CN110628663B - 一株鼠李糖乳杆菌及其高密度培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株鼠李糖乳杆菌及其高密度培养方法和应用，所述菌株为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LR‑ZB1107‑01，于2019年4月16日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为GDMCC No：60640。本发明菌株具有优异的抗肠道致病菌特性，抗氧化能力，并且可以耐受胃肠道环境，可在制备肠道抑菌药物和益生菌食品中应用。本发明还提供了该菌的高密度培养方法，该方法以MRS培养基为基础培养基，对基础培养基中的组分比例进行优化，使得该菌的活菌数达8.56×10⁸CFU/mL，从而有利于该菌广泛用于乳品加工、功能食品生产等领域。

Description

一株鼠李糖乳杆菌及其高密度培养方法和应用

技术领域

本发明属于微生物菌种筛选领域，更具体的，本发明涉及一株健康婴儿粪便来源的具有抗氧化能力、抗肠道致病菌能力和对胃肠道环境耐受的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01以及该菌的高密度培养方法。

背景技术

益生菌是肠道菌群中重要的组成部分，国际上对于益生菌公认的定义为：含有生理活性活菌或含有其组分和代谢物的死菌，其被机体经过口服或者皮肤粘膜或其他给药方式摄入后，能够改善机体正常的微生物群平衡、酶系统的平衡以及能够刺激机体特异性、非特异性免疫机制，最终能够提高机体定殖力及免疫力的一类微生物。

人源益生菌作为一类能够调节人体肠道微生态平衡的特殊菌群，从上个世纪初人们就开始认识到微生物及其代谢产物能够对机体产生影响，并且从人体内筛选获得了许多被认为是益生菌的微生物，例如干酪乳杆菌、LGG、BB12，都成为了世界上著名的益生菌，创造了很大的经济价值。研究证明，益生菌除了具有常规的预防和治疗腹泻、调节机体免疫力、预防癌症等功能之外，还具有降胆固醇、降血压、抗氧化等功能。目前对益生菌的研究日益广泛，研究表明早期肠道菌群的定殖很大程度上影响人体成年后的肠道菌群结构，婴儿时期为肠道菌群的关键时期。因此，在一定程度上，研究婴儿时期的肠道益生菌组成对益生菌的开发利用更具有潜力和价值。

益生菌在体内的数量达到一定水平时，才能产生一定的益生效果。所以，在益生菌作为主要成分的功能性食品、保健品中需要添加益生菌至相应数量。这一需求对益生菌培养过程中实现高密度培养提出要求。实现益生菌株的高密度培养，有利于益生菌产品在生产环节中节约成本，缩短生产周期，提高生产效率。因此，益生菌的高密度培养是当前益生菌产品研发过程中不容小觑的关键技术。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新的来源于健康婴儿粪便的，具有抗氧化能力、抑制肠道致病菌，对胃肠道环境耐受的鼠李糖乳杆菌。该菌株经过安全性评价，可广泛用于乳品加工和其他功能性产品的生产应用中。

本发明的目的之二在于通过对培养基的优化进一步提供了该菌的高密度培养方法。

在本发明的第一方面，提供一株鼠李糖乳杆菌，所述菌株为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LR-ZB1107-01，于2019年4月16日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为GDMCC No：60640。

在本发明的第二方面，提供所述的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01的安全性评价，其中包括菌株的溶血性实验、吲哚实验、硝基还原酶实验、抗生素敏感性实验，实验证明鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01不溶血、吲哚实验阴性、硝基还原酶实验阴性，该菌株对四环素、红霉素、氨苄西林和卡那霉素敏感，该菌株安全。

在本发明的第三方面，提供所述的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌悬液或其发酵液或其代谢产物的抗氧化能力，其中菌株发酵液和上清液的抗氧化性为90～98％，无细胞提取液的抗氧化性为40％～60％。

在本发明的第四方面，提供所述的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌悬液或其发酵液或其代谢产物对肠道致病菌的抑制作用，鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01发酵液对大肠杆菌的抑菌圈大小(cm)为2～3，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小(cm)为3～4。

在本发明的第五方面，提供所述的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株在人工模拟胃肠液环境下的耐受能力。鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01或其培养液或其菌悬液在不同pH下的人工模拟胃液中(pH＝1.5、2、2.5、3、3.5)暴露3h后存活率大于90％，在人工肠液中暴露3h后存活率大于95％。本发明菌株对胃肠道具有良好的耐受性。

