KR101245208B1 - 세라믹 막 분리 배양기 - Google Patents

Abstract

본 특허는 건강 식품으로 사용되기 위한 유산균의 제조를 위해 막 분리 배양기를 제조하는 기술과 발명된 기술을 산업화하는 기술을 포함한다. 본 특허에 사용된 세라믹 (ceramic) 막은 기존의 cellulose acetate polymer, polypropylene, polyvinylidene fluoride등 과는 달리 열과 산, 염기 (alkali)에 매우 강한 특징을 보인다. 본 특허에서 사용된 기술로서 막 배양기 설계의 특징은 외장형 막 분리 배양기 (externally installed membrane bioreactor)이며, 동시에 발효 전 배양기로 배지를 사입하는 방법으로서 배지 살균 방식이 막 분리 방법을 사용하여 막을 통한 여과 속도를 증가 시키는 특징을 갖는다. 본 특허에서 사용된 외장형 막 분리 배양기는 배양기내에 막 분리장치가 설치된 침지형 막 배양기 (submerged membrane bioreactor) 와는 다른 특징을 보이면서 본 특허에서 토론되었다. 본 특허는 외장형 막 분리 배양기에서 Bifidobacterium longum과 Lactobacillus plantarum의 배양을 다루고 있으며, 또한 본 특허에서 개발된 외장형 막 분리 배양기를 이용하여 기존의 회분식 배양 (stirred tank reactor)에 비하여 높은 균체 농도 (high biomass density)와 효율(effectiveness)로 살아있는 유산균을 배양하는데 성공 하였음을 기술하였다. 단위 시간 당 균체 생산 속도는 B. longum의 경우 건조 균체 증가 속도 (g/L,h as DCW) 가, 4.06 배, 생균수 증가속도 (cfu/L,h) 이상으로 증가되었으며, L. plantarum의 경우 6.81 배와 76.96 배가 각각 증가하였다. 또한 vial culture에 비하여, 총균체농도 (total X)는 B, longum의 경우 8.21배, L. plantarum의 경우 19.01배 증가하였다.

Description

세라믹 막 분리 배양기{Ceramic Membrane Bioreactor}

본 발명은 세라믹 막 분리 배양기 에 관한 기술이다. 보다 상세하게는 Zircon-alumina 또는 Zircon-titanium 재질의 ceramic 막 필터(3), 배지 살균용 막 필터(4), 배양기(2) 및 배지 제조 탱크(5)를 포함하는 세라믹 막 분리 배양기 및 상기 막 분리 배양기를 이용한 유산균Lactobacillus plantarum 또는 Bifidobacterium longum의 비호기적 배양방법 나아가 Lactobacillus , Bifidobacterium , Leuconostoc, Oenococcus , Weisella 속에 속하는 유산간균, Clostridium butyricum 및 Actinobacillus succinogenes , 나아가 구균(coccus)인 Streptococcus , Enterococcus 속에 속하는 유산구균의 비호기적 배양방법에 관한 기술을 포함한다. 그리고 succinic acid 등의 생산방법, 생활하수(municipal sewages) 등의 분해방법, bio-gas의 생산방법, 감미료의 생산방법, 저 알코올음료(alcoholic beverage)를 숙성방법 등에 관한 기술이다.

유산균은 인간과 함께 존재하면서 인간의 건강에 도움이 돼 왔으며, 최근 유산균의 이용은 양적으로나 방법적으로 수효가 크게 증가하고 있다. 최근에 유산균 market에서의 요구는 기존의 회분식 배양 방법에서 고 농도 배양 형태로 기술적인 발전을 요구하고 있다.

[1] 유산균의 산업적 응용과 고농도 유산균에 대한 요구

최근 항생제 남용으로 발생하는 부작용 때문에 항생제의 사용 규제가 강해지면서 유산균은 건강식품의 분야에서 항생제 사용의 대체제로서 pro-biotics의 사용이 증가하고 있으며 건강기능식품공전 개별기준 및 규격에 의하면 하루 섭취량이 10⁸ ~ 10¹⁰ cfu 의 수준으로 사용되고 있지만 최근 dosage를 증가해야 한다는 요구와 함께 투여량이 > 10¹¹ cfu까지 증가하고 있다.

Pro-biotics로 사용되는 유산균은 동물의 건강과 성장을 강화하면서 silage와 사료 (feed-stocks) 등에 첨가되어 사용되고 있다. 가축의 사료나 silage 등에 사용될 경우 유산균은 feed나 silage가 다른 동물 병원성 미생물에 의한 오염을 막고 동시에 silage에 존재하는 탄소원이 CO₂로서 감소되는 것을 막는 효과를 가지고 있다. 그러나 silage에 초기 투여량 등은 > 10⁶ cfu/g of silage가 되었을 경우 그 효과를 보이며, 또한 feed-stock의 경우도 동물의 장에 유산균이 도달할 때 10⁶ ~ 10⁸ cfu/ml of gastric fluid 정도로서 dosage를 나타내고 있다.

pro-biotics는 최근 capsule이나 tablet으로 제조되어 복용될 뿐만 아니라, 전통적으로yogurt나 또는 Yakult의 형태로 복용되어 왔다. 이런 Yakult나 yogurt 제품들은 우유를 이용한 발효 식품들로서 함유하고 있는 유산균은 10⁸ ~ 10⁹ cfu 를 포함하고 있다. 그러나 우유의 유기산 발효 후 curd의 환경은 유산균에 친화적이지 않으므로 유산균을 혼합 할 경우 매우 높은 농도 (10¹¹ ~ 10¹² cfu/g) 의 유산균 원료가 필요하다. 이런 경우 매우 높은 농도의 유산균 starter culture가 요구된다.

또한 유산균은 European wine이나 cider의 제조에서 whole cell biocatalyst로서 malolactic bio-transformation을 위해 사용된다. Biocatalysts로서 사용되며 배양 부적합한 환경에서 또는 반응 환경에서 반응이나 배양의 효과를 강화하기 위해서 사용되는 유산균의 최초 접종 농도는 최소 10⁸ 이상 되어야 한다.

[2] 순수 유산균에 대한 요구

막 분리 배양기의 특징은 배양 중에 발생하는 젖산, 초산, 개미산과 같은 유산균의 성장에 저해를 줄 수 있는 저해 물질들을 연속적으로 제거하고 동시에 새로운 배지를 배양 시스템에 공급하는 연속식 배양 형태를 기본으로 한다. 더구나 막 분리 배양기는 이런 연속식 배양 시스템에 막 분리 기능을 첨가하여 균체를 배양 시스템 내에 축적시키고 성장 저해 물질만을 선택적으로 제거하는 추가적인 기능을 가지고 있다.

따라서 막 분리 배양기에서 균체는 기존의 STR 발효 방법에 비하여 보다 낮은 농도의 성장 저해 물질을 포함하게 된다. 이렇게 발효 후 저해물질의 낮은 농도는 회수 공정에서 균체의 안정성 (viability)에도 긍정적인 영향을 줄 수 있다.

[3] 생산 용량 (capacity)의 축소

막 분리 배양기는 기존의 STR에 비하여 높은 생산성을 보인다. 작은 생산 capacity를 가지고 기존의 STR와 비슷한 생산량을 얻을 수 있다. 표 1 은 여러 종류의 막 분리 배양기를 사용하여 얻은 생산성 증가의 예들이다. 막 배양기에서 얻어진 균체 양과 배양의 효율은 배양 시간과 feeding배지의 양과 비례하여 증가하며 또한 배양 중인 균체의 viability는 유기산에 대한 균체의 저항성 factor, 막 장치의 필터 면적 (m²)에 대한 전체 volume (L)의 연계로서 dilution rate (D)에 의존한다.

특히 건강식품, starter culture에서는 균체의 viability가 매우 중요하므로 막 분리 배양기의 운전 중, 균체의 viability에 영향을 줄 수 있는 유기산과 당 농도를 맞추고, 또한 배양 중 wall shear stress를 조절하는 것이 중요하다.

[4] 기타 생물 공정에서 막 배양기의 활용성 증가

최근 막 배양기의 활용성은 기존의 생물 공정을 강화하는 목적으로 생물공정의 여러 분야로 빠르게 확산하고 있다. 막 배양기는 비 호기성 균주를 고농도로 배양 할 수 있는 장점이 있기 때문에 생산된 고농도의 균체를 이용하여 생물 공정을 빠른 속도로, 그리고 농축 환경에서 효과적으로 처리할 수 있다. 막 배양기의 이런 장점을 이용하여 확산하는 분야는 생물 전환 촉매 반응 (biotransformation), 환경 수 (water)처리, 슬러지 (sludge) 처리, 저 칼로리 감미료의 생산, 생물 재생 에너지 (renewable bio-energy)등이다.

본 발명은 유산균을 건강식품으로 생산하는 과정으로, 세라믹 막 배양기를 이용하여 유산균을 고농도로 배양하고, 생산 과정에서 viability를 증가시키기 위한 방법들을 다루고 있다.

[5] 본 발명의 배경기술로서 인용문헌은 아래와 같으며, 하기의 기재 중 관련내용에서 참고문헌을 표시하였다.

