CN114015729A - 植物乳杆菌在制备乳酸菌素、乳酸和苯乳酸中的应用 - Google Patents

植物乳杆菌在制备乳酸菌素、乳酸和苯乳酸中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114015729A
CN114015729A CN202111346294.XA CN202111346294A CN114015729A CN 114015729 A CN114015729 A CN 114015729A CN 202111346294 A CN202111346294 A CN 202111346294A CN 114015729 A CN114015729 A CN 114015729A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactobacillus plantarum
fermentation
lactic acid
lactein
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111346294.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN114015729B (zh
Inventor
邓禹
周胜虎
刘颖颖
贾以泽
毛银
李国辉
赵运英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202111346294.XA priority Critical patent/CN114015729B/zh
Publication of CN114015729A publication Critical patent/CN114015729A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114015729B publication Critical patent/CN114015729B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了植物乳杆菌在制备乳酸菌素、乳酸和苯乳酸中的应用，属于发酵工程技术领域。本发明采用具有高抑菌活性的植物乳杆菌CCTCC No：M 2017138，通过改良MRS培养基配方，优化发酵罐的发酵条件，使乳酸菌发酵48h的代谢产物中乳酸含量达到127.3g/L，乳酸菌素含量达到46.08mg/L。应用该植物乳杆菌CCTCC No：M 2017138结合改良MRS培养基，通过优化发酵罐的发酵条件，使乳酸菌代谢产物中的乳酸菌素、乳酸和苯乳酸等益生代谢产物含量显著提高，并且抑菌性能增强，有助于肠道健康。

