CN117551592B - 乳酸菌发酵用碳源及采用该碳源的乳酸菌培养方法及应用 - Google Patents
乳酸菌发酵用碳源及采用该碳源的乳酸菌培养方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出一种新型的乳酸菌发酵用碳源，其包括甲酸盐与乙酸盐构成的混合碳源，所述甲酸盐在发酵液中的浓度5‑10 g/L，乙酸盐在发酵液中的浓度20‑40 g/L。该碳源可以替代传统粮食基碳源，如葡萄糖、蔗糖，并通过发酵工艺的优化，获得高效生产乳酸菌的培养发酵方法。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种乳酸菌发酵用碳源及采用该碳源的乳酸菌培养方法。
背景技术
益生菌是调节宿主肠道菌群以改善宿主健康状态的活菌，主要包括两个大类：其中一类为乳酸菌，例如嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌等，另一类则为双歧杆菌，例如长双歧杆菌、两歧双歧杆菌等。其中乳酸菌类在研究领域中深受重视和青睐，而乳酸菌（Lactic acidbacteria）是肠道中的一类重要益生菌，有调节肠道菌群、抑制病原菌、增强免疫力等诸多益生功能，并在食品、动物、医药以及饲料等领域中广泛应用。
随着乳酸菌应用在社会各个领域中，活菌含量高、生产成本低逐渐成为市场的需求，而乳酸菌的高密度发酵是实现浓缩乳杆菌发酵剂工业化的研究基础，因此高密度发酵成为乳酸菌的重要研究内容。乳酸菌对生长环境和营养成分的要求较为严苛，在进行乳酸菌的高密度时，采取追加营养物质、调节 pH 等措施，可以降低乳酸等代谢产物对细胞生长的影响，从而延长菌体的对数生长期以获得更高的活菌数。
乳酸菌常用的发酵培养基主要碳源为葡萄糖，少量使用果糖、蔗糖等，而这些糖类物质的最终来源都是粮食资源。因此寻找一种以非葡萄糖为主要碳源的微生物发酵生产乳酸菌是现阶段行业亟需解决的问题。
申请人长期致力于电化学级联合成生物技术的研究，发现工业碳排尾气二氧化碳通过电催化技术可以制备一元酸盐和二元酸盐的单一产品或通过控制催化剂的类型和电流密度，获得一定配比的混合产物，其中混合产物可以大大降低转化过程中的成本，提高转化效率，但是混合产物的应用是一个难题，二氧化碳电催化获得的一元酸盐和二元酸盐均在一些菌种培养发酵过程中发挥一定的功效，因此，申请人考虑将这一混合产物作为碳源尝试应用于生物发酵过程中。本发明通过研究对发酵培养基的调整优化，以利用乙酸盐为主的混合产物碳源发酵益生菌的发酵工艺，提高了乳酸菌的产量以及解决了只能利用葡萄糖、蔗糖、果糖等粮食来源碳源生产益生菌的局限性，降低了生产成本以及提供了绿色生产的可能性。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的乳酸菌发酵用碳源，替代传统粮食基碳源，如葡萄糖、蔗糖，并通过发酵工艺的优化，获得高效生产乳酸菌的培养发酵方法。
为解决上述技术问题，本发明提供一种乳酸菌发酵用混合碳源，该混合碳源包括甲酸盐与乙酸盐构成的混合碳源，所述甲酸盐在发酵液中的浓度5-10 g/L，乙酸盐在发酵液中的浓度20-40 g/L。
所述混合碳源还包括葡萄糖，所述葡萄糖在发酵液中的浓度为3-5 g/L。
所述甲酸盐可以为甲酸钠、甲酸钾、甲酸铵中的一种或几种混合。
所述乙酸盐可以是乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵中的一种或几种混合。
所述甲酸盐和乙酸盐是电催化、热催化或光催化工业尾气二氧化碳获得的混合物。
本发明还提供所述混合碳源在含有乙酸盐和甲酸盐代谢通路的乳酸菌发酵培养过程中的应用。