在本发明的第六方面，对基础MRS培养基中的成分进行优化，提供了一种活菌数含量8.56×10⁸CFU/mL的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01的高密度培养方法。

因此，本发明鼠李糖乳杆菌可在制备肠道抑菌药物和制备益生菌食品中应用。

一种鼠李糖乳杆菌高密度培养的方法，包括以下步骤：

(1)将鼠李糖乳杆菌置于MRS培养基中进行活化得种子发酵剂；

(2)以体积比为3～6:100的比例，将种子发酵剂接入高密度培养基中，于36～38℃下进行恒温培养，18～24h后收集发酵菌液；所述高密度培养基是在MRS培养基的基础上添加包括D-异抗坏血酸，硫酸镁和细菌学蛋白胨在内的营养成分。

优选地，以重量份数计，所述的高密度培养基的配方为：酪蛋白酶消化物0.8～1.2份，酵母膏粉0.3～0.5份，牛肉膏0.5～1.0份，葡萄糖1.5～2.0份，柠檬酸三铵0.1～0.2份，硫酸镁0.08～0.16份，磷酸氢二钾0.1～0.2份，乙酸钠0.4～0.5份，吐温-80 0.1～0.3份，D-异抗坏血酸0.01～0.05份，硫酸锰0.01～0.06份，细菌学蛋白胨1～3份。

优选地，所述高密度培养基为：将上述原料用蒸馏水定容至100份，调节pH至6.8±0.3，搅拌溶解均匀后，灭菌、冷却即可。

优选地，所述灭菌条件为0.08～0.10MPa灭菌15～20min。

优选地，所述种子发酵剂的菌含量为2～5×10⁷CFU/mL。

本发明的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01最初来源于健康的1月龄婴儿粪便，经过16SrDNA测序鉴定结果可得，该菌株属于鼠李糖乳杆菌的亚种。通过一系列安全性实验证明该菌株安全，且能抑制肠道内有害菌的生长，具有良好的抗氧化性以及耐受胃肠液，可在制备肠道抑菌药物和益生菌食品中应用。本发明还提供了该菌的高密度培养方法，为该菌株用于制备以益生菌为主要成分的发酵食品、保健食品、动物饲料等产品提供了技术基础。

附图说明

图1实施例1鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01革兰氏染色后菌体形态图。

图2鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株的系统进化树图。

图3实施例2鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株在血琼脂平板上的生长情况图；(a)为LR-ZB1107-01在血琼脂平板上的生长情况，(b)为质控菌株大肠杆菌在血琼脂平板上的生长情况。

图4实施例2鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株的吲哚实验结果图，左一试管为加入质控菌株大肠杆菌的阳性对照的实验组，中间试管为加入鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株的实验组，右一试管为空白对照。

图5实施例2鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株硝基还原酶实验结果图，左一试管为加入质控菌株大肠杆菌的实验组，中间试管为空白对照实验，右一试管为加入鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01的实验组。

图6实施例2鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株抗生素敏感性实验结果图，a.为LR-ZB1107-01对卡那霉素的抗性实验结果，b.为LR-ZB1107-01对红霉素的抗性实验结果，c.为LR-ZB1107-01对氨苄西林的抗性实验结果，d.为LR-ZB1107-01对四环素的抗性实验结果。

图7实施例3鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株发酵菌液及上清液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用结果图，左一为鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株上清液对金黄色葡萄球菌的抑制作用，右一为鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株发酵菌液对金黄色葡萄球菌的抑制作用。

图8实施例3鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株发酵菌液及上清液对大肠杆菌的抑菌作用结果图，左一为鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株发酵上清液对大肠杆菌的抑制作用，右一为鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株发酵菌液对大肠杆菌的抑制作用。

图9实施例4Box-Behnken优化实验拟合响应曲面交互作用影响图；(a)A:D-异抗坏血酸与B:硫酸镁交互作用影响等高线图，(b))A:D-异抗坏血酸与B:硫酸镁交互作用影响3D曲面图，(c)A:D-异抗坏血酸与C:细菌学蛋白胨交互作用影响等高线图，(d)A:D-异抗坏血酸与C:细菌学蛋白胨交互作用影响3D曲面图，(e)B:硫酸镁与C:细菌学蛋白胨交互作用影响等高线图，(f)B:硫酸镁与C:细菌学蛋白胨交互作用影响3D曲面图。

