CN113106052A - 一种提升短双歧杆菌增殖效率的肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提升短双歧杆菌增殖效率的肽及其应用，属于微生物技术领域。本发明为解决因氮源利用率低影响短双歧杆菌增殖的问题，提供了一种提升短双歧杆菌增殖效率的方法，该方法以脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽作为培养基的氮源培养短双歧杆菌。利用该方法培养短双歧杆菌，4g/L氮源培养浓度下发酵液OD600高于2.6，为其他氮源的1.7～2.5倍，代时小于2.1h，氮源利用率高于35％。该方法在实现高效促进菌株生长的同时，显著提高氮源利用效率，有效减少氮源的浪费。

Description

一种提升短双歧杆菌增殖效率的肽及其应用
技术领域
本发明涉及一种提升短双歧杆菌增殖效率的肽及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
双歧杆菌(Bifidobacteria)是一类非常重要且被广泛认可的益生菌，具有调节肠道菌群，防治便秘及胃肠障碍；降低胆固醇；延缓机体衰老以及抗肿瘤等作用。鉴于其具有上述有效的益生功能，双歧杆菌也越来越成为人们研究、开发、生产的重点，也被逐渐应用到益生菌乳制品生产中。但是目前商业化应用的双歧杆菌菌株种类较少，主要在于双歧杆菌的制备非常困难，氮源是制约其有效增殖的关键因素之一。
关于双歧杆菌生长限制因子的研究表明，氮源是制约其生长的因子，而非葡萄糖。此外，对短双歧杆菌的细胞壁蛋白酶研究发现，其普遍缺失细胞壁蛋白酶，故而无法直接利用外源蛋白，因此，为满足营养需求，在培养过程中需添加氨基酸、小分子肽等物质。然而目前市售酵母浸粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、鱼骨蛋白胨等多种氮源分子量分布及结构特性差异较大，组分中可被短双歧杆菌利用的肽段含量也有所差异。而目前也是更多的通过单一因素筛选适宜氮源，然而这种方法的添加量往往是过量的，在发酵过程中不被利用的氮源会增加发酵液渗透压，短双歧杆菌的耐渗透压能力较弱，因此将会抑制菌株的最终增殖浓度。
基于上述一系列问题，研究短双歧杆菌选择性利用的肽的分子量和结构，提高氮源中可有效促进短双歧杆菌增殖的肽浓度，定向制备其专用氮源显得尤为重要。因此，亟需找到一种适用于短双歧杆菌高效增殖的肽，以提高在短双歧杆菌生长过程中的氮源的利用率、降低企业生产经济并缩短短双歧杆菌的代时，提高短双歧杆菌活菌数的产量。
发明内容
本发明针对短双歧杆菌培养过程中因氮源利用率低影响短双歧杆菌增殖的问题，提供了一种提升短双歧杆菌增殖效率的方法，所述方法用脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽培养短双歧杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽作为培养基的氮源。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2、酵母浸出粉、胡萝卜汁。
本发明还提供了一种提升短双歧杆菌氮源利用率的方法，所述方法用脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽培养短双歧杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽作为培养基的氮源。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2、酵母浸出粉、胡萝卜汁。
本发明还提供了脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽的制备方法，具体步骤如下：
(1)将酪蛋白与水混匀后，加入蛋白酶，进行酶解，经灭酶处理后，沉淀未水解蛋白并离心收集蛋白酶解液，对蛋白酶解液真空冷冻干燥得到酪蛋白酶解物干粉；
(2)将酪蛋白酶解物干粉溶于水后，用截流量为2000Da的滤膜进行超滤处理并收集滤液；
(3)采用NAK-II大孔树脂对步骤(2)获得的滤液浓缩富集，最后采用纳滤膜收集分子量介于200～800Da的组分，即得分子量为200～800Da的肽。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中酪蛋白浓度为65～75g/L；酪蛋白酶解在恒温pH下进行，酶解温度为45～50℃，pH为6.5～7，酶解时间为4～4.5h；所述蛋白酶选用胰蛋白酶，添加量为3500～4000U/g pro。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中酪蛋白浓度为70g/L，酪蛋白酶解在恒温恒pH下进行，温度为50℃，pH为7，酶解时间为4h，所述蛋白酶选用胰蛋白酶，添加量为4000U/g pro。