本发明还提供一种乳酸菌发酵培养基，其包括上述混合碳源、碳酸氢钠1-10 g/L、磷酸氢二钾0-2 g/L、柠檬酸氢二铵0.5-2 g/L、蛋白胨1-10 g/L、酵母粉1-10 g/L、牛肉浸粉1-10 g/L、大豆蛋白胨1-5 g/L、七水硫酸镁0.2-0.6 g/L、一水硫酸锰0.05-0.2 g/L、吐温1 g/L， 108℃灭菌30分钟后冷却至常温使用。
本发明还提供一种乳酸菌发酵培养方法，其包括：
菌种按接种量2%-10%接入发酵罐基础培养基，发酵过程厌氧发酵，发酵期间观察pH值变化，当pH值达到5.5-6.5时，添加补料培养基进行补料，所述发酵pH值为5-10，所述发酵温度为30℃-37℃，所述发酵周期为12-24h；
所述基础培养基为碳酸氢盐1-10 g/L、葡萄糖3-5 g/L、磷酸氢二钾0.5-2 g/L、柠檬酸氢二铵0.5-2 g/L、蛋白胨1-10 g/L、酵母粉1-10 g/L、七水硫酸镁0.2-0.6 g/L、一水硫酸锰0.05-0.2 g/L、牛肉浸粉1-10 g/L、大豆蛋白胨1-5 g/L、吐温1 g/L，通过去离子水配制，定容至9L，108℃灭菌30分钟后冷却至常温使用；
补料培养基为甲酸盐50-100 g/L，乙酸盐200-400 g/L，定容至1L，121℃灭菌20分钟后冷却至常温使用。
其中，发酵期间观察pH值变化，根据菌体生长情况补料，当pH值达到5.5-6.5时开始匀速添加补料培养基，流加速度为1.9-2.2ml/min。
其中，整个发酵过程中的转速为25rpm/min-50 rpm/min。
本发明的有益效果：
1、与现有发酵培养乳酸菌工艺相比，本发明使用混合碳源替代部分葡萄糖碳源，通过调整培养过程中混合碳源的添加时机和补料速度，发酵工艺能够明显提高乳酸菌的活菌数；
2、通过提供这种新型混合碳源作为发酵培养基，替代部分葡萄糖，实现非粮生物基碳源对粮食源的替换，可以大幅度降低嗜酸乳杆菌的发酵成本和稳定性；
3、通过催化技术实现混合碳源由工业尾气二氧化碳转化而来，从而降低益生菌产品的碳足迹。
附图说明
图1：实施例2嗜酸乳杆菌ATCC 4356平板计数结果；
图2：比较例1嗜酸乳杆菌ATCC 4356平板计数结果。
具体实施方式
发明人利用常规的以葡萄糖为主碳源的生产益生菌的培养基确定该菌种的生长水平，随后通过对比，在常规摇瓶发酵的基础上分别用甲酸盐、乙酸盐以及乙酸盐和甲酸盐为主体的混合碳源分别替代同比例的葡萄糖碳源进行摇瓶培养，发现单纯甲酸盐浓度超过10 g/L具有明显的抑制菌株生长，在这浓度之下有一定的促进作用，单纯的乙酸盐浓度超过40 g/L抑制效果明显，这是因为高浓度的乙酸盐对乳酸菌的生长产生抑制作用，过量的乙酸盐可以导致细胞内部酸化，影响代谢活性和生长速度，在这浓度之下有一定的促进作用，而采用甲酸盐和乙酸盐的混合碳源具有明显的促进作用。
在此基础上进一步设计优化不同甲酸盐和乙酸盐配比的混合碳源替代部分葡萄糖碳源的发酵培养基，利用发酵罐进行发酵验证，并设计补料培养基以及调整加料方式，获得以乙酸盐和甲酸盐为主体的混合碳源发酵乳酸菌的最优发酵方法。
具体的，本发明提供一种以乙酸盐为主体的混合碳源发酵乳酸菌的方法，所采用的碳源包括甲酸盐与乙酸盐构成的混合碳源。所述甲酸盐在发酵液中的浓度5-10 g/L，乙酸盐在发酵液中的浓度20-40 g/L。发明人经过实验与调研发现，甲酸盐经甲酸脱氢酶氧化的过程中，NAD+被还原形成NADH，而NADH参与到乳酸菌生长的多个代谢过程中并提供还原力，促进菌株生长，但是如果浓度过低，经过试验验证，小于5 g/L，在该体系下提供的还原力不足，无法实现最优菌株生长；乙酸盐在无氧条件下经过乙酸激酶的作用能参与合成乙酰辅酶A，而乙酰辅酶A将直接参与到三羧酸循环等代谢过程中，为菌株生长提供能量，因在本方案中乙酸盐是替代葡萄糖作为碳源使用，如果浓度过低，经验证，小于20 g/L，无法满足菌株生长的基本碳源需求。
