CN111748512A - 一种适用于青春双歧杆菌高效增殖的氮源及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适用于青春双歧杆菌高效增殖的氮源及其应用，属于微生物技术领域。本发明的方法先获得青春双歧杆菌最适生长氮源组成，再采用超滤冷冻干燥制备青春双歧杆菌特定氮源，所述氮源由分子量500～2000Da的分子肽组成。将青春双歧杆菌添加至以此氮源为唯一氮源的培养体系中，可显著提高青春双歧杆菌对氮源的利用率与生长速率，发酵液中青春双歧杆菌活菌数高；使得青春双歧杆菌利用单位质量特定氮源活菌数不低于3.0×108CFU/mL，提高了至少1倍。有利于青春双歧杆菌产业化培养，从而提升产业效益。

Description

一种适用于青春双歧杆菌高效增殖的氮源及其应用
技术领域
本发明涉及一种适用于青春双歧杆菌高效增殖的氮源及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
青春双歧杆菌是人体肠道内典型的有益细菌，它的生长繁殖贯穿在人的整个生命历程中。双歧杆菌可抑制和杀死肠道病原菌，使菌群保持正常平衡。若食用青春双歧杆菌发酵的乳制品，青春双歧杆菌可进入肠道内迅速发挥作用，减少因肠道紊乱引起的消化系统病症；青春双歧杆菌能分解N一亚硝胺，产生具有抗肿瘤特性的胞外多糖；可分泌双皮杆菌素和类溶菌物质，提高巨噬细胞的吞噬能力，增强人体免疫抗病力。正因如此，青春双歧杆菌发酵剂广泛应用于生物医药、食品、养殖等行业。高效增值是发酵剂制备的关键，因此青春双歧杆菌高密度培养逐步成为人们研究、开发、生产的重点。
氮源是制约乳酸菌高密度培养的关键因素，微生物细胞生长代谢和产物合成都需要氮源。氮源主要用于合成菌体细胞物质和含氮代谢物。青春双歧杆菌对不同氮源的利用效果不同，对微生物类氮源的利用效果好，对其他种类蛋白利用程度较差；青春双歧杆菌利用氮源的特征不同，培养基中氮源没有被完全利用，氮源中某些物质仍残留在培养基中未被利用，限制了青春双歧杆菌高密度生长。培养基中氮源利用程度低，增加培养基的环境渗透压，进而导致产品中的活菌数较低，很容易就会死亡，活菌数稳定性不高。
为了获得青春双歧杆菌的高效增殖，获得高浓度的青春双歧杆菌细胞，寻找一种适合青春双歧杆菌生长繁殖的氮源至关重要。因此，急需找到一种适用于青春双歧杆菌高效增殖的氮源制备方法，以提高在青春双歧杆菌生长过程中的氮源的利用率、降低企业生产经济并提高青春双歧杆菌活菌数的产量。
发明内容
为解决本发明的技术问题，本发明根据青春双歧杆菌在不同氮源的培养基中，根据对不同分子量的氮源的利用情况，找到最适合于菌株生长的分子肽，并将其加入培养基中，培养青春双歧杆菌，菌株在此培养基中，生长速率显著提升，有利于菌株在生产中的应用。
本发明提供了制备分子肽的方法，所述分子肽的分子量为500～2000Da。
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法是动物蛋白在水解酶作用下水解形成多肽水解液，灭酶后进行超滤后收集各分子量的滤液，将滤液冷冻干燥制成所述分子肽的冻干粉末。
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法中制备原料为动物蛋白，蛋白质量浓度为20～60g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法中水解酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶，水解酶在水解体系中的酶活均为3000～5000U/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法中水解条件为30～60℃、时间0.5～8h、pH为6.0～8.0。
在本发明的一种实施方式中，将水解后的水解液在80～95℃灭酶、时间20～30min。
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法中超滤为分级超滤，分为10000Da、5000Da、2000、500Da的超滤膜。
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法中冷冻干燥条件为温度-30～-50℃、时间6～20h、真空度为50～200μbar。
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法中超滤条件为压力0.02～1.8MPa、温度20～45℃、pH值4.0～9.0。
本发明提供了分子肽在提高青春双歧杆菌生长速率中的应用，所述分子肽分子量为500～2000Da。
在本发明的一种实施方式中，所述分子肽为培养基的氮源。
在本发明的一种实施方式中，青春双歧杆菌生长体系中还含有葡萄糖、金属离子、磷酸盐、半胱氨酸盐酸盐。
在本发明的一种实施方式中，金属离子优选为镁离子。
在本发明的一种实施方式中，所述镁离子以硫酸镁的形式添加至培养体系中，所述硫酸镁为MgSO2·7H2O，浓度为0.02～0.25g/L。
本发明还提供了一种培养基，培养基中的氮源为分子量500～2000Da的分子肽。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基中还含有葡萄糖、金属离子、磷酸盐、半胱氨酸酸盐。