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)对于酶解完成的酪蛋白水解物，采用沸水浴10min进行灭酶处理，并将pH调整至4.6沉淀未水解物的蛋白，并8000r/min，15min离心取上清。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)对酪蛋白肽混合组分进行NAK-II大孔树脂分离时，洗脱液依次选用浓度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80％(v/v)的乙醇，流速为1.5mL/min，检测波长为220nm。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)利用截流量为200Da和800Da的纳滤膜收集分子量介于200～800Da的组分。
在本发明的一种实施方式中，所述的短双歧杆菌菌液的制备方法是通过将短双歧杆菌接种至培养基中进行培养，接种量为2％。
在本发明的一种实施方式中，测定不同氮源对短双歧杆菌的增殖效果时，氮源的添加量为4g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述的短双歧杆菌最高生长量的测定是将短双歧杆菌接种至培养基中培养至对数期末期并测定OD600。
在本发明的一种实施方式中，所述的短双歧杆菌包括短双歧杆菌CGMCCNO.11828、短双歧杆菌GDMCC NO:60459、短双歧杆菌GDMCC NO:60605。
本发明还提供了一种培养基，所述培养基中的氮源为脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2、酵母浸出粉、胡萝卜汁。
本发明还提供了上述提升短双歧杆菌增殖效率的方法、提升短双歧杆菌氮源利用率的方法、脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽的制备方法和上述培养基在培养短双歧杆菌中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种提升短双歧杆菌增殖效率的方法，是利用以脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽为氮源的培养基培养短双歧杆菌。利用该方法培养短双歧杆菌时，4g/L氮源培养浓度下短双歧杆菌OD600高于2.6，显著高于其他氮源，OD600为其他氮源的1.7～2.5倍；与其他氮源相比代时显著缩短，小于2.1h。
本发明中，依据短双歧杆菌利用肽的分子量及结构特性，结合酶解技术、超滤、纳滤以及NAK-II大孔树脂分离技术，依次对肽组分进行区分浓缩，获得了适宜短双歧杆菌高效增殖的肽，以所述肽为氮源的培养基培养短双歧杆菌，可使氮源利用率达35％以上(其他氮源的利用率仅在10％以下)，有效提高了氮源的利用效率，有效减少氮源的浪费。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的酪蛋白购自于创赛生物科技有限公司；下述实施例中涉及的风味蛋白酶购自于江苏博美达科技有限公司；下述实施例中涉及的酵母浸粉FM888、胰酪蛋白胨、牛骨蛋白胨、大豆蛋白胨购自于安琪酵母股份有限公司；下述实施例中涉及的磷酸钾、2-脱氧葡萄糖、葡萄糖购自于国药化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的短双歧杆菌CCFM683保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.11828，公开于申请号为201610547034.1的专利中；
短双歧杆菌CCFM1026保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:60459，公开于申请号为PCT/CN2019/082656的专利中；
短双歧杆菌CCFM1049保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:60605，公开于申请号为2019104631547的专利中。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS-L液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐1g/L。
固体MRS-L培养基：在液体MRS-L培养基成分的基础上，添加1.5％的琼脂粉，115℃、20min高压灭菌。灭菌冷却至50～60℃后，向培养基中加入0.1％的莫匹罗星，混匀后，按每个培养皿15mL倒入培养基，待其凝固后采用保鲜膜包裹保藏于4℃冰箱中备用。