所述甲酸盐和乙酸盐可以采购市售的复配，也可以是电催化、热催化或光催化工业尾气二氧化碳获得的混合物，如专利申请号CN202211251789.9提到的制备方法获得的混合碳源，根据设计并验证的混合碳源中甲酸盐和乙酸盐的添加量，如电催化二氧化碳尾气获得的混合碳源不满足浓度和比例要求，补加对应的甲酸盐或乙酸盐，以满足益生菌发酵培养要求。
所述甲酸盐可以是甲酸钠、甲酸钾、甲酸铵中的一种或几种混合；所述乙酸盐可以使乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵中的一种或几种混合。
所述碳源还包括葡萄糖，所述葡萄糖在发酵液中的浓度为3-5 g/L，传统发酵过程中以葡萄糖为唯一碳源的添加浓度为不少于20 g/L,本发明目的是通过以非粮生物基碳源替代粮食基碳源葡萄糖，乳酸菌菌株的生长初期离不开葡萄糖，如浓度过低，无法满足菌株初始生长要求，大幅度降低乳酸菌的活菌数，因添加其他碳源，即使浓度过高，也无法进一步提升活菌数。
发酵温度优选为30℃-37℃，发酵所采用的培养基的pH值为5-10。
当采用摇瓶发酵时，接种乳酸菌至摇瓶培养基中，无氧发酵培养，发酵时间为12h-24h。
摇瓶培养基：MRS(无糖)培养基：磷酸氢二钾0-2 g/L、柠檬酸二铵0.5-2 g/L、蛋白胨1-10 g/L、酵母粉1-5 g/L、牛肉膏1-10 g/L，七水硫酸镁0.2-0.6 g/L、一水硫酸锰0.05-0.2 g/L、吐温1 g/L。
碳源：葡萄糖3-5 g/L、甲酸盐5-10 g/L、乙酸盐20-40 g/L、碳酸氢盐1-10 g/L ，将上述无糖MRS培养基与上述碳源通过去离子水配制，108℃灭菌30分钟后冷却至常温使用。
当采用发酵罐培养时，将菌种按接种量为2%-10%接入发酵罐培养基；发酵过程无氧发酵，发酵时间为12h-24h，发酵期间观察pH值变化，根据菌体生长情况补料，当pH值达到5.5-6.5时开始匀速添加补料培养基，流加速度为1.9-2.2ml/min，整个发酵过程中pH控制在5-10，转速为25rpm/min-50 rpm/min。
发酵罐培养基：碳酸氢盐1-10 g/L、葡萄糖3-5 g/L、磷酸氢二钾0.5-2 g/L、柠檬酸氢二铵0.5-2 g/L、蛋白胨1-10 g/L、酵母粉1-10 g/L、七水硫酸镁0.2-0.6 g/L、一水硫酸锰0.05-0.2 g/L、牛肉浸粉1-10 g/L、大豆蛋白胨1-5 g/L、吐温1 g/L，通过去离子水配制，定容至9L，108℃灭菌30分钟后冷却至常温使用。
补料培养基组成：甲酸盐50-100 g/L，乙酸盐200-400 g/L，定容至1L，121℃灭菌20分钟后冷却至常温使用。其中甲酸盐的种类可以是甲酸钠、甲酸钾、甲酸铵中的一种或几种的混合物；乙酸盐的种类可以是乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵中的一种或几种的混合物。
以下采用实施例和附图来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明所采用的用于发酵的菌株为乳酸菌中的嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌，具体采用了嗜酸乳杆菌ATCC 4356、嗜酸乳杆菌CICC 20244、干酪乳杆菌CICC25035、鼠李糖乳杆菌CICC 20255，均保藏于广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)。
