CN109943509A - 一种利用全单质培养基高密度培养乳酸菌的方法 - Google Patents

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CN109943509A CN201910291578.XA CN201910291578A CN109943509A CN 109943509 A CN109943509 A CN 109943509A CN 201910291578 A CN201910291578 A CN 201910291578A CN 109943509 A CN109943509 A CN 109943509A
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张怡轩
李野
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Abstract

本发明属于微生物发酵领域，涉及一种利用全单质培养基高密度培养乳酸菌的方法，具体涉及一种体外通过定量添加特定氨基酸组合、碳源组合及维生素组合等，替代传统乳酸菌(LAB)发酵培养基(如脱脂乳粉、MRS、TOS等)进行高密度培养获得菌体的方法。本发明一方面以较低的成本大量收获LAB菌体，另一方面因所利用的培养基为全合成培养基(synthetic medium)品质纯净，组成稳定，故可以尽最大可能获得均一且稳定的菌体，并有利于进一步菌体收集及洗脱等工艺的开展。同时因不含脱脂奶、酵母抽提物、蛋白胨等天然来源组分，故不含潜在过敏源(allergen‑free)及未知组分，有利于最终产品适用于过敏体质人群(如乳清蛋白过敏儿童)的应用。

Description

一种利用全单质培养基高密度培养乳酸菌的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域，涉及一种利用全单质培养基高密度培养乳酸菌的方法，具体涉及一种体外通过定量添加特定氨基酸组合、碳源组合及维生素组合等，替代传统乳酸菌(LAB)发酵培养基(如脱脂乳粉、MRS、TOS等)进行高密度培养获得菌体的方法。
背景技术：
乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的一类革兰氏阳性细菌的通称。我国2016年版可在“普通食品”中应用的乳酸菌主要包括：乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌及肠膜明串珠菌等。主要用以制造酸奶、乳酪、泡菜、果蔬发酵及益生菌膳食补充剂等。
这些乳酸菌广泛存在于人体内及发酵乳、泡菜等传统食品中，不同菌株对人体具有广泛的“益生”功能，其生理功能主要包括：
1、防治有色人种普遍患有的乳糖不耐症(喝鲜奶时出现的腹胀、腹泻等症状)。
2、促进蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收，产生维生素B族等大量有益物质。
3、使肠道菌群的构成发生有益变化，改善人体胃肠道功能，恢复人体肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，维护人体健康。
4、抑制腐败菌的繁殖，消解腐败菌产生的毒素，清除肠道垃圾。
5、抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压作用。
6、免疫调节作用，增强人体免疫力和抵抗力。
7、抗肿瘤、预防癌症作用。
8、提高SOD酶活力，消除人体自由基，具抗衰老、延年益寿作用。
9、有效预防女性泌尿生殖系统细菌感染。
10、控制人体内毒素水平，保护肝脏并增强肝脏的解毒、排毒功能。
故近年，以乳酸菌为代表的“益生菌产业”迎来了井喷式发展。2014年至今，中国“益生菌产业”市场规模年增长率大于16％(同期中国营养品市场规模年增长率为6-7％)，并预计至2020年，该市场规模每年可达850亿元以上(净利润率>30％)，其中仅膳食补充剂市场规模即可达到260亿元(中研普华，2017)。并且益生菌的应用亦更加广泛，由于“鼠李糖乳杆菌(LGG)”可有效降低婴幼儿过敏症状，故美赞臣公司于2018年于中国市场首次推出添加了该菌的“乳蛋白深度水解婴儿配方粉”——安敏健，并专用于对乳清蛋白严重过敏的婴儿。由此亦可看出，市场的需求对原料菌粉的品质亦提出了更苛刻的要求，除保证足够的活菌量以外，在生产过程中，尽最大限度的减少引入有害物质的风险，包括过敏源，亦将成为未来益生菌(乳酸菌)菌粉市场的新需求。而在传统的乳酸菌发酵过程中，通常采用脱脂奶、牛肉蛋白胨、酵母抽提物、麦芽汁等天然组分，不可避免的在生产过程中引入未知成份及潜在的过敏源，故本发明将利用单质的培养基组分，如氨基酸、维生素、葡萄糖等小分子对乳酸菌进行发酵生产，在获得高密度培养的同时，从根本上杜绝在发酵过程中从培养基中引入的潜在过敏源。
发明内容：
本发明所解决的技术问题是提供一种利用全单质培养基高密度培养乳酸菌的方法，利用单质小分子组分，如氨基酸、维生素及其它活性小分子，对传统乳酸菌培养基中脱脂奶、蛋白胨、酵母抽提物等天然组分进行替代，实现全单质培养基对乳酸菌的高密度发酵，避免培养基中潜在过敏源的引入。
实际上，本发明涉及一种通过对传统培养基，菌体培养前后，培养基中各游离氨基酸及非游离氨基酸组成变化，进而设计全单质培养基氮源组成，基于菌体实际氨基酸需求，进而实现高密度培养。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明所述的全单质培养基包括基础培养基和氮源，具体包括氮源、碳源、、基础组分、生长因子、微量元素和抗氧化剂，各组成成分占全单质培养基的组成为：所述的氮源在占3.933～98.327g/L，优选19.665～98.327g/L；所述基础组分占2.12～153g/L，优选32.85～153g/L；所述碳源占4.75～480g/L，优选90～480g/L；所述生长因子占0.09～5.5g/L，优选0.514～5.5g/L；所述微量元素占0.24～12.59g/L，优选2.419～12.59g/L；所述抗氧化剂占0.4～15.84g/L，优选1.98～15.84g/L。
我们以鼠李糖乳杆菌SPUB_4243在改良MRS培养基中培养的实际氮源(游离及非游离型氨基酸)消耗水平为例(表1.)，阐述本发明的氮源设计原则。
表1.鼠李糖乳杆菌SPUB_4243在改良MRS培养基中培养8h氨基酸含量的变化.
