CN110191945A - 乳酸菌及其在细菌生物膜形成的预防性、抑制性和/或减少性处理中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及属于乳杆菌属的选择的细菌菌株、及其在细菌生物膜的处理中的应用,所述处理具体而言为旨在抑制和/或减少细菌生物膜的形成的预防性处理。特别是,本发明涉及属于乳杆菌属的以下细菌菌株及其在细菌生物膜的处理中的应用,所述细菌菌株选自包含植物乳杆菌LMC1(DSM 32252)、罗伊氏乳杆菌LMC3(DSM 32253)、副干酪乳杆菌LMC4(DSM 32254)、罗伊氏乳杆菌LMC5(DSM 32255)、鼠李糖乳杆菌LMC6(DSM 32256)、鼠李糖乳杆菌LMC7(DSM 32257)、副干酪乳杆菌LMC8(DSM 32258)、罗伊氏乳杆菌LMC9(DSM 32259)和鼠李糖乳杆菌LMC10(DSM 32260)的或由它们组成的组,所述处理具体而言为旨在抑制和/或减少细菌生物膜的形成的预防性处理。此外,本发明涉及包含混合物和可选的药物或食品级技术添加剂和/或赋形剂的药物组合物、用于医疗器械的组合物或用于膳食补充剂的组合物,所述混合物包含一种或多种上述细菌菌株或由一种或多种上述细菌菌株组成,所述组合物用于细菌生物膜的处理,并且具体而言用于旨在抑制和/或减少细菌生物膜的形成的预防性处理。
Description
本发明涉及属于乳杆菌属的选择的细菌菌株,及其在细菌生物膜的处理中的应用,所述处理具体而言为旨在抑制和/或减少细菌生物膜的形成的预防性处理。特别是,本发明涉及属于乳杆菌属的以下细菌菌株及其在细菌生物膜的处理中的应用,所述细菌菌株选自包含植物乳杆菌LMC1(DSM 32252)、罗伊氏乳杆菌LMC3(DSM 32253)、副干酪乳杆菌LMC4(DSM 32254)、罗伊氏乳杆菌LMC5(DSM 32255)、鼠李糖乳杆菌LMC6(DSM 32256)、鼠李糖乳杆菌LMC7(DSM 32257)、副干酪乳杆菌LMC8(DSM 32258)、罗伊氏乳杆菌LMC9(DSM32259)和鼠李糖乳杆菌LMC10(DSM 32260)的或由它们组成的组,并且所述处理具体而言为旨在抑制和/或减少细菌生物膜的形成的预防性处理。此外,本发明涉及包含混合物和可选的药物或食品级技术添加剂和/或赋形剂的药物组合物、用于医疗器械的组合物或用于膳食补充剂的组合物,所述混合物包含一种或多种上述细菌菌株或由一种或多种上述细菌菌株组成,所述组合物用于细菌生物膜的处理,并且具体而言用于旨在抑制和/或减少细菌生物膜的形成的预防性处理。
在生物医学情况中,所谓的生物膜由锚定在生物或非生物表面上并掺入/封闭在细胞外胞外多糖基质(1)中的微生物群落组成。生物膜形成(其在负责其产生的特定细菌基因的控制下发生)是与多细胞生物体中的细胞分化相比较的过程。生物膜的典型实例由当细菌粘附到生物或非生物表面并将其自身锚定于表面上、生长和分裂从而形成由聚合性物质(特别是多糖)的细胞外基质构成的两个涂层时形成的生物膜代表。掺入生物膜内的细菌表面上的所述细胞外基质有效地保护它们免受外部试剂(例如抗生素)的作用(2)。许多研究事实上已经证明:与浮游形式的相同细菌相比,生物膜可以将微生物对抗微生物剂的抗性提高超过一百倍(3,4);因此,很难消除生物膜内的细菌,因为没有现成的分子能够有效地穿透这种生物结构。据估计,世界上大约80%的微生物质量以生物膜状态存在,并且上述微生物生物膜是超过75%的可能在人类中发现的总微生物感染中的原因(5)。细菌生物膜能够在活生物体(例如,人或动物)的外表面上或内部形成,或者在与不完全灭菌(如在例如假体的情况下)的环境相关的各种类型的损伤中或附近形成,或者由于所述损伤形成。此外,细菌生物膜也可以在不完全灭菌的非生物表面、例如血管内导管和假体植入物(6)上形成,或者在例如骨骼、骨组织、和骨组织中假体插入物的情况下形成。这些人造表面上的生物膜内的微生物通常在插入或植入装置期间来自患者自身或医务人员的皮肤菌群。仅作为非限制性实例,主要的微生物特别包括血管内导管上的凝固酶阴性葡萄球菌(Staphylococci)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、假单胞菌(Pseudomonas)的各个物种、肠球菌(Enterococcus)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)和念珠菌(Candida);导尿管上的大肠杆菌(Escherichia coli)、肠球菌、假单胞菌、克雷伯氏菌(Klebsiella)、肠杆菌(Enterobacter)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和念珠菌;以及髋关节置换植入物上的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcus emidermitis)和痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)(6)。