(1) Ohashi R., Yamamoto T., and Suzuki T. (1999) Continuous production of lactic acid from molasses by perfusion culture of Lactococcus lactis using a stirred ceramic membrane reactor J Biosci Bioeng 87(5):647 ~ 654

(2) Boudrant J., Menshutina N.V., Skorohodov A.V., Guseva E.V., Fick M. (2005) Mathematical modeling of cell suspension in high cell density conditions application to l-lactic acid fermentation using Lactobacillus casei in membrane bioreactor Process Biochem 40:1641 ~ 1647

(3) Silvia E.M., Yang S-.T., (1995) Kinetics and stability of a fibrous-bed bioreactor for continuous production of lactic acid from unsupplemented acid whey J Biotech 41:59 ~ 70

(4) Schiraldi C., Adduci V., Valli V., Maresca C., Giuliano M., Lamberti M., Carteni M., De Rose M (2003) High cell density cultivation of probiotics and lactic acid production B & B 82(2):213 ~ 222

(5) Kwon S.G., Son J. W., Kim H. J., Park C. S., Lee J. K., Ji G. E. and Oh D. K. (2006) High concentration cultivation of Bifidobacterium bifidum in a submerged membrane bioreactor Biotechnol Prog 22:1591 ~ 1597

(6) Suzuki T. (1996) A dense cell culture system for microorganisms using a stirred ceramic membrane reactor incorporating asymmetric porous ceramic filters J Ferm and Bioeng 82(3):264 ~ 271

(7) Crespo J.P.S.G., Xavier A.M.R.B., Barreto M.T.O., Goncalves L.M.D., Almeida J.S., and Carrondo M.J.T. (1992) Tangential flow filtration for continuous cell recycle culture of acidogenic bacteria Chem Eng Sci 47(1):205 ~ 214

(8) Bibal B. Vayssier Y., Goma G., and Pareilleux A. (1991) High-concentration cultivation of Lactococcus cremoris in a cell-recycle reactor B & B 37 : 746 ~ 754

(9) Levenspiel O. (1980) The Monod equation: A revisit and a generalization to product inhibition situations B&B XXII:1671 ~ 1687

(10) Sikder J., Pereira C., Palchoudhury S., Vohra K., Basumatary D., Pal P. (2009) Synthesis and characterization of cellulose acetate-polysulfone blend microfiltration membrane for separation of microbial cells from lactic acid fermentation broth Desalination 249:802 ~ 808

(11) Guo H., Ulbricht M. (2010) Surface modification of polypropylene microfiltration membrane via entrapment of an amphiphilic alkyl oligoethyleneglycoether J Membrane Sci 349:312 ~ 320

(12) Chua L.P., Tung S.C. and Chan W.K. (1999) Preliminary measurements of wall stress Int Comm Heat Mass Transfer 26(1):65 ~ 74

(13) Jaouen P., Vandanjon L., Quemeneur F. (1999) The shear stress of microalgal cell suspension (Tetraselmis suecica) in tangential flow filtration systems: the role of pumps. Bioresource Technol 68:149 ~ 154

(14) Detry J.G., Jensen B.B.B., Sindic M., Deroanne C. (2009) Flow rate dependency of critical wall shear stress in a radial-flow cell. J Food Eng 92:86 ~ 99

(15) Kiviharju K., Salonen K., Leisola M., Eerikainen T. (2007) Kinetics of Bifidobacterium longum ATCC 15707 growth. Process Biochem 42: 1140 ~ 1145

(16) Jung I. and Lovitt R.W. (2010) A comparative study of the growth of lactic acid bacteria in a pilot scale membrane bioreactor. J Chem Technol Biotechnol 85: 1250 ~ 1259

본 발명에서는 세라믹 막 분리 배양기를 제공함을 목적으로 한다. 보다 상세하게는 Zircon-alumina 또는 Zircon-titanium 재질의 ceramic 막 필터 (3), 배지 살균용 막 필터(4), 배양기(2) 및 배지 제조 탱크(5)를 포함하는 세라믹 막 분리 배양기 및 상기 막 분리 배양기를 이용한 유산균Lactobacillus plantarum 또는 Bifidobacterium longum의 비호기적 배양방법 나아가 Lactobacillus , Bifidobacterium, Leuconostoc , Oenococcus , Weisella 속에 속하는 유산간균, Clostridium butyricum 및 Actinobacillus succinogenes , 나아가 구균(coccus)인 Streptococcus, Enterococcus 속에 속하는 유산구균의 비호기적 배양방법에 관한 기술을 포함한다. 그리고 succinic acid 등의 생산방법, 생활하수(municipal sewages) 등의 분해방법, bio-gas의 생산방법, 감미료의 생산방법, 저 알코올음료(alcoholic beverage)를 숙성방법 등을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명에서 사용하는 약어의 구체적인 내용은 하기와 같이 정의된다.

C _R : inhibitor의 농도 (mole/L)

: 성장을 완전히 멈추는 inhibitor (mole/L)

μ_A: apparent growth rate (h^-1)

μ_m: 최대 성장 속도 (h^-1)

μ^*: C_R에서 균체의 성장 속도 (h^-1)

n: 독성 factor (dimensionless)

S: 기질 농도 (mole/L)

X: 균체 농도 (g/L)

g_w: wall shear stress (N/m²,Pa.s)

r: radius (m)

ω: 각 속도 (m/sec)

Re: Reynold number (diensionless)

d: pump head의 impeller의 끝과 head 내부의 차이 (m)

ρ: density (kg/m³)

Q: flow rate (m³/sec)

υ: kinematic viscosity (m²/sec)

α: dynamic viscosity (N.s/m², Pa.s)

L : 길이 (m)

본 발명에서는 Zircon-alumina 또는 Zircon-titanium 재질의 ceramic 막 필터(3), 배지 살균용 막 필터(4), 배양기(2) 및 배지 제조 탱크(5)를 포함하는 세라믹 막 분리 배양기를 제공한다.

상기 막 분리 배양기에 중앙 control panel(1), 배양 온도 조절용 열 교환기(6), level 조절기(7), 소비된 알칼리 측량용 로드 셀(8), 열 교환기의 온도 조절용 솔레노이드 발브(9), 유량계(10), 압력계(11), 온도계(14), bubbling bottle(15), pH 전극(17) 및 diaphragm valve(18)를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 Zircon-alumina 또는 Zircon-titanium 재질의 ceramic 막은0.1~1.0 micron 다공 크기의 세라믹 막인 것을 특징으로 할 수 있고; 상기 배양기(2)와 별도로 분리 설치됨을 특징으로 할 수 있다.

상기 Zircon-alumina 또는 Zircon-titanium 재질의 ceramic 막에서 발생하는 wall shear stress를 줄이기 위해서, fiber의 내경이 2~4mm임을 특징으로 할 수 있다.

상기 배지 살균용 막 필터(4)와 배양기(2) 사이에 배지 저장용 탱크를 설치하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 막 배양기의 wall shear stress를 줄여 생산되는 균체의 viability와 안정성(stability)를 증가시키기 위해서 gear pump, diaphragm pump 및 lobe pump 등으로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나를 추가하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명에서는 세라믹 막 분리 배양기를 이용하여 feed 배지 내 단백질원 1.0%(w/v), 탄소원 와 1.0 ~ 2.0%(w/v)로 유지함으로써, 유기산 농도는 감소시키되, 균체 성장속도는 증가시키는 것을 특징으로 하는 비호기적 배양방법을 제공한다.

상기 균체는 유산균 Lactobacillus plantarum 또는 Bifidobacterium longum인 것을 특징으로 할 수 있다. 그리고 Lactobacillus , Bifidobacterium , Leuconostoc , Oenococcus , Weisella 속에 속하는 유산간균, Clostridium butyricum 및 Actinobacillus succinogenes , 나아가 구균(coccus)인 Streptococcus, Enterococcus 속에 속하는 유산균을 포함할 수 있다.

또한 본 발명에서는 상기 비호기적 배양방법을 이용하여 succinic acid, lactic acid 및butyric acid 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 탄소화합물을 생산하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명에서는 상기 세라믹 막 분리 배양기를 이용하여 생활하수(municipal sewages), 생활 슬러지(sludge), 공업 슬러지, 농업 슬러지 및 수산 슬러지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 분해하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명에서는 상기 세라믹 막 분리 배양기를 이용하여 메탄(CH₄) 또는 수소(H₂)를 생산할 수 있는 비호기성 균을 배양함으로써 bio-gas를 생산하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명에서는 상기 세라믹 막 분리 배양기를 이용하여 배양된 유산균을 이용함으로써 mannitol, trehalose, sorbitol 및 xylitol으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 생산하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명에서는 상기 세라믹 막 분리 배양기를 이용하여 배양된 유산균을 이용함으로써 알코올 농도가 13%(w/v) 이하인 저 알코올음료(alcoholic beverage)를 숙성(maturation)하는 방법을 제공한다.

보다 구체적으로 설명하면, 본 발명은 건강 식품으로 사용되기 위한 유산균의 제조를 위해 막 분리 배양기를 제조하는 기술과 발명된 기술을 산업화하는 기술을 포함한다.

본 특허에 사용된 세라믹 (ceramic) 막은 기존의 cellulose acetate polymer, polypropylene, polyvinylidene fluoride등 과는 달리 열과 산, 염기 (alkali)에 매우 강한 특징을 보인다. 본 특허에서 사용된 기술로서 막 배양기 설계의 특징은 외장형 막 분리 배양기 (externally installed membrane bioreactor)이며, 동시에 발효 전 배양기로 배지를 사입하는 방법으로서 배지 살균 방식이 막 분리 방법을 사용하여 막을 통한 여과 속도를 증가 시키는 특징을 갖는다. 본 특허에서 사용된 외장형 막 분리 배양기는 배양기내에 막 분리장치가 설치된 침지형 막 배양기 (submerged membrane bioreactor) 와는 다른 특징을 보이면서 본 특허에서 토론되었다.

본 특허는 외장형 막 분리 배양기에서 Bifidobacterium longum과 Lactobacillus plantarum의 배양을 다루고 있으며, 또한 본 특허에서 개발된 외장형 막 분리 배양기를 이용하여 기존의 회분식 배양 (stirred tank reactor)에 비하여 높은 균체 농도 (high biomass density)와 효율(effectiveness)로 살아있는 유산균을 배양하는데 성공 하였음을 기술하였다. 단위 시간 당 균체 생산 속도는 B. longum의 경우 건조 균체 증가 속도 (g/L,h as DCW)가 4.06 배, 생균수 증가속도 (cfu/L,h)는 19.2 배로 증가되었으며, L. plantarum의 경우 6.81 배와 76.96 배가 각각 증가하였다. 또한 vial culture에 비하여, 총균체농도 (total X)는 B. longum의 경우 8.21배, L. plantarum의 경우 19.01배 증가하였다.