Description

植物乳杆菌在制备乳酸菌素、乳酸和苯乳酸中的应用
技术领域
本发明涉及植物乳杆菌在制备乳酸菌素、乳酸和苯乳酸中的应用，属于发酵工程技术领域。
背景技术
乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类革兰氏阳性、无芽孢、不运动或少运动、发酵糖产大量乳酸的有益菌群。乳酸菌种类丰富并且分布广泛，不但可以赋予食品较高的营养价值和良好的风味，还具有抗病和抑菌能力、调节肠道菌群平衡，进而对调节其他器官机能、缓和代谢综合症等疾病具有促进作用，在畜禽养殖、食品工业、医药制造等领域应用广泛。乳酸菌产生的益生代谢产物包括有机酸、脂肪酸、细菌素、蛋白质类化合物和酚类等化合物，通过减少和抑制有害菌群的在肠道的定植，对促进宿主健康具有积极作用。
乳酸菌生产的具有代表性的抑菌物质为乳酸和细菌素，以及近年来关注度逐渐升高的新型抑菌物质苯乳酸。乳酸和苯乳酸检测手段均较为成熟，而细菌素的检测方法比较落后。常用的细菌素测定方法包括琼脂扩散法、滤纸片法、点种法、浊度分析法、绿色荧光蛋白测定法以及ATP生物发光测定法，还有基于反向高效液相色谱、阳离子交换色谱和毛细管区带电泳的分析方法。但这些方法大都存在准确性差、耗时长和成本高的缺点，不适合工业上大规模应用，因而发明一种快速准确低成本的乳酸菌素定量方法是很有必要的。
乳酸菌属于化能异养型微生物，缺乏对许多有机化合物的合成能力，菌株能否在不同环境下进行代谢活动很大程度上取决于营养物质的供给，因而发酵培养基的改良是影响菌株代谢的重要因素。通过对乳酸菌培养基中碳源和氮源等成分比例进行调整，促使菌株获得最大生长速率，从而提高乳酸菌素、乳酸和苯乳酸等益生代谢产物含量。
发明内容
本发明提供了一种可提高植物乳杆菌生产乳酸菌素、乳酸和苯乳酸能力的培养基，所述培养基中含有：蛋白胨5～10g、酵母粉10～15g、葡萄糖30～40g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2～4g、乙酸钠5g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、吐温80 1mL、蒸馏水1L，pH为5.5～7，115℃灭菌30min。
在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌CCTCC No：M2017138，记载于公开号为CN107446852B的专利文件中。
本发明还提供了一种植物乳杆菌在制备乳酸菌素、乳酸和苯乳酸中的应用，所述应用为，将植物乳杆菌种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养；所述发酵培养基中含有：蛋白胨0～15g/L、酵母粉0～15g/L、葡萄糖10～40g/L、磷酸氢二钾2～3g/L、柠檬酸三铵0～4g/L、乙酸钠5～6g/L、七水硫酸镁0.5～0.6g/L、四水硫酸锰0.2～0.3g/L、吐温80 1mL/L；pH为5.5～7。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基中含有：蛋白胨5～10g、酵母粉10～15g、葡萄糖30～40g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2～4g、乙酸钠5g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、吐温80 1mL、蒸馏水1L，pH为5.5～7。
在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌CCTCC No：M2017138。
在本发明的一种实施方式中，将植物乳杆菌种子液接种至发酵培养基中的发酵条件为：在30～37℃发酵12～48h。
在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌种子液的OD600为6～8。
在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌种子液在发酵培养基中的接种量为：2～5％(v/v)。
在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌种子液在发酵培养基中的接种量为2％(v/v)。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵液中小肽含量为1.99mg/mL，乳酸含量为19.8g/L，苯乳酸含量为140.26mg/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵液储存条件为真空冷冻干燥浓缩。