氨基酸(游离及非游离) 初始含量(g/L) 8h后含量(g/L) 氨基酸利用量(g/L)
丙氨酸 1.095 0.190 0.905
精氨酸 1.942 0.342 1.600
天冬氨酸 0.479 0.383 0.096
半胱氨酸 0.096 0.042 0.054
谷氨酸 1.549 0.509 1.040
甘氨酸 0.387 0.107 0.280
组氨酸 0.399 0.074 0.325
异亮氨酸 0.918 0.154 0.765
亮氨酸 2.554 0.456 2.098
赖氨酸 2.735 0.405 2.330
甲硫氨酸 0.728 0.125 0.603
苯丙氨酸 1.580 0.351 1.229
脯氨酸 0.052 0.158 -0.106
丝氨酸 0.837 0.164 0.673
苏氨酸 0.810 0.141 0.669
色氨酸 0.000 0.006 -0.006
酪氨酸 0.570 0.120 0.450
缬氨酸 1.120 0.207 0.913
总计 17.850 3.933 13.917
原则上表1.中，“氨基酸利用量”即被认为是鼠李糖乳杆菌SPU_4243在培养过程中所需要的氨基酸组成。
其它菌株亦基于以上原则，即为通过测定从培养初期到培养完成，不同时间段，培养基中各氨基酸含量的变化，从而确定菌体在不同时期氨基酸需求量，进而获得初始及培养过程中，各个时间段的各种氨基酸添加量。
基于上述方法，本发明所述全单质培养基中，以全单质培养基为基准，各单质氨基酸在培养基中的最终添加量如表2.所示。
表2.全单质培养基中各单质氨基酸的添加量.
本发明除利用单质氨基酸替代了脱脂奶、牛肉蛋白胨、酵母抽提物、麦芽汁等天然组分中的氮源外，还提供了基础组分、碳源、生长因子、微量元素及抗氧化剂，具体如下：
1.基础组分，包括并不限于表3.中的一种或几种：
表3.全单质培养基中基础组分添加终浓度.
序号 基础组分 最低限(g/L) 最高限(g/L) 推荐量(g/L)
1 K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 0.2 10.0 2
2 KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.2 10.0 2
4 CaCO<sub>3</sub> 0.05 35.0 5
5 MgSO<sub>4</sub> 0.05 2.0 0.6
6 (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 0.5 10.0 3
7 乙酸钠 0.2 35.0 2～8
8 丙酸钠 0.5 35.0 15
9 柠檬酸氢二铵 0.2 10.0 2～3
10 MnSO<sub>4</sub> 0.02 1.0 0.25
11 吐温80 0.2 5 1
2.碳源，包括并不限于表4.中所述9种碳源中的一种或几种：
表4.全单质培养基中的碳源组分及添加浓度.
序号 碳源组分 最低限(g/L) 最高限(g/L) 推荐量(g/L)
1 葡萄糖 0.5 50.0 10～30
2 乳糖 0.45 45.0 10～30
3 半乳糖 0.45 45.0 10～30
4 低聚半乳糖 0.45 45.0 10～30
5 果糖 0.5 50.0 10～30
6 低聚果糖 0.5 50.0 10～30
7 麦芽糖 0.7 65 10～30
8 低聚麦芽糖 0.7 65 10～30
9 蔗糖 0.5 65 10～30
3.生长因子，包括并不限于表5.中生长因子中的一种或几种：
表5.全单质培养基中各生长因子的添加量.