하기 표 1은 막 분리 배양기를 이용한 유산균의 발효에서 균체 농도에 관한 것이다.

배양기 (types)	미생물 종 (species)	E- area (m2)	Biomass (g L-1, dcw)	배양시간 (hours)	Dilution rate ( h -1)	Ref (No)
ISCMBR	L. lactis	0.08	248	643	0.4 - 0.2	1
ECMBR	L. casei		125	60	0.6	2
ECMBR	L. helveticus		63	90	0.33	3
EPMBR	L. delbruecki	0.023	18	25	0.2	4
ISPMBR	B. bifidum	25	12	36	0.075	5
ESCMBR	L. lactis	0.06	141	238	0.3	6
ESCMBR	Propionibacterium acidipropionici L. delbruecki L. plantarum	0.1	140 148 73	180 180 180	0.3 0.4 0.4	7
ESCMBR	L. cremoris	0.2	88	50	1.05	8

ISCMBR: internally stirred ceramic membrane reactor, ECMBR: externally fitted ceramic membrane bioreactor, EPMBR: externally fitted polypropylene membrane bioreactor, ISPMBR: internally submerged polyvinylidene fluorides membrane bioreactor, ESCMBR: externally stirred ceramic membrane bioreactor

하기 표 2는 외장형 막 배양기 (externally fitted membrane bioreactor)와 침지형 막 배양기(submerged membrane bioreactor)의 장/단점을 정리한 것이다.

외장형 막 배양기		침지형 막 배양기
장점	단점	장점	단점
-Cleaning 작업이 간편하다 -오염에 강하다 -외부 가압식 방법으로 액을 순환하여 membrane flux 조절이 쉽다 -Shear rate를 조절하여 membrane fouling에 저항성이 강하다. -배양기 부분과 막 부분의 압력을 별도로 조절할 수 있다 -막의 추가와 제거가 간편하여 scale-up이나 scale-down이 쉽다.	-Shear stress가 강하다.	-Shear에 민감한 공정에 유리하다. -점도가 높은 fluids의 공정에 유리하다.	-cleaning작업이 어렵다. -오염에 약하다. -배양기 부분과 막 분리 부분의 압력을 다르게 조절할 수 없다. -Scale-up 이나 scale-down이 어렵다. -외부 흡입 식으로 막 여과 속도를 조절하여 막 여과 속도의 조절이 어렵다.

하기 표 3는 표준 glucose, fructose, acetic acid, lactic acid, mannitol, malic acid을 이용하여 제조된 standard curve에 관한 것이다.

표준 유기산, 당	The linear relationship between the substance concentration (mM) and the HPLC peak area (mV).	Reference
Lactate	Y = 314005 X + 6566.08 (t = 0.996)	도 6 (a)
Acetate	Y = 94949.64 X + 3573.26 (t = 0.999)	도 6 (b)
Glucose	Y = 93485.46 X + 5388.07 (t = 0.999)	도 6 (c)
Fructose	Y = 29998.77 X - 1099.45 (t = 0.998)	도 6 (d)

하기 표 4는 배양 방법에 따른 균체 생산성의 변화 에 관한 것이다.

Culture mode	B. longum	L. plantarum
Vial	12 h μ = 0.385 /h Total X = 2.7 g/L	12 h μ = 0.086 /h Total X = 1.55 g/L
생산성 증가 (times)	1.0	1.0
Batch	12 h μ1 = 1.13 /h μ2 = 0.31 /h Total X = 5.46 g/L Viable cells = 1.1 X 1012 cfu/L	12 h μ1 = 0.505 /h μ2 = 0.208 /h Total X = 4.33 g/L Viable cells = 6.9 X 1012 cfu/L
생산성 증가 (times)	2.02 (1)	2.79 (1)
Fed-batch	12 h μ1 = 1.102 /h μ2 = 0.456 /h Total X = 6.96 g/L Viable cells = 1.8 X 1012 cfu /L	12 h μ1 = 0.460 /h μ2 = 0.267 /h Total X = 6.26 g/L Viable cells = 28 X 1012 cfu/L
생산성 증가 (times)	1.27 (2.01)	1.45 (5.86)
MBR	12 h μ = 0.134 /h D = 0.65 ~ 0.47 /h Total X = 22.18 g/L Viable cells = 5.2 X 1012 cfu/L	20 h μ = 0.076 /h D = 0.136 ~ 0.56 /h Total X = 29.48 g/L Viable cells = 130 X 1012 cfu/L
생산성 증가 (times)	3.19 (9.21)	2.82 (13.14)

생산성 증가에서 시간 당 건조 균체 중량 기준의 증가 (g/L,h as DCW) 는 괄호 밖에서, 그리고 cfu (cfu/L,h as viable cell count) 기준의 생산성 증가는 괄호 내에서 표시되어 있다.

μ₁ ; 배양 초기에서 배지 feeding 시작 전(6 h)까지의 성장속도

μ₂ ; 배지 feeding이 시작 된 후에서 발효 종료까지의 성장속도

본 발명에 따르면 기존의 회분식 배양 (stirred tank reactor)에 비하여 높은 균체 농도 (high biomass density)와 효율(effectiveness)로 살아있는 유산균을 배양하는데 유리한 효과가 인정된다.

보다 구체적으로는 단위 시간 당 균체 생산 속도는 B. longum의 경우 건조 균체 증가 속도 (g/L,h as DCW)가 4.06 배, 생균수 증가속도 (cfu/L,h)는 19.2배로 증가되었으며, L. plantarum의 경우 6.81 배와 76.96 배가 각각 증가하였다. 또한 vial culture에 비하여, 총균체농도 (total X)는 B, longum의 경우 8.21배, L. plantarum의 경우 19.01배 증가하였다.

