CN115537364B

CN115537364B - 一种鼠李糖乳杆菌jl1高密度发酵的方法

Info

Publication number: CN115537364B
Application number: CN202211495838.3A
Authority: CN
Inventors: 姜毓君; 满朝新; 张宇; 汪禹宏; 苏悦
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-11-28
Filing date: 2022-11-28
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2042-11-28
Also published as: CN115537364A

Abstract

本发明公开了一种鼠李糖乳杆菌JL1高密度发酵的方法，属于微生物发酵技术领域。该高密度发酵培养基，其由下述组分及配比组成：D‑半乳糖44‑52 g/L，L‑半胱氨酸32‑37 g/L，磷酸氢二钾3‑5 g/L，柠檬酸氢二铵2‑5 g/L，乙酸钠8‑10 g/L，硫酸镁0.10‑0.30 g/L，硫酸锰0.02‑0.05 g/L和吐温‑80 1.00‑2.00 g/L，余量为水。本发明以工业化生产为出发点，对具有潜在益生特性菌株鼠李糖乳杆菌JL1高密度培养基配方和培养工艺进行优化，优化后发酵液活菌数显著提高，实现了菌株的高密度培养，为后续的鼠李糖乳酸菌产品工业化生产提供理论支持。

Description

一种鼠李糖乳杆菌JL1高密度发酵的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种鼠李糖乳杆菌JL1高密度发酵的方法。

背景技术

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一种以乳酸为主要发酵产物的革兰氏阳性菌的统称，主要包括乳杆菌属（ Lactobacillus）、乳球菌属（ Lactococcus）、双歧杆菌属（ Bifidobacterium）、肠球菌属（ Enterococcus）、链球菌属（ Streptococcus）和明串珠菌属（ Leuconostoc）。它们通常都是兼性厌氧生物，通过发酵糖类来获取能量，因此需要持续不断的补充嘌呤、嘧啶、维生素和氨基酸等物质以维持生命活力。大量研究表明，乳酸菌具有多种益生功能，主要体现在以下几方面：抗氧化作用、免疫调节作用、降胆固醇作用、预防肿瘤作用、调节血糖作用等。

鼠李糖乳杆菌( L.rhamnosus)，从属于乳杆菌属，是人体正常菌群之一，肠道黏着率高，定植能力强，并具有高效降胆固醇，促进细胞分裂，可起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿、提高机体免疫力及抗癌等重要的生理保健功能。并已经正式应用于食品和临床药品的生产。

目前，消费者对于益生菌产品的需求日益增加，如鼠李糖乳杆菌发酵的酸奶等产品成为消费者追求的热潮，菌剂的活菌数对发酵效果显得尤为重要。然而，当前市售的鼠李糖乳杆菌发酵剂的活菌数数量级约为10⁹ CFU/mL，且工业生产用量大，传统培养基发酵菌液发酵的活菌数较低，无法满足工业生产对于降低生产成本、提高生产效率，缩短生产周期的工艺要求。因此，提出一种鼠李糖乳杆菌高密度发酵的方法是十分有必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种鼠李糖乳杆菌JL1高密度发酵的方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法得到的发酵液活菌数达5.64×10¹¹ CFU/mL以上，实现了菌株的高密度培养，为后续的鼠李糖乳酸菌产品工业化生产提供理论支持。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种鼠李糖乳杆菌JL1的高密度发酵培养基，由下述组分及配比组成：

D-半乳糖44-52 g/L，L-半胱氨酸32-37 g/L，磷酸氢二钾3-5 g/L，柠檬酸氢二铵2-5 g/L，乙酸钠8-10 g/L，硫酸镁0.10-0.30 g/L，硫酸锰0.02-0.05 g/L和吐温-80 1.00-2.00 g/L，余量为水。

进一步地，由下述组分及配比组成：

D-半乳糖44.28 g/L，L-半胱氨酸33.29 g/L，磷酸氢二钾3.52 g/L，柠檬酸氢二铵3.52 g/L，乙酸钠8.98 g/L，硫酸镁0.20 g/L，硫酸锰0.04 g/L和吐温-80 1.00 g/L，余量为水。