基础培养基：无水葡萄糖30g/L，无水乙酸钠4g/L，KH2PO4、K2HPO4均为2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO4·4H2O 0.005g/L，FeSO4 0.02g/L，柠檬酸氢二铵1g/L，吐温1mL/L，半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，胡萝卜汁添加量为15％，酵母浸出粉5g/L，pH为6.5，115℃、20min高压灭菌。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
发酵液中氮含量的测定方法：采用凯氏定氮法测定，具体可见参考文献：林艺华.硫酸蒽酮法测定风柜斗草粗多糖含量[J].福建分析测试,2017,26(06):52-55.。
实施例1：可提升短双歧杆菌增殖效率的肽的定向制备方法
本实施例中，通过实验鉴定可被短双歧杆菌利用的肽，总结其规律及肽的特征，制备获得可提升短双歧杆菌增殖效率的肽。本实施例中选用的短双歧杆菌分别为短双歧杆菌CGMCC NO.11828、短双歧杆菌GDMCC NO:60459、短双歧杆菌GDMCC NO:60605。
具体操作如下：
(1)将冷藏于-80℃的保菌管取出，待其融化后，用接种环蘸取少量菌液于MRS-L固体培养基上划线，于厌氧工作站中37℃恒温培养48h。待其长出菌落后，挑取单菌落接种于5mL MRS-L液体管中，厌氧培养18h～24h，按上述操作重复2～3次得到活化的菌液。
(2)将酪蛋白以70g/L的浓度与水混合，加入胰蛋白酶(添加量为4000U/g pro)，pH调整为7，温度为50℃恒温恒pH酶解4小时，酶解完成后，沸水浴10min进行灭酶处理，pH调整为4.6，沉淀未水解的酪蛋白，8000r/min，15min离心取上清，冻干后收集菌粉备用。
(3)将制备得到的胰蛋白4小时水解物，采用截留分子量为2000Da的膜进行超滤处理，除去大分子蛋白及多肽，收集分子量小于2000Da的组分A，经旋蒸浓缩后冻干备用。
(4)采用肽转运实验测定A中可对三株短双歧杆菌有效转运的肽段。主要操作如下：离心去除培养基，收集菌泥，用100mM的磷酸钾(含5mM MgSO4)的缓冲溶液A洗涤细胞两次并重悬至A660≈25。为了使细胞断电并消耗掉细胞内的氨基酸和肽，将洗涤后的细胞采用20mM 2-脱氧葡萄糖溶液在30℃条件下培养30min。断电结束后，用缓冲液A将细胞洗涤两次并重悬至A660≈50，随后用含有0.5％的葡萄糖的缓冲液A将细胞悬液稀释至A660≈15，并在30℃条件下预充电3min，预充电结束后，加入适宜浓度的肽段启动肽转运实验，分别收集转运前后培养基各2mL，经0.22μm滤膜去除菌体。通过nanoLC-MS/MS技术进行肽段分子量及结构测定，通过转运前后对比确定被短双歧杆菌转运的肽段。分析可被三株短双歧杆菌转运肽段的主要特征(检测结果见表1)。由表1可以看出被菌株高效转运的肽段主要为分子量介于200～800Da的亲水性肽；对转运肽的氨基酸组成分析发现主要含脯氨酸，对肽段中脯氨酸占比的计算表明脯氨酸含量主要介于17％～21％。
综上可知，被短双歧杆菌高效转运的肽段主要为脯氨酸含量达介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽。
表1短双歧杆菌转运肽特征分析
Figure BDA0003092419100000051
(5)基于上述分析，制备提升短双歧杆菌增殖效率的肽，选取步骤(3)收集到的组分A进行后续制备，主要操作如下：
配制浓度为50mg/mL的组分A溶液，利用5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80％(v/v)浓度的乙醇对溶液A进行NAK-II大孔树脂分离，根据组分亲疏水性进行分离洗脱，收集洗脱液并冷冻干燥收集。得到3个组分B1(5～20％)、B2(25～50％)、B3(55～80％)，收集分离组分B1。
(6)对于(5)中收集到的B1组分，选用截流量分别为200Da、800Da的纳滤膜对该组份进行分离处理，收集组分C(200～800Da)，真空冷冻干燥收集干粉。采用液质检测技术，测定组分C中肽段结构，结果表明组分C中肽段中脯氨酸含量占比达到18％。
实施例2：适宜短双歧杆菌高效增殖的肽的应用
本实施例中选用的短双歧杆菌分别为短双歧杆菌CGMCC NO.11828、短双歧杆菌GDMCC NO:60459、短双歧杆菌GDMCC NO:60605。
利用实施例1中制备得到的肽组分C培养三株短双歧杆菌，测定菌株在该组分下的最高生物量、生长代时及氮源利用率。
(1)将实施例1中制备得到的肽组分C以4g/L的浓度添加至基础培养基中，分别培养三株短双歧杆菌，以2％接种量接种活化好的菌液，每隔2h测定OD600及pH值，测定该培养条件下短双歧杆菌的生长曲线，测定菌株在该组分下的最高生物量；在对数期内，按式(A)计算短双歧杆菌的生长代时，其中G表示短双歧杆菌的生长代时，A0表示进入对数生长期时菌株的初始吸光度，At表示t时刻发酵液的吸光度。