도 1은 온도에 따른 물 (J_W), 성장 배지 (J_m) 그리고 detergent로서 0.01%(w/v) Tween-80 (J_md)을 포함한 성장 배지의 막 여과 속도 (membrane flux)에 관한 것이다. 본 여과 실험에 사용된 성장 배지는 1.0%(w/v) glucose, 0.9%(w/v) yeast extract만을 포함하였다.
도 2는 특허에 사용된 막 분리 배양기의 flow chart, pump 1, 2, 3은 magnetic co-centrifugal pumps로서 hygienic control하에서 작동되었으며 pump의 speed는 중앙 control panel (1)에 의해서 조절되었다. 각각의 부호에 대한 내용은 아래와 같다.
1 : 중앙 control panel
2 : 70 L 배양기
3 : Zircon-alumina 또는 Zircon-titanium 재질의 ceramic 막 필터(효과 면적, 0.7 m², 0.17 micro-meter pore size, 3.0 mm fiber diameter, 1 m 길이, 25 mm diameter)
4 : 배지 살균용 막 필터 (효과 면적, 0.7 m², 0.17 micro-meter pore size, 3.0 mm fiber diameter, 1 m 길이, 25 mm diameter)
5 : 100 L 배지 제조 탱크
6 : 열 교환기 (배양 온도 조절용)
7 : level 조절기
8 : 로드 셀 (소비된 알칼리 측량)
9 : 솔레노이드 발브 (열 교환기의 온도 조절용)
10 : 유량계
11 : 압력계 (P1)
12 : 압력계 (P3)
13 : 압력계 (P2)
14 : 온도계
15 : bubbling bottle
16 : 유량계
17 : pH 전극
18 : 다이아 프람 발브 (diaphragm valve)
도 3은 magnetic co-centrifugal pump에서 pump speed증가에 따른 wall shear stress의 변화에 관한 것이다. 각 sample은 막 분리 배양기에서 얻은 B. longum의 발효 액과 water(●, ○)를 사용하였으며, B. longum의 발효 액은 dynamic viscosity가 2.38 X 10^-3 kg-f m²/sec (▲, △)와 6.1 X 10^-3 kg-f m²/sec(■, □)이었으며, 온도는 37℃ 이었다. 참고로 37℃에서 물의 dynamic viscosity는 6.92 X 10^-4이었다.
도 4는 ceramic membrane과 composite membrane사이의 wall shear stress의 비교에 관한 것이다. Ceramic membrane(●)의 dimension은 1 m 길이, 2.5 X 10^-2 m cartridge의 직경 (3 X 10^-3 m 내부 fiber의 직경), 0.35 m² 효과 면적을 가진 Zircon-alumina 또는 Zircon-titanium 재질의 막이었다. Composite membrane(○)은 GE health life science에서 구입된 polypropylene 재질의 막이었으며, dimension은 6.0 X 10^-1 m 길이, 5.0 X 10^-2 m 직경 (1.0 X 10^-3 m 내부 fiber의 직경), 1.8 m² 효과 면적을 가지고 있었다.
도 5는 전 배양과 vial culture를 위한 10 ml 압력 튜브와 50 ml vials, butyl rubber stopper, aluminum seals에 관한 것이다.
도 6은 표준 시약을 이용한 standard curve에 관한 것이다. a)는 lactic acid (mM), b)는 acetic acid (mM), c)는 glucose (mM) 그리고 d)는 fructose (mM)에 대한 표준 곡선이다.
도 7은 L. plantarum 의 성장에서 glucose, yeast extract, soy peptone의 효과에 관한 것이다. a)는 glucose 의 농도(mM)에 대한 균체 농도(X, ●)의 변화와 따르는 대당 수율(Y_{x /s}, ○)을, b)는 yeast extract의 첨가 농도에 대한 L. plantarum 성장 속도(μ)의 변화를 보인다. C)는 첨가된 soy peptone의 농도에 대한 배양 종료 시 균체 농도의 변화를 보이고 있으며, d)는 첨가된 soy peptone의 농도에 대한 L. plantarum 성장 속도에서의 변화를 보인다.
도 8은 B. longum의 성장에서 glucose, fructose, yeast extract, ammonium sulfate 농도의 영향에 관한 것이다. a)는 함수 포도당의 농도(mM)에 따른 균체 농도(●)의 증가와 대당 수율(○), b) 100 mM 함수 포도당과 함께 fructose의 농도 증가에 따른 B. longum 성장 속도(μ)에서의 증가, c)는 yeast extract의 농도 증가 (%(w/v))에 따른 성장 속도의 증가, d) 효모 추출물 없이 ammonium sulfate의 농도 증가에 따른 성장 속도의 변화 e)효모 추출물 없이 ammonium sulfate의 농도 증가에 따른 균체 농도에서의 변화, f) 효모 추출물 (Y)과 soy peptone (S)을 ammonium sulfate (A)와 함께 첨가한 경우 성장 속도에서의 변화이며, 이 때 Y (1.0%(w/v)), S (1.0%(w/v)), YS (0.5%(w/v) + 0.5%(w/v))로서 각각의 경우에 ammonium sulfate (10 mM)이 첨가되었다.
도 9는 vial 배양에서 B. longum과 L. plantarum의 배양 표준 곡선에 관한 것이다. Vial culture 에서 a) L. plantarum과 b) B. longum의 배양 표준 곡선. L. plantarum의 경우 성장 속도는 0.086 /h으로 1.55 g/L의 균체를 얻었으며, B. longum의 경우 0.385/h의 성장 속도로 성장하여 2.7 g/L의 균체를 얻었다. pH는 L. plantarum의 배양 초기 pH 5.5에서 시작하여 pH 2.5 주변까지 감소되었으며, B. longum의 경우 초기 pH 6.3에서 시작하여 pH 3.5까지 떨어졌다.
도 10은 L. plantarum과 B. longum의 유기산에 대한 성장 억제 효과에 관한 것이다. a) L. plantarum과 b) B. longum의 lactic acid(○)와 acetic acid(△)에 대한 성장 억제 효과. μ는 각 유기산 농도 (mM)에서의 초기 6시간 내의 성장속도이고 μ_o는 유기산이 초기에 첨가되지 않은 경우의 초기 성장속도이다.
도 11은 STR에서 B. longum의 batch 배양과 fed-batch 배양의 표준 성장 곡선에 관한 것이다. STR에서 batch 배양(●)을 한 경우와 vial culture에서 선정된 배지의 조성을 이용하여 fed-batch(○)를 한 경우를 비교하였다. 12 h의 배양 동안 batch culture는 5.46 g/L의 건조 균체를, fed-batch의 경우 6.96 g/L를 건조 균체를 생산하였다. 이때 비교 배양으로 batch 배양의 배지는 2.5%(w/v) 함수 포도당, 1.0%(w/v) soy peptone, 1.5%(w/v) 효모 추출물, 제 1인산 칼륨, K-citrate, Na-glutamate, L-cycteine, 황산 마그네슘, 황산 망간을 첨가하였다. 생균수로는 fed-batch 배양의 경우 2.8 X 10⁹ cfu/ml가, batch 배양의 경우 1.1 X 10⁹ cfu/ml가 분석되었다. 배지에 함수 포도당(○)을 첨가하여 B. longum을 배양 한 경우 Lactic acid(△) 와 acetic acid(□)가 형성되었다. 또한 배양 동안 첨가된 alkali (5.0 mole NaOH /L)는 batch 배양(●)과 fed-batch(○)의 각각 축적된 양으로 표시되었다.
도 12는 STR에서 L. plantarum의 batch 배양과 fed-batch 배양의 표준 성장 곡선에 관한 것이다. STR에서 batch 배양(●)을 한 경우와 vial culture에서 선정된 배지 조성을 이용하여 fed-batch 실험(○)을 한 경우 비교하였다. 이때 비교로서 batch 배양의 배지는 4.0%(w/v) 함수 포도당, 1.0%(w/v) soy peptone, 1.5%(w/v) 효모 추출물, K-citrate, 황산 마그네슘, 황산 망간을 첨가하였다. 12 h의 배양 시간 동안 L. plantarum은 batch culture를 통하여 4.33 g/L까지 성장하였으며 fed-batch를 통하여 6.26 g/L까지 증식하였다. 이때 batch culture 동안 균체 증식속도 μ = 0.287 /h이었으며 fed batch 동안 균체 증식속도 μ = 0.324 /h이었다. 생균수로는 fed-batch 배양의 경우 2.8 X 10¹⁰ cfu/ml가, batch 배양의 경우 6.9 X 10⁹ cfu/ml가 분석되었다. 또한 함수 포도당(○)을 이용하여 L. plantarum을 배양한 경우 Lactic acid(△)가 형성되었다. 또한 배양 중에 첨가된 alkali (5.0 mole NaOH /L)는 batch 배양(●) 과 fed-batch 배양(○) 에서 각각의 시간 당 축적된 양으로서 표시되었다.
도 13은 막 분리 배양기에서 B. longum의 배양에 관한 것이다. B. longum은 막 분리 배양기에서 12 h의 배양 동안 총 X = 22.18 g/L의 건조 균체 중량(●)을 생산하였으며, 성장 속도는 0.134 /h이었다. 또한 배양의 초기 4시간 까지 dilution rate(●)는 D = 0.65 h^-1까지 증가할 수 있었지만, 균체 농도의 증가와 함께 빠르게 감소되어 D = 0.47 h^-1에서 안정화되었다. 배양 동안 함수 포도당(●)과 fructose(▲)가 feed 배지와 함께 연속 공급되었으며 배양기 내에 lactic acid( )는 50 mmole L^{- 1}이하로 유지되었으며, acetic acid (r)는 200 mmole L^-1 주변에서 유지될 수 있었다. 배양 종료 시 생균수는 5.2 X 10⁹ cfu/mL이었다.
도 14는 막 분리 배양기에서 L. plantarum의 배양에 관한 것이다. L. plantarum은 막 분리 배양기에서 총 20 h의 배양 동안 X = 29.48 g/L의 건조 균체(●) 중량을 생산하였으며, 균체 증식속도 (μ) = 0.076 h^{- 1} 이었다. 배양 동안 dilution rate (○) D = 0.136 h^-1에서 시작하여 최고 D = 0.56 h^-1까지 증가되었으며 더 이상 증가되지는 않았다. 배양 중에 함수 포도당(●)의 농도는 50 mmole/L 주변에서 유지되었으며, lactic acid (○)는 초기 100 mmole/L에서 균체 농도와 함께 증가하기 시작하여 발효 말기 325 mmole/L까지 증가되었다. 배양 종료 시 배양액 내의 생균수는 1.3 X 10¹¹ cfu/ml이었다.
도 15는 Wall shear stress에 따른 L. plantarum과 B. longum의 안정성 (stability)에 관한 것이다. 막 배양기에서 a) L. plantarum과 b) B. longum의 배양 시, wall shear stress가 균체의 viability에 미치는 영향을 나타내고 있다. 균체의 안정성 (stability)를 분석하기 위해서 40℃에서 총 4 주 동안 생균수는 분석되었다. 두 균주를 발효 후, pellet은 원심 분리를 통해 회수되었으며, 보호제로 20.0%(w/w) trehalose, 10.0%(w/w) malto-dextrin, 1.0%(w/w) skim milk, 2.0%(w/w) K-phosphate buffer (2.5 mole/L, pH 8.5), 1.2%(w/w) xanthan gum이 pellet 대비로 첨가되어 동결 건조되었다.

첨부된 도면을 참조하여 본 발명인 세라믹 막 분리 배양기 및 이를 이용한 방법에 대해 구체적으로 설명한다.

첫째, 우선 본 발명에서 사용된 막 분리 배양기에 대해서 구체적으로 기재한다.

[1] 막 분리 방식에 의한 배지 살균 (도 2)

기존의 STR 발효에서 성장 배지의 성분과 농도는 균체의 성장속도(μ_m)와 발효 종료 시 전체 균체 농도를 결정하는 중요한 factor이다. 따라서 기존의 STR배지는 균체의 성장 속도를 최대로 유지하기 위해서 가능한 한 고 농도의 풍부한 nutrition을 포함하고 있다. 그러나 막 분리 배양기에서 성장 속도는 dilution rate와 막 배양을 시작하는 시점에서의 균체농도에 절대적으로 의존한다. 즉, 배양 중에 배지 내에 축적된 유해 물질들의 제거, 새로운 nutrition의 공급속도 등이 모두 dilution rate에 의해 결정되기 때문이다 [참고문헌 8, 9]. 즉,

또한 dilution rate(D)를 최적화하는 것은 균체의 성장 속도를 최대화함은 물론 균체 생산 수율 (yields)을 극대화하는 효과를 갖는다.

또한 막 배양기의 장점은 균체의 성장에 해로운 물질은 연속적으로 제거하면서 동시에 균체는 배양기를 포함한 system내에 농축하는 것이다.

따라서 균체의 농축은 기존의 batch culture에 따른다. 즉,

로서 균체의 증가 속도는 존재하는 균체 농도에 비례한다 [참고문헌 15]. 막 배양 system은 그 시작의 point가 높은 균체 농도에서 시작하므로 기존의 batch culture에 비하여 일반적으로 높은 생산성을 보인다 [참고문헌 16].

막 여과 속도 (membrane flux)는 배지 내에 존재하는 particle들의 분포에 따라 크게 영향을 받는다. 배지 성분들의 수용성 정도, 단백질 농도, 불용성 입자들의 크기 분포 등은 막 여과 속도에 영향을 주는 가장 큰 요인들 이다. 따라서 배지 성분들의 주의 깊은 선택과 여과에 의한 배지 살균은 막 여과 배양 중에 배지의 여과 속도에 영향을 주는 결정적인 인자이다.

도 1은 본 특허에 사용된 세라믹 막을 이용하여 막의 여과 속도에 영향을 줄 수 있는 온도, 단백질 농도의 영향을 조사한 경우를 나타내고 있다.