本发明还提供了一种制备乳酸菌素的方法，所述方法为，将植物乳杆菌CCTCC No：M2017138的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养；所述发酵培养基中含有：蛋白胨5～10g、酵母粉10～15g、葡萄糖30～40g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2～4g、乙酸钠5g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、吐温80 1mL、蒸馏水1L，115℃灭菌30min。
在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌种子液在发酵培养基中的接种量为2％(v/v)。
本发明还提供了一种采用植物乳杆菌在发酵罐中制备乳酸菌素、乳酸和苯乳酸的方法，所述方法为：将植物乳杆菌CCTCC No：M 2017138的种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养；发酵罐发酵条件为装液量40～60％，厌氧，接种量2～10％(v/v)，转速200～400rpm，温度30～37℃，pH为5.8～6.5。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵还包括流加补葡萄糖，所述补糖的策略为0～10h不补糖，10～24h流加速度为15～25g/h，24～52h流加速度为5～15g/h，其中，葡萄糖的浓度为：400～600g/L。
在本发明的一种实施方式中，采用发酵罐发酵结束之后的发酵液中乳酸含量为131.8g/L，乳酸菌数为6.8×1010cfu/mL。
在本发明的一种实施方式中，将制备得到的发酵液进行冷冻干燥，所述冷冻干燥后制备的乳酸菌益生代谢产物的发酵液干重为18.08g/100mL，小肽的含量为46.08mg/g，乳酸含量为0.72g/g，菌体干重为0.87g/100mL，活菌数为1.22×1012cfu/g。
本发明还提供了利用上述方法制备得到的乳酸菌素、乳酸和苯乳酸。
本发明还提供了一种含有上述乳酸菌素的高抑菌活性的发酵剂。
本发明还提供了含有上述乳酸菌素的产品，所述产品为药品、保健品或饲料添加剂。
有益效果
本发明采用具有高抑菌活性的植物乳杆菌CCTCC No：M 2017138，通过改良MRS培养基配方，优化发酵罐的发酵条件，使乳酸菌发酵48h的代谢产物中乳酸含量达到127.3g/L，乳酸菌素含量达到46.08mg/L；
采用具体实施方式中牛津杯法抑菌实验检测方法，检测发酵上清液对大肠杆菌的抑菌效果，实验结果显示，平均抑菌圈大小为26.94mm，相比对照组的21.23mm，抑菌直径提高了26.90％。
附图说明
图1：培养基单因素优化时植物乳杆菌的生长与代谢图，其中，A为葡萄糖优化；B为蛋白胨优化；C为酵母粉优化；D为柠檬酸铵优化。
图2：植物乳杆菌DY6的5L发酵罐生长与代谢图。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的菌株植物乳杆菌DY1、副干酪乳杆菌DY2、副干酪乳杆菌DY3、鼠李糖乳杆菌DY4、乳酸片球菌DY5公开于“植物乳杆菌DY6主要抑菌代谢物的分析和鉴定”论文当中。
下述实施例中所涉及的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DY6，保藏编号为CCTCC NO:M 2017138，记载于公开号为CN107446852A的专利申请中。
下述实施例中所涉及的植物乳杆菌DY7、鼠李糖乳杆菌DY8、植物乳杆菌DY9、植物乳杆菌DY10、粪肠球菌DY11、干酪乳杆菌DY12、干酪乳杆菌DY13、鼠李糖乳杆菌DY14是实验室筛选，保藏于江南大学国家级微生物资源平台。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：蛋白胨10.0g·L-1，牛肉膏8.0g·L-1，酵母浸出粉4.0g·L-1，葡萄糖20.0g·L-1，K2HPO4 2.0g·L-1，柠檬酸三铵2.0g·L-1，醋酸钠5.0g·L-1，MgSO4·7H2O0.58g·L-1，MnSO4·4H2O 0.25g·L-1，吐温80 1mL·L-1，pH 6.3～6.5。
LB液体培养基：酵母粉5g·L-1，胰蛋白胨10g·L-1，NaCl 10g·L-1。在此基础上添加2％的琼脂粉即为LB固体培养基，添加1％的琼脂粉为LB半固体培养基。
下述实施例中所涉及的乳酸和苯乳酸的含量检测方法如下：
乳酸含量测定使用Agilent Technologies1260 Infinity高效液相色谱进行分析，色谱柱使用BIO-RAD Aminex HPX-87H Column 300×7.8mm，流动相为5mM的H2SO4溶液。柱温：35℃；采用RID检测器；流速：0.6mL/min；进样量：20μL。