本发明首先对嗜酸乳杆菌ATCC 4356进行碳源利用的生理生化鉴定，经验证嗜酸乳杆菌ATCC 4356可以利用乙酸盐等作为碳源生长。
实验材料和试剂
1、菌种发酵所用培养基组分
MRS活化培养基：葡萄糖10-20 g/L、磷酸氢二钾0-2 g/L、柠檬酸二铵0.5-2 g/L、蛋白胨1-10 g/L、酵母粉1-5 g/L、牛肉膏1-10 g/L，七水硫酸镁0.2-0.6 g/L、一水硫酸锰0.05-0.2 g/L、吐温1 g/L。该用于嗜酸乳杆菌的菌种培养与分离，配制平板即需加入1.5%-2%的琼脂。
摇瓶培养基：MRS(无糖)培养基+葡萄糖3-5 g/L +甲酸盐5-10 g/L+乙酸盐20-40g/L+碳酸氢盐1-10 g/L。该用于嗜酸乳杆菌摇瓶生长的基础培养基，在此基础上增加碳源用于提高嗜酸乳杆菌的活菌数。在培养基中蛋白胨提供微生物生长所需的氮源、酵母粉提供微生物生长所需的氮源、维生素、生长因子等营养；Mg2+是TCA途径、EMP途径等多种酶的重要调控剂；磷元素是蛋白质、DNA的重要组成成分，碳酸氢盐在培养基体系中起到一定的缓冲作用。该培养基首先含有少量的葡萄糖提供菌体初始生长，在无氧环境中，当体系内的葡萄糖被消耗尽时，菌体开始利用乙酸盐，最后形成乙酸辅酶A，将参与到TCA途径，为菌体生长代谢提供能量，同时甲酸盐会在甲酸脱氢酶的作用下进行转化，在此过程中NAD+被还原形成NADH，为菌体生长提供足够的还原力，从而共同提高菌体活菌数。
MRS(无糖)培养基：磷酸氢二钾0-2 g/L、柠檬酸二铵0.5-2 g/L、蛋白胨1-10 g/L、酵母粉1-5 g/L、牛肉膏1-10 g/L，七水硫酸镁0.2-0.6 g/L、一水硫酸锰0.05-0.2 g/L、吐温1 g/L。
发酵罐培养基：碳酸氢盐1-10 g/L、葡萄糖3-5 g/L、磷酸氢二钾0.5-2 g/L、柠檬酸氢二铵0.5-2 g/L、蛋白胨1-10 g/L、酵母粉1-10 g/L、七水硫酸镁0.2-0.6 g/L、一水硫酸锰0.05-0.2 g/L、牛肉浸粉1-10 g/L、大豆蛋白胨1-5 g/L、吐温1g/L。
补料培养基：甲酸盐50-100 g/L，乙酸盐200-400 g/L。
实施例1
不同乳酸菌碳源利用的生化鉴定。
1、菌种的来源
嗜酸乳杆菌ATCC 4356、干酪乳杆菌CICC 25035、鼠李糖乳杆菌CICC 20255均保藏于广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)。
2、生理生化验证
表1 不同乳酸菌碳源利用特性
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性
通过对表1数据分析显示，嗜酸乳杆菌ATCC 4356、干酪乳杆菌CICC 25035、鼠李糖乳杆菌CICC 20255均可以利用甲酸、乙酸等碳源进行生理代谢活动，具备以一碳、二碳化合物为主体碳源发酵的基础。
实施例2
嗜酸乳杆菌ATCC 4356的摇瓶发酵。
用接种环在超净工作台上将菌株嗜酸乳杆菌ATCC 4356划线至MRS平板上，随后使用MRS固体培养基液封表面，37℃活化24h，待其长出单克隆；
在超净工作台中用无菌接种环挑取上述单克隆抗体，接种至装有8mL MRS培养基中的12mL摇菌管中，37℃，静置培养12h，获得种子液；
在超净工作台上用移液器将种子液以2%添加量添加至含50mL摇瓶培养基的150mL三角瓶中，37℃，静置培养24 h。
摇瓶培养基：MRS(无糖)培养基：磷酸氢二钾0-2 g/L、柠檬酸二铵0.5-2 g/L、蛋白胨1-10 g/L、酵母粉1-5 g/L、牛肉膏1-10 g/L，七水硫酸镁0.2-0.6 g/L、一水硫酸锰0.05-0.2 g/L、吐温1 g/L。