由于这种类型的植入物经常长时间留在患者体内,因此由这些有害微生物形成生物膜可能引起难以根除的严重的局部和/或全身性感染,例如骨髓炎,其是一种同时影响骨骼和骨髓的感染过程(6)。口腔生物膜也构成微生物的滋生地,可以通过短暂的菌血症传播,正如从口腔感染中分离出的不同类型的生物膜所证明的那样(7)。生物膜中存在的细菌的脱离和随后的血源性传播与某些形式的感染性心内膜炎、急性细菌性心肌炎、脑脓肿、肝脓肿、肺脓肿和海绵窦血栓形成有关(8-13)。口腔生物膜可能对全身健康产生影响的假设得到交叉研究(cross-sectional study)的支持,该研究报告牙周炎患者全身炎症标志物水平升高(14,15)。令人信服的证据支持牙周炎与心血管疾病和脑血管疾病和糖尿病之间的系统性-口腔联系,所有这些都具有炎症性病因。此外,无论如吸烟、年龄、教育程度、体重指数和生活方式等因素的普通风险因素如何,都可以证明牙周炎与心血管疾病之间存在关联性(16)。
然而,值得注意的是,与上面所描述的内容相反,还存在天然存在于胃肠和/或女性泌尿生殖道中的生物膜,其含有有益微生物,例如乳杆菌和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus),因为这种结构(生物膜)有利于区域的长期定殖和这些细菌在生物体中的持久性(17),因此能够在生物体中发挥保护作用。
因此,特别是与抗生素的有效性降低相关的由致病菌产生的细菌微生物生物膜对人类健康的负面影响,刺激了对能够有效发挥抗生物膜试剂作用的新的生物活性产品的追求,所述抗生物膜试剂能够抑制其形成(预防作用)和/或阻断和/或减少它们的生长/发展(治疗作用),从而能够最佳地应用所需/期望的抗微生物/抗菌治疗(例如抗生素)。
然而,据申请人所知,迄今尚未鉴定/生产出能够以完全令人满意的方式实现上述目的的产品。
因此,该领域的从业者仍然强烈需要使其一次性产品、组合物和制剂能够有效地作为抗菌生物膜剂发挥作用,以抑制生物膜形成和/或阻断和/或减少其生长/发展,从而能够最佳地应用所需/期望的抗菌处理(例如,抗生素)。
本发明的目的是为上述技术问题提供适当的应对。
申请人现在意外地发现,合适的一组特定选择的人类来源的乳杆菌能够对上述技术问题提供所需的应对。
本发明的一个目的是一种或多种属于乳杆菌属的人类来源的细菌菌株,如所附独立权利要求所述。
本发明的另一个目的是一种或多种属于乳杆菌属的人类来源的细菌菌株,其用于细菌生物膜的处理,具体而言用于旨在抑制和/或减少细菌生物膜的形成的预防性处理,如所附独立权利要求所述。
本发明的另一个目的是药物组合物、或用于医疗器械的组合物、或用于膳食补充剂的组合物,所述组合物包含混合物和可选的药物或食品级技术添加剂和/或赋形剂,所述混合物包含一种或多种上述细菌菌株或由一种或多种上述细菌菌株组成,如所附独立权利要求所述。
本发明的另一个目的是药物组合物、或用于医疗器械的组合物、或用于膳食补充剂的组合物,所述组合物包含混合物和可选的药物或食品级技术添加剂和/或赋形剂,所述混合物包含一种或多种上述细菌菌株或由一种或多种上述细菌菌株组成,所述组合物用于细菌生物膜的处理,并且具体而言用于旨在抑制和/或减少细菌生物膜的形成的预防性处理,如所附独立权利要求所述。
本发明的其他目的是上述乳杆菌的应用,如所附独立权利要求所述。特别是,本发明的目的是包含属于一种或多种以下菌株的微生物的组合物:
植物乳杆菌,保藏号DSM 32252[另外表示为LMC1];
副干酪乳杆菌,保藏号DSM 32254[另外表示为LMC4];
鼠李糖乳杆菌,保藏号DSM 32256[另外表示为LMC6];
鼠李糖乳杆菌,保藏号DSM 32257[另外表示为LMC7];
副干酪乳杆菌,保藏为DSM 32258[另外表示为LMC8]
所述组合物用于治疗或预防由有害细菌菌株形成生物膜以及与所述生物膜形成相关的失调或病理,所述有害细菌菌株例如优选为选自念珠菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、奇异变形杆菌和痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌中的那些菌株。
本发明的优选实施方式在所附的从属权利要求中阐述。
以下描述中公开的本发明的优选实施方式在此仅通过示例的方式示出,并且决不限制本发明的广泛应用范围,本领域技术人员对此十分清楚。
表1说明了使用本发明的乳杆菌获得的对由金黄色葡萄球菌产生生物膜的抑制百分比。
上清 | %抑制 |
LMC1 | 84 |
LMC4 | 82 |
LMC6 | 54 |
LMC7 | 62 |
LMC8 | 87 |
表1
图1显示了金黄色葡萄球菌(对照)上清中生物膜的3D图像。生物膜用FilmTracerTM生物膜活力试剂盒染色;绿色染色剂(SYTO9)代表活细胞;红色染色剂(碘化丙锭)代表死细胞。
图2显示了金黄色葡萄球菌(对照)上清中生物膜的横截面图像。
图3显示了在LMC8的上清中温育后,由金黄色葡萄球菌产生的生物膜的截面图像;基本上仅有非常少/没有生物膜产生。
植物乳杆菌菌株(DSM 32252)的表征
菌株:植物乳杆菌
内部识别号-ID:ID 1952