序号 生长因子 最低限(mg/L) 最高限(mg/L) 推荐量(mg/L)
1 生物素 0.00 0.40 0.004
2 烟酸 0.01 0.40 0.04
3 维生素B6(vb6) 0.02 1.00 0.1
4 核黄素(vb2) 0.00 0.20 0.02
5 硫铵素(vb1) 0.01 0.40 0.04
6 维生素B12(vb12) 0.00 0.20 0.02
7 对氨基苯甲酸 0.00 0.20 0.02
8 维生素B5(vb5) 0.00 0.20 0.02
9 胆碱 0.02 1.00 0.1
10 肌醇 0.02 0.80 0.08
11 维生素K1(vk1) 0.00 0.20 0.02
13 叶黄素 0.01 0.40 0.04
14 叶酸 0.00 0.10 0.01
4.微量元素，包括并不限于表6.中微量元素中的一种或几种：
表6.全单质培养基中各微量元素的添加量.
序号 微量元素 最低限(mg/L) 最高限(mg/L) 推荐量(mg/L)
1 FeCl<sub>2</sub> 0.19 9.51 0.951
2 H<sub>3</sub>BO<sub>4</sub> 0.02 0.78 0.078
3 ZnCl<sub>2</sub> 0.01 0.68 0.068
4 CuCl<sub>2</sub> 0.00 0.13 0.013
5 CoCl<sub>2</sub> 0.01 0.65 0.063
6 NiCl<sub>2</sub> 0.00 0.13 0.065
7 Na<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub> 0.00 0.17 0.017
8 Na<sub>2</sub>WO<sub>4</sub>-2H<sub>2</sub>O 0.01 0.33 0.033
9 Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub> 0.00 0.21 0.021
5.抗氧化剂，包括并不限于表7.中抗氧化剂中的一种或几种：
表7.全单质培养基中抗氧化剂的添加量.
序号 抗氧化剂 最低限(g/L) 最高限(g/L) 推荐量(g/L)
1 Na<sub>2</sub>S-9H<sub>2</sub>O 0.10 3.84 0.48
2 Cysteine 0.10 4.00 0.5
3 Ascorbic Acid 0.10 4.00 0.5
4 Na<sub>2</sub>S<sub>2</sub>O<sub>3</sub> 0.10 4.00 0.5
本发明除提供乳酸菌(LAB)全单质培养基组分，亦提供了全单质培养基高密度培养的方法。其培养条件为：
培养温度：35-45℃。
pH值：4.5～7.5，采用NaOH(10％，w/v)或Na2CO3(15％，w/v)碱液控制。
保护气：N2或N2/CO2(80:20，v/v)，压力为100kPa～250kPa；推荐为150kPa(1.5atm)。
其中碳源及氮源氨基酸，可一次性加入，亦可采用分批加入及连续流加加入。
其中生长因子可以无水乙醇为溶剂，制成合适浓度母液，直接加入。
所述全单质培养基的所有组分可一起混合高温灭菌。
本发明所适用的乳酸菌包括并不限于：青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、卷曲乳杆就(Lactobacillus crispatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentium)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆就(Lactobacillus johnsonii)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。
附图说明：
图1为鼠李糖乳杆菌的生长曲线。
其中CK表示利用改良MRS培养基培养,AA表示利用全单质培养基进行培养。
图2为动物双歧杆菌的生长曲线。
其中CK表示利用改良MRS培养基培养,AA表示利用全单质培养基进行培养。
图3为干酪乳杆菌的生长曲线。
其中CK表示利用改良MRS培养基培养,AA表示利用全单质培养基进行培养。
图4为副干酪乳杆菌的生长曲线。
其中CK表示利用改良MRS培养基培养,AA表示利用全单质培养基进行培养。
图5为两歧双歧杆菌的生长曲线。
其中CK表示利用改良MRS培养基培养,AA表示利用全单质培养基进行培养。
图6长双歧杆菌的生长曲线。
其中CK表示利用改良MRS培养基培养,AA表示利用全单质培养基进行培养。
图7为嗜酸乳杆菌的生长曲线。
其中CK表示利用改良MRS培养基培养,AA表示利用全单质培养基进行培养。
图8为植物乳杆菌的生长曲线。
其中CK表示利用改良MRS培养基培养,AA表示利用全单质培养基进行培养。
图9为保加利亚乳杆菌的生长曲线。
其中CK表示利用改良MRS培养基培养,AA表示利用全单质培养基进行培养。
图10为嗜热链球菌的生长曲线。
其中CK表示利用改良MRS培养基培养,AA表示利用全单质培养基进行培养。
具体实施方式：
为更好的阐述完全单质培养基可以有效的实现各种乳酸菌的高密度发酵，下面将描述本发明的5个实施例，但本发明的内容包括但不局限于此。
实施实例1：全单质培养基对鼠李糖乳杆菌的高密度培养方法
a)基础培养基的组成为：
表3.中全部基础成份；
表4.中5g/L葡萄糖、2.5g/L蔗糖；
表5.中全部生长因子；
表6.中全部微量元素；
表7.中半胱氨酸。
基础培养基所添加的氮源为：基于鼠李糖乳杆菌在改良MRS培养基中对培养基中游离及非游离氨基酸消耗量添加。所添加的各氨基酸比例参见表8中，初始氨基酸总量为5g/L。
表8.鼠李糖乳杆菌全单质培养基中氨基酸添加比例.