保藏说明

菌种名称：鼠李糖乳杆菌

拉丁名：Lactobacillus rhamnosus

菌株编号：LR-ZB1107-01

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：广州市先烈中路100号大院59栋

保藏日期：2019年4月16日

保藏中心登记入册编号：GDMCC No.60640。

具体实施方式

本发明提供一株具有良好益生活性的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01，具体而言，本发明涉及一株健康婴儿粪便来源的具有抗氧化能力、抗肠道致病菌能力、和对胃肠道环境耐受的鼠李糖乳杆菌以及该菌的高密度培养方法。为了更好的理解本发明，下面结合具体的实施例，对本发明进行详细的阐述和说明，但本发明要求保护范围并不局限于以下具体实施例所示范围。

实施例1：菌株的筛选与鉴定

用一次性粪便采集杯收集广州市爱弥儿月子中心一月龄内健康婴儿的粪便，样品于4h内在生理盐水中梯度稀释10⁷倍，将样品稀释液涂布于MRS琼脂培养基中，37℃厌氧培养48h。根据菌落大小、形态等特征选取单菌落进行分离纯化。将筛选出的菌株进行革兰氏染色、产气实验、过氧化氢酶实验，选取革兰氏染色阳性、产气阴性、过氧化氢酶阴性的菌株进行测序鉴定。该菌株16S rDNA序列参见SEQ NO.1，经16SrDNA测序结果显示，LR-ZB1107-01菌株为鼠李糖乳杆菌亚种。将分离纯化后的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株保存至甘油中，-20℃下冻存。

实施例2：菌株的安全性评价

将-20℃冰箱中冻存的菌株，接种于种子培养基中，连续进行2～3次活化，得到种子培养液，该种子发酵剂的菌含量为2～5×10⁷CFU/ml。所述培养基为MRS培养基：酪蛋白酶消化物1份、牛肉膏粉1份、酵母膏粉1.0份、柠檬酸三铵0.22份、乙酸钠0.5份、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02份、硫酸锰(MnSO4·4H2O)0.005份、磷酸氢二钾0.2份、葡萄糖2份、吐温-80 0.108份，加蒸馏水至100份。pH＝5.7±0.2。121℃灭菌15min。

1鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01安全性评价研究

1.1菌株的溶血性检测

将活化后的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01以及质控菌株大肠杆菌分别用灭过菌的接种针在哥伦比亚血琼脂上划线接种，同时做空白对照，37℃恒温培养48h，观察菌落周围有无明显的溶血圈并拍照记录。结果如图3所示，(a)为LR-ZB1107-01在血琼脂平板上的生长情况(b)为质控菌株大肠杆菌在血琼脂平板上的生长情况。本实施例选用的质控菌株具有溶血性，周围出现溶血圈。与质控菌株对比，鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01周围无明显溶血圈形成，即鼠李糖乳杆菌不会对人体造成溶血伤害，是安全的。

1.2吲哚实验

将活化后的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01种子液以及阳性对照菌株大肠杆菌液按3％(v/v)的接种量接种于蛋白胨水培养基中，同时设置空白对照，37℃恒温培养72h，加入吲哚试剂8～10滴后观察实验结果。出现两层液体交界面处出现红色环为阳性，不变色则为阴性。实验结果如图4所示，在加入吲哚试剂后，接种了阳性对照大肠杆菌的蛋白胨水培养基中两层液体交界处出现了明显的红色环，吲哚实验结果为阳性。接种了LR-ZB1107-01的蛋白胨水培养基和空白对照均没有明显的颜色变化，吲哚实验结果为阴性。上述蛋白胨水培养基，按质量计算，细菌学蛋白胨1份、氯化钠0.5份，添加蒸馏水至100份，搅拌均匀，调节培养基pH值至7.6，分装到锥形瓶中，121℃高压灭菌15min。