在本发明的一种实施方式中，所述金属离子优选为镁离子。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的镁离子以硫酸镁的形式添加至培养基中，所述硫酸镁为MgSO2·7H2O，浓度为0.02～0.25g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的磷酸盐为Na2HPO2和K2HPO2，浓度分别为2～20g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基中含有葡萄糖5～10g/L，磷酸氢二钾8～12g/L，磷酸氢二钠8～12g/L，MgSO2·7H2O0.2～0.25g/L和半胱氨酸盐酸盐1～5g/L。
本发明还提供一种提高青春双歧杆菌生长速率的方法，其特征在于，将青春双歧杆菌在以分子量500～2000Da的小分子肽为氮源的体系中培养。
在本发明的一种实施方式中，将青春双歧杆菌在30～37℃、pH 5.0～6.5下厌氧培养。
本发明提供了一种提升青春双歧杆菌单位增殖率的方法，所述培养体系中的氮源为分子量500～2000Da的分子肽。
在本发明的一种实施方式中，所述培养体系还含有葡萄糖、金属离子、磷酸盐、半胱氨酸盐酸盐。
在本发明的一种实施方式中，金属离子优选为镁离子。
在本发明的一种实施方式中，所述镁离子以硫酸镁的形式添加至培养体系中，所述硫酸镁为MgSO2·7H2O，浓度为0.02～0.25g/L。
本发明还提供了一种高密度培养青春双歧杆菌的方法，将青春双歧杆菌接种至氮源为分子量500～2000Da的分子肽的培养体系中，进行培养。
在本发明的一种实施方式中，所述分子肽的添加量为1～5g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述青春双歧杆菌在培养体系中的浓度不低于2.5×108CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的成分包含葡萄糖、硫酸锰、磷酸盐、半胱氨酸盐酸盐。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的硫酸镁为MgSO2·7H2O，浓度为0.02～0.25g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的磷酸盐有K2HPO2、Na2HPO2，浓度分别为2～20g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述培养条件为30～37℃、时间20～26h、pH为5.0～6.5。
本发明还保护所述制备分子肽的方法，或提高青春双歧杆菌生长速率的方法，提升青春双歧杆菌单位增殖率的方法在培养青春双歧杆菌中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种适用于青春双歧杆菌生长繁殖的氮源，所述氮源由分子量500～2000Da的分子肽组成；将青春双歧杆菌添加至以此氮源为唯一氮源的培养体系中，可显著提高青春双歧杆菌对氮源的利用率与生长速率，并且能够实现高密度培养，单位质量氮源可使青春双歧杆菌活菌数不低于3.0×108CFU/mL，单位质量氮源增殖效果提高1倍，有利于青春双歧杆菌产业化，从而提升产业效益。
具体实施方式
下述实施例中涉及的微生物类氮源购自安琪酵母股份有限公司；下述实施例中涉及其余试剂均购自国药集团。动物蛋白(鱼粉蛋白胨CAS91079-42-4)购自国药集团。
下述实施例中涉及的青春双歧杆菌CCFM1061保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:60706，公开于申请号为CN201910765971.8的专利中；
青春双歧杆菌CCFM1062保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:60707，公开于申请号为CN201910770725.1的专利中。
青春双歧杆菌CCFM1066保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:60702，公开于申请号为CN 201910777578.0的专利中。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
活菌数的检测采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
肽谱与肽含量测定方法采用高效液相色谱；蛋白水解度测定采用OPA法。
实施例1：青春双歧杆菌对不同分子量蛋白肽的利用效果
采用MRS培养基接菌活化青春双歧杆菌，在37℃恒温静置厌氧培养18h，获得种子液用于后续实验。
配制不同氮源培养基：氮源1g/L(分别为酵母提取物、酵母浸粉FM803、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼骨蛋白胨)、葡萄糖6g/L、硫酸镁0.25g/L、硫酸锰0.02g/L、Tween80 2g/L、磷酸盐20g/L、半胱氨酸盐酸盐1g/L。
将菌浓为109CFU/mL的种子液以2mL/100mL的接种量接种至不同氮源培养基中，培养18h。
采用高效液相色谱测定菌株在不同氮源培养基发酵前后肽组成分布，根据其减少量分析出菌株利用的肽段。
通过分析发酵前后各氮源多肽的变化，发现青春双歧杆菌主要利用分子量在2000Da以下的肽，且对500-1000Da的小分子肽利用率最高。
表1青春双歧杆菌CCFM1061发酵前后肽肽谱分析
Figure BDA0002585543650000041
Figure BDA0002585543650000051
