘制峰面积-浓度标准曲线；再将经柱前衍生化处理的检测液用液相色谱检测，根据峰面积-浓度标准曲线，即可得到红曲样品的γ-氨基丁酸含量。
所述液相色谱法的测定条件为：色谱柱为反相C18柱；检测波长为338nm；色谱柱温度为室温；流动相A和流动相B按比例混合均匀，其中流动相A所占比例为30～70%，使用前经微孔滤膜过滤，超声波脱气后使用；流动相流速为0.5～1.5mL/min；进样量10～20μl。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明采用醇沉、酶处理、脱色素处理，有效的去除从红曲所提取的γ-氨基丁酸中的杂质含量，降低检测过程中的干扰，有效的提升检测准确性，检测结果可靠稳定。
本发明使用高效液相色谱、柱前衍生化法检测红曲产品中的γ-氨基丁酸，该方法操作简单，省时省力，使用的试剂毒性较小，衍生化之前使用的纯化方法回收率高，杂质干扰小，同时也可以减少样品对色谱柱的损伤，延长液相色谱柱的适用寿命。
本发明检测红曲中的γ-氨基丁酸，线性范围在10-3～2mg/mL之间，检出限为0.01mg/mL，回收率大于90%，相对标准偏差小于5%。本发明提供了一种可靠稳定的检测红曲中降血压成分的检测方法，可以满足一般生产和科研的需要。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明中γ-氨基丁酸标准样品高效液相色谱图；
图2是本发明样品中的γ-氨基丁酸高效液相色谱图；
图3是本发明中γ-氨基丁酸标准曲线图。
具体实施方式
实施例1：本高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法采用下述原料、仪器和工艺步骤。
一、实验仪器与试剂如下
1）仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪（美国安捷伦）；色谱柱为DiamonsilC18250x4.6mm,5μm（迪马科技）；针筒式微孔滤膜；0.22μm有机系滤膜；旋转蒸发仪（上海申科）；电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；高速离心机（湘仪集团）；超声仪。
2）实验试剂：γ-氨基丁酸标准品、甲醇、乙腈、甲酸、四氢呋喃、超纯水。
二、实验如下：
1）使用γ-氨基定酸标准品实验并确定最佳的色谱条件。
2）用已经确定的方法检测待测样品，确定其中是否含有γ-氨基丁酸。
3）向待测样品中添加γ-氨基丁酸标准品，测定方法的回收率、精密度以及检出限。
三、具体实验方法：
（一）样品处理：
（1）红曲样品中γ-氨基丁酸的提取：准确称取样品红曲2.0g，放于50mL离心管中；按照1:20的质量体积比加入超纯水40ml，超声提取60分钟，8000rmp离心10min，收集上清液；重复上述步骤2次，将上清液合并；加入2倍上清液体积无水乙醇和1/8上清液体积的10wt%醋酸铵溶液，-10℃沉淀30min；
（2）8000rmp离心10min，弃去沉淀，常温减压浓缩脱去溶剂，然后加入复合酶制剂，调节pH=5.0，常温处理60min；所述复合酶制剂为蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和果胶酶的混合物；
（3）脱色素处理：将树脂装入1.6×30cm层析柱，柱床高20cm，将浓缩液上柱吸附，用2mol/L的氨水洗脱，洗脱液用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤，所得过滤液即为待检测液；
（4）取400μL样品中加入2倍体积衍生化试剂，避光混合1min；微孔滤膜过滤后检测。
（二）、所使用的试剂的配制：
（1）0.05mol/L（19.07g/L）硼酸溶液：取硼砂1.907g溶于100ml超纯水。
（2）0.2mol/LNaOH溶液：取0.8gNaOH溶于100ml超纯水。
（3）0.4mol/L硼酸缓冲液：取pH9.6的0.05mol/L硼酸溶液25ml，0.2mol/LNaOH溶液11.5ml，定溶至100ml，调节pH=10.4。
（4）衍生化试剂配制：将OPA（邻苯二甲醛）50mg，β-MCE（β-巯基乙醇）40μL溶于5.0ml甲醇中，加入0.4mol/L硼酸缓冲液（pH=9.6）10ml。
（5）流动相A：10ml冰醋酸，15g醋酸钠，50ml四氢呋喃，超纯水定容至1000ml，调节pH至4.7。
（6）流动相B：乙腈。
（三）、液相色谱条件：
所用的仪器为安捷伦1260；
色谱柱为DiamonsilC18250x4.6mm,5μm；
检测波长：338nm；
色谱柱温度为室温；流动相A:流动相B=1:1，使用前经0.22μm微孔滤膜过滤，超声波脱气后使用；
流动相流速为1.0mL/min；
进样量20μl。
（四）、实验结果：
1）标准曲线绘制：
用超纯水配制0.001mg/mL、0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL的γ-氨基丁酸标准溶液，在上述液相色谱条件下检测，记录峰面积，绘制峰面积-浓度标准曲线；γ-氨基丁酸标准样品高效液相色谱图如图1所示，标准曲线如图3所示；
根据其保留时间对应的峰面积与其浓度进行回归分析，得到线性方程：y=15590893.2165x-131880.5121，R2=0.9999，γ-氨基丁酸在0.001～3.0mg/mL范围内呈线性。
2）检测结果：上述红曲中提取的待检测液在上述液相色谱条件下检测，红曲样品中γ-氨基丁酸高效液相色谱图如图2所示，根据线性方程即可得到红曲样品中γ-氨基丁酸含量；检测结果见表1。
表1：红曲样品中γ-氨基丁酸含量
3）本测定方法的回收率和精密度：
对添加10mg/g、50mg/g、100mg/gγ-氨基丁酸标准溶液的样品进行重复性试验，每个浓度取三个平行样。根据测定结果计算回收率和精密度，结果见表2所示。
表2：回收率和精密度结果
4）方法的检出限：
