CN115372494B - 一种发酵液中γ-氨基丁酸的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵液中γ‑氨基丁酸的测定方法，包括以下步骤：将发酵液离心，得到第一次上清液；在所述第一次上清液中加入乙腈，离心得到第二次上清液；将第二次上清液通过高效液相三重四极杆串联质谱测定γ‑氨基丁酸。本发明利用高效液相三重四极杆串联质谱仪快速筛选产γ‑氨基丁酸菌株的方法，该方法中样品的前处理简单，特异性强，灵敏度高，检出限低，耗时短，节省了时间成本，利于大量样品的快速检测，提供了一种快速、操作简便的γ‑氨基丁酸测定方法。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种发酵液中γ-氨基丁酸的测定方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)，是分布于哺乳动物、植物和微生物中的非蛋白氨基酸，在生物体内由L-谷氨酸(L-Glu)或L-谷氨酸钠(L-MSG) 经过谷氨酸脱羧酶的作用，脱去一分子羧基而形成。GABA同样作为一种重要的抑制性神经递质，存在于脊椎动物中枢神经系统中，能够起到抑制作用。但年龄增长和精神压力的不断变大会影响人体内谷氨酸转化为GABA，并且当人体缺乏GABA时，会出现焦躁、失眠、疲劳等症状，而通过日常饮食摄入GABA 是补充该功效物质的一种有效方式。
乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一种存在于人类体内的益生菌，广泛应用于食品行业。LAB作为一种食品安全级的微生物，具有谷氨酸脱羧酶 (glutamic aciddecarboxylase，GAD)活性，可以催化L-谷氨酸及其钠盐合成 GABA。因此，挖掘得到一株产GABA的乳酸菌菌株一直是乳酸菌领域的研究热点。
目前，产GABA乳酸菌菌株的筛选和检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法等，但这些方法都存在着缺陷，比如耗时长、灵敏度低、样品前处理方法繁琐等。因此，开发一种简单、快速筛选产GABA乳酸菌菌株的方法一直是GABA研究的重点，并将其开发应用到食品有待进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种发酵液中γ-氨基丁酸的测定方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种发酵液中γ-氨基丁酸的测定方法，包括以下步骤：
(1)将发酵液离心，得到第一次上清液；
(2)在所述第一次上清液中加入乙腈，离心得到第二次上清液；
(3)将第二次上清液通过高效液相三重四极杆串联质谱测定γ-氨基丁酸。
本发明中样品前处理简单，通过利用高效液相三重四极杆串联质谱仪快速筛选产γ-氨基丁酸菌株，利于大量样品的检测。
作为优选，步骤(1)中，离心时间为5-10min，离心转速为8000-10000rpm。
作为优选，步骤(2)中，所述乙腈和上清液体积比例为1～3：1。
作为优选，步骤(2)中，所述离心温度为4℃，离心时间为10～20min，离心转速为10000～15000rpm。
作为优选，所述高效液相三重四极杆串联质谱测定的条件为：
ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(3.0×100mm，1.8μm)，进样量1μL，流动相A相：0.01％甲酸+2mM甲酸铵水溶液，B相：0.01％甲酸+2mM甲酸铵甲醇溶液；
采用以下梯度：
95％A：0.0-1.0min，95-10％A：1.0-4.0min，10％A：4.0-6.0min，10-95％A： 6.0-6.1min，95％A：6.1-8.0min。总运行时间为8min，流速为0.40mL/min。
本发明中的检测方法可以适用于多种发酵液的检测，作为优选，所述发酵液由短乳杆菌接种于培养基中发酵得到，所述短乳杆菌分类命名为Lactobacillus brevis，菌株号为YSJ-3，已于2021年8月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23307。
作为优选，所述培养基为MRSG肉汤培养基，所述发酵条件为：培养温度 37℃，培养时间为48h。
本发明从野生蘑菇中分离得到一株产γ-氨基丁酸的短乳杆菌YSJ-3，经过上述方法检测，在MRSG肉汤培养基中γ-氨基丁酸含量达1.30mg/mL，本发明拓展了产γ-氨基丁酸的乳酸菌菌株来源，为以后乳酸菌，γ-氨基丁酸的工业化生产和应用奠定了基础。