表2青春双歧杆菌CCFM1062肽谱分析
Figure BDA0002585543650000052
表3青春双歧杆菌CCFM1066肽谱分析
Figure BDA0002585543650000053
实施例2：青春双歧杆菌CCFM1061在特定氮源中的培养
基于实施例1，制备适合青春双歧杆菌生长繁殖的特定氮源N，所述氮源N的制备方法为：将动物蛋白配制成质量浓度为60g/L的蛋白溶液，调制pH为7.0，在其中加入中性蛋白酶和碱性蛋白酶(酶活比例1:1)，使蛋白溶液中性蛋白酶或碱性蛋白酶活力在4000U/mL，在55℃、pH 6.0，水解2h后，在80℃水浴锅灭酶20min；将水解后得到的水解液通过超滤系统，用截留分子量为10000、5000、2000、500Da的超滤膜分级过滤水解液，操作压力0.1Mpa，操作温度20℃，运行60min，得到4个不同分子量的多肽混合液组分F1(5000～10000Da)、F2(2000～5000Da)、F3(500～2000Da)、F2(<500Da)，收集超滤得到含有500～2000Da小分子肽的超滤液，将滤液进行冷冻干燥，冷冻干燥条件为-50℃，维持2h；接着进行一次干燥，-30℃及200μbar，保持30h；再进行二次干燥，25℃及0μbar，保持20h，得到含有特定氮源N的粉末。
在特定氮源N培养基中，氮源N的添加量为1g/L。
其余培养基中的氮源分别为：酵母提取物1g/L、胰蛋白胨1g/L、大豆蛋白胨1g/L、鱼骨蛋白胨1g/L、水解动物蛋白1g/L、牛肉浸粉1g/L。
除上述氮源外，培养基中还含有：葡萄糖6.0g/L，K2HPO2 10.0g/L，Na2HPO2 10.0g/L，MgSO2·7H2O0.25 g/L，MnSO2·H2O 0.05g/L、半胱氨酸盐酸盐1g/L。
将菌浓为109CFU/mL的种子液以2mL/100mL的接种量接种至不同氮源培养基中，培养18h，比较特定氮源对菌株的增殖效果。
结果如表4所示，培养18h后，菌株在含有氮源N的培养基中活菌数可达到3.27×108CFU/mL，而在以其他物质为氮源的培养基中，活菌数数最高也只能达到1.88×108CFU/mL，因而氮源N能显著促进两期双歧杆菌CCFM1063的生长。
表4青春双歧杆菌CCFM1061利用单位质量氮源的活菌数(108CFU/mL)
Figure BDA0002585543650000061
实施例3：青春双歧杆菌CCFM1062在特定氮源中的培养
具体实施方式参见实施例2，区别在于，将青春双歧杆菌CCFM1062替换为青春双歧杆菌CCFM1061，比较特定氮源对青春双歧杆菌CCFM1062的增殖效果。
结果如表5所示，培养18h后，菌株在含有氮源N的培养基中活菌数可达到3.05×108CFU/mL，而在以其他物质为氮源的培养基中，活菌数数最高也只能达到1.42×108CFU/mL，因而氮源N能显著促进两期双歧杆菌CCFM1062的生长。
表5青春双歧杆菌CCFM1062利用单位质量氮源的活菌数(108CFU/mL)
Figure BDA0002585543650000071
实施例4：青春双歧杆菌CCFM1066在特定氮源中的培养
具体实施方式参见实施例2，区别在于，将青春双歧杆菌CCFM1061替换为青春双歧杆菌CCFM1066，比较特定氮源对青春双歧杆菌CCFM1066的增殖效果。
结果如表6所示，培养18h后，菌株在含有氮源N的培养基中活菌数可达到2.94×108CFU/mL，而在以其他物质为氮源的培养基中，活菌数数最高也只能达到1.90×108CFU/mL，因而氮源N能显著促进青春双歧杆菌CCFM1066的生长。
表6青春双歧杆菌CCFM1066利用单位质量氮源的活菌数(108CFU/mL)
Figure BDA0002585543650000072
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.分子肽在提高青春双歧杆菌生长速率中的应用，其特征在于，所述分子肽的分子量为500～2000Da。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，青春双歧杆菌生长体系中还含有葡萄糖、金属离子、磷酸盐、半胱氨酸盐酸盐。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分子肽作为培养体系中的氮源。
4.一种培养基，其特征在于，培养基中的氮源为分子量500～2000Da的分子肽。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述培养基中还含有葡萄糖、金属离子、磷酸盐、半胱氨酸盐酸盐。
6.一种提升青春双歧杆菌单位增殖率的方法，其特征在于，培养体系中的氮源为分子量500～2000Da的分子肽。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养体系的组分还包括葡萄糖、金属离子、磷酸盐、半胱氨酸盐酸盐。
8.一种提高青春双歧杆菌生长速率的方法，其特征在于，将青春双歧杆菌在以分子量500～2000Da的小分子肽为氮源的体系中培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将青春双歧杆菌在30～37℃、pH 5.0～6.5下培养。
10.权利要求4～5任一所述培养基，或权利要求6～9任一所述方法在培养青春双歧杆菌中的应用。
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