苯乳酸含量测定使用C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，线性梯度洗脱，检测波长210nm。流动相为甲醇+0.05％三氟乙酸(溶剂A)和0.05％三氟乙酸+水(溶剂B)。梯度流动相为10～100％A(0～20min)、100％A(20～23min)、100～10％A(23～25min)，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为20μL。
下述实施例中所涉及的牛津杯抑菌圈实验检测方法如下：
以大肠杆菌作为指示菌接种于LB液体培养基中，在37℃条件下250rpm培养12h作为指示菌菌液。取无菌的培养皿，分别倒入约15mL融化后的固体LB培养基作为底层，放置水平面冷却10min后，在此基础上倒入约5mL的融化后的半固体LB培养基，在平板内均匀摊布，其中半固体培养基中菌浓控制在约108CFU·mL-1。在每个平板中等距离放置牛津杯4个，在其中加入前期获得的发酵液200μL，放置在37℃培养箱10～13h后，测量抑菌圈直径大小以评价抑菌效果。
下述实施例中所涉及的小肽检测方法如下：
采用福林酚法检测小肽含量。福林酚法所需试剂为福林酚试剂甲和福林酚试剂乙，福林酚试剂甲的配制为将4％碳酸钠溶液与0.2mol/L氢氧化钠溶液等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液；1％硫酸铜溶液与2％酒石酸钾钠溶液等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成福林酚试剂甲。
(1)标准曲线的制作：分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准溶液于试管中，分别加进不同量的蒸馏水，补足到1mL，各加入5mL试剂甲，混匀后于室温下(25℃左右)放置10min。再加入0.5mL试剂乙，立即混匀，于室温下反应30min，于500nm波长下测定光密度。以吸光值作为纵坐标，蛋白质含量为横坐标绘制标准曲线。
(2)样品蛋白质含量的测定取1mL样品溶液和，加入5mL试剂甲，混匀后于25℃左右放置10min，再加入0.5mL试剂乙，立即摇匀，于25℃左右反应30min，测定吸光值，从标准曲线查出样品小肽含量。
实施例1：高效生产益生代谢产物的乳酸菌筛选
从实验室保藏的14株乳酸菌(植物乳杆菌DY1、副干酪乳杆菌DY2、副干酪乳杆菌DY3、鼠李糖乳杆菌DY4、乳酸片球菌DY5、植物乳杆菌DY6、植物乳杆菌DY7、鼠李糖乳杆菌DY8、植物乳杆菌DY9、植物乳杆菌DY10、粪肠球菌DY11、干酪乳杆菌DY12、干酪乳杆菌DY13、鼠李糖乳杆菌DY14)中筛选出抑菌效果好的革兰氏阳性菌株。
具体步骤如下：
1、配制MRS培养基：
蛋白胨10.0g，牛肉膏8.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钠5.0g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，吐温80 1mL，蒸馏水1L，115℃灭菌30min。在此基础上添加2％的琼脂粉为MRS固体培养基。
配制LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，121℃灭菌20min。在此基础上添加2％的琼脂粉即为LB固体培养基，添加1％的琼脂粉为LB半固体培养基。
2、发酵液制备：
分别从平板中将植物乳杆菌DY1、副干酪乳杆菌DY2、副干酪乳杆菌DY3、鼠李糖乳杆菌DY4、乳酸片球菌DY5、植物乳杆菌DY6、植物乳杆菌DY7、鼠李糖乳杆菌DY8、植物乳杆菌DY9、植物乳杆菌DY10、粪肠球菌DY11、干酪乳杆菌DY12、干酪乳杆菌DY13、鼠李糖乳杆菌DY14的单菌落接种于MRS培养基中，37℃，静置培养16～18h，制备得到种子液，将种子液按照2％(v/v)的比例转接在50mL MRS培养基中，37℃静置培养24h获得植物乳杆菌菌液，8000r·min-1离心15min，测定发酵上清液的抑菌活性。
3、抑菌活性测定：
采用具体实施方式中牛津杯法抑菌实验检测方法，将步骤2得到的发酵上清液进行抑菌活性测定，结果如表1所示，由表1可以看出DY6菌株能有效抑制大肠杆菌，依次为DY13、DY2、DY3、DY1。
表1乳酸菌抑菌结果
Figure BDA0003354257390000051
Figure BDA0003354257390000061
4、有机酸含量测定：