Probiotical商业代码:LMC-1
DSMZ国际保藏中心的保藏号:DSM 32252
菌株表征
来源
植物乳杆菌菌株在Probiotical S.p.A子公司的Mofin Alce Group附属BiolabResearch srl实验室中分离和分析。
生物化学表征
1)表2显示糖发酵特性(API 50CHL,bioMérieux)
表2
2)表3显示酶促特性(API Zym,bioMérieux)
表3
3)蛋白质特性(聚丙烯酰胺凝胶上的电泳)
图4显示出所涉及的菌株的蛋白质特性(聚丙烯酰胺凝胶上的电泳)。
第1-2道显示所述菌株的Master Cell Bank培养物的蛋白质特性;(见泳道);对于第1-2和3道,该菌株的特性是植物乳杆菌物种的特征(见箭头)。在第4和1-2道中,该菌株的蛋白质特性不同于由属于不同物种(副干酪乳杆菌DSM 32258;见十字)的菌株中获得的蛋白质特性。
分子表征
物种特异性分类:
4)利用引物PLAN-F/P-REV的聚合酶链式反应(PCR)
图5显示植物乳杆菌的阳性反应,其中:
1.PCR标志物:Sigma 50-2000bp
2.空白:无DNA
3.阴性参照:副干酪乳杆菌DSM 5622
4.阳性参照:植物乳杆菌DSM 20174
5.菌株:植物乳杆菌LMC-1ID 1952
6.菌株:植物乳杆菌LMC-1ID 1952
5)16S rDNA基因测序
结果用Blast程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)获得。
Score(分数):用于评估鉴定的生物相关性的数字。在序列比对中,分数是描述比对的总体品质的数值。数字越大对应于相似性越大。
E Value(E值)(期望值):该值在由研究人员正确解释的情况下将指示表示两个生物序列之间的相关性的分数的可能性。E值越低,分数越重要。
指纹分析特性
6)图6和7显示以NotI酶(图6)和SfiI酶(图7)进行的脉冲场电泳(PFGE),其中:
1.标志物:Sigma 50-1,000kb
2.植物乳杆菌LMC-1ID 1952–来源–Master Cell Bank
3.植物乳杆菌LMC-1ID 1952–第6代继代培养物–Master Cell Bank
生物表征
7)表4显示抗生素抗性情况(E-测试,ABBiodisk)
表4
^商业菌株用作参照。出于道德原因,本文档中未标明菌株。数据可根据要求提供。
*以E试纸(ABBiodisk)在琼脂上进行抑制环的MIC(最低抑制浓度)评价。
n.r.不需要/n.d.未确定。
**包含在EFSA 2005中
***包含在EFSA 2008中
8)表5显示了对生物液体(模拟胃液、模拟胰液和胆汁盐)的抗性
表5*商业株社用作参照。出于道德原因,本文档中未标明菌株。数据可根据要求提供。
^表5显示在37℃下不同接触时间(5、30和60分钟)后益生菌株在两种不同类型的生物液体:模拟胃液和胰腺分泌物中的存活百分比。
^^通过比较在“具有”和“没有”胆汁盐添加的特定培养基中生长的菌落数,可以获得胆汁分泌物存在时的存活结果。
副干酪乳杆菌菌株(DSM32254)的表征
菌株:副干酪乳杆菌
内部识别号-ID:ID 1953
Probiotical商业代码:LMC-4
DSMZ国际保藏中心的保藏号:DSM 32254
菌株表征
来源
副干酪乳杆菌菌株在Probiotical S.p.A子公司的Mofin Alce Group附属BiolabResearch srl实验室中分离和分析。
生物化学表征
1)表6显示糖发酵特性(API 50CHL,bioMérieux)
表6
2)表7显示酶促特性(API Zym,bioMérieux)
表7
3)图8显示蛋白质特性(聚丙烯酰胺凝胶上的电泳),其中:
1.阴性参照:植物乳杆菌LP01–LMG P-21021
2.菌株:副干酪乳杆菌LMC-4(ID 1953)–Master Cell Bank(来源)
3.菌株:副干酪乳杆菌LMC-4(ID 1953)–Master Cell Bank(继代培养物13#6)
4.阳性参照:副干酪乳杆菌LPC 01–CNCM I-1390
第2-3道显示所述菌株的Master Cell Bank培养物的蛋白质情况;(见泳道);在第1和2-3道中,该菌株的特性是副干酪乳杆菌的特征(见箭头)。对于第4和2-3道,该菌株的蛋白质特性不同于由属于不同物种(植物乳杆菌LMG P-21021;见十字)的菌株中获得的蛋白质特性。
分子表征
物种特异性分类:
4)图9利用引物W2/Y2的聚合酶链式反应(PCR)。反应对副干酪乳杆菌呈阳性,其中:
1.PCR标志物:Sigma 50-2000bp
2.空白:无DNA
3.阴性参照:干酪乳杆菌DSM 20011
4.阳性参照:副干酪乳杆菌DSM 5622
5.菌株:副干酪乳杆菌LMC-4ID 1953
6.菌株:副干酪乳杆菌LMC-4ID 1953
5)16S rDNA基因测序
结果用Blast程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)获得。
Score(分数):用于评估鉴定的生物相关性的数字。在序列比对中,分数是描述比对的总体质量的数值。数字越大对应于相似性越大。