碳源：葡萄糖3-5 g/L、甲酸盐5-10 g/L、乙酸盐20-40 g/L、碳酸氢盐1-10 g/L ，将上述无糖培养基和碳源通过去离子水配制，108℃灭菌30分钟后冷却至常温使用。
活菌数计数方法：
用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1∶10的样品匀液。
另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次,即换用1次1mL灭菌吸管或吸头，直至稀释倍数至108。
选择稀释倍数为107和108的样品，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后,将冷却至48 ℃的 MRS琼脂培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。37℃厌氧培养72h。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。
选取菌落数在30cfu~300cfu 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30cfu的平板记录具体菌落数，大于300cfu 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
实施例3
采用与实施例2相同的方法，区别在于：所采用的混合碳源采用CN202211251789.9中实施例1的方法，通二氧化碳到电解反应器中电解反应，电解过程中的电解液为0.2M的碳酸氢钠溶液，采用还原电势-0.4VvsRHE，反应时间50min，获得产物排出，经检测，产物中甲酸钠含量3.5g/L，乙酸钠含量含量9.2g/L，还含有少量的碳酸氢钠，补充葡萄糖、甲酸钠和乙酸钠至5 g/L葡萄糖+5 g/L甲酸钠+20 g/L乙酸钠。
比较例1
采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为2 g/L葡萄糖+5 g/L甲酸钠+20 g/L乙酸钠。
比较例2
采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为10 g/L葡萄糖+5 g/L甲酸钠+20 g/L乙酸钠。
比较例3
采用与实施例2相同的方法，区别在于，仅采用葡萄糖碳源20 g/L。
表2 不同葡萄糖含量摇瓶发酵嗜酸乳杆菌ATCC 4356的活菌数
由表2数据以及图1和图2（计数平板的稀释倍数均为2×107）可知，如图1所示，实施例2中存在5 g/L的葡萄糖提供菌株的初始生长，同时消耗体系内的氧气，当葡萄糖被消耗完毕后菌体进入厌氧发酵，开始利用乙酸盐进行生长，其最终活菌数为7.7亿cfu。如图2所示，在比较例1中，体系内葡萄糖含量低，不足以满足菌株初始生长的基本碳源要求，同时体系内液体中的氧气是无法被完全除尽的，无法直接开始利用乙酸盐促使生长，从而导致菌株无法生长，活菌数较低；在比较例2中，当使用了加倍的葡萄糖作为碳源生长时，菌株的活菌数下降了1.3%，过量的葡萄糖无法明显促进活菌数的提升；而在对比例3中，仅使用葡萄糖作为碳源时，活菌数依然低于实施例2，这是因为乙酸盐为主的混合碳源相较于单一的葡萄糖碳源而言具有更高营养丰富度，提高了菌株对碳源的利用率，利于菌株生长。
实施例2和实施例3进行比较可以看出，采用电化学技术实现二氧化碳转化为混合碳源，只要保证补充足够量的甲酸盐和乙酸盐，虽产物中包含少量其他成分，但对整体菌株生长没有大影响。
比较例4
采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为5 g/L葡萄糖+0 g/L甲酸钠+20 g/L乙酸钠。