本发明还提供一种鼠李糖乳杆菌JL1高密度发酵的方法，包括将活化的鼠李糖乳杆菌JL1接种到上述的高密度发酵培养基中，在pH为5.8-6.0下发酵的步骤。

进一步地，所述发酵的条件为：pH为5.9，温度为37℃，发酵时间为20h。

进一步地，所述活化的鼠李糖乳杆菌JL1的接种量为4 %v/v。

进一步地，所述活化的鼠李糖乳杆菌JL1是将所述鼠李糖乳杆菌JL1菌种接种至MRS液体培养基中进行活化后获得的。

进一步地，所述活化具体为将所述鼠李糖乳杆菌JL1菌种以5% v/v接种量接种至所述MRS液体培养基，在37℃和pH为6.5-6.8条件下活化培养24h。

本发明还提供一种根据上述的方法获得的鼠李糖乳杆菌JL1高密度发酵液。

本发明还提供一种根据上述的鼠李糖乳杆菌JL1高密度发酵液在制备鼠李糖乳杆菌产品中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以工业化生产为出发点，对具有潜在益生特性菌株鼠李糖乳杆菌JL1高密度培养基配方和培养工艺进行优化，确定高密度培养基配方为D-半乳糖44.28 g/L，L-半胱氨酸33.29 g/L，磷酸氢二钾3.52 g/L，柠檬酸氢二铵3.52 g/L，乙酸钠8.98 g/L，硫酸镁0.20 g/L ，硫酸锰0.04 g/L和吐温-80 1.00 g/L；高密度培养条件为：初始pH 6.5、流加25%氨水恒定pH 5.9、37℃恒温发酵20 h至发酵终点。优化后发酵液活菌数为5.64×10¹¹CFU/mL，远远高于普通发酵培养基的发酵效率，实现了菌株的高密度培养，为后续的鼠李糖乳酸菌产品工业化生产提供理论支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为GEN III 鉴定板中鼠李糖乳杆菌JL1碳源筛选结果；

图2为PM3微孔板中鼠李糖乳杆菌JL1氮源筛选结果；

图3为培养基不同碳氮源总量对鼠李糖乳杆菌JL1菌液活菌数的影响；

图4为D-半乳糖与L-半胱氨酸添加量交互影响的响应面图；

图5为缓冲盐与L-半胱氨酸添加量交互影响的响应面图；

图6为缓冲盐与D-半乳糖添加量交互影响的响应面图；

图7为不同pH对鼠李糖乳杆菌JL1发酵液活菌数的影响；

图8为不同接种量对鼠李糖乳杆菌JL1发酵液活菌数的影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株

鼠李糖乳杆菌JL1，是在已公开发表的文献“一株鼠李糖乳杆菌对脂多糖诱导肠道炎症的缓解作用研究”中记载的鼠李糖乳杆菌JL-1，现保存于东北农业大学实验室。

1.1.2化学试剂

D-半乳糖、L-半胱氨酸。

1.1.3培养基

MRS液体培养基，MRS琼脂、PBS。

1.2仪器与设备

发酵罐，Biolog。

1.3方法

1.3.1菌种活化

鼠李糖乳杆菌JL1冷冻保存于甘油冻存管中（－80℃），每次实验前将菌种以体积分数5%接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，活化2代。

1.3.2培养基成分筛选

采用Biolog全自动微生物鉴定分析系统对 L.rhamnosus JL1生长最适碳氮源进行快速筛选：以不同种类碳氮源分别替代MRS液体培养基中的碳氮源，保持培养基其余成分以及比例不变配制新型培养基，以达到最大促进 L.rhamnosus JL1生长。

1.3.3培养基主要成分响应面优化

根据上述实验优化结果，对 L.rhamnosus JL1培养基碳源、氮源及缓冲盐进行Box-Behnken试验设计（表1），以活菌数为响应值，确定培养基中主要成分的最优比例。

表1 响应面试验因素与水平

1.3.4高密度发酵工艺优化

采用5L液体发酵罐对 L.rhamnosus JL1高密度发酵温度、接种量等关键因素进行单因素优化。以发酵终点发酵菌液活菌数为指标，发酵过程中不断加入体积分数为25%的氨水保持培养基恒定pH5.90±0.02，培养温度37℃，搅拌速率150r/min，罐压0.03~0.04MPa。

1.3.5菌株活菌数测定

L.rhamnosus JL1发酵菌液用无菌PBS溶液进行10倍系列梯度稀释，达到适宜梯度后取1mL稀释液加入培养皿中，采用平板计数法测定活菌数，培养基为MRS琼脂。培养皿放置于37℃培养箱中培养48h后进行数据统计。