E value(E值)(期望值):该值在由研究人员正确解释的情况下将指示表示两个生物序列之间的相关性的分数的可能性。E值越低,分数越重要。
指纹分析情况
6)图10和11显示以NotI酶(图10)和SfiI酶(图11)进行的脉冲场电泳(PFGE),其中:
1.副干酪乳杆菌LMC-4(ID 1953)–培养物来源-Master Cell Bank
2.副干酪乳杆菌LMC-4(ID 1953)–第6代继代培养物-Master Cell Bank
3.电泳标志物:Sigma 50-1,000kb
生物表征
7)表8显示抗生素抗性特性(E-测试,ABBiodisk)
表8
^商业菌株用作参照。出于道德原因,本文档中未标明菌株。数据可根据要求提供。
*以E试纸(ABBiodisk)在琼脂上进行抑制环的MIC(最低抑制浓度)评价。
n.r.不需要/n.d.未确定。
**包含在EFSA 2005中
***包含在EFSA 2008中
8)表9显示了对生物液体(模拟胃液、模拟胰液和胆汁盐)的抗性
表9
*商业菌株用作参照。出于道德原因,本文档中未标明菌株。数据可根据要求提供。
^表9显示在37℃下不同接触时间(5、30和60分钟)后益生菌株在两种不同类型的生物液体:模拟胃液和胰腺分泌物中的存活百分比。
^^通过比较在“具有”和“没有”胆汁盐添加的特定培养基中生长的菌落数,获得胆汁分泌物存在时的存活结果。
副干酪乳杆菌菌株(DSM 32258)的表征
菌株:副干酪乳杆菌
内部识别号-ID:ID 1954
Probiotical商业代码:LMC-8
DSMZ国际保藏中心的保藏号::DSM 32258
菌株表征
来源
副干酪乳杆菌菌株在Probiotical S.p.A子公司的Mofin Alce Group附属BiolabResearch srl实验室中分离和分析。
生物化学表征
1)表10显示糖发酵情况(API 50CHL,bioMérieux)
表10
2)表11显示酶促情况(API Zym,bioMérieux)
表11
3)图12显示蛋白质特性(聚丙烯酰胺凝胶上的电泳),其中:
1.阳性参照:副干酪乳杆菌LPC 01ID 1119–CNCM I-1390
2.菌株:副干酪乳杆菌LMC-8(ID 1954)–Master Cell Bank(来源)
3.菌株:副干酪乳杆菌LMC-8(ID 1954)–Master Cell Bank(继代培养物13#6)
4.阴性参照:植物乳杆菌LP01ID 1171–LMG P-21021
第2-3道显示所述菌株的Master Cell Bank培养物的蛋白质特性;(见泳道);在第1和2-3道中,该株的特性是副干酪乳杆菌的特征(见箭头)。对于第4和2-3道,该株的蛋白质菌不同于由属于不同物种(植物乳杆菌LMG P-21021;见十字)的株中获得的蛋白质菌。
分子表征
物种特异性分类:
4)图13显示利用引物W2/Y2的聚合酶链式反应(PCR),其中该反应对副干酪乳杆菌呈阳性,并且:
1.PCR标志物:Sigma 50-2000bp
2.空白:无DNA
3.阴性参照:干酪乳杆菌DSM 20011
4.阳性参照:副干酪乳杆菌DSM 5622
5.菌株:副干酪乳杆菌LMC-8ID 1954
6.菌株:副干酪乳杆菌LMC-8ID 1954
5)16S rDNA基因测序
结果用Blast程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)获得。
Score(分数):用于评估鉴定的生物相关性的数字。在序列比对中,分数是描述比对的总体质量的数值。数字越大对应于相似性越大。
E Value(E值)(期望值):该值在由研究人员正确解释的情况下将指示表示两个生物序列之间的相关性的分数的可能性。E值越低,分数越重要。
指纹分析情况
6)图14和15显示以NotI酶(图14)和SfiI酶(图15)进行的脉冲场电泳(PFGE),其中:
1.电泳标志物:Sigma 50-1,000kb
2.副干酪乳杆菌LMC-8(ID 1954)–培养物来源–Master Cell Bank
3.副干酪乳杆菌LMC-8(ID 1954)–第6代继代培养物–Master Cell Bank
生物表征
7)表12显示抗生素抗性特性(E-测试,ABBiodisk)
表12
^商业菌株用作参照。出于道德原因,本文档中未标明菌株。数据可根据要求提供。
*以E试纸(ABBiodisk)在琼脂上进行抑制环的MIC(最低抑制浓度)评价。
n.r.不需要/n.d.未确定。
**包含在EFSA 2005中
***包含在EFSA 2008中
8)表13显示了对生物液体(模拟胃液、模拟胰液和胆汁盐)的抗性
表13
*商业菌株用作参照。出于道德原因,本文档中未标明菌株。数据可根据要求提供。
^表13显示在37℃下不同接触时间(5、30和60分钟)后益生菌株在两种不同类型的生物液体:模拟胃液和胰腺分泌物中的存活百分比。
^^通过比较在“具有”和“没有”胆汁盐添加的特定培养基中生长的菌落数,获得胆汁分泌物存在时的存活结果。
本发明涉及属于乳杆菌属的至少一种人类来源的细菌菌株,其选自包含以下菌株或由以下菌株组成的组:
1.植物乳杆菌LMC1(DSM 32252),
2.罗伊氏乳杆菌LMC3(DSM 32253),
3.副干酪乳杆菌LMC4(DSM 32254),
4.罗伊氏乳杆菌LMC5(DSM 32255),
5.鼠李糖乳杆菌LMC6(DSM 32256),
6.鼠李糖乳杆菌LMC7(DSM 32257),
7.副干酪乳杆菌LMC8(DSM 32258),
8.罗伊氏乳杆菌LMC9(DSM 32259),
9.鼠李糖乳杆菌LMC10(DSM 32260)和/或其混合物(第1组)。
在优选的实施方式中,本发明涉及属于乳杆菌属的至少一种人类来源的细菌菌株,其选自包含以下菌株或由以下菌株组成的组:
1.植物乳杆菌LMC1(DSM 32252),
3.副干酪乳杆菌LMC4(DSM 32254),
5.鼠李糖乳杆菌LMC6(DSM 32256),
6.鼠李糖乳杆菌LMC7(DSM 32257),
7.副干酪乳杆菌LMC8(DSM 32258),
和/或其混合物(第2组)。
有利的是,本发明涉及属于乳杆菌属的至少一种人类来源的细菌菌株,其选自包含以下菌株或由以下菌株组成的组:
1.植物乳杆菌LMC1(DSM 32252),
3.副干酪乳杆菌LMC4(DSM 32254),
7.副干酪乳杆菌LMC8(DSM 32258),
和/或其混合物(第3组)。
上面列出的本发明的细菌菌株分离自健康受试者的粪便样品中,如下面实验部分中进一步所描述,并且于2016年1月29日全部保藏在DSMZ[德国微生物保藏中心GmbH,布伦瑞克,德国],并以各自的登记号-DSM 32252-DSM 32260在那里登记。仅为方便起见,上述株在说明书中也可用其代码LMC1-3-4-5-6-7-8-9-10表示。
本发明还涉及一种包含混合物的药物组合物/制剂,所述混合物包含以其代码LMC1-3-4-5-6-7-8-9-10在上文描述且表征的至少一种乳杆菌菌株、或它们的适当组合(例如,它们中的两个或更多个或全部)或者由其组成。
在一个实施方式中,所述组合物包含混合物,所述混合物包含至少一种选自第2组的细菌菌株或者由至少一种选自第2组的细菌菌株组成。
在另一个实施方式中,所述组合物包含混合物,所述混合物包含至少一种选自第3组的细菌菌株或者由至少一种选自第3组的细菌菌株组成。
在所述混合物中,本发明的乳杆菌菌株中的至少一种细菌菌株或其组合的存在总量为1x106至1x1012CFU/g混合物;优选为1x107至1x1011CF/g混合物;更优选为1x108至1x1010CFU/g混合物。
在所述组合物中,本发明的乳杆菌菌株中的至少一种细菌菌株或组合的存在总量为1x106至1x1011CFU/g组合物;优选为1x107至1x1010CF/g组合物;更优选为1x108至1x109CFU/g组合物。
所述组合物还可根据需要进一步包含必需和/或适当量的共配组分(co-formulant)、赋形剂、载体、表面活性剂、佐剂、防腐剂和着色剂。
在质量和数量方面,所述物质在药物制剂领域的技术人员已知和通常使用的那些物质中适当选择。
所述药物组合物可以以最适合所需施用的形式提供。该形式可以是从行业中通常已知和制备的药物形式中选择的任何形式(例如,口服、局部、可注射)。仅作为绝对非限制性实例,提及用于口服施用的组合物,所述组合物可以是漱口剂、片剂、锭剂(lozenge)、软锭剂(pastille)、丸剂、胶囊(具有软或硬包衣,受控释放),用于舌下施用或包装在小袋中以在施用前例如在水中重构的粉末或颗粒(根据需要,所述粉末或颗粒可以掺入合适的药学上可接受的聚合物或聚合物的混合物中,或者以合适的药学上可接受的聚合物或聚合物的混合物涂覆,能够赋予它们特定的性质,例如,抗胃酸性,和/或取决于体内所需的作用位点的受控/延迟释放)。仅作为绝对非限制性实例,提及局部施用的组合物,所述组合物可以是凝胶、乳膏或软膏的形式。
所述组合物使用公知的传统技术和行业中常用的生产设备(混合器、制粒机、搅拌器、和包装机等)制备。技术人员仅基于他的知识将没有困难地识别和选择最适合于其制备中要解决的技术问题的技术和设备。
先前描述的本发明的细菌菌株(本身或彼此组合)以及其药物制剂已经显示出是能够抑制和/或阻断和/或减少细菌生物膜(特别是,由对健康有害的病原菌产生的那些)的形成和/或生长的有效或至少非常有希望的试剂,从而能够最佳地应用必要/期望的抗菌处理(例如,抗生素)。
众所周知(19)并且前面已经提到过,细菌生物膜在人类健康中起着至关重要的作用,因为它们对于细菌本身对抗抗菌疗法而言和对于其他潜在病原体以及在有害细菌通常侵入无菌的解剖区域的传染病中形成了防御屏障。如以下实验部分所指出的,本发明的所有乳杆菌菌株都能够在很大程度上抑制金黄色葡萄球菌(表1)产生生物膜,从而突出了所述乳杆菌对抗临床感兴趣的致病菌的重要作用。特别是,在所述实例中,细菌菌株LMC1-4-6-7-8显示出更大的抑制活性。
上清 | %抑制 |
LMC1 | 84 |
LMC4 | 82 |
LMC6 | 54 |
LMC7 | 62 |
LMC8 | 87 |
表1