실험에 사용된 배지는 1.0%(w/v) glucose와 0.9%(w/v) yeast extract를 포함 한 경우로서 30 ~ 40℃ 온도에서 200 L/m²,bar,h의 막 여과 속도를 보이지만, 당의 농도와 yeast extract 또는 soy peptone, casein peptone이 추가로 첨가될 경우 첨가 농도에 의존하여 막 여과 속도는 감소된다.

또한 본 발명의 목적에 따라 배지 살균용 막 여과 장치 (도 2, No 4)와 배양기 (도 2, No 2)사이에 추가로 배지 저장 탱크를 설치하여 유동적으로 배지 공급 속도를 조절하는 것이 바람직하다.

[2] 세라믹 재질 (ceramic membrane)의 막 여과 장치

막을 이루는 재질에는 여러 종류가 있다. Composite membrane을 구성하는 성분으로 cellulose acetate polymer [참고문헌 10], polypropylene [참고문헌 4, 11], polyvinylidene fluoride [참고문헌 5], cellulose nitrate polymer 등이 있으며 일반적으로 cartridge로서 상품화되어 판매되고 있다. 그러나 이런 composite membrane은 높은 다공성 (porosity)으로 막 여과 속도가 빠르고 또한 unit volume에 비하여 필터 면적 (effective area)이 매우 넓은 장점을 가지고 있다. 반면 열, 산과 알칼리에 대한 저항성이 다소 떨어지는 단점이 있으며 또한 내장된 fiber들의 내경 (internal diameter)이 작아 (0.3 ~ 1 mm), 점도가 높은 fluid에서는 △P의 증가나 wall shear stress의 증가와 같은 단점을 가지고 있다.

이런 단점의 보완을 위해 최근 세라믹 재질이 막 (ceramic membrane)에 사용되고 있다. 일반적으로 Zircon-alumina 성분으로 또는 alumina성분으로 구성되어 있으며 열, 충격, 압력, 산 알칼리 처리에 강해 최근 그 사용의 범위가 넓어지고 있다. 세라믹 막의 이런 강한 성질은 발효 과정의 cleaning과 살균 과정의 산, 알카리 처리나 스팀 (steam) 처리에 적합하다.

본 발명에 사용된 막은 Zircon-alumina 또는 Zircon-titanium 재질의 ceramic 막(membrane)으로서 pore size는 0.14 -1.0 micron이며, 효과 면적이 0.35 m²이며, 131℃까지 열에 저항성이 있으며, pH 2 ~ 14에 안정하다. 또한 내장된 fiber의 내경 (diameter)은 F = 3 mm로서 composite membrane의 F = 1 mm에 비하여 비교적 넓은 내경 (diameter)을 가지고 설계되어 있다.

[3] 외장형 막 분리 배양기 (externally fitted ceramic membrane bioreactor, ECMBR)

도 2의 본 발명에 사용된 막 배양기는 외장형으로서 침지형 (submerged) 막 배양기와는 여러 가지 측면에서 기술적으로 분리된다. 표 2는 침지형 막 배양기와 외장형 막 배양기의 장, 단점을 나열하였다. 침지형 막 배양기는 배양기의 제한된 공간 내에 설치를 하므로 배양기의 구조를 더욱 복잡하게 만듦으로 오염이나 cleaning공정에 큰 단점으로 작용하며 지금까지 lab scale에서 실시되어 산업화를 위한 scale-up시에는 구조적인 단점을 가지고 있다. 반면 배양기 내에서 배양액이 turbulent flow로서 존재하며 여과의 방향성이 막의 외부에서 안으로 유입되는 형태이므로 막을 통과할 때 wall shear stress가 없고, pump등이 균체와 직접적인 접촉이 없으므로 wall shear stress를 최소한으로 감소시킬 수 있는 장점이 있다.

반면 외장형 막 분리 배양기는 막이 배양기와 분리되어 있으므로 필요에 따라서 scale-up이 쉬우며, 또한 생산 공정 중에 cleaning이 쉽고 오염 등에 대처가 쉬운 장점을 가지고 있다. 또한 막 분리 부분과 배양기가 분리되어 존재하므로 압력, 온도 등의 별도 관리가 가능한 장점을 가지고 있으므로 산업화 시에 큰 장점을 가지고 있다. 반면, pump가 공정 중에 균체와 직접적인 접촉을 하며, 균체가 막과 수평방향으로 통과하여 순환 할 때 막의 작은 내경의 fiber를 통과해야 하므로 wall shear stress에 쉽게 노출되는 단점이 있다. 따라서 외장형 막 분리 배양기를 설비할 때 pump와 막의 주의 깊은 선택은 막 배양기의 효율과 최종 균체 농도, viability를 결정하는 제일 중요한 factor로 작용한다.

[4] Pumps에서 발생하는 wall shear stress

본 발명에 사용된 펌프들은 magnetic co-centrifugal 펌프이다. 펌프의 impeller (r = 101 mm)의 끝과 펌프 head의 내부 벽 사이의 간격 (r = 102.5 mm)은 1.5 mm였으며, 펌프의 최고 speed는 1760 rpm이었다. 펌프의 speed 는 중앙의 control panel에서 조절이 가능하였으며 총 10 단계로 나누어 조절되었다.

도 3은 펌프의 speed에 따른 펌프 head 내부 wall shear stress의 변화를 설명하고 있다. 본 그래프에서 water와 B. longum 배양액의 wall shear stress는 배양 중에 pump motor의 속도가 증가와 비례적으로 증가하였지만, 균체 농도에 따라 점도 (dynamic viscosity)가 증가한 경우 wall shear stress의 증가는 반 비례적으로 감소했다 [참고문헌 12].

즉 배양의 초기 dynamic viscosity가 낮은 상태에서 motor speed를 500 rpm이상 올리지 않고 균체의 농도가 증가하여 dynamic viscosity가 어느 정도 증가했을 경우 motor speed를 올리는 것이 바람직하며, motor speed에 의한 wall shear stress 때문에 균체에 발생할 수도 있는 피해를 줄이는 방법이다.

Motor내에서 회전하는 disk impeller의 속도에 따라 발생하는 wall shear stress는 따르는 공식에 의해서 결정되었다.

[5] 세라믹 막 분리장치와 composite 막 분리장치에서 wall shear stress의 비교

막 분리 장치의 재질은 초기에 cellulose 재질을 최초로 사용하였지만, 미생물에 의한 분해, 산 염기 등에 대한 민감성, 그리고 열이나 충격에 약한 단점을 가지고 있으므로 후에 polymer 재질의 막들이 개발되기 시작했으며 이것을 composite 막이라 한다. 후에 막의 산업적 적용의 범위가 확대되면서 보다 열이나 충격, 산 알칼리 등에 강한 세라믹 재질의 막이 개발되었다.

도 4는 composite 막과 ceramic 막 분리 장치에서 발생하는 wall shear stress의 비교를 나타내고 있다. 비교로서 사용된 composite 막은 GE Health life science의 microfiltration 막이었다. Pore size는 0.2 micron, 길이는 600 mm, 직경은 50 mm, 효과 면적은 1.8 m²이었으며, 내부 fiber의 직경은 1.0 mm이었다. Fluid는 water로서 37℃이었다. 도 4에서 볼 수 있듯이 wall shear stress (g_w)는 pipe를 따라 흐르는 유체의 flow rate (m/sec)의 속도와 비례적으로 증가했다. 그러나 내부 fiber의 내경이 작은 composite membrane의 경우 더욱 급격히 증가 됨을 볼 수 있다.

관을 따라 흐르는 유체의 flow rate에 따른 wall shear stress는 따르는 공식에 의해서 결정되었다 [참고문헌 14].

또한, 도 3 과 도 4는 ceramic 막 분리 장치를 이용하는 배양기에서 wall shear stress가 주로 pump에 의해서 발생함을 보이고 있다.

따라서 막 분리 배양기에서 wall shear stress에 약한 균체를 배양하는 동안 균체에 발생할 수 있는 wall shear stress로부터 균체를 보호하기 위해서 pump의 주의 깊은 선택은 균체의 viability를 증가하기 위해서 매우 중요하다.

Wall shear stress를 생산하지 않는 기어 펌프 (gear pump), 다이아프람 펌프 (diaphragm pump) 또는 로베 펌프 (lobe pump)를 사용하면 균체의 viability를 크게 증가 시킬 수 있다 [참고문헌 13].

둘째, 다음으로 본 발명의 공정예 및 실시예에 대해서 구체적으로 기재한다.

[1] 실험 균주

본 발명에 사용된 균주는 Bifidobacterium longum 15707 (KCTC 3128)으로서 실험을 위해 구입되었으며, Lactobacillus plantarum은 진주 국제대학의 김현수 교수님 연구 팀으로 친절하게 기증받았다.

B. longum은 구입 후 BL 배지 (B. longum selective media)에서 활성화된 후, 회수되어서 멸균된 PBS (phosphate buffered saline)로 3번 씻은 후, 25%(w/v)의 glycerol 용액에 suspension 형태로 -70℃의 초저온 냉동고에 보관되었다. L. plantarum은 MRS배지에서 활성화된 후 B. longum과 동일한 절차를 통하여 초저온 냉동고에 보관되었다.

두 균주는 초저온 냉동고에서 최대 6개월 보관되었으며, 실험 전날 꺼내서 30℃의 중탕조에서 녹인 후 사용하였다.

BL 배지는 beef extract 8 g/L, yeast extract 10 g/L, casein peptone 15 g/L, soy peptone 3 g/L, glucose 10 g/l, starch 5 g/L, K₂HPO₄ 1.0 g/L, KH₂PO₄ 1.0 g/L, cysteine 0.5 g/L, NaCl 0.01 g/L, MgSO₄ 0.2 g/L, MnSO₄ 0.007 g/L, FeSO₄ 0.01 g/L, Tween-80 1.0 g/L를 포함한다.