1.4数据处理

采用Design-Expert软件进行响应面试验设计与分析，差异性分析采用SPSS 17.0软件，图形绘制采用Origin 2017软件。

2 结果与分析

2.1培养基成分筛选

2.1.1碳源的筛选

碳源是菌体发酵过程中最重要的营养元素之一，培养基中提供含量充足、种类多样的碳源，有利于提升菌体生长速率，稳定菌体形态，促进菌体均衡生长。而且碳源的多样性也是影响发酵水平及菌体抗逆性的关键因素。GEN III鉴定板中含有不同的碳源、胶质和四唑类显色物质。其中Biolog GEN III 微孔板可以对微生物进行94种表型测试，其中包括：71种碳源利用测试（1-9列）以及23种化学敏感性测试（10-12列），具体表型见表2。通过色度的变化、数值高低来指示微生物对碳源的利用程度以及对化学物质的敏感程度。其中颜色越深数值越高的孔表示对碳源利用程度高，对化学物质较敏感。由图1可知，以D-水杨苷和D-半乳糖作为碳源时效果显著，利用能力高。综合考虑工业生产成本选择D-半乳糖作为碳源进行下一步研究。

表2

2.1.2氮源的筛选

氮源在乳酸菌生长过程中起着重要的作用，不同种类的乳酸菌蛋白水解酶系存在差异，导致最适生长氮源种类不同。氮源为细胞生长提供氨基酸合成所需的营养物质，其添加量会影响鼠李糖乳杆菌JL1的生长。选择适合鼠李糖乳杆菌JL1生长的氮源尤为重要。PM3鉴定板中含有不同的氮源。Biolog PM3微孔板可以对微生物进行表型测试，具体表型见表3。通过色度的变化、数值高低来指示微生物对氮源的利用程度。其中颜色越深数值越高的孔表示对氮源利用程度高，对化学物质较敏感。由图2可知，鼠李糖乳杆菌JL1对L-半胱氨酸和四氧嘧啶氮源有较好的利用能力，生长较为显著。综合考虑工业生产成本选择L-半胱氨酸作为氮源进行下一步研究。

表3

2.1.3培养基中碳氮源总量以及比例优化

培养基内碳氮源总量及比例的变化显著影响着菌体生长。根据上述试验选取碳氮源总量40～80 g/L，碳氮比为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1和3∶1。

由图3可知， L.rhamnosus JL1菌体密度随着培养基内碳氮源总量增加而增A加；当培养基内碳氮源总量一定时随着碳源比例的升高，菌株活菌数都呈现出先上升后下降趋势；培养基不同碳氮源总量在碳氮比为2∶1时活菌数达到最高值，故选择碳氮总量为80 g/L，碳氮比为2∶1进行下一步试验。

2.1.4培养基主要成分响应面优化

采用Design-Expert软件中Box-Behnken设计法对培养基主成分碳源、氮源和缓冲盐用量进行优化，以活菌数为响应值，设计3因素3水平响应面试验。试验设计及结果见表4，方差分析结果见表5。

表4 Box-Behnken试验设计及结果

表5 回归模型方差分析

通过Design Expert 12.0软件对表4的试验数据进行多元回归拟合，得到响应值活菌数值（Y）与D-半乳糖添加量（A）、L-半胱氨酸添加量（B）、缓冲盐体系添加量（C）的关系的多元二次回归方程：

Y=5.876E+011+4.063E+010A+2.850E+010B+4.038E+010C+1.975E+010AB-5.500E+009AC-1.725E+010BC-9.805E+010A²-1.133E+011B²-9.055E+010C²

由表5可知，二次项A²、B²和C²对 L.rhamnosus JL1活菌数有极显著影响（P＜0.01），交叉项AB、AC和BC对 L.rhamnosus JL1活菌数有一定影响但不显著（P＞0.05），方程模型整体极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），方程模型的R²为0.9680，R² _Adj为0.9269，说明方程与试验拟合度良好。

同时由Design-Expert软件获得响应面图4-6。由图4-6可知，随着D-半乳糖、缓冲盐用量增加，菌株活菌数呈现先增加后下降的趋势。菌体密度最大值出现在曲面上，且D-半乳糖、缓冲盐各自对应活菌数最大值与其并不重合，可知二者之间存在显著性差异（P＜0.05）。随着L-半胱氨酸用量增加，活菌数先增加后下降。回归分析结果表明D-半乳糖与L-半胱氨酸（图4）、缓冲盐与L-半胱氨酸（图5）、缓冲盐与D-半乳糖（图6）之间交互作用不显著（P＞0.05）。响应面预测最优培养基为D-半乳糖44.28 g/L、L-半胱氨酸33.29 g/L、缓冲盐16.02 g/L，活菌数预测最大值为5.98×10¹¹CFU/mL。