序号 氨基酸名称 配方比例
1 丙氨酸 6.44％
2 精氨酸 11.40％
3 天冬氨酸 0.69％
4 半胱氨酸 0.39％
5 谷氨酸 7.40％
6 甘氨酸 1.99％
7 组氨酸 2.32％
8 异亮氨酸 5.45％
9 亮氨酸 14.94％
10 赖氨酸 16.59％
11 甲硫氨酸 4.30％
12 苯丙氨酸 8.75％
13 脯氨酸 0.05％
14 丝氨酸 4.79％
15 苏氨酸 4.76％
16 色氨酸 0.04％
17 酪氨酸 3.20％
18 缬氨酸 6.50％
总计 AA 100％
b)流加液(1/2体积基础培养基)的组成为：50g/L葡萄糖，25g/L蔗糖，35g/L氨基酸组合。流加方式为2～10h连续流加完成。
c)培养条件：1％接种；温度37℃；pH 6.2；搅拌30rad/min；N2压力1.5atm。与改良MRS培养基比较，培养结果如图1.所示：
由图1.可知，鼠李糖乳杆菌在改良MRS培养基中，16h达到最大菌浓，其平均活菌数为3.05×109CFU/ml；在利用全单质培养基，采用流加工艺的条件下，可在14h达到最大菌浓，其平均活菌数为3.55×109CFU/ml。
实施实例2：全单质培养基对动物双歧杆菌的高密度培养方法
a)基础培养基的组成为：
表3.中全部基础成份；
表4.中30g/L乳糖；
表5.中全部生长因子；
表6.中全部微量元素；
表7.中半胱氨酸。
基础培养基所添加的氮源见表9.，初始氨基酸总量为5g/L。
表9.动物双歧杆菌全单质培养基中氨基酸添加比例.
序号 氨基酸名称 配方比例
1 丙氨酸 7.02％
2 精氨酸 6.18％
3 天冬氨酸 1.99％
4 半胱氨酸 2.95％
5 谷氨酸 12.52％
6 甘氨酸 1.88％
7 组氨酸 1.64％
8 异亮氨酸 3.44％
9 亮氨酸 11.70％
10 赖氨酸 6.63％
11 甲硫氨酸 5.16％
12 苯丙氨酸 14.32％
13 脯氨酸 2.45％
14 丝氨酸 5.56％
15 苏氨酸 5.97％
16 色氨酸 0.08％
17 酪氨酸 4.09％
18 缬氨酸 6.38％
总计 AA 100％
b)流加液(1/2体积基础培养基)的组成为：60g/L乳糖，50g/L氨基酸组合。流加方式为2～8h连续流加完成。
c)培养条件：1％接种；温度37℃；pH 6.2；搅拌30rad/min；N2压力1.5atm。
与改良MRS培养基(其中碳源为40g/L乳糖，氮源为15g/L大豆蛋白胨、5g/L牛肉浸粉、6.5g/L酵母抽提物)比较，培养结果如图2.所示：
由图2.可知，动物双歧杆菌在改良MRS培养基中，14h达到最大菌浓，其平均活菌数为8.3×109CFU/ml；在利用全单质培养基，采用流加工艺的条件下，可在12h达到最大菌浓，其平均活菌数为1.1×1010CFU/ml。
实施实例3：全单质培养基对干酪乳杆菌的高密度培养方法
a)基础培养基的组成为：
表3.中全部基础成份；
表4.中5g/L葡萄糖、2.5g/L蔗糖；
表5.中全部生长因子；
表6.中全部微量元素；
表7.中半胱氨酸。
基础培养基所添加的氮源见表10.，初始氨基酸总量为5g/L。
表10.干酪乳杆菌全单质培养基中氨基酸添加比例.