比较例5
采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为5 g/L葡萄糖+10 g/L甲酸钠+20 g/L乙酸钠。
比较例6
采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为5 g/L葡萄糖+15 g/L甲酸钠+20 g/L乙酸钠。
表3 不同甲酸钠含量摇瓶发酵嗜酸乳杆菌ATCC 4356的活菌数
由表3可知，当体系内存在5-10 g/L的甲酸钠时，活菌数处于较高水平。甲酸钠会在甲酸脱氢酶的作用下最终被转化，在此转化的过程中NAD+被还原形成NADH，而NADH参与到乳酸菌生长的多个代谢过程中并提供还原力，促进菌株生长。在比较例4中，由于缺失甲酸盐而缺乏还原力，导致菌株代谢能力降低，活菌数下降。在比较例6中，过量的甲酸盐由于其高渗透压力及甲酸盐耐受度均会抑制菌株的生长，因此选择适当的甲酸盐浓度能够促进菌株活菌数的增长。
比较例7
采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为5 g/L葡萄糖+ g/L甲酸钠+0 g/L乙酸钠。
比较例8
采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为5 g/L葡萄糖+5 g/L甲酸钠+40 g/L乙酸钠。
比较例9
采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为5 g/L葡萄糖+5 g/L甲酸钠+60 g/L乙酸钠。
表4 不同乙酸钠含量摇瓶发酵嗜酸乳杆菌ATCC 4356的活菌数
由表4可知，当体系内存在20-40 g/L的乙酸钠时，活菌数处于较高水平。乙酸盐在无氧条件下经过乙酸激酶的作用能参与合成乙酰辅酶A，而乙酰辅酶A将直接参与到三羧酸循环等代谢过程中，为菌株生长提供能量。在比较例7中，由于缺少乙酸盐的存在，当体系中葡萄糖被消耗殆尽时，失去了能够提供菌株生长的所需的能量物质，导致菌株无法正常生长。在比较例9中，过量的乙酸盐由于其高渗透压力及乙酸盐耐受度均会抑制菌株的生长，因此选择适当的乙酸盐浓度能够促进菌株活菌数的增长。
实施例4
发酵罐发酵嗜酸乳杆菌ATCC 4356的活菌数。
用接种环在超净工作台上将菌株嗜酸乳杆菌ATCC 4356划线至MRS平板上，随后使用MRS固体培养基液封表面，37℃活化24h，待其长出单克隆；
在超净工作台中用无菌接种环挑取上述单克隆抗体，接种至装有30mL MRS培养基中的50mL摇菌管中，37℃，静置培养12h，获得一级种子液；
在超净工作台上用移液器将一级种子液以2%添加量添加至含250mL MRS液体培养基的500mL三角瓶中，37℃，静置培养12 h，获得二级种子液。
发酵培养基配制：葡萄糖5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10 g/L、七水硫酸镁0.6 g/L、一水硫酸锰0.2 g/L、牛肉浸粉10 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、吐温1 g/L，pH值调至7.0，通过去离子水配制定容至9L，通过去离子水配制，108℃灭菌30分钟后冷却至常温使用。
补料培养基配制：甲酸盐50 g/L，乙酸盐200 g/L，定容至1L，通过去离子水配制，121℃灭菌20分钟后冷却至常温使用。
按上述配方配制发酵培养基和补料培养基。