作为优选，所述培养基由胡萝卜汁以及加入所述胡萝卜汁中的配料混合而成，所述配料包括L-谷氨酸钠、牛肉粉以及葡萄糖；所述发酵条件为：培养温度37℃，培养时间为48h。
短乳杆菌YSJ-3在以胡萝卜汁为主的培养基里发酵，经过上述方法检测，可以大大提高γ-氨基丁酸的产量，γ-氨基丁酸含量大于2.0mg/mL，并且得到的胡萝卜发酵液可制备得到一种新型的富含γ-氨基丁酸的发酵胡萝卜汁，可以为富含γ-氨基丁酸的食品的发展奠定基础。
本发明中配料的配比对于γ-氨基丁酸产量也有着不同的影响，作为优选，所述L-谷氨酸钠、牛肉粉和葡萄糖在所述胡萝卜汁中的质量百分比分别为 0.3～0.7％、0.3～0.7％和3.0～7.0％。
作为进一步优选，所述L-谷氨酸钠、牛肉粉和葡萄糖在所述胡萝卜汁中的质量百分比分别为0.5％、0.5％和5％。
本发明与现有技术相比的有益效果是：
本发明利用高效液相三重四极杆串联质谱仪快速筛选产γ-氨基丁酸菌株的方法，该方法中样品的前处理简单，特异性强，灵敏度高，检出限低，耗时短，节省了时间成本，利于大量样品的快速检测，提供了一种快速、操作简便的γ- 氨基丁酸测定方法。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中LC-MS/MS测定短乳杆菌YSJ-3发酵液中γ-氨基丁酸峰图。
图2为实施例1中LC-MS/MS测定γ-氨基丁酸的标准曲线
图3为短乳杆菌YSJ-3划线分离图。
图4为短乳杆菌YSJ-3革兰氏染色结果图。
图5为实施例2中LC-MS/MS测定短乳杆菌YSJ-3发酵胡萝卜汁中γ-氨基丁酸峰图。
图6为短乳杆菌YSJ-3的进化树。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例为一种发酵液中γ-氨基丁酸的测定方法，包括以下步骤：
将短乳杆菌YSJ-3接种于培养基中，发酵得到发酵液，具体地，将短乳杆菌YSJ-3接种于MRSG肉汤培养基中发酵，其中，短乳杆菌菌液与MRSG肉汤培养基的体积比为2.0％，其中，所述短乳杆菌菌液的浓度为2×107CFU/mL，培养温度为37℃，培养时间为48h；
其中短乳杆菌YSJ-3从蘑菇的发酵食品中分离得到，短乳杆菌YSJ-3的鉴定如下：
通过蘑菇的发酵食品获得菌样品，将菌样品稀释后接种到MRS固体培养基上，选择合适长势较好的平板，挑取菌落培养，通过划线分离的方式分离出单菌落，见图3，观察长势，发现菌落多为乳白色，圆形，形状规则，不透明，边缘整齐，略突起，正反面颜色一致，中央与边缘颜色一致。
本菌株进行革兰氏染色，油镜下观察细胞的颜色及形态特征，结果为革兰氏阳性菌，形态为短杆状，结果见图4。
根据其生理生化特性及16S rDNA序列((如SEQ ID No.1所示)分析的结果，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)鉴定为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)YSJ-3菌株，并进行保藏，保藏编号为CGMCC No.23307；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
对上述得到的含有γ-氨基丁酸的发酵液进行测定，利用高效液相三重四极杆串联质谱仪对离心得到的短乳杆菌YSJ-3的发酵液进行检测，具体如下：
首先，将短乳杆菌YSJ-3的发酵液在8000rpm下离心5min，去除菌体，取上清液。按乙腈和上清液按照体积比例为2：1进行涡旋混匀，于4℃，12000rpm 下离心15min，取上清液。
其次，将上清液用超纯水稀释1000倍，得到待测样品溶液。
最后，使用LC-MS/MS检测待测样品溶液中的γ-氨基丁酸浓度，其保留时间为1.06min，LC-MS/MS色谱图见图1。所用液质方法的条件为：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(3.0×100mm，1.8μm)，进样量1μL，流动相A相： 0.01％甲酸+2mM甲酸铵水溶液，B相：0.01％甲酸+2mM甲酸铵甲醇溶液。采用以下梯度：95％A：0.0-1.0min，95-10％A：1.0-4.0min，10％A：4.0-6.0min， 10-95％A：6.0-6.1min，95％A：6.1-8.0min。总运行时间为8min，流速为0.40 mL/min。质谱采用多反应监测(MRM)进行，MRM的设置见表1。使用SCIEXOS 1.7.0进行数据采集和分析。在此基础上，建立γ-氨基丁酸的标准曲线，y＝3655.62378x+6.91022(r＝0.99955,r2＝0.99909)，见图2。
表1高效液相三重四极杆串联质谱仪MRM设置参数