因此,本发明的细菌菌株(第2组和/或第3组)及其药物组合物由于其本身预防和抑制细菌生物膜形成和生长的能力而显示出优异/良好的抗细菌生物膜的活性。因此,本发明的细菌菌株及其药物组合物可有利地用于所有与健康相关和非健康相关的情况,所述情况中涉及生物膜作为对药物、抗生素、消毒剂和所有其他具有抗微生物活性的物理和化学制剂具有更大微生物抗性的原因。特别是,本发明的细菌菌株(第2组和/或第3组)及其药物组合物可以有利地用于,但不仅于:
-治疗所有通常的浅表和深部感染,例如但不限于外科手术伤口或褥疮溃疡;
-治疗所有涉及假体或在骨组织中假体插入物的感染;
-治疗由血管和尿导管引起的感染;
-治疗由支架、心脏循环装置、耳科、骨科和齿科假体、螺钉和钉子引起的感染;
-治疗口腔感染(例如使用抗生物膜和抗牙菌斑漱口水)以及口腔和阴道粘膜感染;
-治疗其中细菌生物膜作为持续感染因子参与的局部感染(例如耳炎、鼻窦炎、咽炎、喉炎和肺炎);
-在实验室中当细菌特别粘附于组织和假体因此使其分离和适当鉴定困难时,改善微生物诊断;
-在医疗保健领域,用于通常可从外科手术器械和卫生器具上移除的生物膜的处理(消毒);
-在环境、健康和食品部门,在供水和卫生系统等中,用于由军团菌或其他有害微生物形成的生物膜的移除或消毒处理;
-在环境和食品部门中,用于存在细菌生物膜的容器(container)、盛器(vessel)和容纳罐的清洁处理。
因此,本发明的主题还涉及用作药物的本发明的细菌菌株及其药物组合物。
本发明的主题还涉及本发明的细菌菌株及其药物组合物,其用作治疗健康相关和非健康相关情况的药物,所述情况中涉及生物膜作为对药物、抗生素、消毒剂和所有其他具有抗微生物活性的物理和化学制剂具有更大微生物抗性的原因;特别是通过非限制性实例在上文中描述的健康相关和非健康相关的情况的处理。
下面仅通过绝对非限制性实例描述使用本发明的乳杆菌进行的实验,以验证它们抑制金黄色葡萄球菌形成生物膜的能力。
材料和方法
乳杆菌菌株和金黄色葡萄球菌
本实验中使用的本发明的九株乳杆菌(在本文件中表示为LMC1-3-4-5-6-7-8-9-10,如前所述,在IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi(意大利米兰)的微生物学实验室中采用已知方法分离自健康受试者的粪便样品中。将乳杆菌和金黄色葡萄球菌的菌株在培养液-脑-心输注液(BHI,bioMérieux,Marcy l'Etoile,France)中在37℃在有氧生物条件下温育过夜。
乳杆菌菌株的上清的抗生物膜活性评价(结晶紫测试)
在用测试乳杆菌菌株得到的上清温育时,通过定量生物膜的实体来评估不同乳杆菌菌株的上清的抗生物膜活性,所述生物膜由根据产生生物膜的能力而选择的金黄色葡萄球菌的耐甲氧西林株生产。将在其上清中温育的金黄色葡萄球菌产生的生物膜的量用作阴性对照。如前所述,将每株乳杆菌在BHI中温育24小时。随后将每种培养基以6,000rpm离心10分钟,以将细菌细胞与上清分离。然后将20μL的0.5McFarland金黄色葡萄球菌悬浮液在新的96孔微量培养板中在180μL各种乳杆菌上清中温育。24小时后,除去含有非粘附细菌的培养基并用180μL新鲜上清代替。然后将板温育48小时。最后,通过Christensen等(18)描述的分光光度法评估细菌生物膜。将在96孔板中培养的生物膜风干并通过浸入5%结晶紫(CV)溶液中染色15分钟,然后在多次洗涤后再次干燥。通过用3ml乙醇(96%)洗脱生物膜-CV键并随后通过微量培养板分光光度计(MultiskanTM FC;Thermo Scientific;意大利米兰)在595nm波长测量100μL洗脱溶液的吸光度来定量生物膜的生物量。
共聚焦激光扫描显微镜
共聚焦激光扫描显微镜用于确认从结晶紫分析获得的数据。使用乳杆菌上清,而由金黄色葡萄球菌在其自己的上清中产生的生物膜用作阴性对照。根据制造商的说明书,将微生物生物膜在MBEC生物膜接种器(Innovotech Inc.,Edmonton CA)板上温育。用20μL不同乳杆菌的上清或金黄色葡萄球菌株上清(对照)的0.5McFarland悬浮液准备孔。如前所述准备上清。使用FilmTracerTM LIVE/生物膜活力试剂盒(Molecular Probes,Life Technologies Ltd.,Paisley,UK)揭示样品中的生物量。所有样品在室温下在黑暗中用适当体积的两种染色剂STYO9和碘化丙啶(PI)的混合物(在1mL盐水溶液中有3μL每种要素)染色15分钟。这样可以区分活细菌和死细菌。使用63X油物镜在共聚焦显微镜(LeicaTCS SP5;Leica Microsystems CMS GmbH,Mannheim,Germany)下检查染色的生物膜。使用488nm激光激发SYTO9染色,同时在500nm和540nm之间读取荧光发射。用561nm激光激发PI染色,并在600nm和695nm之间读取其荧光发射。进行两个通道的同时采集以最小化由于细菌运动引起的荧光点之间的错误共定位。对于每个样品,获取2μm连续光学切片,然后在z轴上依次放在一起,以获得生物膜的完整厚度。
结果
乳杆菌菌株的上清的抗生物膜活性评价