Figure BDA0003092419100000061
(2)通过凯氏定氮法测定发酵前后氮含量，计算发酵前后氮源利用率。
检测结果见表2，由结果可知，用实施例1制备得到的组分C培养短双歧杆菌时增殖效果较好，最终发酵液OD600均高于2.60，且氮源利用率均高于35％，代时均小于2.1h，可见，在利用组分C增殖时，生长效果佳且氮源利用率高。
表2短双歧杆菌利用实施例1中制备的肽组分C的增殖情况
Figure BDA0003092419100000062
对比例1
将实施例2中的肽组分C替换成酵母浸粉FM888，分别培养三株短双歧杆菌，并测定菌株在该组分下的最高生物量、生长代时以及氮源利用率。
检测结果见表3，由结果可知，三株短双歧杆菌以酵母浸粉FM888为氮源增殖时，发酵液OD600均小于1.5，氮源利用率均小于10％，生长代时均大于2.6h，相比较于实施例2，增殖效果较差，且氮源利用率低。
表3短双歧杆菌利用酵母浸粉FM888的增殖情况
Figure BDA0003092419100000063
对比例2
将实施例2中的肽组分C替换成胰酪蛋白胨分别培养三株短双歧杆菌，并测定菌株在该组分下的最高生物量、生长代时以及氮源利用率。
检测结果见表4，由结果可知，三株短双歧杆菌胰酪蛋白胨为氮源增殖时，发酵液液OD600均小于1.60，氮源利用率均小于10％，生长代时均大于2.6h，相比较于实施例2，增殖效果较差，且氮源利用率低。
表4短双歧杆菌利用胰酪蛋白胨的增殖情况
Figure BDA0003092419100000071
对比例3
将实施例2中的肽组分C替换成大豆蛋白胨分别培养三株短双歧杆菌，并测定菌株在该组分下的最高生物量、生长代时以及氮源利用率。
检测结果见表5，由结果可知，三株短双歧杆菌以大豆蛋白胨蛋白胨为氮源增殖时，发酵液液OD600均小于1.3，氮源利用率均小于10％，生长代时均大于2.8h，相比较于实施例2，增殖效果较差，且氮源利用率较低。
表5短双歧杆菌利用大豆蛋白胨的增殖情况
Figure BDA0003092419100000072
对比例4
将实施例2中的肽组分C替换成牛骨蛋白胨分别培养三株短双歧杆菌，并测定菌株在该组分下的最高生物量、生长代时以及氮源利用率。
检测结果见表6，由结果可知，三株短双歧杆菌以牛骨蛋白胨为氮源增殖时，发酵液OD600均小于1.6，氮源利用率均小于10％，生长代时均大于2.6h，相比较于实施例2，增殖效果较差，且氮源利用率较低。
表6短双歧杆菌利用牛骨蛋白胨的增殖情况
Figure BDA0003092419100000073
虽然本发明已在较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提升短双歧杆菌增殖效率的方法，其特征在于，用脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽培养短双歧杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽作为培养基的氮源。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2、酵母浸出粉、胡萝卜汁。
4.一种提升短双歧杆菌氮源利用率的方法，其特征在于，用脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽培养短双歧杆菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽作为培养基的氮源。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2、酵母浸出粉、胡萝卜汁。
7.根据权利要求1-6任一所述方法，其特征在于，所述脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽的制备方法如下：
(1)将酪蛋白与水混匀后，加入蛋白酶，进行酶解，经灭酶处理后，沉淀未水解蛋白并离心收集蛋白酶解液，对蛋白酶解液真空冷冻干燥得到酪蛋白酶解物干粉；
(2)将酪蛋白酶解物干粉溶于水后，用截流量为2000Da的滤膜进行超滤处理并收集滤液；
(3)采用NAK-II大孔树脂对步骤(2)获得的滤液浓缩富集，最后采用纳滤膜收集分子量介于200～800Da的组分，即得分子量为200～800Da的肽。
8.一种培养基，其特征在于，所述培养基中的氮源为脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽。
9.根据权利要求8所述的培养基，其特征在于，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2、酵母浸出粉、胡萝卜汁。
10.权利要求1-7任一所述的方法、或权利要求8或9所述的培养基在培养短双歧杆菌中的应用。
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