分别间隔48h进行了三次批次的制备，经检测后发酵液中γ-氨基丁酸含量分别为1.32mg/mL，1.35mg/mL，1.31mg/mL。本实施例中三批发酵实验得到的γ-氨基丁酸产量高，并且产量稳定。
实施例2
本实施例为一种发酵胡萝卜汁中γ-氨基丁酸的测定方法，包括以下步骤：
(1)胡萝卜汁的制备：
将新鲜的胡萝卜清洗、分块后，于蒸锅中蒸熟，按料液比为1:3添加纯净水于榨汁机中打浆，用200mm的标准分样筛过滤，得到胡萝卜汁。
(2)配料：
在步骤(1)胡萝卜汁中按质量比添加质量比为0.5％的L-谷氨酸钠，0.5％的牛肉粉和5.0％的葡萄糖，搅拌溶解后，用柠檬酸调pH值为4.4左右。
(3)杀菌，冷却，接种，发酵：
将混匀后的胡萝卜汁在121℃高压灭菌15min，冷却至室温，在无菌操作的条件下，按体积比为8.0％添加YSJ-3菌液，涡旋混匀，培养温度为37℃下，培养时间为48小时。
对本实施例中得到的发酵胡萝卜汁中γ-氨基丁酸进行测定，具体如下：
首先，将发酵胡萝卜汁在8000rpm下离心5min，去除菌体，取上清液。
然后，按乙腈和上清液体积比例为2：1进行涡旋混匀，于4℃，12000rpm 下离心15min，取上清液，得到待测样品溶液。
最后，使用LC-MS/MS检测待测样品溶液中的γ-氨基丁酸浓度，其保留时间为1.06min，LC-MS/MS色谱图见图5。所用液质方法的条件为：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(3.0×100mm，1.8μm)，进样量1μL，流动相A相： 0.01％甲酸+2mM甲酸铵水溶液，B相：0.01％甲酸+2mM甲酸铵甲醇溶液。采用以下梯度：95％A：0.0-1.0min，95-10％A：1.0-4.0min，10％A：4.0-6.0min， 10-95％A：6.0-6.1min，95％A：6.1-8.0min。总运行时间为8min，流速为0.40 mL/min。质谱采用多反应监测(MRM)进行，MRM的设置见表1。使用SCIEXOS 1.7.0进行数据采集和分析。
分别间隔48h进行了三次批次的制备，经检测后发酵胡萝卜汁中γ-氨基丁酸含量分别为2.21mg/mL，2.17mg/mL，2.25mg/mL，γ-氨基丁酸产量高，相比于未发酵胡萝卜汁中γ-氨基丁酸含量提高了98％，并且产量稳定。目前发酵果蔬汁中γ-氨基丁酸一般低于1.2mg/mL,而本方法制备的发酵胡萝卜果蔬汁中γ-氨基丁酸不低于2mg/mL，是一种高富含γ-氨基丁酸的发酵果蔬汁。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
中国海洋大学
<120> 一种发酵液中γ-氨基丁酸的测定方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1465
<212> DNA
<213> 短乳杆菌(Lactobacillus brevis)
<400> 1
catctcctgt cccttagacg gctgactccc gaaggttatc tcaccggctt tgggtgttac 60
aaactctcat ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat 120
gctgatccgc gattactagc gattccaact tcatgtaggc gagttgcagc ctacaatccg 180
aactgagaac ggctttaaga gattagctta gcctcacgac ttcgcaactc gttgtaccgt 240
ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca 300
ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtctca ccagagtgcc caactgaatg ctggcaactg 360
ataataaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga 420
caaccatgca ccacctgtca ttctgtcccc gaagggaacg tcttatctct aagattggca 480
gaagatgtca agacctggta aggttcttcg cgtagcttcg aattaaacca catgctccac 540
cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg agtttcaacc ttgcggtcgt actccccagg 600
cggagtgctt aatgcgttag ctgcagcact gaagggcgga aaccctccaa cacttagcac 660