[2] 전 배양

초저온 냉동고에 취해진 B. longum은 10 ml의 BL 배지를 포함하는 18 F 압력 시험관(pressure tube)에서 10 - 12시간 동안 활성화된 후, 배양액 10 ml는 1.0 L 전배양 배지를 포함하는 2.0 L 삼각 플라스크에서 전배양을 위한 seed로 사용되었다.

전배양으로 접종 후, 다시 10 시간 동안 전배양을 실시한 후 1.0 L 전배양은 70 L 막 분리 배양기로 접종되었다. 모든 경우에 활성화와 전 배양은 모두 37℃의 정치 배양으로 실시되었다.

B. longum의 전배양 배지는 BL배지가 사용되었다. 접종 전 pH는 6.2 ~ 6.4 이었다. L. plantarum의 경우 MRS배지가 활성화와 전배양 배지로 사용되었다. L. plantarum은 30℃에서 배양을 실시한 것을 제외하고는 B. longum의 경우와 동일한 절차를 통해서 본배양 접종 전까지 실시되었다.

[3] 본 배양

L. plantarum과 B. longum의 두 유산균의 physico-chemistry에 관한 조사는 50 ml serum vial에서 배양을 하면서 실시되었다. 두 균주를 막 배양기에서 고농도로 배양하기에 앞서 feed 배지의 조사는 STR 배양기에서 fed-batch배양을 시도하면서 조사되었다.

최종적으로 vial 배양 동안 얻어진 결과들과 STR에서 fed-batch배양을 하여 얻어진 결과를 이용하여 막 분리 배양기에서 두 균주의 고농도 배양은 실시되었다.

[3-1] Vial에서 배양

앞서 압력 시험관 (18 F pressure tube)에서 활성화되고 다시 전 배양과정을 거처 45 ml의 본배양 배지를 포함하는 50 ml serum vial로 접종되었으며 10 ~ 12 h동안 B. longum은 37℃에서, L. plantarum은 30℃에서 정치 상태로 배양되었다 (도 5). 각 serum vial은 butyl rubber stopper와 aluminum seal을 이용하여 배양 중에 공기로부터 차단되었다.

B. longum과 L. plantarum의 본배양 배지는 함수 포도당, 효모 추출물, soy peptone, 구연산 나트륨, 황산 마그네슘, 황산 제1철, 황산 망간, 황화 제1철을 이용하였으며, 막 분리 배양을 위한 성분들의 적절한 농도와 종류는 vial culture에서 결정되었다.

[3-2] STR 에서 fed-batch 배양

5.0 L STR 배양기에서 fed-batch를 시도하면서 vial culture에서 결정된 feed 배지 성분의 적합성을 확인하였다.

Fed-batch culture의 배지는 처음에 2.0 L로 준비되어 121℃에서 20분간 스팀 살균되었다. Feed 배지는 별도로 1.5 L로 준비되어 따로 살균 준비되었으며, 배양의 시작 후 O.D_{(660 nm )}가 0.6에 도달한 시점에서 feed배지의 공급은 시작되었다. 배지는 882 ml/h의 속도로 공급되었다. 1.5 L의 feed 배지 공급이 완료된 후 O.D_{(660 nm)}가 더 이상 증가되지 않는 시점에서 배양은 종료되었다. 배양 중에 pH는 L. plantarum과 B. longum 모두의 경우 pH 6.0에서 조절되었으며 2 mole/L NaOH 가 alkali로 사용되었다.

[3-3] 막 배양기에서의 배양

2.0 L 삼각 플라스크에서 정치 배양된 B. longum과 L. plantarum은 다시 70 L 막 분리 배양기로 접종되었다. 55.0 L의 초기 배양 배지를 포함하는 70.0 L 막 배양기는 접종 전에 질소 가스로 충진되었다. 접종과 함께 STR내에서 100 rpm으로 교반하면서 배양되었으며 O.D_{(660 nm )}가 0.8~0.9에 도달하였을 때 magnetic co-centrifugal pump를 이용하여 50 L feed 배지로 막 배양 시작의 처음 2 시간 동안 배지를 교환해 주었다. 2시간 동안 배지의 교환 후에 feed배지의 공급은 시작되었다. 초기 1 h 동안 배지의 공급은 0.36 /h이었으며, 다음에 feed 배지의 공급과 막 분리 속도 (membrane flux)는 0.84 /h으로 증가되어 발효 말기까지 계속 진행되었다. B. longum의 배양은 37℃에서 L. plantarum은 30℃에서 실시되었다.

Vial culture와 STR을 이용해 결정된 막 배양기 배양에서 사용할 초기 사입 배지와 feed 배지의 조성으로, B. longum의 초기 사입 배지는 1.0 ~ 2.0%(w/v) 함수 포도당, 1.0 ~ 2.0%(w/v) fructose, 1.0 ~ 2.0%(w/v) (NH₄)₂SO₄, 1.0 ~ 3.0%(w/v) 효모 추출물, 0.1 ~ 0.5%(w/v) 제1인산 칼륨, 0.1 ~ 0.5%(w/v) 구연산 나트륨, 0.001 ~ 0.01%(w/v) 황산 제1철, 0.01 ~ 0.05%(w/v) 황산 마그네슘, 0.001 ~ 0.005%(w/v) 황산 망간을 포함했다. Feed 배지는 1.0 ~ 2.0%(w/v) 함수 포도당, 0.1 ~ 1.0% (w/v) fructose, 0.1 ~ 0.5%(w/v) (NH₄)₂SO₄, 0.1 ~ 1.0%(w/v) 효모 추출물, 0.1 ~ 0.5%(w/v) 제1인산 칼륨, 0.001 ~ 0.01%(w/v) 황산 제1철, 0.01 ~ 0.05%(w/v) 황산 마그네슘, 0.001 ~ 0.005%(w/v) 황산 망간을 포함했으며 살균 전 pH는 pH 7.15로 조정되었다. L. plantarum의 막 배양기 배양을 위한 초기 사입 배지는 1.0 ~ 2.0%(w/v) 함수 포도당, 0.1 ~ 0.5%(w/v) 제1인산 칼륨, 1.0 ~ 2.0%(w/v) 효모 추출물, 0.001 ~ 0.01%(w/v) 황산 망간 이었으며, feed배지는 1.0 ~ 2.0%(w/v) 함수 포도당, 0.1 ~ 0.5%(w/v) 제1인산 칼륨, 0.5 ~ 1.5%(w/v) 효모 추출물, 0.001 ~ 0.01%(w/v) 황산 망간을 포함했다. 살균 전 pH는 pH 7.2로 조정되었다.

배양 중에 pH는 pH 6.0에서 조정되었으며, 5.0 mole/L의 NaOH가 alkali로 사용되었다.

막 배양기에 설치되는 세라믹 막은 배양액의 여과 속도를 충분하게 유지하기 위해서 필요에 따라 추가로 설치되었으며, 특히 wall shear stress를 고려하여 배양액의 순환 속도를 낮추는 경우 배양 동안 dilution rate (D)를 충분하게 조절하기 위해서 추가로 세라믹 막을 설치하여 사용하였다.

[3-4] B. longum과 L. plantarum의 유기산에 대한 tolerance

B. longum은 2.0 mole/L의 glucose를 분해하는 동안 3.5 mole/L의 acetic acid와 0.5 mole/L의 젖산과 3.5 mole/L의 CO₂ 또는 formic acid를 생산한다. 또한 L. plantarum은 homo-lactic fermentative lactic acid bacteria로서 1.0 mole/L의 glucose를 이용하는 동안 2.0 mole/L의 젖산을 생산한다.

이렇게 생산된 유기산들은 배양 동안 배지 내에 축적되어 일정 농도 이상에서 균체의 성장을 억제하고 임계 농도

를 넘어서 균체의 성장을 완전히 멈추게 한다. STR에서 유산균의 batch culture 동안 성장 대수기 이후에 성장이 멈추는 이유는 과도한 유기산의 축적 때문으로 알려져 있다.

두 균주의 젖산, 초산에 대한 민감성은 vial culture에서 배양을 통해 분석되었다. 배양 배지는 121℃에서 스팀 살균되었으며, 젖산과 초산은 고농도로 제조되어 filtration을 통해서 살균 후 접종 전에 첨가되었다. 분석은 초기 6시간까지로 이용하였다.

[4] 분석

[4-1] Cell mass의 분석

배양 중에 균체의 농도는 optical density _{(660 nm )}로서 측정되었다. 발효 초기에서 O.D 값이 2.0을 넘기 전까지는 희석 없이 측정되었으며, O.D 가 2.0을 초과 한 후의 sample은 증류수로 10배 희석하여 측정하였다.

배양 후 O.D는 cell mass의 분석을 위해 미리 결정 된 standard curve에 의해 dry cell weight (DCW)로 결정되었다.

균체의 건조 중량 측정을 위해서 GF/C Glass microfiber filter (dia = 72 mm, Whatman)이 사용되었으며, 측정을 위해 10 ml 발효액이 사용되었다. 건조는 80℃의 dry-oven에서 최소 12시간 건조되어 측량된 후 g/L로서 계산되었다.

B. longum의 경우 O.D_{(660 nm )}를 DCW로 전환하는 수식은 Y = 0.37X + 0.21이었으며, L. plantarum의 경우 Y = 0.26X - 0.01로서 Y는 DCW (g/L)였으며 X는 O.D_{(660 nm )}이었다.

[4-2] HPLC의한 당, 유기산의 측정

발효 중에 소비된 당, 생산된 유기산의 분석은 HPLC로 분석되었다.