根据仪器响应值与噪音的比值为3:1的计算方法的检出限，γ-氨基丁酸的检出限为0.001mg/g。
实施例2：本高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法除下述不同之处，其它与实施例1相同。
（一）样品处理：
（1）红曲样品中γ-氨基丁酸的提取：准确称取样品红曲2.0g，放于100mL离心管中；按照1:30的质量体积比加入超纯水60ml，超声提取2.5小时，5000rmp离心8min，收集上清液；重复上述步骤5次，将上清液合并；加入1倍体积的无水乙醇和1/10体积的7wt%硫酸铵溶液，0℃沉淀10min；
（2）5000rmp离心8min，弃去沉淀，常温减压浓缩脱去溶剂，然后加入复合酶制剂，调节pH=9.0，40℃处理45min；
（3）脱色素处理：将树脂装入柱床高15cm层析柱，，将浓缩液上柱吸附，用1.0mol/L的氨水洗脱，洗脱液经微孔滤膜过滤，所得过滤液即为待检测液；
（4）取400μL样品中加入8倍体积衍生化试剂，避光混合3min；微孔滤膜过滤后检测。
液相色谱条件：色谱柱温度为室温；流动相A:流动相B=3:7，使用前经微孔滤膜过滤，超声波脱气后使用；流动相流速为1.5mL/min；进样量15μl。
本实施例检测的红曲样品中γ-氨基丁酸含量为14.89mg/g。
实施例3：本高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法除下述不同之处，其它与实施例1相同。
（一）样品处理：
（1）红曲样品中γ-氨基丁酸的提取：准确称取样品红曲2.0g，放于50mL离心管中；按照1:10的质量体积比加入超纯水20ml，超声提取4小时，7000rmp离心5min，收集上清液；重复上述步骤4次，将上清液合并；加入1.5倍体积的无水乙醇和1/5体积的5wt%醋酸钾溶液，4℃沉淀20min；
（2）7000rmp离心5min，弃去沉淀，常温减压浓缩脱去溶剂，然后加入复合酶制剂，调节pH=3.5，55℃处理30min；
（3）脱色素处理：将树脂装入柱床高18cm层析柱，，将浓缩液上柱吸附，用0.2mol/L的氨水洗脱，洗脱液经微孔滤膜过滤，所得过滤液即为待检测液；
（4）取400μL样品中加入1倍体积衍生化试剂，避光混合5min；微孔滤膜过滤后检测。
液相色谱条件：色谱柱温度为室温；流动相A:流动相B=7:3，使用前经微孔滤膜过滤，超声波脱气后使用；流动相流速为0.5mL/min；进样量10μl。
本实施例检测的红曲样品中γ-氨基丁酸含量为8.52mg/g。
Claims (8)
1.一种高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于，其测定步骤为：（1）γ-氨基丁酸的提取：将称取的红曲样品加到水中，超声提取，离心分离收集上清液；
（2）醇沉：在上清液中加入乙醇和无机盐溶液进行醇沉处理，离心分离得到醇沉上清液；
（3）酶处理：醇沉上清液脱除溶剂，然后加入复合酶制剂进行酶处理；
（4）脱色素处理：将酶处理后的浓缩液上柱吸附，树脂吸附、氨水洗脱；洗脱液用微孔滤膜过滤，所得过滤液即为待检测液；
（5）所述待检测液经柱前衍生化处理，即可采用液相色谱法测定；
所述步骤（5）中，采用邻苯二甲醛和β-巯基乙醇为衍生化试剂进行柱前衍生；
所述的衍生化试剂配制：将OPA（邻苯二甲醛）50mg，β-MCE（β-巯基乙醇）40μL溶于5.0ml甲醇中，加入pH为10.4的0.4mol/L硼酸缓冲液10ml；
所述液相色谱法的测定条件为：色谱柱为反相C18柱；检测波长为338nm；色谱柱温度为室温；流动相A和流动相B按比例混合均匀，其中流动相A所占比例为30～70%，使用前经微孔滤膜过滤，超声波脱气后使用；流动相流速为0.5～1.5mL/min；进样量10～20μl；
所述的流动相A为10ml冰醋酸，15g醋酸钠，50ml四氢呋喃，超纯水定容至1000ml，调节pH至4.7；
流动相B为乙腈。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，红曲样品加到10～30倍体积超纯水中，超声提取1～4h；所述提取和分离步骤重复2～5次，合并上清液。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，上清液加入1～2倍体积的乙醇和1/5～1/10体积的5wt%～10wt%无机盐溶液，在-10℃～4℃静置处理10～30min。
4.根据权利要求3所述的高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于：所述无机盐为醋酸钾、醋酸铵或硫酸铵。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，复合酶制剂为蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和果胶酶的混合物；酶处理温度为25～55℃，pH为3.5～9.0，静置处理30～60min。
6.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，层析柱的柱床高为15～20cm，采用0.2～2mol/L的氨水洗脱。
7.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于：所述待检测液中加入1～8倍体积衍生化试剂，避光混合1～5min进行衍生，然后微孔滤膜过滤。
8.根据权利要求1－7任意一项所述的高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于，所述步骤（5）中液相色谱法的测定步骤为：首先采用液相色谱检测一系列具有梯度浓度的γ-氨基丁酸标准溶液，绘制峰面积-浓度标准曲线；再将经柱前衍生化处理的检测液用液相色谱检测，根据峰面积-浓度标准曲线，即可得到红曲样品的γ-氨基丁酸含量。
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