在用各种乳杆菌菌株的上清温育时,通过定量由根据产生生物膜的能力而选择的金黄色葡萄球菌的耐甲氧西林株产生的生物膜的量来进行测定(如上所述)。获得的数据(显示在附表1中)显示本发明的大多数乳杆菌菌株显著抑制(>50%的抑制)金黄色葡萄球菌生产生物膜的能力。特别是,当金黄色葡萄球菌分别与LMC 1、4、6、7和8的上清一起温育时,产生的生物膜的数量证明大大减少。菌株LMC 1、4、6、7和8显示为具有抑制金黄色葡萄球菌产生生物膜的最佳活性的菌株。
共聚焦激光扫描显微镜
选择对抗由金黄色葡萄球菌产生生物膜(参见表1)具有最佳抗生物膜活性的菌株LMC8作为优选实例。图1表示对照样品的3D重建,而图2表示所述生物膜的截面图。图1和图2显示了在对照样品中产生的生物膜(即在金黄色葡萄球菌的上清中产生的金黄色葡萄球菌的生物膜)。由金黄色葡萄球菌产生的生物膜由活细胞(绿色)和死细胞(红色)组成。另一方面,图3表示当金黄色葡萄球菌与LMC8的上清一起温育时产生的生物膜。比较图3与图1和图2,可以清楚地观察到当在LMC8的上清中温育所述菌株时,金黄色葡萄球菌的生物膜产生显著减少。这些数据证实了先前从结晶紫测试获得的结果。使用本发明的乳杆菌,特别是株LMC8和株LMC1、LMC4、LMC6、LMC7及其混合物采用与前述基本相同的方法和与前述相似的量(进行必要的变更),进行相同类型的实验,对抗由有害健康的其他细菌菌株(例如念珠菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、痤疮丙酸杆菌)的生物膜形成。获得的结果显示与金黄色葡萄球菌的前述实验部分中描述的结果一致。
工业适用性
本发明的乳杆菌及其药物组合物由于具有预防和抑制细菌生物膜自身形成和生长的能力而被证明是具有抗细菌生物膜的抗生物膜活性的优良药剂。因此,本发明的细菌菌株及其药物组合物可有利地用于所有与健康相关和非健康相关的情况,其中涉及生物膜作为对药物、抗生素、消毒剂和所有其他赋有抗微生物活性的物理和化学制剂具有更大微生物抗性的原因。
本发明的细菌菌株LMC-1 DSM 32252、LMC-3 DSM 32253、LMC-4 DSM 32254、LMC-5DSM 32255、LMC-6 DSM 32256、LMC-7 DSM 32257、LMC-8 DSM 32258、LMC-9 DSM 32259、LMC-10 DSM 32260通过表型表征(API 50CHL)和物种特异性PCR的分子鉴定而分类。
表型表征:
API 50CHL列(bioMèrieux code 50300)使得能够进行微生物中的碳水化合物代谢的研究。
它由50个微管组成,其中第一个没有活性成分,构成阴性对照(空白)。随后的微管各自含有明确定量的脱水底物,所述脱水底物属于碳水化合物和衍生物(杂多糖、多元醇、糖醛酸)家族。
这些底物可以被代谢,这导致颜色变化:从紫色(purple/violet)经过各种色调的绿色变成黄色,原因在于在培养基的pH指示剂(Bromocresol Purple)揭示的厌氧下产生酸。
程序:
将样品以10000rpm离心5分钟以除去培养基并重悬于2ml无菌蒸馏水中。接种物在5ml无菌蒸馏水中制备,样品量等于在McFarland量表(bioMèrieux)上的2。将该悬浮液接种在API 50CHL培养基的安瓿中,并立即分配到列(galleries)中。为了确保样品的厌氧条件,为每个圆顶引入两滴石蜡(bioMèrieux)并在37℃的温控烘箱中温育。
在24和48小时的不同温育时间对列进行读数。
使用APIWEB Plus软件获得各种菌株的表型分类;该程序计算响应,分配典型指数(T)和识别百分比(%id),以及对分析质量进行评论(表15中的结果)。
碳水化合物的使用表现为列的颜色的变化:如果产生亮绿色或黄色,则反应为阳性,如果产生深绿色或紫色则反应为阴性。通过与代表空白的n°0列进行比较,可以方便地检查列的颜色。
通过物种特异性PCR进行分子鉴定:
在细菌染色体中,存在称为16s和23s rRNA的基因,其产生核糖体:该部分具有可变区(在相同物种的细菌中具有相同的序列)。
通过利用属于rRNA可变区的序列的特异性,可以设计物种特异性引物,这将导致它们之间包含的部分的扩增。
在热扩增循环期间,只有当DNA模板属于引物设计所针对的物种时,引物才能退火,产生作为扩增产物的片段,其大小将取决于寡核苷酸沿染色体DNA的位置,并且引物分开的越远,扩增产物就会越长。
程序:
根据MET_INT 049(当前版本)处理样品。
用于分类的引物对如表14所示:
表14.用于PCR反应的引物对列表
细胞裂解
将每株的1ml培养液以10000rpm离心5分钟;随后将细胞重悬于1ml无菌水中;将2μl经洗涤的细胞加入18μl的Micro Lysis Buffer(Labogen)中,并且由此制备的微管加载到热循环仪中并进行特定的细胞裂解循环。
裂解的材料原样用于随后的DNA扩增。
对于每个待热循环的样品,将PCR反应设置在无菌试管中,依次添加12.5μl的PCRMaster Mix(Promega代码M7502),足量无菌水,引物1(100μM-0.3μl)和引物2(100μM-0.3μl)和1μlDNA,总体积为25μl。