序号 氨基酸名称 配方比例
1 丙氨酸 6.44％
2 精氨酸 7.40％
3 天冬氨酸 1.69％
4 半胱氨酸 2.39％
5 谷氨酸 5.40％
6 甘氨酸 1.99％
7 组氨酸 2.32％
8 异亮氨酸 5.45％
9 亮氨酸 12.94％
10 赖氨酸 13.59％
11 甲硫氨酸 4.30％
12 苯丙氨酸 11.75％
13 脯氨酸 3.05％
14 丝氨酸 4.79％
15 苏氨酸 2.76％
16 色氨酸 2.04％
17 酪氨酸 5.20％
18 缬氨酸 6.50％
总计 AA 100.00％
b)流加液(1/2体积基础培养基)的组成为：50g/L葡萄糖，25g/L蔗糖，35g/L氨基酸组合。流加方式为2～8h连续流加完成。
c)培养条件：1％接种；温度37℃；pH 6.4；搅拌30rad/min；N2压力1.5atm。
与改良MRS培养基比较，培养结果如图3.所示：
由图3.可知，干酪乳杆菌在改良MRS培养基中，14h达到最大菌浓，其平均活菌数为5.4×109CFU/ml；在利用全单质培养基，采用流加工艺的条件下，可在10h达到最大菌浓，其平均活菌数为5.5×109CFU/ml。
实施实例4：全单质培养基对副干酪乳杆菌的高密度培养方法
a)基础培养基的组成为：
表3.中全部基础成份；
表4.中5g/L葡萄糖、2.5g/L蔗糖；
表5.中全部生长因子；
表6.中全部微量元素；
表7.中半胱氨酸。
基础培养基所添加的氮源见表11.，初始氨基酸总量为5g/L。
表11.副干酪乳杆菌全单质培养基中氨基酸添加比例.
序号 氨基酸名称 配方比例
1 丙氨酸 6.73％
2 精氨酸 6.79％
3 天冬氨酸 1.84％
4 半胱氨酸 2.67％
5 谷氨酸 8.96％
6 甘氨酸 1.94％
7 组氨酸 1.98％
8 异亮氨酸 4.44％
9 亮氨酸 12.32％
10 赖氨酸 10.11％
11 甲硫氨酸 4.73％
12 苯丙氨酸 13.04％
13 脯氨酸 2.75％
14 丝氨酸 5.18％
15 苏氨酸 4.37％
16 色氨酸 1.06％
17 酪氨酸 4.65％
18 缬氨酸 6.44％
总计 AA 100.00％
b)流加液(1/2体积基础培养基)的组成为：50g/L葡萄糖，25g/L蔗糖，35g/L氨基酸组合。流加方式为2～8h连续流加完成。
c)培养条件：1％接种；温度37℃；pH 6.4；搅拌30rad/min；N2压力1.5atm。
与改良MRS培养基比较，培养结果如图4.所示：
由图4.可知，副干酪乳杆菌在改良MRS培养基中，14h达到最大菌浓，其平均活菌数为3.6×109CFU/ml；在利用全单质培养基，采用流加工艺的条件下，可在10h达到最大菌浓，其平均活菌数为4.0×109CFU/ml。
实施实例5：全单质培养基对两歧双歧杆菌的高密度培养方法
a)基础培养基的组成为：
表3.中全部基础成份(其中无水乙酸钠10g/L)；
表4.中5g/L葡萄糖，5g/L低聚半乳糖；
表5.中全部生长因子；
表6.中全部微量元素；
表7.中维生素C。
基础培养基所添加的氮源见表12.，初始氨基酸总量为15g/L。
表12.两歧双歧杆菌全单质培养基中氨基酸添加比例.
序号 氨基酸名称 配方比例
1 丙氨酸 4.96％
2 精氨酸 10.06％
3 天冬氨酸 1.39％
4 半胱氨酸 2.59％
5 谷氨酸 8.74％
6 甘氨酸 1.34％
7 组氨酸 1.42％
8 异亮氨酸 3.46％
9 亮氨酸 14.96％
10 赖氨酸 10.60％
11 甲硫氨酸 5.03％
12 苯丙氨酸 14.98％
13 脯氨酸 1.74％
14 丝氨酸 4.50％
15 苏氨酸 4.49％
16 色氨酸 0.05％
17 酪氨酸 3.94％
18 缬氨酸 5.73％
总计 AA 100.00％
b)流加液(1/2体积基础培养基)的组成为：65g/L葡萄糖，20g/L低聚乳糖，60g/L氨基酸组合。流加方式为2～12h连续流加完成。
c)培养条件：1％接种；温度37℃；pH 6.0；搅拌30rad/min；N2压力1.5atm。
与改良MRS培养基(其中25g/L葡萄糖，10g/L乙酸钠，14g/L酪蛋白胨替代原蛋白胨)比较，培养结果如图5.所示：
由图5.可知，两歧双歧杆菌在改良MRS培养基中，16h达到最大菌浓，其平均活菌数为1.15×109CFU/ml；在利用全单质培养基，采用流加工艺的条件下，可在12h达到最大菌浓，其平均活菌数为2.3×109CFU/ml。
实施实例6：全单质培养基对长双歧杆菌的高密度培养方法
a)基础培养基的组成为：
氨基酸组成如表13所示，添加量为5g/L，其它组成参见实施实例1.