分别检测步骤2中得到的植物乳杆菌DY6发酵上清液、干酪乳杆菌DY13发酵上清液、副干酪乳杆菌DY2发酵上清液、副干酪乳杆菌DY3发酵上清液、植物乳杆菌DY1发酵上清液中的乳酸和苯乳酸的含量，结果如表2所示，由表2可以看出，植物乳杆菌DY6发酵上清液中的乳酸和苯乳酸的含量最高。
表2乳酸菌有机酸产量
Figure BDA0003354257390000062
由实施例1可知，植物乳杆菌DY6发酵上清液中的乳酸和苯乳酸的含量最高，因此，后续实验以植物乳杆菌DY6进行研究。
实施例2：植物乳杆菌DY6发酵培养基优化
具体步骤如下：
(1)为获得抑菌性能最佳的发酵培养基成分，本实施例提出一种优化后的乳酸菌的改良MRS培养基配方，从葡萄糖(10、20、30、40g/L)、酵母粉(0、5、10、15g/L)、蛋白胨(0、5、10、15g/L)、柠檬酸铵(0、1、2、4g/L)四个因素出发，设计了单因素实验；
具体步骤如下：
将植物乳杆菌DY6单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃，静置培养16～18h，制备得到种子液，将种子液按照2％(v/v)的比例转接在50mL MRS培养基中，37℃静置培养24h获得植物乳杆菌菌液，8000r·min-1离心15min后，采用具体实施方式中牛津杯法抑菌实验检测抑菌直径大小，福林酚法测小肽含量；
其中，葡萄糖单因素实验：MRS培养基中其他成分不变，将葡萄糖的浓度分别调整为10、20、30、40g/L，结果如图1A所示，结果显示，OD600分别为4.4、7.54、6.95、7.72，抑菌直径(mm)分别为21.23、26.24、26.71、28.17，小肽含量(mg/mL)分别为0.37、0.31、0.31、0.39。
蛋白胨因素实验：MRS培养基中其他成分不变，将蛋白胨的浓度分别调整为0、5、10、15g/L，结果如图1B所示，结果显示，OD600分别为5.68、6.38、7.25、7.64，抑菌直径(mm)分别为25.82、25.53、24.71、24.15，小肽含量(mg/mL)分别为0.27、0.30、0.33、0.37。
酵母粉单因素实验：MRS培养基中其他成分不变，将酵母粉的浓度分别调整为0、5、10、15g/L，结果如图1C所示，结果显示，OD600分别为5.46、6.49、7.32、8.36，抑菌直径(mm)分别为23.87、25.95、25.41、25.88，小肽含量(mg/mL)分别为0.30、0.26、0.32、0.35。
柠檬酸铵素实验：MRS培养基中其他成分不变，将柠檬酸铵的浓度分别调整为0、5、10、15g/L，结果如图1D所示，结果显示，OD600分别为6.91、6.38、7.1、7.73，抑菌直径(mm)分别为25.13、25.56、24.85、25.22，小肽含量(mg/mL)分别为0.31、0.31、0.29、0.37。
每个因素选取四个水平，采用具体实施方式中牛津杯法抑菌实验检测抑菌直径大小，福林酚法测小肽含量，优化后的生长情况、抑菌圈直径和小肽含量见附图1。
经优化后最佳培养基配方为：蛋白胨5～10g、酵母粉10～15g、葡萄糖30～40g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2～4g、乙酸钠5g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、吐温801mL、蒸馏水1L。
(2)按照步骤(1)的结果，选择以下培养基作为改良后的MRS培养基：
蛋白胨5g、酵母粉15g、葡萄糖40g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、吐温80 1mL、蒸馏水1L，115℃灭菌30min。
将植物乳杆菌DY6单菌落接种于步骤(2)配制得到的改良后的MRS培养基中，37℃，静置培养16～18h，得到种子液；将制备得到的种子液按2％(v/v)的接种量转接在50mL上述改良后的MRS培养基中，37℃，静置培养24h获得植物乳杆菌发酵液；
将制备得到的发酵液在8000r·min-1条件下离心15min，取上清液进行检测；
对照组：具体实施方式同上，区别在于，将改良后的MRS培养基替换为未改良的MRS培养基；制备得到的对照上清液；
分别将上述上清液利用福林酚法检测24h发酵液中小肽，其中采用改良后的MRS培养基制备得到的上清液中小肽含量为1.99mg/mL，而作为对照的，采用未改良的MRS培养基制备得到的对照上清液中小肽的含量为1.73mg/mL，提高了15.03％。
(3)分别将上述步骤(2)制备得到的上清液采用真空冷冻干燥技术浓缩12.5倍，获得浓缩发酵液，将制备得到的浓缩发酵液进行牛津杯抑菌圈实验，以检测对大肠杆菌的抑菌能力；
实验结果显示，采用改良后的MRS培养基制备得到的上清液的平均抑菌圈大小为26.94mm，相比对照上清液的21.23mm，抑菌直径提高了26.90％。