对于每个PCR反应,引入以下:阳性对照,其由来自国际保藏中心并属于与进行分析的样品相同的细菌物种的参考株的DNA组成;阴性对照,其由来自国际保藏中心但属于与进行分析的样品不同的细菌物种的参考株的DNA组成;和空白,其仅由反应缓冲液组成的以检查任何污染。
根据样品和表1中规定的相应退火温度(Ta),对样品进行乳杆菌的热循环(MET-INT 049,当前版本)。
获得的扩增物在补充有溴化乙锭(5μl/10ml)的1X TAE缓冲液中在1%琼脂糖凝胶中进行电泳(30分钟,80V)。
PCR 50-2000bp标志物(SIGMA code P9577)用于估计扩增片段的大小。
在电泳结束时,使用透射仪(Gel-Doc,BIO-RAD)在紫外光下观察琼脂糖凝胶;结果见表15。
结果:
表15.由表型和分子表征获得的结果。
*在APIWEB软件中没有指出罗伊氏乳杆菌种,所以获得的结果涉及系统发育最接近的物种;结果实际上应该始终通过物种特异性PCR确认。
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Claims (9)
1.一种属于乳杆菌属的人类来源的细菌菌株,其选自由以下菌株组成的组:
植物乳杆菌,保藏号DSM 32252[LMC1];
副干酪乳杆菌,保藏号DSM 32254)[LMC4];
鼠李糖乳杆菌,保藏号DSM 32256[LMC6];
鼠李糖乳杆菌,保藏号DSM 32257[LMC7];
副干酪乳杆菌,保藏号DSM 32258[LMC8],
均于2016年1月29日保藏于DSMZ(德国微生物保藏中心GmbH,布伦瑞克,德国)。
2.如权利要求1所述的细菌菌株,其中,所述菌株对于抵抗由有害细菌菌株形成生物膜具有活性,所述有害细菌菌株例如优选为选自念珠菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、奇异变形杆菌和痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌中的那些菌株。
3.一种包含混合物的组合物,所述混合物包含选自以下组的至少一种细菌菌株或由其组成,所述组包含以下菌株或由以下菌株组成:
植物乳杆菌,保藏号DSM 32252[LMC1];
副干酪乳杆菌,保藏号DSM 32254[LMC4];
鼠李糖乳杆菌,保藏号DSM 32256[LMC6];
鼠李糖乳杆菌,保藏号DSM 32257[LMC7];
副干酪乳杆菌,保藏号(DSM 32258[LMC8],
均于2016年1月29日保藏于DSMZ(德国微生物保藏中心GmbH,布伦瑞克,德国),
和/或
其组合。
4.如权利要求3所述的组合物,其中,所述组合物包含混合物,所述混合物包含选自以下组的至少一种细菌菌株或由其组成,所述组包含以下菌株或由以下菌株组成:
植物乳杆菌(DSM 32252)[LMC1];
副干酪乳杆菌(DSM 32254)[LMC4];
副干酪乳杆菌(DSM 32258)[LMC8],和/或
其组合。
5.如权利要求3或4所述的组合物,其中,所述组合物用作药物。
6.如权利要求3-5中任一项所述的组合物,其中,所述组合物:
-在外科手术伤口或褥疮溃疡的情况下,用于治疗浅表和深部感染;
-用于治疗由血管和尿导管引起的感染;
-用于治疗由支架、心脏循环装置、假体、假体插入物、耳科、整形外科和齿科假体、螺钉和钉子引起的感染;
-用于治疗口腔感染以及口腔和阴道粘膜感染;
-用于治疗局部感染、耳炎、鼻窦炎、咽炎、喉炎和肺炎;
-用于在实验室中处理细菌生物膜,特别是粘附于组织和假体的细菌生物膜,从而改善组织和假体的微生物诊断的可能性;
-在医疗保健领域,用于通常可从外科手术器械和卫生器具上移除的生物膜的处理(消毒);
-在环境、健康和食品部门,在供水和卫生系统等中,用于由军团菌或其他有害微生物形成的生物膜的移除或消毒处理;
-在环境和食品部门中,用于存在细菌生物膜的容器、盛器和容纳罐的清洁处理;
-用于处理已经由于对药物、抗生素、消毒剂和赋有抗微生物活性的物理和化学制剂具有更大微生物抗性而形成的细菌生物膜。
7.如权利要求3-6中任一项所述的组合物,其中,所述混合物中包含的所述至少一种细菌菌株的存在总量为1x106至1x1012CFU/g混合物;优选为1x107至1x1011CF/g混合物;更优选为1x108至1x1010CFU/g混合物。
8.如权利要求3-7中任一项所述的组合物,其中,所述组合物中包含的所述至少一种细菌菌株的存在总量为1x106至1x1011CFU/g组合物;优选为1x107至1x1010CF/g组合物;更优选为1x108至1x109CFU/g组合物。
9.如权利要求3-8中任一项所述的组合物,其中,所述组合物对由有害细菌菌株形成生物膜具有活性,所述有害细菌菌株例如优选选自念珠菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、奇异变形杆菌和痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌的菌株。
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