表13.长双歧杆菌全单质培养基中氨基酸添加比例.
序号 氨基酸名称 配方比例
1 丙氨酸 5.01％
2 精氨酸 7.09％
3 天冬氨酸 14.84％
4 半胱氨酸 2.33％
5 谷氨酸 8.73％
6 甘氨酸 1.92％
7 组氨酸 1.24％
8 异亮氨酸 3.30％
9 亮氨酸 11.56％
10 赖氨酸 7.64％
11 甲硫氨酸 4.17％
12 苯丙氨酸 13.89％
13 脯氨酸 1.76％
14 丝氨酸 4.17％
15 苏氨酸 4.14％
16 色氨酸 0.03％
17 酪氨酸 3.27％
18 缬氨酸 4.91％
总计 AA 100.00％
b)流加液(1/2体积基础培养基)的组成为：50g/L葡萄糖，25g/L蔗糖，35g/L氨基酸组合。流加方式为2～8h连续流加完成。
c)培养条件：1％接种；温度37℃；pH 6.0；搅拌30rad/min；N2压力1.5atm。
与改良MRS培养基(其中25g/L葡萄糖，10g/L乙酸钠，14g/L酪蛋白胨替代原蛋白胨)比较，培养结果如图6.所示：
由图6.可知，长双歧杆菌在改良MRS培养基中，14h达到最大菌浓，其平均活菌数为1.6×1010CFU/ml；在利用全单质培养基，采用流加工艺的条件下，可在10h达到最大菌浓，其平均活菌数为1.5×1010CFU/ml。
实施实例7：全单质培养基对嗜酸乳杆菌的高密度培养方法
a)基础培养基的组成为：
表3.中全部基础成份；
表4.中30g/L葡萄糖；
表5.中全部生长因子；
表6.中全部微量元素；
表7.中半胱氨酸。
基础培养基所添加的氮源见表14.，初始氨基酸总量为5g/L。
表14.嗜酸乳杆菌全单质培养基中氨基酸添加比例.
序号 氨基酸名称 配方比例
1 丙氨酸 4.92％
2 精氨酸 5.27％
3 天冬氨酸 5.58％
4 半胱氨酸 1.48％
5 谷氨酸 14.40％
6 甘氨酸 2.18％
7 组氨酸 2.08％
8 异亮氨酸 4.00％
9 亮氨酸 10.76％
10 赖氨酸 10.27％
11 甲硫氨酸 3.83％
12 苯丙氨酸 7.95％
13 脯氨酸 8.55％
14 丝氨酸 5.18％
15 苏氨酸 3.16％
16 色氨酸 1.02％
17 酪氨酸 4.31％
18 缬氨酸 5.05％
总计 AA 100.00％
a)流加液(1/2体积基础培养基)的组成为：60g/L葡萄糖，65g/L氨基酸组合。流加方式为2～8h连续流加完成。
b)培养条件：1％接种；温度37℃；pH 6.0；搅拌30rad/min；N2压力1.5atm。
与改良MRS培养基(其中40g/L葡萄糖)比较，培养结果如图7.所示：
由图7.可知，嗜酸乳杆菌在改良MRS培养基中，12h达到最大菌浓，其平均活菌数为7.35×108CFU/ml；在利用全单质培养基，采用流加工艺的条件下，可在12h达到最大菌浓，其平均活菌数为1.3×109CFU/ml。
实施实例8：全单质培养基对植物乳杆菌的高密度培养方法
a)基础培养基的组成为：
表3.中全部基础成份；
表4.中15g/L葡萄糖，2.5g/L低聚麦芽糖；
表5.中全部生长因子；
表6.中全部微量元素；
表7.中半胱氨酸。
基础培养基所添加的氮源见表15.，初始氨基酸总量为5g/L。
表15.植物乳杆菌全单质培养基中氨基酸添加比例.