实施例3：植物乳杆菌DY6益生代谢产物测定
具体步骤如下：
(1)按照实施例2步骤(1)的结果，选择以下培养基作为改良后的MRS培养基：
蛋白胨5g、酵母粉15g、葡萄糖40g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、吐温80 1mL、蒸馏水1L，115℃灭菌30min。
(2)将植物乳杆菌DY6单菌落接种于步骤(1)配制得到的改良后的MRS培养基中，37℃，静置培养16～18h，得到种子液，将制备得到的种子液按2％(v/v)的接种量转接在50mL上述改良后的MRS培养基中，37℃，静置培养24h获得植物乳杆菌发酵液；
将制备得到的发酵液在8000r·min-1条件下离心15min后取上清，检测乳酸和苯乳酸含量，植物乳杆菌DY6发酵液中乳酸和苯乳酸含量见表3。
表3植物乳杆菌DY6益生代谢产物的含量
Figure BDA0003354257390000081
(3)将步骤(2)制备得到的离心后的发酵上清液的pH值，通过1mol·L-1的HCl和NaOH调整为4.5，在此条件下维持一小时，制备得到上清液，进行抑菌效果检测。
对照组：步骤(2)制备得到的离心后的发酵上清液为对照上清液，进行抑菌效果检测；
分别将上述上清液采用牛津杯法抑菌实验检测抑菌直径大小，检测上清液对大肠杆菌的抑菌能力。
结果显示，pH值调整为4.5的上清液的抑菌直径为12.22mm，而对照上清液的抑菌直径为18.72mm，因此，可排除乳酸等有机酸对抑菌效果的影响。
(4)将步骤(2)制备得到的离心后的发酵上清液的pH调至4.5后，分别被胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶处理，具体步骤如下：
分别将胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶酶溶液的浓度调整为1g·L-1，将酶液和发酵上清液按照体积比为1:1的比例进行混合，分别制备得到混合溶液；
将含有胰蛋白酶混合溶液的pH调至7.0；将含有胃蛋白酶混合溶液的pH调至2.0；将含有木瓜蛋白酶混合溶液的pH调至7.0；然后25℃放置3h后，分别把各个混合溶液的pH值重新调整至pH 4.5，通过测定抑菌圈的变化，检测对大肠杆菌的抑菌效果。
对照组：将步骤(2)制备得到的离心后的发酵上清液的pH调至4.5后，分别将胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶酶液在100℃高温条件下处理后，将各个酶液和发酵上清液按照体积比为1:1的比例进行混合，作为对照组，通过测定抑菌圈的变化，检测对大肠杆菌的抑菌效果。结果如表4所示。
表4植物乳杆菌DY6抑菌物质探究
Figure BDA0003354257390000082
Figure BDA0003354257390000091
从表4看出，植物乳杆菌DY6的发酵上清液经排除乳酸等有机酸后，对大肠杆菌的抑菌活性具有明显的降低，在排除酸干扰后的上清液中再加入胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶抑菌活性明显下降，表明植物乳杆菌DY6发酵上清液的抑菌物质对蛋白酶较敏感，初步确定植物乳杆菌DY6代谢所产生的抑菌物质为蛋白质性质的乳酸菌素。
实施例4：5L发酵罐优化
具体步骤如下：
(1)按照实施例2步骤(1)的结果，选择以下培养基作为改良后的MRS培养基：
蛋白胨5g、酵母粉15g、葡萄糖40g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵4g、乙酸钠5g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、吐温80 1mL、蒸馏水1L，115℃灭菌30min。
(2)制备种子液
一级种子液制备：将植物乳杆菌DY6单菌落接种于步骤(1)制备得到的培养基中，37℃，静置培养16～18h。
二级种子液制备：取一级种子液按照2％(v/v)的接种量转接在50mL步骤(1)制备得到的培养基中，37℃，静置培养12～16h。
(3)发酵罐进行发酵
将步骤(1)配置的改良后的MRS培养基按照40～60％(v/v)的装液量添加至发酵罐中，将步骤(2)制备得到的二级种子液按照接种量5％(v/v)接种至上述培养基中，将转速设置为400rpm，温度为37℃，将发酵期间是否通气和控制pH条件作为变量，设计四个实验(通气速率为2～3v/v·min)。所述实验还包括补糖，补糖策略为0～10h不补糖；10～24h流加速度为20g/h；24～52h流加速度为10g/h。具体条件及实验结果见表5。
表5上罐发酵条件优化
Figure BDA0003354257390000092