1.3硝基还原酶实验

将活化后的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01以及阳性对照菌株大肠杆菌按3％(v/v)的接种量接种于硝基还原酶检测培养基中，同时设置空白对照组，37℃恒温培养72h。向培养基中依次加入α-萘胺溶液和对氨基苯甲磺酸溶液8～10滴，轻轻摇匀后观察培养基颜色变化，拍照记录结果。培养基变为红色则代表硝基还原酶检测结果为阳性，否则为阴性。结果如图5所示，鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01硝基还原酶实验结果为阴性，即鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01菌株内并无具有活性的硝基还原酶，不会将硝酸盐还原成亚硝酸盐。上述硝基还原酶检测培养基，按质量计算，细菌学蛋白胨1份、氯化钠1份、硝酸钾0.5份，添加蒸馏水至100份，搅拌均匀，调节培养基pH值至6.8，分装到锥形瓶中，121℃高压灭菌15min。

1.4抗生素敏感性实验

将活化后的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01种子液取1ml菌液加入到培养皿中，和15ml琼脂培养基混合摇匀，待培养基凝固后，将浸泡有万古霉素、卡那霉素、克林霉素、氨苄青霉素、红霉素的纸片置于已凝固的培养基上，37℃培养48h。观察培养基中供试菌株的生长情况，若抗生素纸片周围出现明显的透明圈，则用直尺测量透明圈的直径以判断供试菌株是否具有药敏性。同时选用金黄色葡萄球菌作为药敏实验的质控菌株。供试菌株是否具有对各种抗生素的抗性依据美国临床和实验室标准化协会(Clinical and LaboratoryStandards Institute,CLSI)制定的相关标准(见表1)判断。

表1药敏纸片含量及抗药性判断标准

表2K-B纸片扩散实验结果

K-B纸片扩散实验结果如表2所示，鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01对四种抗生素的敏感性都很高，因此，是安全的。

实施例3：鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01的益生活性研究

将-20℃冰箱中冻存的菌株，接种于种子培养基中，连续进行2～3次活化，得到种子培养液，该种子发酵剂的菌含量为2～5×10⁷CFU/ml。所述培养基为MRS培养基：酪蛋白酶消化物1份、牛肉膏粉1份、酵母膏粉1.0份、柠檬酸三铵0.2份、乙酸钠0.5份、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02份、硫酸锰(MnSO4·4H2O)0.005份、磷酸氢二钾0.2份、葡萄糖2份、吐温-800.108份，加蒸馏水至100份。pH＝5.7±0.2。121℃灭菌20min。

3.1DPPH自由基清除实验

活化后的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01，将菌液浓度调节至2×10⁸CFU/ml，分别检测稀释1、2、4、8倍的菌液、上清液、无细胞提取液的DPPH自由基清除能力。取等体积的待测样品和DPPH暗反应30min后，同时设置对照组(等体积DPPH+无水乙醇)，空白组(等体积的待测样品+无水乙醇)，测定517nm处的吸光值。自由基清除率＝[1-(A_样-A_空/A_对)]×100％。上述DPPH为0.2mmol/L的DPPH 0.0078g用无水乙醇定容至100ml。上述上清液为该浓度下的菌液离心后取上清液，上述无细胞提取液是该浓度下的菌液经细胞破碎仪破碎30min后，离心后取上清为无细胞提取液。用上述相同的方法测定鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469的DPPH抗氧化性。如表3-1和3-2所示，两株鼠李糖乳杆菌均有较强的抗氧化能力，且随着菌体浓度的增大，抗氧化性逐渐增强。其中鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01的发酵液和上清液的抗氧化性均达98％以上，无细胞提取液的抗氧化性可达44.16％。

表3-1鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01的DPPH自由基清除率

表3-2鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469的DPPH自由基清除率

3.2抑制致病菌实验

金黄色葡萄球菌(G⁺)和大肠杆菌(G^-)作为指示菌株，指示菌(约10⁸CFU/ml)涂布于已冷却的LB琼脂培养基表面，其上垂直放上已高温灭菌的牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm)，在牛津杯中加入200μl待测样品，在4℃条件下扩散24h后转移到培养箱中，37℃培养48h，观察并测量抑菌圈直径，每组三个平行。分别检测了鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01的发酵菌液及上清液的抑菌能力。按照上述相同的方法检测鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469的发酵菌液及上清液的抑菌能力。上述LB琼脂培养基，按质量计算，葡萄糖1份，氯化钠5份，酵母膏粉5份，蛋白胨10份，琼脂20份，加蒸馏水至1000份，pH为7.0±0.2。如表4-1和表4-2所示，分别为鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01和鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469对致病菌的抑制效果。结果表明，两株鼠李糖乳杆菌的上清液和发酵菌液对金黄色葡萄球菌(G⁺)和大肠杆菌(G^-)都有一定的抑制效果，其中鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01上清液对金黄色葡萄球菌(G⁺)和大肠杆菌(G^-)的抑制效果略强于鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469上清液。