序号 氨基酸名称 配方比例
1 丙氨酸 7.88％
2 精氨酸 8.87％
3 天冬氨酸 6.59％
4 半胱氨酸 1.05％
5 谷氨酸 16.16％
6 甘氨酸 4.73％
7 组氨酸 2.12％
8 异亮氨酸 4.35％
9 亮氨酸 10.00％
10 赖氨酸 7.23％
11 甲硫氨酸 2.34％
12 苯丙氨酸 6.24％
13 脯氨酸 2.14％
14 丝氨酸 6.03％
15 苏氨酸 4.21％
16 色氨酸 0.42％
17 酪氨酸 3.70％
18 缬氨酸 5.94％
总计 AA 100％
c)流加液(1/2体积基础培养基)的组成为：60g/L葡萄糖，25g/L低聚麦芽糖，20g/L氨基酸组合。流加方式为2～6h连续流加完成。
d)培养条件：1％接种；温度37℃；pH 6.4；搅拌30rad/min；N2压力1.5atm。
与改良MRS培养基(其中30g/L葡萄糖,10g/L低聚麦芽糖)比较，培养结果如图8.所示：
由图8.可知，嗜酸乳杆菌在改良MRS培养基中，12h达到最大菌浓，其平均活菌数为3.15×109CFU/ml；在利用全单质培养基，采用流加工艺的条件下，可在8h达到最大菌浓，其平均活菌数为4.15×109CFU/ml。
实施实例9：全单质培养基对保加利亚乳杆菌的高密度培养方法
a)基础培养基的组成为：
表3.中全部基础成份；
表4.中5g/L乳糖，2.5g/L葡萄糖；
表5.中全部生长因子；
表6.中全部微量元素；
表7.中半胱氨酸及维生素C。
基础培养基所添加的氮源见表16.，初始氨基酸总量为5g/L。
表16.保加利亚乳杆菌全单质培养基中氨基酸添加比例.
序号 氨基酸名称 配方比例
1 丙氨酸 5.73％
2 精氨酸 7.24％
3 天冬氨酸 8.27％
4 半胱氨酸 2.36％
5 谷氨酸 7.07％
6 甘氨酸 1.95％
7 组氨酸 1.78％
8 异亮氨酸 4.37％
9 亮氨酸 12.25％
10 赖氨酸 10.62％
11 甲硫氨酸 4.23％
12 苯丙氨酸 12.82％
13 脯氨酸 2.40％
14 丝氨酸 4.48％
15 苏氨酸 3.45％
16 色氨酸 1.03％
17 酪氨酸 4.23％
18 缬氨酸 5.71％
总计 AA 100％
e)流加液(1/2体积基础培养基)的组成为：50g/L乳糖，25g/L葡萄糖，50g/L氨基酸组合。流加方式为2～8h连续流加完成。
f)培养条件：1％接种；温度37℃；pH 6.4；搅拌30rad/min；N2压力1.5atm。
与改良MRS培养基(其中20g/L乳糖,10g/L葡萄糖)比较，培养结果如图9.所示：
由图9.可知，保加利亚乳杆菌在改良MRS培养基中，14h达到最大菌浓，其平均活菌数为9.86×108CFU/ml；在利用全单质培养基，采用流加工艺的条件下，可在12h达到最大菌浓，其平均活菌数为2.3×109CFU/ml。
实施实例10：全单质培养基对嗜热链球菌的高密度培养方法
b)基础培养基的组成为：
表3.中全部基础成份；
表4.中5g/L乳糖，5g/L葡萄糖；
表5.中全部生长因子；
表6.中全部微量元素；
表7.中半胱氨酸及维生素C。
基础培养基所添加的氮源见表17.，初始氨基酸总量为5g/L。
表17.嗜热链球菌全单质培养基中氨基酸添加比例.
g)流加液(1/2体积基础培养基)的组成为：35g/L乳糖，20g/L葡萄糖，35g/L氨基酸组合。流加方式为1～4h连续流加完成。
h)培养条件：1％接种；温度42℃；pH 6.8；搅拌30rad/min；N2压力1.5atm。
与改良MRS培养基(其中碳源为15g/L乳糖,10g/L葡萄糖，25g/L番茄汁，50g/脱脂乳)比较，培养结果如图10.所示：
由图10.可知，保加利亚乳杆菌在改良MRS培养基中，8h达到最大菌浓，其平均活菌数为5.40×109CFU/ml；在利用全单质培养基，采用流加工艺的条件下，可在8h达到最大菌浓，其平均活菌数为5.35×109CFU/ml。

Claims (10)

1.一种利用全单质培养基高密度培养乳酸菌的方法，其特征在于，所述的全单质培养基包括基础培养基和氮源，所述的基础培养基包括碳源、生长因子、基础组分、微量元素、抗氧化剂；所述的氮源包括苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸。
2.如权利要求1所述的高密度培养乳酸菌的方法，其特征在于，所述的氮源占全单质培养基的重量组成为：3.933～98.327g/L，优选19.665～98.327g/L。