배양 중에 생산된 젖산과 초산은 Ion-Pac AS11 HC anion exchange column (4 X 250mm)을 본 column으로 사용하고 Ion Pac^® ATC-1 trap column(9 X 2.4mm)을 가드 column으로 사용하면서 detector는 DS3 Detector stabilizer (Model: DS3-1 from Dionex Corporation)이 장착된 ED 40 electrochemical detector를 사용하면서 conductivity를 이용하여 유기산의 농도를 측정하였다. 측정 동안 column의 온도는 35℃ (heating chamber, Waters Millipore)로 조정되었다. HPLC를 구성하는 모든 연결은 분석 중에 발생할 수 있는 noisy를 줄이기 위해 PEEK tubing (id = 0.25 mm)을 사용하였다. Mobile phase는 NaOH (carbonate free)로서 농도는 0.5 mM부터 50 mM까지 30분의 cycle time을 가지고 gradient mode로서 사용되었다. Flow rate는 1.0 ml/min으로 조절되었으며 이때 압력은 1500 ~ 1850 psi이었다. 이런 조건에서 젖산의 peak는 초산 peak앞에 13 ~ 15 min 사이에 나타났다.

당 분석을 위해서 가드 column으로 CarboPac ^TM MA-1 (4 X 50mm)이 사용되었으며 본 column으로는 CarboPac ^TM MA-1 (4 X 250mm)이 사용되었다 (Dionex Corporation, USA). Detector로서는 동일한 ED 40 electrochemical detector가 사용되었지만 INT Amperometry로서 분석되었다. Mobile phase로서는 480 mM의 NaOH,가 사용되었으며 flow rate는 0.4 ml/min으로 조정되었으며, 이때 압력은 1500 ~ 1800 psi에서 조정되었다.

모든 samples은 20 ml의 sample loop를 가진 레오다인 인젝터 (rheodyne injector)를 통해서 column으로 load되었다.

당 분석 동안 온도는 조절되지 않았다. Varian Pro-Star work station이 분석 program으로 사용되었다. 표 3과 도 6은 앞서 설명된 HPLC 조건과 표준 chemicals을 이용하여 만들어진 standard curve이다.

[4-3] 생균수 분석

생균수 분석은 발효 종료 시 발효액에 존재하는 생균수 (cfu/ml), 동결 건조 후 분말에 존재하는 생균수 (cfu/g), 그리고, 가속실험 시 분말에 존재하는 생균수의 조사를 위해 실시되었다.

L. plantarum은 MRS agar (Difco)에서, 그리고 B. longum은 BL agar (Difco)를 이용하여 분석되었다. 발효액이나 건조 분말에 존재하는 균체는 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.2)에서 희석하여 도말되었다. 도말된 균체를 포함하는 agar plate는 다시 gas pack (Difco)을 포함하고 N₂ (oxygen free)-gas로 충진한 anaerobic jar에서 2일 동안 배양한 후 형성된 colony의 수로서 분석되었다.

[4-4] 가혹성 실험

B. longum과 L. plantarum은 보호제를 첨가하여 동결 건조된 후 건조 분말 상태에서 균체의 안정성을 비교하기 위해서 가속성 실험되었다. 각 분말의 30 g이 (pouch에 저장된 상태로서) 40℃로 조절되는 dry-oven에 저장되었으며, 생균수 분석은 총 4주의 기간 동안 매주 실시되었다.

[5] 실험예

[5-1] Vial culture 에서 B. longum 과 L. plantarum 의 physico - chemistry 조사

두 균주의 vial culture에서 함수 포도당, fructose, 효모 추출물, soy peptone 등과 같이 균체의 성장속도에 영향을 줄 수 있는 배지 성분들의 종류와 농도에 대한 평가를 실시하였다. 또한 배지 내 당의 높은 농도는 유기산의 과도한 생산을 초래하며 효모 추출물이나 soy peptone과 같은 단백 유기물의 높은 농도는 막 여과 속도에 악영향을 끼친다 (도 1).

도 7은 L. plantarum의 배양에서 함수 포도당, 효모 추출물, soy peptone의 농도 영향을 설명하고 있다. 함수 포도당의 농도가 200 mM을 초과했을 때까지 균체의 농도는 일정한 증가를 보였지만 수율은 급격한 감소를 보였다. 이는 L. plantarum이 배지 내에 생성되는 유기산에 느린 반응을 보인다는 것을 나타낸다. 또한 yeast extract의 농도에 대하여 균체 성장속도는 매우 민감한 반응을 보인 반면, soy peptone의 경우 성장속도에는 큰 영향을 보이지 않았지만 균체 농도는 soy peptone의 사용 농도에 비례하여 증가하였다. 결과적으로 배지에 첨가하기 위한 함수 포도당의 농도는 200 mmole/L 이하의 농도에서 사용하였으며, yeast extract농도는 0.7%(w/v)로서 초기 사입 배지에, soy peptone은 1.0%(w/v)로서 사용하되 feed 배지에 첨가하기로 결정하였다.

도 8은 B. longum의 성장에서 yeast extract, 함수 포도당, fructose, soy peptone의 영향을 묘사하고 있다. B. longum의 균체 농도는 100 mM 이상의 함수 포도당 농도에서 더 이상 증가하지 않았으며, 균체의 대당 수율도 100 mM 이상의 함수 포도당 농도에서 감소되는 경향을 보였다. 이것은 L. plantarum의 경우에 비하여 B. longum이 보다 낮은 농도의 유기산에 예민하게 저해 받는 다는 것을 의미한다. 또한 함수 포도당이 첨가된 상태에서 fructose 첨가는 B. longum이 추가적인 성장을 허락하였으며 특히 pentose-phosphate pathway를 통한 ribose 형성을 촉진시킨다. 여기서 ribose는 nucleic acid의 중요 성분으로 성장을 돕는다. B. longum의 성장 속도는 yeast extract의 농도와 비례적으로 증가하였다. 또한 ammonium sulfate가 yeast extract 없이 사용되었을 경우 성장 촉진 현상이 발생하지 않았지만 yeast extract와 함께 사용되었을 때 성장 촉진의 현상을 보였다.

도 8의 결과에 따라 1.0 ~2.0%(w/v) 함수 포도당, 1.0 ~ 3.0%(w/v) fructose, 1.0 ~ 2.0%(w/v) 효모 추출물이 초기 사입 배지에 첨가되었으며, feed 배지에서 fructose는 제외되었다.

도 9는 위의 조사에서 얻어진 초기 사입 배지를 이용해서 vial에서 배양한 경우 표준 성장 곡선을 보이고 있으며, L. plantarum은 0.086 /h의 성장 속도로 성장하여 최종 1.55 g/L DCW를 얻었으며, B. longum의 경우 0.385 /h의 속도로 성장하여 최종 2.7 g/L DCW를 얻었다.

[5-2] B. longum 과 L. plantarum 의 유기산에 대한 tolerance

도 10는 L. longum과 L. plantarum의 유기산에 대한 성장 억제 효과를 조사한 결과를 보이고 있다. L. plnatarum은 배양 중에 젖산을 생산하는 homo-fermentative lactic acid bacteria로서 젖산에 예민한 반응을 보임으로서 젖산의 농도가 300 400 mM에서 50 %까지 초기 성장이 둔화되었으며 550 mM에서는 완전히 성장이 멈추었다.

B. longum은 L. plantarum 보다 더 민감한 반응을 보였으며 젖산 보다는 초산에 더 민감한 반응을 보였다. 도 10의 b)에 따르면 초산과 젖산의 농도가 초기에 100 ~ 200 mM 농도로 존재할 경우 성장 속도가 40 % 수준으로 감소함을 보이고 있다.

따라서, 막 분리 배양기에서 B. longum을 배양하는 경우 젖산과 초산의 농도를 100 ~ 200 mM 이하로 유지해야 하며, L. plantarum을 배양하는 경우 젖산의 농도를 200 ~ 300 mM이하로 유지해야 균체의 증식 속도를 50% 정도로 유지할 수 있다.

[5-3] STR 에서 B. longum 과 L. plantarum 의 fed - batch 실험

도 11은 5.0 L jar에서 B. longum을 이용하여 fed-batch 배양을 하면서 기존의 B. longum의 batch culture용 배지와 성장성, pH 변화, 생 균수 분석 등을 시도하였다. 이때 fed-batch배양을 위한 배양배지의 조성은 3-3-3)에서 기록된 바와 동일하다.

배양 동안 pH는 모든 배양의 경우에 pH 6.0에서 유지되었으며 alkali로서는 5 mole/L NaOH가 사용되었다. pH 조절을 위해서 batch 배양의 경우 총 1800 ml의 5.0 mole/L가 투여된 반면 fed-batch의 경우 총 400 ml의 5.0 mole/L NaOH가 투여되었다. 이런 결과는 fed-batch배양 동안 pH 6.0 - 6.5사이의 feed 배지가 연속적으로 공급되었으므로 alkali의 투여량이 줄어든 것으로 판단된다. 총 12시간의 배양 동안 batch 배양의 경우 5.46 g/L DCW (Y_{X /S} = 0.26)가 생산되었으며, fed-batch의 경우 6.96 g/L (Y_{X /S} = 0.22)가 생산되었다.

발효 초기에 6시간 동안 모든 경우에 성장 속도는 큰 차이를 보이지 않았지만, 실제 새로운 배지의 공급이 시작되는 6시간 이후에 batch 배양의 경우 성장 속도 (μ)가 0.31 /h이었으며, fed-batch의 경우 0.456 /h으로 높게 유지되었다. 생산되는 유기산으로 초산과 젖산의 농도는 fed-batch 의 경우 batch배양 보다 10 % 낮게 생산되었다.

발효 종료 후 배양액 내의 생 균수는 batch 배양의 경우 1.1 X 10⁹ cfu/ml 이었으며 fed-batch의 경우 1.8 X 10⁹ cfu/ml으로 63.6% 높게 분석되었다.