表4-1鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01对两种指示菌的抑菌能力(cm)

表4-2鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469对两种指示菌的抑菌能力(cm)

3.3人工胃液耐受性实验

活化后的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01种子液按照5％(v/v)的接种量，分别接种于pH＝2、2.5、3、4的人工模拟胃液中，同时以90％的生理盐水作为空白组，37℃培养，分别在0h、1h、2h、3h取样，计活菌数。活化后的鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469按上述相同的方法，与鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01进行不同pH的人工胃液耐受性对比实验。上述人工胃液，取20ml 1mol/L的盐酸，用NaOH调节pH至2、2.5、3、4，然后按1g/100ml加入胃蛋白酶，充分溶解后，将配制好的人工胃液过孔径为0.22μm的滤膜除菌备用。如表5-1所示，鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01在不同pH的人工胃液下存活状态良好，不同pH下活菌数变化与空白组比较没有显著差异(p＜0.05)，在不同pH胃液中暴露3h后存活率仍高于99％。如表5-2所示，鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469在pH为2.5、3、4的人工胃液中存活状态良好，与空白组对比均无显著差异，但在低pH2的人工胃液中处理3h后，活菌数下降超过1LOG(CFU/mL)，耐受性明显弱于鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01。其中人工胃液的配制为：1mol/L的盐酸100份，胃蛋白酶0.01份，用1mol/L的NaOH调节pH至2、2.5、3、4。充分溶解后，用孔径0.22μm的微孔膜过滤除菌。

表5-1鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01在不同pH人工胃液下的存活状态(LOG(CFU/mL))

表5-2鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469在不同pH人工胃液下的存活状态(LOG(CFU/mL))

3.4人工肠液耐受性实验

活化后的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01按照5％(v/v)的接种量接种于人工肠液中，同时设置90％的生理盐水为空白对照组，37℃培养，于0h、2h、4h、6h、8h取样，计活菌数。活化后的鼠李糖标准菌株ATCC7469按上述相同的方法，与鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01进行人工肠液耐受性对比实验。上述人工肠液，取KH₂PO₄ 0.27g，加蒸馏水20ml溶解，用1mol/L的NaOH调节pH至6.8，再按0.1g/L加入胰蛋白酶，充分溶解后用孔径0.22μm的微孔膜过滤除菌，制得人工肠液备用。如表6-1所示，鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01在模拟肠液中处理8h存活状态良好，活菌数变化与空白组比较没有显著差异(p<0.05)，在人工肠液中暴露8h存活率超过100％。如表6-2所示，鼠李糖标准菌株ATCC7469在人工模拟肠液中处理8h活菌数并未显著下降，与空白组比较没有显著差异(p<0.05)。鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01和标准菌株ATCC7469都有着较好的人工肠液耐受性。其中人工肠液的配制为：KH₂PO₄1.35份，胰蛋白酶0.01份，蒸馏水100份。调节pH至6.8，充分溶解后，用孔径0.22μm的微孔膜过滤除菌。

表6-1鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01在人工肠液中存活状态(LOG(CFU/mL))

表6-2鼠李糖乳杆菌标准菌株ATCC7469在人工肠液中存活状态(LOG(CFU/mL))

实施例4鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01的高密度培养方法研究

将-20℃冰箱中冻存的菌株，接种于种子培养基中，连续进行2～3次活化，得到种子培养液，该种子发酵剂的菌含量为2～5×10⁷CFU/mL。以3％(v/v)的比例，将活化后的种子发酵液接入高密度培养基中，于37℃进行发酵培养，22h后计活菌数。所述的高密度培养基为：酪蛋白酶消化物1份，酵母膏粉0.4份，牛肉膏粉1.0份，葡萄糖2份，柠檬酸三铵0.2份，硫酸镁0.14份，磷酸氢二钾0.2份，乙酸钠0.5份，吐温-80 0.108份，D-异抗坏血酸0.02份，硫酸锰0.05份，细菌学蛋白胨3份，添加蒸馏水至100份，搅拌均匀，调节培养基pH至6.8。搅拌均匀后于0.10MPa灭菌20min，冷却至30℃备用。