3.如权利要求1或2所述的高密度培养乳酸菌的方法，其特征在于，苏氨酸0.1874～4.684g/L、脯氨酸0.0020～0.050g/L、甘氨酸0.0783～1.958g/L、缬氨酸0.2557～6.391g/L、丝氨酸0.1884～4.710g/L、半胱氨酸0.0152～0.380g/L、异亮氨酸0.2142～5.355g/L、亮氨酸0.5877～14.692g/L、谷氨酸0.2912～7.280g/L、天冬氨酸0.0270～0.675g/L、丙氨酸0.2535～6.336g/L、赖氨酸0.6526～16.314g/L、酪氨酸0.1259～3.148g/L、精氨酸0.4483～11.207g/L、组氨酸0.0911～2.278g/L、苯丙氨酸0.3442～8.605g/L、色氨酸0.0016～0.039g/L、甲硫氨酸0.1689～4.224g/L。
4.如权利要求1所述的高密度培养乳酸菌的方法，其特征在于，所述的碳源为葡萄糖、乳糖、半乳糖、低聚半乳糖、果糖、低聚果糖、麦芽糖、低聚麦芽糖、蔗糖中的一种或几种；所述的营养因子为生物素、烟酸、维生素B6、微生物B2、维生素B1、维生素B12、对氨基苯甲酸、维生素B5、胆碱、肌醇、维生素K1、叶黄素及叶酸中的一种或几种；所述的微量元素为FeCl2、H3BO4、ZnCl2、CuCl2、CoCl2、NiCl2、Na2SeO3、Na2WO4-2H2O、Na2MoO4中的一种或几种；所述的基础无机盐组分为丙酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、铵盐、磷酸盐、碳酸盐及硫酸盐中的一种或几种；所述的抗氧化剂为Na2S、Na2S2O3、半胱氨酸及抗坏血酸中的一种或几种。
5.如权利要求4所述的高密度培养乳酸菌的方法，其特征在于，所述的碳源中各组分的用量为：葡萄糖0.5～50.0g/L、乳糖0.45～45.0g/L、半乳糖0.45～45.0g/L、低聚半乳糖0.45～45.0g/L、果糖0.5～50.0g/L、低聚果糖0.5～50.0g/L、麦芽糖0.7～65g/L、低聚麦芽糖0.7～65g/L、蔗糖0.5～65g/L；所述的生长因子中各组分的用量为：生物素0.00～0.40g/L、烟酸0.01～0.40g/L、维生素B6 0.02～1.00g/L、维生素B2 0.00～0.20g/L、维生素B10.01～0.40g/L、维生素B12 0.00～0.20g/L、对氨基苯甲酸0.00～0.20g/L、维生素B50.00～0.20g/L、胆碱0.02～1.00g/L、肌醇0.02～0.80g/L、维生素K1 0.00～0.20g/L、叶黄素0.01～0.40g/L及叶酸0.00～0.10g/L；所述的微量元素各组分的用量为：FeCl2 0.19～9.51g/L、H3BO4 0.02～0.78g/L、ZnCl2 0.01～0.68g/L、CuCl2 0.00～0.13g/L、CoCl2 0.01～0.65g/L、NiCl2 0.00～0.13g/L、Na2SeO3 0.00～0.17g/L、Na2WO4-2H2O 0.01～0.33g/L、Na2MoO4 0.00～0.21g/L；所述的基础组分中各组分的用量为：丙酸钠0.5～35.0g/L、柠檬酸氢二铵0.2～10.0g/L、乙酸钠0.2～35.0g/L、MnSO4 0.02～1.0g/L、吐温0.2～5g/L、K2HPO40.2～10.0g/L、KH2PO4 0.2～10.0g/L、CaCO3 0.05～35.0g/L、MgSO4 0.05～2.0g/L、(NH4)2SO4 0.05～10.0g/L；所述的抗氧化剂中各组分的用量为：Na2S-9H2O 0.10～3.84g/L、Na2S2O3 0.10～4.00g/L、半胱氨酸0.10～4.00g/L及抗坏血酸0.10～4.00g/L。
6.如权利要求1-4任何一项所述的高密度培养乳酸菌的方法，其特征在于，其培养条件为：pH值：4.5～7.5，采用NaOH或Na2CO3碱液控制，培养温度为35-45℃。
7.如权利要求1-4任何一项所述的高密度培养乳酸菌的方法，其特征在于，在培养过程中，其中碳源及氮源氨基酸，可一次性加入，亦可采用分批加入及连续流加加入。
8.如权利要求1-4任何一项所述的高密度培养乳酸菌的方法，其特征在于，在培养过程中，其中生长因子以无水乙醇为溶剂，制成母液，基础培养基高温蒸汽灭菌后，直接加入。
9.如权利要求1所述的高密度培养乳酸菌的方法，其特征在于，所适用的乳酸菌包括：青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆就、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆就、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌。
10.权利要求1-8任何一项所述的高密度培养乳酸菌的方法在提高乳酸菌生长速率中的应用。
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