将二级种子液按5%接种于15L发酵罐（培养基总体积为10L）中的培养基中，调整发酵温度为37℃，不通气，搅拌转速50 rpm/min，发酵时间为24h，发酵前期不控制pH，待菌体正常生长至pH=5.5时开始添加补料培养基，匀速2.08mL/min流加8h补完，开始添加补料培养基后pH控制5.5，直至发酵结束，其中补料乙酸盐类型为乙酸钠，甲酸盐类型为甲酸钠。
比较例10
采用与实施例4相同的方法，区别在于，补料时间点为pH=5.0。
比较例11
采用与实施例4相同的方法，区别在于，补料时间点为pH=6.0。
比较例12
采用与实施例4相同的方法，区别在于，补料时间点为pH=7.0。
表5 不同补料时间点下嗜酸乳杆菌ATCC 4356的活菌数
由表5可知，当补料的时间点较早时，由于菌体量较少，菌体利用乙酸盐效率不高，导致生长缓慢，当补料时间点较晚时，由于乳酸菌的代谢产物含大量酸性物质，造成的酸性环境不适合菌株生长。因此平衡好菌株生长产酸以及碱性补料培养基的营养成分的添加的时间点十分关键。
同时，由于不同菌株生长过程中代谢途径特性具有差异，因此其最适生长pH也不尽相同，在发酵不同乳酸菌时其pH的控制条件也会有所差异。
比较例13
采用与实施例4相同的方法，区别在于，补料速度为1.85mL/min。
比较例14
采用与实施例4相同的方法，区别在于，补料速度为2.38mL/min。
表6 不同补料速度下嗜酸乳杆菌ATCC 4356的活菌数
由表6可知，当补料培养基的补料速度较慢时，添加的乙酸盐和甲酸盐的量较少，无法满足菌体的正常生长，导致活菌数较低。当补料培养基的补料速度较快时，过量的乙酸盐和甲酸盐导致培养体系pH较高，影响菌体的正常生长，导致活菌数较低。因此平衡好菌株生长对营养的需求量以及碱性补料培养基的营养成分的添加的速率十分关键。
比较例15
采用与实施例4相同的方法，区别在于发酵转速为200rpm/min。
比较例16
采用与实施例4相同的方法，区别在于发酵转速为400rpm/min。
表7 不同转速下发酵嗜酸乳杆菌ATCC 4356的活菌数
由表7可知，发酵期间随着转速的增长，嗜酸乳杆菌的活菌数会随之下降。这是因为嗜酸乳杆体内的乙酸激酶只有在无氧环境中才能将乙酸盐进一步转化，有氧发酵时体系内初始少量的葡萄糖难以维持菌株高密度发酵，对应活菌数低。
实施例5
不同底盘菌对发酵活菌数的影响。
采用与实施例4相同的方法，区别在于发酵菌种选用嗜酸乳杆菌CICC 20244。
实施例6
采用与实施例4相同的方法，区别在于发酵菌种选用干酪乳杆菌CICC 25035。
实施例7
采用与实施例4相同的方法，区别在于发酵菌种选用鼠李糖乳杆菌CICC 20255。
比较例17 传统工艺发酵罐发酵嗜酸乳杆菌ATCC 4356的活菌数
用接种环在超净工作台上将菌株嗜酸乳杆菌ATCC 4356划线至MRS平板上，随后使用MRS固体培养基液封表面，37℃活化24h，待其长出单克隆；
在超净工作台中用无菌接种环挑取上述单克隆抗体，接种至装有30mL MRS培养基中的50mL摇菌管中，37℃，静置培养12h，获得一级种子液；
在超净工作台上用移液器将一级种子液以2%添加量添加至含250mL MRS液体培养基的500mL三角瓶中，37℃，静置培养12 h，获得二级种子液。
发酵培养基配制：葡萄糖30 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉10 g/L、七水硫酸镁0.6 g/L、一水硫酸锰0.2 g/L、牛肉浸粉10 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、吐温1 g/L，pH值调至7.0，通过去离子水配制定容至10L，108℃灭菌30分钟后冷却至常温使用。
按上述配方配制发酵培养基。