所述MRS基础培养基配方为：酪蛋白酶消化物1份、牛肉膏粉1份、酵母膏粉0.4份、柠檬酸三铵0.2份、乙酸钠0.5g份、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02份、硫酸锰(MnSO4·4H2O)0.005份、磷酸氢二钾0.2份、葡萄糖2份、吐温-80 0.108份，加蒸馏水至100份。pH＝5.7±0.2。121℃灭菌20min。

所述的高密度培养及通过以下单因素优化、Plackett-Burmen实验设计和Box-Behnken优化实验而获得，具体如下：

4.1高密度培养单因素优化

4.1.1碳源优化

从表7可看出，葡萄糖添加量为1倍时，LR-ZB1107-01活菌数达到最高，为2.67±0.29×10⁸CFU/ml。当葡萄糖添加量到达一定倍数时，菌体利用率达极限，继续添加对其生长没有帮助，加入过多的葡萄糖反而会抑制其增殖。

表7葡萄糖添加量对LR-ZB1107-01活菌数的影响

注：单位(倍)指：葡萄糖添加量为基础培养基中葡萄糖含量的倍数，即添加0份、2.0份、3.0份、4.0份、5.0份、6.0份、7.0份、8.0份。

4.1.2氮源优化

(1)酵母提取粉优化

在基础MRS培养基中分别加入0、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4倍的酵母提取粉，从表8中可以看出，当酵母提取粉的添加量为基础培养基的3.5倍时，获得菌悬液中活菌数最多(P<0.05)，此时含量适宜LR-ZB1107-01的生长。在3.5倍后，活菌数下降，说明该菌对酵母提取粉的利用率已达极限，过多的氮源会产生一定的抑制作用。

表8酵母提取粉添加量对LR-ZB1107-01活菌数的影响

注：单位(倍)指：酵母提取粉添加量为基础培养基中酵母膏粉含量的倍数，即添加0份、0.4份、0.6份、0.8份、1.0份、1.2份、1.4份、1.6份。

(2)细菌学蛋白胨优化

MRS基础培养基中含酪蛋白酶消化物1份，以该物质的含量为单位含量，在基础MRS培养基中分别加入0、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4倍的细菌学蛋白胨，从表9中可以看出，当细菌学蛋白胨的添加量为MRS基础培养基中氮源(酪蛋白酶消化物)的3.5时，LR-ZB1107-01活菌数达到最大，当添加量继续增大时，活菌数反而下降，说明该菌并不能利用过量的细菌学蛋白胨，过多的细菌学蛋白胨添加量不利于获得高浓度菌悬液。

表9细菌学蛋白胨添加量对LR-ZB1107-01活菌数的影响

注：单位(倍)指：细菌学蛋白胨添加量为基础培养基中氮源(酪蛋白酶消化物)含量的倍数，即添加0份、1份、1.5份、2份、2.5份、3份、3.5份、4份。

4.1.3生长因子优化

(1)硫酸锰优化

在MRS基础培养基中加入0、1、2、3、4、5、6倍的硫酸锰，从表10中可以看出，当硫酸锰添加量为MRS基础培养基的4倍时，LR-ZB1107-01活菌数达到最大(P<0.05)，继续添加硫酸锰，活菌数不再继续上升。

表10硫酸锰添加量对LR-ZB1107-01活菌数的影响

注：单位(倍)指：硫酸锰添加量为基础培养基中硫酸锰含量的倍数，即添加0份、0.005份、0.01份、0.015份、0.02份、0.025份、0.03份。

(2)硫酸镁优化

在MRS基础培养基中加入0、1、2、3、4、5、6倍的硫酸镁，从表11中可以看出，添加5倍硫酸镁时，LR-ZB1107-01菌悬液活菌数最多(P<0.05)，此时菌的生长状况比空白组好。继续增大硫酸镁添加量，活菌数趋于稳定。

表11硫酸镁添加量对LR-ZB1107-01活菌数的影响

注：单位(倍)指：硫酸镁添加量为基础培养基中硫酸镁含量的倍数，即添加0份、0.02份、0.04份、0.06份、0.08份、0.10份、0.12份。

(3)D-异抗坏血酸优化

由表12可以看出，当添加0.03％抗坏血酸时，获得的LR-ZB1107-01菌悬液活菌数最多(p<0.05)，此时LR-ZB1107-01生长状况较好，随着D-异抗坏血酸的继续添加，活菌数开始下降。