도 12는 STR에서 L. plantarum을 이용하여 fed-batch를 시도한 경우로서, 총 12시간의 배양 동안 fed-batch의 경우 6.26 g/L의 균체 건조중량을 얻었으며, batch 배양의 경우 4.33 g/L의 건조 중량을 얻었다. Fed-batch와 batch 배양의 경우 초기 6시간 동안의 배양 동안 성장 속도는 μ = 0.46 /h과 μ = 0.505 /h이었지만, 6시간 이후 배지 공급이 시작되었을 때 μ = 0.267 /h과 μ = 0.208 /h로 fed-batch의 경우 28% 더 높았다. 젖산의 생산에 있어서 batch 배양의 경우 lactic acid는 생산 중에 거의 500 mmole/L로 까지 축적되었지만, fed-batch의 경우 총 lactic acid 축적은 350 mmole/L정도로 낮았다. 결과적으로 생균 수의 측면에 있어서 batch 배양의 경우 6.9 X 10⁹이었지만 fed-batch의 경우 2.8 X 10¹⁰ 4배 정도로 높았다.

[5-4] 막 분리 배양기에서 B. longum 과 L. plantarum 의 고 농도 배양

B. longum은 막 분리 배양기에서 12 h의 배양 동안 총 X = 22.18 g/L의 건조 균체 중량을 생산하였으며, 성장속도는 μ = 0.134 /h이었다. 또한 배양의 초기 4시간 까지 dilution rate D = 0.65 /h 까지 증가할 수 있었지만, 균체 농도의 증가와 함께 빠르게 감소되어 D = 0.47 /h 에서 안정화되었다. 배양 동안 배양기 내에 lactic acid는 50 mmole/L 이하로 유지되었으며, acetic acid는 200 mmole/L 주변에서 유지될 수 있었다 (도 13).

L. plantarum은 막 분리 배양기에서 총 20 h의 배양 동안 X = 29.48 g/L의 건조 균체 중량을 생산하였으며, 균체 증식 속도 μ = 0.076 /h이었다. 배양 동안 Dilution rate D = 0.136 /h 에서 시작하여 최고 D = 0.56 /h까지 증가되었으며 더 이상 증가되지는 않았다. 배양 중에 함수 포도당의 농도는 50 mmole/L 주변에서 유지되었으며, lactic acid는 초기 100 mmole/L에서 균체 농도와 함께 증가하기 시작하여 발효 말기 325 mmole/L까지 증가되었다. 이런 lactic acid의 농도에서 균체 증식 속도는 크게 감소되지 않았다 (도 14).

표 4는 발명의 최종 결과를 보이고 있다. B. longum의 배양에서, Vial culture부터 막 배양기까지 건조 균체의 최종 농도 (total X)는 8.2 배 증가하였으며, 균체 성장 속도는 vial culture에서 μ = 0.385 /h이었으며, STR에서 배지 공급이 시작된 D-6시간 이전까지 μ = 1.13 /h이었지만 stationary period 동안 μ = 0.31 /h로 감소된 반면, STR에서 fed batch 배양 동안 6시간 이전까지 균체 성장 속도 μ = 1.102 /h이었지만 배지 공급의 시작 후, 균체 성장속도 μ = 0.456 /h으로 batch 배양의 stationary period 경우 보다 높았다. 그러나 막 배양 동안 균체의 성장 속도 μ = 0.134 /h으로 유지되었다. STR에서 막 배양기까지 단위시간 당 건조 균체 중량 (total X)의 증가속도 (g/L,h as DCW)는 4.06 배 증가되었지만, 단위시간 당 생산성 (cfu/L,h as viable cell count) 기준에서 19.2배까지 증가하였다. 또한 표 4는 fed-batch에서 막 배양 단계로 변화했을 때 생산성이 다른 단계에서 보다 가장 높게 증가하였음을 보이고 있다.

L. plantarum의 경우, vial culture부터 막 배양기까지 총 건조 균체 농도 (total X)는 19배 증가하여 막 배양기에서 20 h 배양 후 최종 균체 농도는 29.48 g/L가 얻어졌다. STR에서 배양 동안 건조 균체 증가속도는 vial culture에서 보다 훨씬 높게 유지되었다. Vial culture에서 건조 균체 성장속도 μ = 0.086 /h이었으며, STR에서 batch culture 동안 초기 6시간 동안 μ = 0.505 /h이었으며 stationary period 동안 μ = 0.208 /h으로 감소하였다. STR에서 건조 균체 성장속도 μ = 0.460 /h이었지만, 배지의 공급이 시작된 후에 건조 균체 증식 속도는 μ = 0.267 /h으로 batch culture 보다 높게 유지되었다. 막 배양기에서 건조 균체 증식속도 μ = 0.076 /h이었다. 단위시간 당 건조 균체의 증식속도 (g/L,h as DCW)는 STR에서 batch culture부터 막 배양기에서 배양까지 6.81 배 증가하였으며, 생균수 기준 (cfu/L,h as viable cell count)으로는 76.96배 증가하였다.

B. longum과 L. plantarum을 막 배양하는 중에, wall shear stress는 균체의 viability와 깊은 관계를 가지고 있다. 막 배양기에서 wall shear stress는 설치된 magnetic co-centrifugal pump part와 막 분리 장치 (membrane separation part)에서 대 부분 발생되었다. 분석 결과 L. plantarum은 B. longum에 비하여 wall shear stress에 더욱 강하여 477 Pa.s wall shear stress에서 배양된 균체의 경우 4주간의 가혹성 실험에서도 30 % 정도의 viability를 보였으며, 최고의 wall shear stress인 1330 Pa.s 에서도 8 % 정도의 viability를 보였다. 반면, B. longum의 경우 control로서 이용된 STR에서 batch culture의 경우 4주의 가속성 실험을 통하여 15 %까지 viability가 감소되었으며, 250 Pa.s wall shear stress에서 배양한 경우 비슷한 viability를 보였지만 713 Pa.s wall shear stress 이상에서 배양한 경우 viability가 5% 이하로 감소되었다(도 15).

이상 본 발명의 구체적 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 명세서에서 설명한 각 구성요소의 물질은 당업자가 공지된 다양한 물질로부터 용이하게 선택하여 대체할 수 있다. 또한 당업자는 본 명세서에서 설명된 구성요소 중 일부를 성능의 열화 없이 생략하거나 성능을 개선하기 위해 구성요소를 추가할 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자는 공정 환경이나 장비에 따라 본 명세서에서 설명한 방법 단계의 순서를 변경할 수도 있다. 따라서 본 발명의 범위는 설명된 실시형태가 아니라 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.

Claims (15)

1. Zircon-alumina 또는 Zircon-titanium 재질의 ceramic 막 필터(3), 배지 살균용 막 필터(4), 배양기(2) 및 배지 제조 탱크(5)를 포함하는 세라믹 막 분리 배양기.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 막 분리 배양기에 중앙 control panel(1), 배양 온도 조절용 열 교환기(6), level 조절기(7), 소비된 알칼리 측량용 로드 셀(8), 열 교환기의 온도 조절용 솔레노이드 발브(9), 유량계(10), 압력계(11), 온도계(14), bubbling bottle(15), pH 전극(17) 및 diaphragm valve(18)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세라믹 막 분리 배양기.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 Zircon-alumina 또는 Zircon-titanium 재질의 ceramic 막은0.1~1.0 micron 다공 크기의 세라믹 막인 것을 특징으로 하는 세라믹 막 분리 배양기.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 Zircon-alumina 또는 Zircon-titanium 재질의 ceramic 막은 상기 배양기(2)와 별도로 분리 설치됨을 특징으로 하는 세라믹 막 분리 배양기.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 Zircon-alumina 또는 Zircon-titanium 재질의 ceramic 막에서 발생하는 wall shear stress를 줄이기 위해서, fiber의 내경이 2~4mm임을 특징으로 하는 세라믹 막 분리 배양기.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 배지 살균용 막 필터(4)와 배양기(2) 사이에 배지 저장용 탱크를 설치하는 것을 특징으로 하는 세라믹 막 분리 배양기.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 막 배양기의 wall shear stress를 줄여 생산되는 균체의 viability와 stability를 증가시키기 위해서 gear pump, diaphragm pump 및 lobe pump 으로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나를 추가하는 것을 특징으로 하는 세라믹 막 분리 배양기.
   
8. (i) 제1항의 세라믹 막 분리 배양기를 이용하고, (ii) feed 배지 내 단백질원은 1.0%(w/v), 탄소원은 1.0 ~ 2.0%(w/v)로 유지함으로써, 유기산 농도는 감소시키되 균체 성장속도는 증가시키는 것을 특징으로 하는 비호기적 배양방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 균체는 Lactobacillus , Bifidobacterium , Leuconostoc , Oenococcus, Weisella 속에 속하는 유산간균; Clostridium butyricum; Actinobacillus succinogenes; 및 Streptococcus , Enterococcus 속에 속하는 유산구균;으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 비호기적 배양방법.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 Lactobacillus 속에 속하는 유산간균은 Lactobacillus plantarum 이고, 상기Bifidobacterium속에 속하는 유산간균은 Bifidobacterium longum인 것을 특징으로 하는 비호기적 배양방법.
    
11. 제8항의 비호기적 배양방법을 이용하여 succinic acid, lactic acid 및 butyric acid 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 탄소화합물을 생산하는 방법.
    
12. 제1항의 세라믹 막 분리 배양기를 이용하여 생활하수(municipal sewages), 생활 슬러지(sludge), 공업 슬러지, 농업 슬러지 및 수산 슬러지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 분해하는 방법.
    
13. 제1항의 세라믹 막 분리 배양기를 이용하여 메탄(CH₄) 또는 수소(H₂)를 생산할 수 있는 비호기성 균을 배양함으로써 bio-gas를 생산하는 방법.
    
14. 제1항의 세라믹 막 분리 배양기를 이용하여 배양된 유산균을 이용함으로써 mannitol, trehalose, sorbitol 및 xylitol으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 생산하는 방법.
    
15. 제1항의 세라믹 막 분리 배양기를 이용하여 배양된 유산균을 이용함으로써 알코올 농도가 13%(w/v) 이하인 저 알코올음료(alcoholic beverage)를 숙성(maturation)하는 방법.
    

Images