结果显示，确定厌氧发酵且控制pH 5.8～6.5是最佳发酵条件，发酵过程中菌体生长和乳酸含量变化如表5和图2所示。
实验结果显示，未通气，控pH 5.8～6.5的条件下，在发酵终点52h时，植物乳杆菌DY6的OD600为24，乳酸含量为131.8g/L，发酵液中乳酸菌数为6.8×1010cfu/mL，菌体干重0.87g/100mL，直接冻干干燥后活菌数为1.22×1012cfu/g，存活率为15.59％；发酵上清中干重为18.08g/100mL，小肽的含量为46.08mg/g，乳酸含量为0.72g/g。
菌体生长过程中2～15h为对数生长期，菌体和乳酸在此时合成速率最大。15h后，菌体增长缓慢，但仍会利用葡萄糖合成乳酸，且合成速率稳定。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种可提高植物乳杆菌生产乳酸菌素、乳酸和苯乳酸能力的培养基，其特征在于，所述培养基中含有：蛋白胨5～10g、酵母粉10～15g、葡萄糖30～40g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2～4g、乙酸钠5g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、吐温80 1mL、蒸馏水1L，pH为5.5～7。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌CCTCC No：M2017138。
3.植物乳杆菌在制备乳酸菌素、乳酸和苯乳酸中的应用，其特征在于，所述应用为，将植物乳杆菌种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养；所述发酵培养基中含有：蛋白胨5～10g、酵母粉10～15g、葡萄糖30～40g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2～4g、乙酸钠5g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、吐温80 1mL、蒸馏水1L，pH为5.5～7。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌CCTCC No：M2017138。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将植物乳杆菌种子液接种至发酵培养基中的发酵条件为：在30～37℃发酵12～48h。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌种子液的OD600为6～8。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌种子液在发酵培养基中的接种量为：2～5％。
8.一种制备乳酸菌素的方法，其特征在于，将植物乳杆菌CCTCC No：M 2017138的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养；所述发酵培养基中含有：蛋白胨5～10g、酵母粉10～15g、葡萄糖30～40g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2～4g、乙酸钠5g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、吐温80 1mL、蒸馏水1L，pH为5.5～7。
9.权利要求8所述的方法制备得到的乳酸菌素。
10.含有权利要求9所述的乳酸菌素的产品，其特征在于，所述产品为药品、保健品或饲料添加剂。
CN202111346294.XA 2021-11-15 2021-11-15 植物乳杆菌在制备乳酸菌素、乳酸和苯乳酸中的应用 Active CN114015729B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111346294.XA CN114015729B (zh) 2021-11-15 2021-11-15 植物乳杆菌在制备乳酸菌素、乳酸和苯乳酸中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111346294.XA CN114015729B (zh) 2021-11-15 2021-11-15 植物乳杆菌在制备乳酸菌素、乳酸和苯乳酸中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114015729A true CN114015729A (zh) 2022-02-08
CN114015729B CN114015729B (zh) 2023-08-15