表12D-异抗坏血酸添加量对LR-ZB1107-01活菌数的影响

(4)维生素B₁优化

由表13可以看出，当VB₁添加量为0.06％时，LR-ZB1107-01菌悬液的活菌数达到最大(P<0.05)，各组添加不同浓度的VB₁的培养基比空白培养基更有利于LR-ZB1107-01的生长。

表13维生素B₁添加量对LR-ZB1107-01活菌数的影响

(5)维生素C优化

由表14可以看出，添加0.03％的维生素C使LR-ZB1107-01菌悬液浓度达到最大(P<0.05)。随着维生素C添加量逐渐增大，活菌数下降。说明过量的维生素C添加不利于该菌的增殖。

表14维生素C添加量对LR-ZB1107-01活菌数的影响

(6)叶酸优化

由表15可看出，当叶酸的添加量为0.04％时，LR-ZB1107-01菌悬液的活菌数达到最大(P<0.05)，此时菌的生长状态最佳。

表15叶酸添加量对LR-ZB1107-01活菌数的影响

4.2培养基配方优化实验

使用Design Expert11软件进行培养基优化实验设计。在上述单因素分析中，选择了葡萄糖、酵母提取粉、细菌学蛋白胨、硫酸锰、硫酸镁、D-异抗坏血酸、维生素B₁、维生素C、叶酸这九种单因素进行分析，实验结果表明，当培养基中分别含有(以MRS培养基为基础培养基)1倍葡萄糖、3.5倍酵母提取粉、3.5倍的细菌学蛋白胨、4倍硫酸锰、5倍硫酸镁、0.03％D-异抗坏血酸、0.06％维生素B₁、0.03％维生素C、0.04％叶酸时，获得的菌悬液是各自单因素优化实验组别中活菌数数量最多的。因此选择这几个浓度作为基准，进行Plackett-Burmen实验和Box-Behnken优化实验。

表16 Plackett-Burmen实验结果表

利用Design Expert 11软件对上表中的数据进行分析，结果如下：

表17 Plackett-Burmen实验分析表

从表17可知，在促进鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01生长上，D-异抗坏血酸，硫酸镁和细菌学蛋白胨的贡献度最高，分别为40.963％、21.449％和13.138％。结果表明在这9种促进因子中，加入D-异抗坏血酸、硫酸镁和细菌学蛋白胨，对于鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01的生长促进作用较其他更为明显，这三种因子的贡献值远高于其他因子。因此，选择D-异抗坏血酸、硫酸镁和细菌学蛋白胨作为研究对象，进行下一步的Box-Behnken优化实验。

4.3Box-Behnken优化实验结果分析

表18 Box-Behnken实验结果表

表19 Box-Behnken实验分析表

由表19可知，拟合模型的p＝0.0065＜0.05，决定系数R²＝0.9094，说明模型与实际情况的拟合较好。根据以上分析得知活菌数Y对自变量D-异抗坏血酸(A)、硫酸镁(B)、细菌学蛋白胨(C)的多元回归方程为：

Y＝855.63025-4.83768A+11.15859B-1.44562C+2.14213AB+6.18824AC-2.47984BC-0.811830A²+8.00391B²-2.65968C²

该方程表示了鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01发酵液中活菌数和3个影响因子之间的线性关系是显著的，即这种建模方法是可靠的。根据回归方程，一次项系数比较大，交互项系数中AC的交互系数较大，说明D-异抗坏血酸和细菌学蛋白胨之间的交互效应较大，而AB的交互系数较小，说明D-异抗坏血酸和硫酸镁之间的交互效应较小。

为了检验该方程的有效性，对建立的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01发酵液中活菌数的模型进行方差分析，并对三个因子的偏回归系数进行检测。一次项中B的回归系数高度显著，p为0.0004，说明硫酸镁的浓度对LR-ZB1107-01生长有着显著的促进作用。交互项AC回归系数较其他因素更为显著，说明D-异抗坏血酸和细菌学蛋白胨的交互项对鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01生长的促进作用更为显著，拟合度R²＝0.9094，说明该方程对鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01生长的实际情况拟合较好。