2.2发酵条件的优化

2.2.1发酵温度的优化

发酵温度是影响乳酸菌发酵生长周期的关键因素之一。在34~37℃时，温度越高，发酵活菌数越高；高于37 ℃时，发酵活菌数为下降趋势。当培养温度较低时，菌种接种于培养基后，菌种适应该温度需要一定的时间，延滞期变长，导致发酵周期延长，温度过高可致菌体死亡，对菌体生长不利。适宜的温度刺激能促使菌体的快速繁殖，因此鼠李糖乳杆菌JL1的最佳培养温度为37 ℃。

2.2.2发酵pH的优化

不同pH对鼠李糖乳杆菌的生长影响不同，pH会影响菌株的延滞期和生长速率，过高或过低都不利于菌落生长。选择pH5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0进行单因素实验。如图7所示，鼠李糖乳杆菌JL1的最适生长pH为5.9。

2.2.3接种量的优化

不同接种量直接影响着鼠李糖乳杆菌JL1高密度培养。适当加大接种量，有利于形成群体优势而缩短延滞期，进而缩短发酵周期，同时减少污染的可能性; 但接种量过大，活菌生长量大，后期代谢产物积累及营养物质匮乏造成菌种早衰、活力下降。接种量不同，发酵结束后活菌数略有差别。选取接种量为2%、3%、4%、5%、6%进行单因素实验，实验结果如图8，由图8可知鼠李糖乳杆菌JL1的最适接种量为4%，故选择体积分数4%作为接种量。

2.3结果验证

为验证该方法可靠性，采用上述优化后培养基及发酵工艺对L.rhamnosus JL1活化二代按4%接种量37 ℃恒温pH5.9恒定培养20h，平板计数法测定菌落数为5.64×10¹¹CFU/mL，与模型预测最优值不存在显著差异（P＞0.05），表明此方法结果可靠。最终优化后静态培养基成分为D-半乳糖44.28 g/L，L-半胱氨酸33.29 g/L，磷酸氢二钾3.52 g/L，柠檬酸氢二铵3.52 g/L，乙酸钠8.98 g/L，硫酸镁0.2 g/L ，硫酸锰0.04 g/L，吐温-80 1 g/L。

3 结论

本研究以工业化生产为出发点，对具有潜在益生特性菌株L.rhamnosus JL1高密度培养基配方和培养工艺进行优化。确定高密度培养基为D-半乳糖44.28 g/L，L-半胱氨酸33.29 g/L，磷酸氢二钾3.52 g/L，柠檬酸氢二铵3.52 g/L，乙酸钠8.98 g/L，硫酸镁0.20g/L ，硫酸锰0.04 g/L，吐温-80 1.00 g/L。确定高密度培养条件为：初始pH 6.5、流加25%氨水恒定pH 5.9、37 ℃恒温发酵20 h至发酵终点。优化后发酵液活菌数为5.64×10¹¹ CFU/mL。本研究提高了具有潜在益生特性L.rhamnosus JL1发酵液的活菌数，提高了发酵效率，为后续的鼠李糖乳酸菌产品的工业化发展提供参考。

对比例1

与本发明的区别在于，将高密度发酵培养基替换成普通MRS肉汤培养基。结果显示，鼠李糖乳杆菌JL1发酵液活菌数为1.65×10⁹CFU/mL。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种鼠李糖乳杆菌JL1的高密度发酵培养基，其特征在于，由下述组分及配比组成：

D-半乳糖44.28 g/L，L-半胱氨酸33.29 g/L，磷酸氢二钾3.52 g/L，柠檬酸氢二铵3.52g/L，乙酸钠8.98 g/L，硫酸镁0.20 g/L，硫酸锰0.04 g/L和吐温-80 1.00 g/L，余量为水。

2.一种鼠李糖乳杆菌JL1高密度发酵的方法，其特征在于，包括将活化的鼠李糖乳杆菌JL1接种到权利要求1所述的高密度发酵培养基中，在pH为5.8-6.0下发酵的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为：pH为5.9，温度为37℃，发酵时间为20h。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述活化的鼠李糖乳杆菌JL1的接种量为4%v/v。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述活化的鼠李糖乳杆菌JL1是将所述鼠李糖乳杆菌JL1菌种接种至MRS液体培养基中进行活化后获得的。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述活化具体为将所述鼠李糖乳杆菌JL1菌种以5% v/v接种量接种至所述MRS液体培养基，在37℃和pH为6.5-6.8条件下活化培养24h。