tcatcgttta cggcatggac taccagggta tctaatcctg ttcgctaccc atgctttcga 720
gcctcagcgt cagttacaga ctagacagcc gccttcgcca ctggtgttct tccatatatc 780
tacgcattcc accgctacac atggagttcc actgtcctct tctgcactca agtctcccag 840
tttccgatgc acttctccgg ttaagccgaa ggctttcaca tcagacttaa aaaaccgcct 900
gcgctcgctt tacgcccaat aaatccggac aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct 960
gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg ttaaataccg tcaacccttg aacagttact 1020
ctcaaaggtg ttcttcttta acaacagagt tttacgagcc gaaacccttc ttcactcacg 1080
cggcattgct ccatcagact ttcgtccatt gtggaagatt ccctactgct gcctcccgta 1140
ggagtttggg ccgtgtctca gtcccaatgt ggccgattac cctctcaggt cggctacgta 1200
tcatcgtctt ggtgggcctt tacctcacca actaactaat acgccgcggg atcatccaga 1260
agtgatagcc gaagccacct ttcaaacaaa atccatgcgg attttgttgt tatacggtat 1320
tagcacctgt ttccaagtgt tatcccctgc ttctgggcag atttcccacg tgttactcac 1380
cagttcgcca ctcgcttcat tgttgaaatc agtgcaagca cgtcattcaa cggaagctcg 1440
ttcgactgca gtatagcagc cgcaa 1465
Claims (4)
1.一种发酵液中γ-氨基丁酸的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将发酵液离心，得到第一次上清液；
（2）在所述第一次上清液中加入乙腈，离心得到第二次上清液；
（3）将第二次上清液通过高效液相三重四极杆串联质谱测定γ-氨基丁酸；
其中，所述发酵液由短乳杆菌接种于培养基中发酵得到，所述培养基由胡萝卜汁以及加入所述胡萝卜汁中的配料混合而成，所述配料包括L-谷氨酸钠、牛肉粉以及葡萄糖；所述发酵条件为：培养温度37℃，培养时间为48h；
所述L-谷氨酸钠、牛肉粉和葡萄糖在所述胡萝卜汁中的质量百分比分别为0.3~0.7%、0.3~0.7%和3.0~7.0%；
所述高效液相三重四极杆串联质谱测定的条件为：
ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱 ：3.0×100mm，1.8μm，进样量1μL，流动相A相：0.01%甲酸+2 mM甲酸铵水溶液，B相：0.01%甲酸+2 mM甲酸铵甲醇溶液；
采用以下梯度：
95%A：0.0-1.0min，95-10%A：1.0-4.0min，10%A：4.0-6.0min，10-95%A：6.0-6.1min，95%A：6.1-8.0min；总运行时间为8min，流速为0.40mL/min；
所述短乳杆菌分类命名为Lactobacillus brevis，菌株号为YSJ-3，已于2021年8月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23307。
2.如权利要求1所述的发酵液中γ-氨基丁酸的测定方法，其特征在于，步骤（1）中，离心时间为5-10min，离心转速为8000-10000rpm。
3.如权利要求1所述的发酵液中γ-氨基丁酸的测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乙腈和上清液体积比例为1~3：1。
4.如权利要求1所述的发酵液中γ-氨基丁酸的测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述离心温度为4℃，离心时间为10~20min，离心转速为10000~15000rpm。
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