对二阶方程求一阶偏导，当响应值Y(活菌数)最大值时各因子水平为D-异抗坏血酸(A)为0.02％、硫酸镁(B)为6倍，细菌学蛋白胨(C)为3倍。此时理论预测鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01浓度为8.84×10⁸CFU/mL，对该配方所获得的培养基进行验证实验，实际菌体浓度为8.56×10⁸CFU/mL，与理论值接近。

序列表

<120> 一株鼠李糖乳杆菌及其高密度培养方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggctcgctcc ctaaaagggt tacgccaccg gcttcgggtg ttacaaactc tcatggtgtg 60

acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcgtgctgat ccgcgattac 120

tagcgattcc gacttcgtgt aggcgagttg cagcctacag tccgaactga gaatggcttt 180

aagagattag cttgacctcg cggtctcgca actcgttgta ccatccattg tagcacgtgt 240

gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt 300

caccggcagt cttactagag tgcccaacta aatgctggca actagtcata agggttgcgc 360

tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct 420

gtcattttgc ccccgaaggg gaaacctgat ctctcaggtg atcaaaagat gtcaagacct 480

ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 540

cgtcaattcc tttgagtttc aaccttgcgg tcgtactccc caggcggaat gcttaatgcg 600

ttagctgcgg cactgaaggg cggaaaccct ccaacaccta gcattcatcg tttacggcat 660

ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct acccatgctt tcgagcctca gcgtcagtta 720

cagaccagac agccgccttc gccactggtg ttcttccata tatctacgca tttcaccgct 780

acacatggag ttccactgtc ctcttctgca ctcaagtttc ccagtttccg atgcacttcc 840

tcggttaagc cgagggcttt cacatcagac ttaaaaaacc gcctgcgctc gctttacgcc 900

caataaatcc ggataacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 960

ccgtggcttt ctggttggat accgtcacgc cgacaacagt tactctgccg accattcttc 1020

tccaacaaca gagttttacg acccgaaagc cttcttcact cacgcggcgt tgctccatca 1080

gacttgcgtc cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtt tgggccgtgt 1140

ctcagtccca atgtggccga tcaacctctc agttcggcta cgtatcattg ccttggtgag 1200

ccgttacctc accaactagc taatacgccg cgggtccatc caaaagcgat agcttacgcc 1260

atctttcagc caagaaccat gcggttcttg gatttatgcg gtattagcat ctgtttccaa 1320

atgttatccc ccacttaagg gcaggttacc cacgtgttac tcacccgtcc gccactcgtt 1380

caaaattaaa tcaagatgca agcacctttc aataatcaga actcgttcga cttgcatgta 1440

ttaggcacgc cgccagcgtt catcctgagc caaaaatcaa aacaccactt g 1491

Claims (7)

1.一株鼠李糖乳杆菌，其特征在于，所述菌株为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LR-ZB1107-01，于2019年4月16日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为GDMCC No：60640。

2. 权利要求1所述鼠李糖乳杆菌在制备抑制肠道菌药物中的应用，其特征在于，所述肠道菌为金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）。

3.一种鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01高密度培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将权利要求1的鼠李糖乳杆菌置于MRS培养基中进行活化得种子发酵剂；

（2）以体积比为3~6:100的比例，将种子发酵剂接入高密度培养基中，于36~38℃下进行恒温培养，18~24h后收集发酵菌液；所述高密度培养基是在MRS培养基的基础上添加包括D-异抗坏血酸，硫酸镁和细菌学蛋白胨在内的营养成分。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以重量份数计，所述的高密度培养基的配方为：酪蛋白酶消化物0.8~1.2份，酵母膏粉0.3~0.5份，牛肉膏0.5~1.0份，葡萄糖1.5~2.0份，柠檬酸三铵0.1~0.2份，硫酸镁0.08~0.16份，磷酸氢二钾0.1~0.2份，乙酸钠0.4~0.5份，吐温-80 0.1~0.3份，D-异抗坏血酸0.01~0.05份，硫酸锰0.01~0.06份，细菌学蛋白胨1~3份。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述高密度培养基为：将上述原料用蒸馏水定容至100份，调节pH至6.8±0.3，搅拌溶解均匀后，灭菌、冷却即可。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述灭菌条件为0.08~0.10MPa灭菌15~20min。

7.根据权利要求3或4或5或6所述的方法，其特征在于，所述种子发酵剂的菌含量为2~5×10⁷CFU/mL。

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