将二级种子液按5%接种于15L发酵罐（培养基总体积为10L）中的培养基中，调整发酵温度为37℃，不通气，搅拌转速200 rpm/min，发酵时间为24h，控制pH=5.5，直至发酵结束。
比较例18
采用与比较例17相同的方法，区别在于发酵菌种选用嗜酸乳杆菌CICC 20244。
比较例19
采用与比较例17相同的方法，区别在于发酵菌种选用干酪乳杆菌 CICC 25035。
比较例20
采用与比较例17相同的方法，区别在于发酵菌种选用鼠李糖乳杆菌 CICC 20255。
表8 不同底盘菌株使用不同碳源发酵工艺对发酵活菌数的影响
由表8可知，使用该混合碳源的发酵方法，不仅仅能使嗜酸乳杆菌ATCC 4356的发酵水平提高，嗜酸乳杆菌CICC 20244、干酪乳杆菌CICC 25035、鼠李糖乳杆菌CICC 20255同样能够有效的适配混合碳源的发酵模式，且相较于使用30 g/L的葡萄糖的传统发酵方法，使用该混合碳源发酵工艺的活菌数提升了10%-30%。当菌株体内存在乙酸或甲酸代谢相关的途径时，体系内的乙酸盐或甲酸盐就会被菌体利用，为菌体生长提供能量，从而促进菌体活菌数的增长。
通过以上对不同乳酸菌的代谢通路分析以及实验数据相结合，可知乳酸菌能够在以乙酸盐为主的混合碳源中，通过该套发酵工艺获得更高的活菌数。使用该以乙酸盐和甲酸盐为主的混合碳源的发酵工艺在减少粮食碳源发酵乳酸菌中具有高效性与创新性。
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (4)
1.一种混合碳源在含有乙酸盐和甲酸盐代谢通路的乳酸菌发酵培养过程中的应用，其特征在于：所述混合碳源为甲酸盐、乙酸盐和葡萄糖，所述甲酸盐在发酵液中的浓度5-10g/L，所述乙酸盐在发酵液中的浓度20-40 g/L，所述葡萄糖在发酵液中的浓度为3-5 g/L；所述甲酸盐为甲酸钠；所述乙酸盐是乙酸钠。
2.如权利要求1所述混合碳源在含有乙酸盐和甲酸盐代谢通路的乳酸菌发酵培养过程中的应用，其特征在于：所述甲酸盐和乙酸盐是电催化、热催化或光催化工业尾气二氧化碳获得的混合物。
3.一种乳酸菌发酵培养基，其特征在于：包括葡萄糖3-5 g/L、甲酸钠5-10 g/L、乙酸钠20-40 g/L、碳酸氢钠1-10 g/L、磷酸氢二钾0-2 g/L、柠檬酸氢二铵0.5-2 g/L、蛋白胨1-10g/L、酵母粉1-10 g/L、牛肉浸粉1-10 g/L、大豆蛋白胨1-5 g/L、七水硫酸镁0.2-0.6 g/L、一水硫酸锰0.05-0.2 g/L、吐温1 g/L， 108℃灭菌30分钟后冷却至常温使用。
4.一种乳酸菌发酵培养的方法，其特征在于，包括：
将乳酸菌菌种按接种量2%-10%接入发酵罐基础培养基，发酵过程厌氧发酵，发酵期间观察pH值变化，当pH值达到5.5时，添加补料培养基进行补料，所述发酵pH值为5-10，所述发酵温度为30℃-37℃，所述发酵周期为12-24h；
所述基础培养基为碳酸氢钠1-10 g/L、葡萄糖3-5 g/L、磷酸氢二钾0.5-2 g/L、柠檬酸氢二铵0.5-2 g/L、蛋白胨1-10 g/L、酵母粉1-10 g/L、七水硫酸镁0.2-0.6 g/L、一水硫酸锰0.05-0.2 g/L、牛肉浸粉1-10 g/L、大豆蛋白胨1-5 g/L、吐温1 g/L，通过去离子水配制，定容至9L，108℃灭菌30分钟后冷却至常温使用；
所述补料培养基为甲酸盐50-100 g/L，乙酸盐200-400 g/L，定容至1L，121℃灭菌20分钟后冷却至常温使用；
根据菌体生长情况补料，前0-12h不补料，后12h-24h使用补料培养基匀速流加，流加速度为2.08ml/min；整个发酵过程中的转速为50 rpm/min。
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