Family

ID=80064052

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111346294.XA Active CN114015729B (zh) 2021-11-15 2021-11-15 植物乳杆菌在制备乳酸菌素、乳酸和苯乳酸中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114015729B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116790449A (zh) * 2023-08-21 2023-09-22 三亚中国农业科学院国家南繁研究院 同时提高乳酸和苯乳酸产量的发酵菌组合物及应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101333547A (zh) * 2008-08-05 2008-12-31 江南大学 一种控制pH和补料发酵生产苯乳酸的方法
CN103403157A (zh) * 2011-01-31 2013-11-20 旭化成化学株式会社 苯丙酮酸还原酶及使用该酶制造光学活性苯基乳酸及4-羟基苯基乳酸的制造方法
CN105087680A (zh) * 2015-08-19 2015-11-25 沈阳科纳提克生物科技有限公司 一种乳酸菌发酵培养基及高产量生产乳酸的工艺
CN106148213A (zh) * 2015-03-16 2016-11-23 江西科诺生物科技有限公司 一种饲用植物乳杆菌高密度发酵培养基及方法
CN106148420A (zh) * 2015-04-27 2016-11-23 牡丹江佰佳信生物科技有限公司 一种提高乳酸菌代谢产物抑菌活性的发酵方法
CN108570421A (zh) * 2017-03-09 2018-09-25 北京大北农科技集团股份有限公司 一株植物乳杆菌菌株及其青贮饲料发酵剂
CN109287847A (zh) * 2018-09-27 2019-02-01 江南大学 一种富含苯乳酸的发酵豆粕的制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101333547A (zh) * 2008-08-05 2008-12-31 江南大学 一种控制pH和补料发酵生产苯乳酸的方法
CN103403157A (zh) * 2011-01-31 2013-11-20 旭化成化学株式会社 苯丙酮酸还原酶及使用该酶制造光学活性苯基乳酸及4-羟基苯基乳酸的制造方法
CN106148213A (zh) * 2015-03-16 2016-11-23 江西科诺生物科技有限公司 一种饲用植物乳杆菌高密度发酵培养基及方法
CN106148420A (zh) * 2015-04-27 2016-11-23 牡丹江佰佳信生物科技有限公司 一种提高乳酸菌代谢产物抑菌活性的发酵方法
CN105087680A (zh) * 2015-08-19 2015-11-25 沈阳科纳提克生物科技有限公司 一种乳酸菌发酵培养基及高产量生产乳酸的工艺
CN108570421A (zh) * 2017-03-09 2018-09-25 北京大北农科技集团股份有限公司 一株植物乳杆菌菌株及其青贮饲料发酵剂
CN109287847A (zh) * 2018-09-27 2019-02-01 江南大学 一种富含苯乳酸的发酵豆粕的制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李亚;谈重芳;王雁萍;李宗伟;金庆生;: "植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CW5的筛选及细菌素抑菌活性的研究", 食品科技, no. 11, pages 17 - 20 *
柴虹宇等: "一株植物乳杆菌培养条件优化", 农业科技与装备, no. 189, pages 28 - 30 *
范远景等: "一株LABR-X 植物乳酸杆菌的产抗菌小肽培 养条件优化与所产小肽抗菌效果的研究", 生物工程, vol. 29, no. 11, pages 383 - 386 *
解俊梅;文汉;: "植物乳酸菌类细菌素特性研究及其产生条件的优化", 食品工业科技, no. 11, pages 93 - 100 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116790449A (zh) * 2023-08-21 2023-09-22 三亚中国农业科学院国家南繁研究院 同时提高乳酸和苯乳酸产量的发酵菌组合物及应用
CN116790449B (zh) * 2023-08-21 2023-10-27 三亚中国农业科学院国家南繁研究院 同时提高乳酸和苯乳酸产量的发酵菌组合物及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114015729B (zh) 2023-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113444664B (zh) 一株产γ-氨基丁酸短乳杆菌及其应用
CN112608861B (zh) 一种含有丁酸梭菌和乳酸片球菌的复合制剂及其制备方法和应用
CN116496950B (zh) 一株赖氨酸生产菌株及用途，生产赖氨酸的方法
CN105400729A (zh) 一种抑菌性产木聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株
CN113980853B (zh) 一株产乳酸的格氏乳球菌wbt0008及其应用
CN117551592B (zh) 乳酸菌发酵用碳源及采用该碳源的乳酸菌培养方法及应用
CN110804571B (zh) 一种复合乳酸菌制剂及在制备成饲料添加剂中的应用
CN114015729B (zh) 植物乳杆菌在制备乳酸菌素、乳酸和苯乳酸中的应用
CN113046253B (zh) 一种提高马克斯克鲁维酵母耐热性的培养方法
CN104277989B (zh) 一株面包酵母及其在发酵生产辅酶i中的应用
CN115537364B (zh) 一种鼠李糖乳杆菌jl1高密度发酵的方法
KR20120135450A (ko) 세라믹 막 분리 배양기
CN111187744A (zh) 同温层芽孢杆菌高密度工业发酵培养基及其发酵方法
CN114806944B (zh) 植物乳杆菌lp11、其发酵液及制备方法和应用
CN1793325A (zh) 芳香型直投式酸奶发酵剂
CN115895974A (zh) 一株富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌及其应用
CN111793593B (zh) 一种促进光合细菌生长的方法
CN101575579A (zh) 一种富铁酵母及其生产方法
CN110144309B (zh) 一株低温乳酸菌
CN113583913A (zh) 一种用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂及其应用
CN109234348B (zh) 一种抗抑郁降血脂红曲粉及其制备方法
CN108587923B (zh) 一种改善苹果酸发酵性能的方法
CN117904009B (zh) 适用非粮生物基碳源的枯草芽孢杆菌及其发酵生产方法
CN112175834A (zh) 植物乳酸菌在枯草芽孢杆菌固体菌剂保存中的应用及延长枯草芽孢杆菌的保存期的方法
TWI760923B (zh) 新穎的乳酸桿菌及其應用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Mao Yin

Inventor after: Deng Yu

Inventor after: Zhou Shenghu

Inventor after: Liu Yingying

Inventor after: Jia Yize

Inventor after: Li Guohui

Inventor after: Zhao Yunying

Inventor before: Deng Yu

Inventor before: Zhou Shenghu

Inventor before: Liu Yingying

Inventor before: Jia Yize

Inventor before: Mao Yin

Inventor before: Li Guohui

Inventor before: Zhao Yunying

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant