CN103502434B - 乳酸菌以及含有该乳酸菌的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乳酸菌类的微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合。所述微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或其组合可以与至少一种金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌共凝集。

Description

乳酸菌以及含有该乳酸菌的组合物

技术领域

本发明涉及新型乳酸菌、其类似物或片段以及含有它们的组合物，尤其用作益生菌和/或用于生理卫生和治疗中。本发明尤其涉及新型乳酸菌和/或含有它们的组合物用于治疗和/或预防可以由金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引起的全部疾病的用途。

此外，这里描述的开发提供了GRAS微生物乳酸菌形式的新颖生物产品，所述生物产品可以用作具有预防和局部治疗皮肤感染和加速慢性伤口治疗的特殊作用的抗微生物添加物。

另外，本发明涉及根据本发明的微生物或其类似物或其片段在组合物或药物产品或化妆产品或医用产品中以及用于皮肤或表面消毒剂中的用途。

背景技术

皮肤的主要功能是保护皮肤下方组织免受外部环境影响。因此，它防止致病微生物渗入身体中，这仅为其中功能之一。皮肤和粘膜当然由多种微生物栖居，所述微生物经常作为共生物以相对稳定的组成在体表生活并支持皮肤的保护性功能。在理想情况下，具有有利健康作用的细菌将压倒同时存在的有害微生物。如果这种体系失去平衡，实际上注定不利地影响人的健康和福利。

致病微生物具有借助结合蛋白特异性粘附至表皮结构的能力。例如，已知微生物可借以粘附至纤连蛋白结构的粘附素的存在随致病性菌株金黄色葡萄球菌一起出现(Bingham,R.J.等人,2008；O'Neill,E.等人,2008)。

致病微生物通常具有与宿主粘附的较高潜力，这因此解释了增加的毒性。皮肤顶层中极小损害或其他损伤的存在增加了致病微生物侵入的风险。

另外，伤口表面的细菌性感染，尤其在伤口愈合时，可以导致并发症。首先存在急性伤口将不愈合并将导致慢性伤口的风险。这些慢性伤口的微生物区系是高度复杂的，并且已知多种微生物可以对伤口愈合过程产生有害影响(Davies等人,2004；Kirketerp-Moller等人,2008)。

已经鉴定有氧细菌，例如铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，作为伤口中的主要病原体。伤口愈合的炎性期正常情况下起到消灭潜在致病性微生物和细胞再生的作用。然而，不良愈合或难治性伤口经常在已经遭受免疫抑制并具有降低的炎症反应的患者中出现。这削弱的免疫反应可能不再针对主要伤口细菌提供有效防御，从而细菌渗入伤口中并形成菌落，这些菌落组织成生物被膜(James等人,2008)。

生物被膜不仅抵抗宿主的防御系统，还抵抗浮游细胞(planktonic cell)或微菌落(Fux等人,2005，Sheldon,2005)。归因于受损的免疫系统，生物被膜使伤口愈合过程保持在炎性期，结果是例如存在升高的基质金属蛋白酶(如弹性蛋白酶、纤溶酶和凝血酶)的浓度，这转而降解对于愈合所必需的生长因子和它们的受体(Mast和Schultz,1996)。

另外，升高的游离氧自由基和炎性细胞因子浓度严重损伤宿主细胞(James等人,2003；Moseley等人,2004)。

现有技术中已经描述了能够消除生物被膜并因此消灭慢性和难治性伤口病因的治疗药。

根据现有技术通过复杂的抗生素疗法治疗伤口感染，所述抗生素疗法并不总是导致治愈，因为前述伤口生物并不响应于这种治疗，原因在于它们的适应性和抗性机制，包括它们形成生物被膜的能力。皮肤护理产品如pH优化的沐浴露、洗涤洗液、沐浴油和护肤液可用于预防性阻止皮肤损伤，尤其在免疫抑制的患者中，例如，患有异位性皮炎、湿疹、脂溢性皮炎的那些患者中。

主要病原体金黄色葡萄球菌是可以在无养分情况下存活至多到7个月的疾病病原体。它在送洗衣物和门把手、灯具开关、地垫上以及在床榻立面上存活(JJulia Bidder 2010)。它在健康人群中不引起症状，但是如果某人的免疫系统削弱，如伤口感染的情况下，这种微生物将增殖并造成愈合不良的炎症、皮肤溃疡、疖、肺部感染、尿路感染和致命性血液中毒、眼部感染、中耳感染。这种感染可以蔓延至实际上任何器官。某些因素可以促进金黄色葡萄球菌感染，例如，削弱的免疫系统、糖尿病、先前存在的皮肤损伤(脱皮或神经性皮炎)、皮肤损伤(例如，由于事故、手术、插管)、患有褥疮的老年人和卧床患者、其自身皮肤为微生物感染的形成提供潮湿储存地的肥胖患者。

抗生素甲氧西林不再有效对抗金黄色葡萄球菌的耐甲氧西林菌株(MRSA)。在实践中这意味这些菌株对三种或更多种抗生素多重耐药。仅所谓订制抗生素(reserve antibiotic)现在有助于对抗这些菌株。德国门诊部估计治疗MRSA患者的成本每天增加1600至4300欧元(Julia Bidder 2010)。

铜绿假单胞菌是另一个在院内感染中频繁遭遇并因其代谢和其细胞膜结构而具有多重抗生素耐药的主要病原体。铜绿假单胞菌占据几乎10％的全部医院感染并且是德国最常见的院内微生物之一。由这些细菌引起的疾病谱是广泛的。溶血能力是这种细菌的首要引发因子之一，同时产生细菌的多种致病性因素如外毒素A(ADP核糖基转移酶)和细胞毒素外切酶S和外切酶U也是如此。最常见表现是肺炎伴发囊性纤维化，这可能在免疫抑制患者和AIDS患者中尤其严重。也可能诱发尿路感染、小肠结肠炎、脑膜炎、外耳炎(者游泳耳病”泳、烧伤感染或隐形眼镜使用者中的角膜炎。

通常使用乳酸菌作为益生菌以保护对抗疾病病原体引起的胃肠道疾病，因为除乳酸之外，它们经常产生抗菌物质。这些乳酸菌(乳杆菌目、乳酸杆菌或乳酸菌)形成一个革兰氏阳性细菌类别，它们总是厌氧的或大多情况下耐氧并且特征在于它们将糖降解成乳酸(乳酸发酵)。乳杆菌目(Lactobacillales)包括乳杆菌科(Lactobacillaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)和链球菌科(Streptococcaceae)。两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)物种以前划归为乳酸杆菌(双歧乳杆菌(Lactobacillusbifidum)，但是根据如今可获得的信息，它在系统进化与该目并不密切相关。然而，就代谢而言，仍将它作为乳酸菌对待。乳酸菌也在食品工业中十分重要，在食品工业中，它们用来生产乳产品，但是也可能作为病害生物出现(例如，在啤酒酿造厂中)。将乳酸菌划归为非致病性。

现有技术中也已知益生细菌用于餐具洗涤剂的用途(例如，WO2010/130563)，因此，可以减少餐具洗涤对皮肤的不利影响。它还具有皮肤护理作用。

微生物在化妆性皮肤治疗药中的用途已经是已知的。因此，例如，US6,790,434描述了这类微生物在化妆性皮肤治疗药中与胞外基质的植物提取物组合来对抗UV引起的皮肤损伤的用途。然而，该来源没有公开这些微生物在洗涤剂和清洁剂中的用途。

此外，某些芽孢杆菌属(Bacillus species)物种在卫生清洁剂中的用途是已知的。因此，WO 97/25865描述了芽孢杆菌属物种在卫生清洁剂中的用途，因为它们防止病原体繁殖并能够降解有机污垢。然而，该专利没有描述对皮肤具有有益作用的微生物的用途。

同时，益生细菌口服剂型在WO 2005/117921中公开，其中该剂型含有至少一个属的益生菌微生物，其中向剂型和/或细菌提供含有纤维素醚的包衣。

本发明的目的是提供用于急性和预防性治疗伤口感染和皮肤疾病和/或皮肤刺激，而没有现有技术缺点或不足的药物或组合物。

发明内容

上述发明目的是由独立权利要求实现的。优选的实施方案源自从属权利要求。

本发明涉及一种属于乳酸菌类的微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合，其中所述微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或其组合可以与至少一种致病微生物共凝集，其中所述致病微生物选自包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的组。完全令人惊讶的是，可以提供尤其与感染性细菌菌株凝集的乳酸菌，特别是通过与它们凝集并因此降低微生物的局部浓度、抑制它们的生长或甚至杀死它们或防止形成生物被膜。这构成与现有技术的差异，与现有技术的传统治疗选项相比具有一些重要优点，因为不需要抗生素治疗，取而代之可以使用致病性乳酸菌。另外，与生产抗生素和以下治疗成本相比，特定乳酸菌的生产构成价廉替代品。用专门针对这些微生物所衍生并且不造成这些微生物进一步任何耐药的乳酸菌治疗是对抗致病微生物的战斗中的独特方案。

在本发明的意义下，共凝集作用描述了遗传不同的细菌物种彼此的特殊粘附或结合，而共粘附尤其指遗传相同的细菌物种的粘附或结合。因此，就此而言，甚至更令人惊讶的是，乳酸菌可以与病原菌结合，由此尤其是通过特异性结合导致共凝集。

本发明尤其涉及一种微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合，其中共凝集所述至少一种致病微生物的能力甚至在生物、化学或物理处理后仍然存在。采用优选的微生物或其片段、衍生物、突变体或组合，共凝集所述至少一种致病微生物的能力优选地甚至在约3和约8之间的pH值下存在。在优选的实施方案中，该微生物或其片段、衍生物、突变体或组合尤其具有抑制所述至少一种致病微生物的生物被膜的形成的能力。

尤其优选该微生物或其片段、衍生物、突变体或组合选自乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、绿色乳杆菌(Lactobacillus viridescens)、两歧双歧杆菌或其类似物、衍生物、片段或突变体。

可以使用根据前述权利要求中任一项或多项所述的微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合，其中所述微生物选自以下已经保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心并配有以下保藏编号：DSM 25906、DSM 25907、DSM25908、DSMZ 25909、DSM 25910、DSM 25911、DSM 25912、DSM 25913、DSM 25914和DSM Z25915的微生物。

在另一个方面，本发明涉及包含至少一种微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合的组合物。在本发明的意义下，术语“组合物”可以作为术语“制剂”的同义词使用。优选的组合物也可以含有选自化妆品可用溶媒或赋形剂、可药用溶媒或赋形剂或皮肤学可用溶媒或赋形剂的溶媒或赋形剂。

所述组合物可以优选地为粉剂、棒剂(stick)、气溶胶喷雾剂、泵式喷雾剂、乳膏剂、分散体剂(dispersion)、乳剂、泡沫剂、软膏剂、喷雾剂、气溶胶剂、粉剂、棒剂(stick)、衣物剂(cloths)、洗剂、混悬剂、溶液剂(solution)、凝胶剂形式或在基底上。尤其优选所述组合物为护肤霜、皮肤洗涤洗剂或皮肤软膏剂的形式。

在优选的实施方案中，所述组合物可以以固体、液体、粘稠的形式或作为气溶胶存在。另外，优选的护肤霜、皮肤洗涤洗剂或皮肤软膏尤其可以以固体、液体或粘稠的形式或作为气溶胶存在。

优选的组合物也可以优选地包含益生菌、防腐剂或其他抗菌物质，因而在优选的组合物中，它是药用、兽用、化妆品或食品组合物。

在另一优选的实施方案中，所述组合物还优选地包含促净剂物质、表面活性表面活性剂、酶、有机和/或无机过氧化合物、过氧化物激活剂、水可溶混性有机溶剂、掩蔽剂、电解质、pH调节剂、增稠剂、去污剂、荧光增白剂、发灰抑制剂、染料转移抑制剂、泡沫调节剂和/或其他着色剂。

此外，可以优选的是所述组合物包含选自以下组中的至少一种物质：

a.对皮肤状况具有积极影响的有效成分，尤其是对老年皮肤具有积极影响的有效成分，特别是与生物醌(尤其是泛醌Q10)、肌酸、肌酐、肉碱、生物素、异黄酮、心磷脂、硫辛酸、抗冻蛋白、牛蒡苷、啤酒花和啤酒花-麦芽提取物组合时；

b.用于重建结缔组织的促进剂，尤其是异黄酮类化合物；

c.支持干性皮肤上的皮肤功能的有效成分，尤其是维生素C、生物素、肉碱、肌酸、丙酸、绿茶提取物、桉油、脲和无机盐(尤其是NaCl、海洋矿物质和渗压剂)；

d.用于减轻炎性皮肤状态和/或对其产生积极影响的有效成分，尤其是绢毛榄仁苷(sericoside)、多种甘草提取物、甘草查尔酮(尤其是甘草查尔酮A)、水飞蓟素、水飞蓟宾-磷脂复合物(silyphos)和/或右旋泛醇。

优选的是所述微生物在该组合物中以灭活、活性或无活性形式存在。此外，所述微生物可以在组合物中优选以封装、喷雾干燥和/或冻干的形式存在。还优选所述微生物尤其以细胞溶解物的形式存在于该组合物中。在一个优选实施方案中，所述微生物在该组合物中尤其以某个量存在，所述量是按重量计0.001重量％至10重量％、优选地0.005重量％至5重量％、特别优选地0.01重量％至3重量％。

本发明还涉及一种用于鉴定和/或选择具有与选自包含金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌的组中的致病微生物共凝集的特性的乳酸菌的方法，其中所述方法至少包括以下步骤：

a.孵育所述致病微生物以形成生物被膜；

b.添加待研究的乳酸菌并孵育以形成在致病微生物和待研究的乳酸菌之间形成共凝集的混合物；

c.通过移走上清液分离未结合的乳酸菌；以及

d.就共凝集的乳酸菌而言测定生物被膜。

这种方法可以优选地还包括以下额外的步骤：

–研究致病微生物对生物被膜的抑制，由此在孵育形成生物被膜的致病微生物期间添加待研究的乳酸菌。

另外，这种方法可以在优选实施方案中由以下方法步骤补充：

–通过与不添加待测试乳酸菌时的对照相比来测量光密度的方式，将通过移除未结合细胞的生物被膜的形成定量。

在另一个方面，本发明涉及所述组合物的用途，优选用于生产治疗或预防以下皮肤疾病的药用药物、医用产品或化妆品，尤其是葡萄球菌的皮肤综合征、触染性脓疱病、浅表毛囊炎、脓疱化、皮肤脓肿、疖、痈、脓肿、蜂窝织炎、干性皮肤、痒性皮肤、发红皮肤、炎性皮肤、极度油性皮肤、座疮、糖尿病足、褥疮、神经性皮炎、急性淋巴结炎、藏毛囊肿、藏毛瘘、藏毛窦、藏毛瘘、藏毛囊肿、皮肤和皮下组织的局部感染、脓皮病、脓性皮炎、脓毒性皮炎、化脓性皮炎、皮炎和湿疹、异位性湿疹、脂溢性湿疹、尿布皮疹、过敏性接触性皮炎、脂溢性皮炎、剥脱性皮炎、中毒性接触性皮炎、慢性单纯性苔藓、痒疹、瘙痒症和其他形式的皮炎、丘疹鳞屑性皮肤疾病、银屑病、副银屑病、皮肤附属物的疾病、脱发瘢痕化、脱发性毛囊炎以及皮肤和皮下组织的其他疾病、下肢溃疡、皮肤损伤、痒病和疮痂、事故或手术后伤口。

在一个优选实施方案中，所述组合物可以用来生产用于处理表面的清洁剂或消毒剂。此外，所述组合物可以也有利地用来生产在生理卫生、医用产品和预防领域中使用的产品。

所述组合物优选用来生产施加至皮肤表面的洗剂、震荡合剂(shakemixture)、粉剂、水凝胶剂、乳膏剂、克勒萨(cresa)、软膏剂、脂性软膏剂或糊膏剂。

已经有利地发现所述组合物可以优选地用来生产对局部治疗皮肤感染和加速慢性伤口愈合具有特殊作用的抗微生物添加物。所述组合物可以优选地预防性或治疗性地使用。另外，所述组合物可以优选地局部施加。

在另一个方面，本发明涉及用于卫生处理的试剂盒(kit)，所述试剂盒含有微生物或所述组合物以及生理卫生装置或设备、冲洗液和/或糊膏剂。

在优选的应用形式中，本发明可以用作针对动物，尤其是狗、马、猫和啮齿类动物(兔、野兔、仓鼠、豚鼠)和商品动物如鸡、猪和牛的喷雾剂或洗涤液的抗微生物添加物，以便显著地减少皮肤、软毛和羽毛上负载的微生物。

本发明因此也涉及微生物，尤其是乳酸菌、其类似物、突变体、衍生物或片段以及含有前者的组合物的用途，尤其是用于治疗或预防婴儿、学步儿童、儿童、健康人、老年人、免疫抑制人群、病理性皮肤变化(尤其是葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征、触染性脓疱病、浅表毛囊炎、脓疱化、皮肤脓肿、疖(疖病)、痈(脓肿)、蜂窝织炎、干性皮肤、发痒皮肤、发红皮肤、炎性皮肤、极度油性皮肤、座疮、糖尿病足、褥疮、神经性皮炎、急性淋巴结炎、藏毛囊肿(包括潜毛性瘘、藏毛窦、尾骨瘘、尾骨囊肿)、皮肤和皮下组织的其他局部感染(例如，脓皮病、脓性皮炎、脓毒性皮炎、化脓性皮炎)；还有多种形式的皮炎和湿疹(例如，异位性湿疹、脂溢性湿疹、尿布皮疹、过敏性接触性皮炎、脂溢性皮炎、剥脱性皮炎、中毒性接触性皮炎、慢性单纯性苔藓、痒疹、瘙痒症和其他形式的皮炎)的人群的皮肤疾病；它们也可以用来治疗丘疹鳞屑性皮肤疾病(银屑病、副银屑病)、皮肤附属物的疾病(例如，脱发伴发瘢痕化、包括脱发性毛囊炎)、以及皮肤和皮下组织的其他疾病(例如，下肢溃疡)、具有先前存在的皮肤损伤(例如，干性皮肤)的人群、皮肤损伤(例如，疮痂、伤口、包括事故或手术后的那些)或用于商业动物和家用宠物中。

优选的微生物即是如下的微生物，其属于乳酸菌类或其类似物、衍生物、突变体或片段并具有共凝集能力，尤其是优选地特异性结合选自金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌群的至少一种致病微生物。完全令人惊讶的是，优选的乳酸并不导致共生性皮肤细菌或微生物如杰氏棒状杆菌(Corynebacteriumjeikeium)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、痤疮丙酸杆菌属(Propionibacteriumacnes)座疮或尤其是表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的任何共凝集或结合。例如，表皮葡萄球菌是皮肤菌群的几乎不引人注意的共生生物。在皮肤内或表面存在的各种微生物的相互作用中，这个物种存在于许多哺乳动物的健康皮肤菌群中并且与这些哺乳动物处于微生物平衡中–至少在健康皮肤上如此。因此，在本发明的范围内将优选不影响这种细菌(例如，因凝集而影响)并且因此不影响生理卫生中以靶向方式使用的其他微生物。

换而言之，优选的乳酸菌特异性与病原菌金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌共凝集。没有该类型的构思来源自现有技术。现有技术仅描述了也显示与共生微生物结合的乳酸菌，从而它们不能在不造成副作用的情况下使用。与这些相反，优选的乳酸菌不显示与占据皮肤菌群的共生性皮肤细菌或其他致病微生物的任何结合或共凝集。根据另一个优选实施方案，本发明乳酸菌不具有与皮肤上共生性微生物结合的能力。

本领域技术人员已知，健康皮肤被微生物如细菌和真菌以共生或互助形式稠密占据。这些微生物是皮肤表面的天然组分并且由术语“皮肤菌群”概括。隶属于术语皮肤菌群的微生物是保护皮肤本身和身体完好无损免受致病生物作用的重要前提并且是生物屏障的部分。在这方面，特别有利的是，优选的乳酸菌不导致皮肤菌群失去平衡，反而仅与病原菌金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌结合和/或与它们共凝集。

微生物尤其具有特定粘附特性并且与致病微生物金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌形成共凝集。然而，还优选乳酸菌也特异性与葡萄球菌属(Staphylococcus)或假单胞菌属(Pseudomonas)微生物的其他致病物种共凝集或至少与它们相互作用。

并非所有本发明的微生物都具有防止生物被膜形成的特性。鉴于以下事实：优选的乳酸菌与病原菌共凝集和/或相对于它们具有粘附特性，致病微生物可以被掩蔽，这导致许多致病因素的隐匿并且因此导致细菌负荷的降低和/或导致抑制生物被膜形成，例如，通过掩蔽和/或结合病原菌的相应表面粘附蛋白。

虽然本发明具体涉及乳酸菌群，但是仍存在专利申请所教导内容的一致性。要求保护的微生物具有共同特性或作用。结构或功能公共性的总和导致共凝集金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌、皮肤不结合共生性微生物和防止生物被膜形成和/或破坏金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌建立生物被膜之间的功能关系这些共同特征因此不构成任何特征总和，反而背离所提到的要求保护的微生物的共同特征，所述共同特征有利地允许和表征用于这种目的的微生物的适用性。

优选的微生物，尤其乳酸菌，选自包含以下微生物的组：乳酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、詹氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、食淀粉乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、食果糖乳杆菌、希氏乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊乳杆菌、绿色乳杆菌、两歧双歧杆菌或其类似物、衍生物、片段或突变体；这些微生因彼此的功能关系相关以形成本发明的统一构思，从而它们共有多种特性和/或作用，即它们特异性与病原菌金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌共凝集，不结合皮肤和/或粘膜的任何共生性微生物并且还防止金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌形成生物被膜。这些乳酸菌尤其包括选自以下微生物的微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合，所述微生物以代码编号DSM 25906、DSM 25907、DSM25908、DMS 25909、DSM 25910、DSM 25911、DSM 25912、DSM 25913、DSM 25914和DSM Z25915保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心。完全令人惊讶的可能鉴定到具有相同有利特性的一组乳酸菌。还未描述过综合全部这些特性，同时还无致病性并且不对皮肤天然菌群造成任何损伤或影响的细菌，尤其乳酸菌。也已经发现，施加优选的乳酸菌，无论是否作为组合物，均防止金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌结合和侵入宿主细胞。这种情况的原因是迄今未知的，但是应当由额外的实验确定。

优选的微生物、尤其乳酸菌的另一个令人惊讶的优点是它们也可以预防性使用。优选的微生物、尤其乳酸菌的另一个令人惊讶的优点是它们也可以预防性使用。换而言之，乳酸菌和/或含有它们的组合物可以预防性地施加至存在风险的皮肤区域和/或施加至存在风险的人类或动物群体，而不对皮肤或皮肤菌群造成任何损伤。例如，已知开放伤口可能在必须长时间卧床的人中在压迫点处形成。初步实验已经显示，预防性处理这些区域可以防止开放伤口的形成并且可以至少保护免遭由金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌引起的额外感染

在本发明的意义上，在优选的实施方案中，将皮肤具体理解为是人类或动物身体的外部器官，所述外部器官起到界定内部与外部的作用。在本发明意义下，在优选的实施方案中，皮肤区域包括皮肤顶层组分、真皮(或真皮)或皮下组织。根据本发明、皮肤的顶层(表皮)也以下层由组成：角质层、透明层、颗粒层(粒层)、棘细胞层(棘层)和/或基底层。对这个区域内细胞的每种调节构成本发明意义下的皮肤面积内的细胞调节。也可以作为本发明皮肤区域的组分的真皮优选地由结缔组织纤维组成并且发挥作用以向皮肤提供营养和锚定作用。边界区域内的毛细血管化血管系统连同表皮也属于本发明意义下的皮肤区域，皮脂腺和汗腺(sudoriferous gland)或汗腺(sweat gland)也是如此。本发明意义下的真皮可以再分成乳头层和网层。此外，本发明意义下的皮肤区域可以是任何区域，即，在皮下组织(皮下层)或在身体或任何器官或器官部分中的组织内部或表面上的任何位置。区分器官与周围结构的组织屏障可以是本发明意义下的皮肤。此外，本发明的皮肤区域概念也可以理解成包括皮肤附属物如毛发、皮脂腺、竖毛肌、指甲、趾甲和汗腺，尤其外分泌汗腺和顶泌汗腺，还有乳腺。偏离正常的任何细胞调节，尤其细胞生长，可以用本发明的药物处理，优选地，而不限于皮肤外部区域。然而，本发明意义下的皮肤区域也可以包括沟部皮肤，如手指或足趾上的那部分皮肤或外皮和与之相关的皮肤附属物。

皮肤的乳酸菌耐受性是成功治疗皮肤感染和伤口或其中存在来自葡萄球菌群或假单胞菌群的微生物的其他疾病或症状中细菌性感染的前提。

优选的组合物可以尤其含于皂；洗液、粉剂、合成洗涤剂，泡沫剂、棒剂、乳剂、喷雾剂、乳膏剂、凝胶剂、洗发液、液体皂或除臭剂中。还优选组合物特别作为益生菌使用，其中可以将所述益生菌添加至洗涤剂；冲洗剂；清洁剂或消毒剂(例如，皂、粉剂、糊膏剂、溶液剂、乳剂、洗剂)；清洁和/或消毒毛巾；洗发剂；用于皮肤、毛发和/或解剖刀用的冲洗液或敷贴；乳膏剂；软膏剂；皮肤清洁洗液和/或皮肤护理洗液；用于眼、耳、口、鼻部或喉中或其上的溶液剂(例如，作为滴剂、喷雾剂、冲洗液)和/或可以掺入绷带或伤口敷料内以抑制致病微生物的形成、结合它们以将它们作为聚集物除去和/或抑制它们或杀死它们并因而降低它们的数目。

完全令人惊讶的是，本发明组合物的优点可以通过将它并入前述药用形式中再次改进。本领域技术人员熟悉将本发明组合物导入溶媒物质的其他制剂构思，例如，如用于皮肤应用的乳剂或其他产品，例如，可以优选无水或含水的液体形式，其中含水形式可以根据本发明划分成单相体系和多相体系。此外，可以为无水或含水的半固态形式，其中再次可能将它们划分成单相体系和其中含水半固态形式也可能存在的多相体系。也可以优选地使用亲脂或亲水的固态形式。除上文已经提到的那些形式之外，这类形式的例子还包括例如基于脂肪的软膏剂、泡沫剂、粉剂、棒剂、凝胶剂、乳膏剂、水分散体凝胶剂、水性乳剂、洗剂、软膏剂、喷雾剂和乳剂。本领域技术人员在此意识到，这类溶媒物质可以首先基于皮肤上的感觉区分成丰富/高贵的那些和清新及淡雅的那些，并且其次可以就粘度而言区分成具有低粘度的那些和具有高粘度的其他，其中水凝胶或保湿霜和/或O/W乳液或W/O乳液具有高粘度。当使用液态施加形式时，如上文解释，它们可以再次划分成含水和无水体系。对于无水体系，非极性体系、无乳化剂的极性体系和含乳化剂的极性体系是特别优选的。对于含水体系，单相体系如溶液和微乳液是优选的；对于多相体系，多相乳液W/O乳液或O/W乳液是优选的。对于固态/液态体系，优选的形式包括悬液或液/固/液体系如悬液体系/乳液体系。本领域技术人员知晓供应这类溶媒的各种可能。对于O/W乳液，优选的药用主导物质包括O/W乳化剂、W/O乳化剂、液态亲水成分和液态亲脂成分。对于W/O乳液，优选的药用主导物质包括W/O乳化剂、O/W乳化剂、液态和半固态亲脂成分、凝胶形成剂、液态亲水成分和/或盐。

对于半固态的优选溶媒物质，无水体系以及含水体系对各种应用都是优选的。无水体系可以由无乳化剂的非极性体系或极性体系如脂凝胶、油凝胶或聚乙二醇凝胶组成，和/或可以由基于O/W吸收基质或W/O吸收基质的含乳化剂的非极性体系组成。含水体系可以优选地由单相体系如水凝胶或微乳凝胶或多相体系如O/W乳膏、W/O乳膏或两性体系组成。优选的半固态制备物是用于在室温和皮肤温度之间的温度范围施加至皮肤或用于施加粘膜的可铺展制备物，其中它们具有局部用作用，在此它们输送有效成分或对皮肤具有软化或保护作用。优选的制备物包括更狭义上的软膏剂、乳剂、凝胶剂和/或糊膏剂。除软膏剂、乳剂、凝胶剂和糊膏剂之外，油凝胶也可以作为半固态透明单相体系使用。本领域技术人员从美国专利6,187,323或Aiache等人,2001中知晓用于配制半固态体系的各种无水混合物，包括，例如，油凝胶和水凝胶的混合物，其可以称作为本发明的大凝胶。此外，水分散体凝胶或各种脂类可以用来提供本发明的溶媒物质。当使用脂类时，有机硅化合物和有机碳化合物可以用来在分散体系中供应脂质相，而例如可以借助不可水解脂类或可水解脂类(甘油)或蜡酯供应有机碳化合物。这类体系的优点包括改进的皮肤柔顺性和弹性增加以及取决于脂质组成，具有增加物质释放及其渗透效果的能力。例如，本领域技术人员将知道他们必须使用哪种脂质以在某个时间参数内部增加或减少渗透。

额外的优选溶媒物质包括例如水分散体凝胶和/或微胶囊、微球粒或团粒(大珠)。提到的溶媒起到增加稳定性并确保皮肤上最短施加时间的作用。优选的半固态单相体系可以借助以下药用主导物质制备：液态亲水成分尤其水和(多元)醇、亲水性成凝胶物质、成盐物质和W/O乳化剂、O/W乳化剂、液态、半固态和固态亲脂成分以及亲脂性成凝胶物质和助洗液。本领域技术人员将将知道他们必须怎样组合这些物质以实现某种效果。

本领域技术人员将也指导用于皮肤产品的其他药物制品。根据本专利申请，例如，由Daniels和Knie在JDDG；2007,5:367-383在引文中公开的全部药用化合物。本领域技术人员知道不同药物制品在皮肤中具有不同作用并且他们将以不同的量施加植物制剂组合物至皮肤。将JDDG；2007,5:367-383的内容引入根据本专利申请所教导的公开内容。本发明的优选产品包括例如亲脂性或亲水性溶液、亲脂性或亲水性乳液、亲脂性或亲水性悬液、专用液体制剂、疏水性或亲水性软膏、水乳化软膏、亲脂性、亲水性或两性乳膏剂、水凝胶、疏水性或亲水糊膏剂和/或散剂。

实验已经显示，优选的乳酸菌尤其乳杆菌属细胞与金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌细胞接触时形成共凝集物。由于形成共凝集物，所以尤其阻止金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌渗入皮肤伤口中，或沉降在皮肤上并形成菌落，且建立、粘附和形成生物被膜。金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌细胞，尤其它们的细胞表面，被乳酸菌尤其乳杆菌属细胞掩盖，从而金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌细胞优选地不再能够与皮肤上皮细胞结合。由于阻止金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌与皮肤上皮细胞结合，因此炎症反应不能出现和/或减少或防止皮肤刺激。金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌细胞，尤其它们的细胞表面，被乳酸菌尤其乳杆菌属细胞结合。随后与单独存在或处于小凝集物中的金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌细胞相比，形成了通常可以更容易和更高效且有效地从皮肤、伤口和表面(软毛、羽毛、钢、塑料和金属表面)移除(洗掉)的由乳杆菌属细胞和/或金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌细胞组成的细胞共凝集物。

在本发明的意义下，益生微生物包含对人类和/或动物身体具有有利影响的细胞。优选的组合物作为益生组合物使用并含有对人类和/或动物身体具有有利影响的乳酸菌。有利影响可以尤其在于改善皮肤菌群。具体而言，皮肤菌群中不想要的微生物如金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌可以因益生菌微生物与不想要的微生物直接相互作用而被抑制，和尤其因间接相互作用而被抑制，所述间接相互作用基于因益生微生物的表达产物而抑制不想要的微生物的代谢。实验已经显示，在通过优选的乳酸菌共凝集后，致病微生物金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌不显示任何生长，即没有进一步的细胞物质增殖，并且相反，细胞被掩蔽、在共凝集物中被结合和/或杀死。

本文所述的乳酸菌的类似物、突变体、衍生物或片段尤其通过生物、化学或物理处理所述乳酸菌来产生并且令人惊讶地显示有利特性，甚至在处理后也是如此。乳酸菌有利地选自乳酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、詹氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、食淀粉乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、食果糖乳杆菌、希氏乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊乳杆菌、绿色乳杆菌、两歧双歧杆菌或优选地选自以下保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心的微生物，其中将这些微生物是编为DSM 25906、DSM 25907、DSM 25908、DSMZ 25909、DSM 25910、DSM 25911、DSM 25912、DSM 25913、DSM 25914和DSMZ 25915。

另外，令人惊讶的是，甚至在物理、化学或生物杀死后，乳酸菌、其片段、衍生物、突变体、类似物或组合将仍具有有利特性。例如，优选的菌株，即DSM 25906、DSM 25907、DSM 2598、DSMZ 25909、DSM 25910、DSM 25911、DSM 25912、DSM 25913、DSM 25914和DSMZ 25915导致病原体的共凝集、防止生物被膜形成并且还不显示与共生性微生物的任何结合，甚至在70致病热处理20分钟或用超声处理后也是如此。因此，在组合物的优选实施方案中，乳酸菌、片段、衍生物、突变体、类似物或其组合可以有利地还以杀死方式存在。该组合物的稳定性和使用性可以按这种方式大幅度延长。另外，该组合物也可以在不允许使用活微生物的应用领域中使用。完全令人惊讶的是，在组合物中的乳酸菌可以是灭活、有活性或无活性并且然而仍能够特异性结合和/或共凝集于致病微生物。可以有利地使用组合物作为食品、食品添加剂或药剂、医用产品、化妆品、清洁剂添加物和作为动物饲料或饮料。

优选的组合物是的一种组合物，其含有具有共凝集至少一种致病微生物的能力的本发明乳酸菌或类似物、片段、突变体或其衍生物，所述致病微生物选自金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌群，其中所述组合物用于生理卫生、物理疗法和/或预防。

优选的微生物是乳酸菌属或目的代表，即通发酵葡萄糖产生乳酸的革兰氏阳性细菌。本发明的微生物在一方面以如下事实为特征：它们具有特异性共凝集选自金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌群的至少一种致病微生物的能力。这种结合导致形成本发明微生物和特异性结合的致病微生物的凝集物。归因于共凝集物的形成，后者即致病微生物可以容易地以机械方式并以靶向方式去除(例如，通过冲洗移除)，这采用过去已知的措施时是不可能的。与单独存在或处于小凝集物中的金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌细胞相比，通常可以更容易和更高效且有效地从皮肤、伤口和表面(软毛、羽毛、钢、塑料和金属表面)移除(洗掉)的由乳杆菌属细胞和/或金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌细胞组成的细胞共凝集物。

在本发明意义下以及一般在微生物学和卫生、尤其人类微生物学和生理卫生领域，术语“特异性结合”或“共凝集”理解为指遗传上属于不同细胞类型的细胞的相互识别和粘附。在细胞表面上，细菌在此表达粘附于其他细胞类型的受体和结构，所述受体和结构用于细胞之间的粘附。这种粘附作用在致病微生物以及共生性微生物定居中发挥优异作用，从而介入这种粘附作用可能导致深远的结果。归因于本发明的微生物具有特异性结合，尤其共凝集于选自金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌群的至少一种致病微生物的能力的事实，形成本发明微生物和致病微生物的凝集物。所产生的共凝集物可以轻易移除，例如，通冲洗表面、皮肤、组织和/或一些其他部位或定居储存地，从而致病微生物的数目明确地降低。此外，通过掩蔽致病微生物的表面结构物，防止和/或减少对表面、皮肤、组织和/或其他部位或定居储存地的初始/或接续粘附。如果细胞彼此结合并形成凝集物，则这个过程尤其称作为凝集。如果仅一个细胞种类参与这种凝集物形成，这个过程称作为自动凝集或自凝集。如果至少两种不同细胞种类参与凝集物的形成，这种过程特别称作为共凝集。

在本发明的意义下，“特异性结合少一种致病微生物”尤其理解为尤其指根据本发明微生物结合来自金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌群的至少一种细菌。

根据本发明微生物的一个优选实施方案，它们进一步特征在于，与至少一种致病微生物特异性结合的能力甚至在生物、化学或物理处理后(例如，在最低70℃下热处理)仍存在。换而言之，优选的乳酸菌可以优选地存在于优选的组合物中，因为与病原菌，尤其金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌特异性相互作用或结合的能力不受影响并且因此可以建立结合或相互作用。

失活或无活性乳酸菌细胞可能是特别有利的，因为没有代谢活性可以从这些乳酸菌细胞发出。

根据乳酸菌的另一个优选特性，除了上文描述的特性，即特异性结合选自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)群的至少一种致病微生物的能力之外，本发明的微生物也可以由热稳定性表征，并且它们可以在高温、优选地至少大约60℃、更优选地至少65℃、和甚至更优选地至少70℃持续至少20分钟、优选地25分钟和更优选地至少大约30分钟的处理下存活，并且就共凝集所述致病微生物的能力而言保持不变。

在组合物的一个优选实施方案中，乳酸菌是灭活、有活性或杀死的或是部分和其片段，例如，酶促或机械裂解产物(例如，弗氏压碎器等)或代谢产物，因为它们仍具有共凝集和/或防止生物被膜形成的能力。还优选的乳酸菌以封装、喷雾干燥和/或冻干形式，即以封装、喷雾干燥和/或冻干形式在优选的组合物中使用。另外，如果乳酸菌以消化细胞的形式使用，则这可以是有利的。

另外，如果本发明乳酸菌与致病微生物特异性结合的能力甚至在大约3和8之间的pH值下持续存在，则这是优选的。这意味乳酸菌可以处在具有3至8的pH值的培养基中并且仍具有结合金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌的能力。本领域技术人员是知晓皮肤具有略酸性pH值的事实。在这方面，特别有利的是，优选的乳酸菌也显示它们在宽pH值范围内共凝集金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌的能力。皮肤的pH值可以变动，例如，归因于化妆产品或处于不同身体区域。优选的乳酸菌可以有利地处在宽pH值范围内和/或在优选的范围内具有优选的特性。优选的乳酸菌可以因此有利地在不同身体区域内广泛使用。

另外，本文所述的发明是在蛋白酶处理(例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶TPCK处理、溶菌酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶、凝血酶、PNG酶(PNGase)、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶)后还具有共凝集特性的组合物，尤其是新颖益生菌。

本发明的乳酸菌令人惊讶地显示在约25℃-42℃的宽温度范围内与金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌共凝集的特性。

本领域技术人员因此将明白，在本文以及在本发明中给出的由此类术语“约”或“大约”表征的范围描述中，精确的数值范围不需要用“约”或“大约/大约”指明表述，但反而甚至就所示数值而言向上或向下的微小偏移仍处于本发明的范围内。

本发明乳酸菌与所列致病微生物的结合优选地导致抑制这些致病微生物的生长。

令人惊讶的是，归因于致病微生物和本发明乳酸菌的结合，作为沉积物存在的凝集物尤其在5至100分钟后在室温无搅拌情况下形成。

伤口中的有氧细菌、(主要)病原菌尤其是金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌。伤口愈合的炎性期正常情况下起到消灭潜在致病性微生物和细胞再生的作用。然而，难治性伤口经常在已经遭受免疫抑制并具有降低的炎症反应的患者中出现。这缩减的免疫反应可能不再击败主要伤口细菌并且因此细菌渗入伤口中并形成菌落，这些菌落组织成生物被膜。生物被膜不仅抵抗宿主的防御系统，它们还包含浮游细胞或微菌落。

在一个优选实施方案中，优选的乳酸菌、其类似物、片段、突变体、衍生物或组合优选地具有至少一个以下特征：a)热稳定性或在生物、化学和/或物理处理后的稳定性或b)抑制金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌形成生物被膜的能力。完全令人惊讶的是，本发明的乳酸菌甚至在生物、化学和/或物理处理后将保留它们特异性结合金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌的能力。

本发明乳酸菌的另一个特性是抑制金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌形成生物被膜的能力。这些细菌形成极端坚韧的生物被膜，所述生物被膜抵抗超声、去垢剂、蛋白酶或热并且还抗微生物物质。本发明的微生物尤其具有抑制金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌形成生物被膜的特性。因为抑制生物被膜的形成，这些病原菌可以不再定居在生物表面或无机表面并且因此可以不再造成疾病。

在本发明的意义下，短语“抑制金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌形成生物被膜”因此理解为尤其是指下述特性：本发明的乳酸菌以这种方式与金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌相互作用，即与它们结合或否则以它们不再可以形成生物被膜的方式影响它们。

根据一个优选实施方案，本发明的微生物可以因此具有至少一个所述特性，即抗生物、化学和/或物理处理的抵抗性；耐热性；与金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌特异性结合、共凝集的能力。优选的特性组合包括，例如，抗生物、化学和/或物理处理的抵抗性、耐热性和与金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌结合的能力，或者抗生物、化学和/或物理处理的抵抗性、耐热性和抑制金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌形成生物被膜。

在本明的情况下，如已经陈述的，表述“属于乳酸菌属或类的微生物”也理解成包括仍具有本发明所述的本发明微生物的特征和/或特征或特性的衍生物、突变体、类似物或其片段。本发明的乳酸菌优选地是细菌物种加氏乳杆菌、卷曲乳杆菌和ingluviei乳杆菌(Lactobacillus ingluviei)。

因此，要求保护前述微生物的“突变体或衍生物”，前述微生物属于乳酸菌属、尤其是乳酸杆菌物种的突变体或衍生物，并且具有与本发明情况下对本发明乳酸菌并尤其对相同菌株所要求保护的特征相同的特征。这将至少指特异性共凝集选自金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌群的至少一种致病微生物的能力。此外，它优选具有至少一个以下特征：(i)特异性结合能力对生物、化学和/或物理处理、尤其在高于70℃下处理持续至少30分钟的热处理的抵抗力；(ii)不与表皮葡萄球菌或其他共生性皮肤微生物结合；(iii)与至少一种致病、形成生物被膜的微生物特异性结合的能力；(iv)抑制金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌形成生物被膜的能力；(v)在pH值为3-8下存在特异性结合。这类优选的衍生物可以例如通过基因工程产生。本发明意义下的术语“通过基因工程产生”尤其包括本基因工程领域技术人员熟悉的用于体外和体内修饰核酸的全部方法，从而可以通过重组DNA技术引入基因修饰并且可以修饰基因。

因此，本发明也包括尤其本发明乳酸菌的片段，所述片段仍具有本发明乳酸菌的特性。本发明意义下的“片段”尤其是本发明微生物的细胞组分和优选地是细胞膜的部分。本领域技术人员将充分熟悉从现有技术获得细胞膜级分的方法。

本发明的微生物优选地处于分离或纯化的形式，其中术语“分离”尤其意指乳酸细源自它们的培养基-包括例如，它们的天然培养基。术语“纯化”不限于绝对纯度。

优选，除了活性形式的本发明微生物之外，根据本发明的范围内部也包括本发明微生物的非活性形式。术语“非活性形式”在此指不再能够在培养平板上形成菌落的灭活细胞或死细胞。本领域技术人员熟悉用于灭活的适合方法(例如，生物、化学或物理灭活方法)。然而，在本发明的情况下，微生物也可以按冻干的形式使用。冻干的细胞可以在液体或固体培养基中适宜培养后经诱导以再次生长。

在本发明的情况下，术语“灭活形式”或“非活性形式”和“衍生物”或“类似物”或“突变体”也包括本发明微生物的细胞和/或发酵上清液、溶解物(lysate)、级分(fraction)或提取物，其中这些溶解物、级分或提取物优选地具有乳酸菌的特性，其中“溶解物”以及术语“提取物”尤其是指在水介质中本发明微生物的细胞的溶液或悬液，并且包含例如大分子如DNA、RNA、蛋白质、肽、脂类、糖等以及细胞残片。溶解物优选地也包括细胞壁或细胞壁组分。产生溶解物的方法是本领域技术人员充分熟知的并且包括例如使用“弗氏压碎器”或酶促裂解、带有玻璃珠或铁珠的球磨机。细胞可以由酶促、物理或化学方法破开。酶促细胞裂解的例子可以包括单种酶以及酶混合物，例如，蛋白酶、蛋白酶K、脂肪酶、糖苷酶；化学裂解可以由离子载体、去垢剂如SDS、酸或碱引起；物理方法也可以通过利用高压如弗氏压碎器、渗透性、温度或交替加热和冷却来实施。另外，化学、物理酶促方法当然可以组合。

本发明微生物的“灭活形式”或“非活性形式”和“衍生物”或“类似物”或“突变体”优选地具有与前述菌株相同的特性。“灭活形式”或“非活性形式”和“衍生物”或“类似物”优选地不再具有任何代谢活性。

本发明微生物的类似物是溶解物或片段的形式。本发明微生物的片段是细胞的部分，如细胞膜；大分子如DNA、RNA、蛋白质、肽、脂类、糖等以及细胞残片。本领域技术人员可以为这类术语如“类似物”、“片段”、“衍生物”或“突变体”提供内容并且他们可以在不需要任何巨大技术付出情况下解读本发明意义下的这些术语。为了提供优选微生物的突变体、衍生物、片段或类似物，本领域技术人员可以依赖于他们可获得的标准文献，所述标准文献公开了可以用来产生突变体、衍生物、片段或类似物的技术。

遗传地改变突变体和/或遗传改变的变体或衍生物，例如，通过重组DNA技术(重组核酸的克隆、测序、转化)以及物理诱变，例如，通过紫外辐射，还因化学剂如采用甲磺酸乙酯(EMS)进行。可以选择正向特性的变化-以靶向方式或通过评价形成的多个突变体。遗传改变的突变体含有本发明微生物的细胞并且使重组核酸在它们的细菌染色体和/或质粒中产生。因点突变所致的修饰以及在没有任何直接遗传操作下的自发突变也可以对表达/转录/翻译产生影响。

类似物或片段可以是本发明微生物的热灭活(死)或冻干形式，所述形式(例如通过增加表面积)保留或改善它们的发明特性。甚至在冻干(冷冻干燥)后，细胞仍可以在一些情况下有活性。这些细胞可以经过在不同温度的特定存储过程灭活。灭活细胞可以例如具有完整的或破裂的细胞膜，但是它们不能具有任何代谢活性。获得灭活细胞的方法可以例如包括用玻璃珠处理它们，其中细胞和玻璃珠之间的剪切力作用造成细胞破裂。额外的物理方法如弗氏压碎器、高压均化、球磨机或冻融过程和高压灭菌，以及UV照射、自溶过程或在不同温度的特定存储过程，也导致失活并导致本发明微生物的片段。

本发明意义下的术语“乳杆菌属细胞”也可以用来指乳酸菌或乳酸杆菌并且也包括需要糖、尤其葡萄糖和乳糖用于乳酸发酵并通常利用埃姆登-迈耶霍夫生物合成途径的微生物。乳杆菌属细胞在分类学上划入乳杆菌科(Lactobacteriaceae)。它们是革兰氏阳性，不形成孢子并通常是不动的。乳杆菌属细胞厌氧生活但是是耐氧，虽然它们的确不含有任何氯高铁血红素(细胞色素、过氧化氢酶)(Schleifer等人,System.Appl.Microb.18,461-467(1995)或Ludwiq等人,System.Appl.Microb.15,487-501(1992)。乳杆菌属细胞和/或物种可以基于糖类利用样式，尤其通过API试验(Biomerieux Co.)和借助16sRNA测序来确定。根据本发明，这尤其包括适合同型发酵乳酸发酵或异型发酵乳酸发酵的物种。还优选的是选自以下的那些乳杆菌属细胞：乳酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、詹氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、食淀粉乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、弯曲乳杆菌和植物乳杆菌(均为同型发酵)，还有短乳杆菌、布氏乳杆菌、食果糖乳杆菌、希氏乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊乳杆菌、绿色乳杆菌以及两歧双歧杆菌(均为异型发酵)。

在一个优选实施方案中，本发明微生物选自加氏乳杆菌、加氏乳杆菌、加氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、卷曲乳杆菌、卷曲乳杆菌、卷曲乳杆菌、卷曲乳杆菌、卷曲乳杆菌和ingluviei乳杆菌(Lactobacillus ingluviei)，每种细菌以保藏编号DSM 25906、DSM 25907、DSM 25908、DSMZ 25909、DSM 25910、DSM 25911、DSM 2591、DSM 25913、DSM 25914和DSMZ 25915保藏于布伦瑞克的德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)。前述DSMZ保藏物根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约作出。

如上文解释进一步，本发明也涉及优选地含有活微生物或其类似物、突变体、衍生物或片段以及优选地至少一种溶媒或赋形剂的组合物，所述溶媒或赋形剂选自以下溶媒或赋形剂中的至少一种：化妆品可用溶媒或赋形剂、可药用的溶媒或赋形剂或皮肤学可用溶媒或赋形剂。

本发明意义下的术语“组合物”理解成尤其包括具有至少一种本发明微生物或其片段、衍生物、类似物或突变体以及任选地其他成分如溶媒或赋形剂或任选地其他有效成分和盐的任何组合物。化妆品可用、可药用或皮肤学可用的赋形剂、溶媒或添加物被理解为包括下述的任何物质，所述物质在化妆品、药物或牙科领域常规使用，旨在以化妆品用方式或药用方式施用、使用或活化有效成分或组合物，即在本发明的情况下，至少一种微生物或类似物或衍生物或突变体或其片段。

优选的是所述组合物不仅含有本发明微生物或其类似物、突变体、衍生物或片段之一，还含有本发明微生物的混合物或类似物、衍生物、突变体或片段的混合物或本发明微生物及其片段、衍生物、突变体或类似物的混合物。

所述组合物可以优选地处于固态或液态或粘稠形式或是气溶胶，并且可以例如以粉剂、片剂、溶液剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂等形式，即以适于施用的任何形式使用。如果组合物包含额外的益生菌、防腐剂或其他抗菌物质，优选地但是任选地包含糖和防腐剂、矫味剂、甜味剂、维生素、矿物质等，这也是优选的。文献EP 2,133,414A1列出可以用于优选的组合物的许多成分；在本公开中明确参考该公开文献。另外，填料、流控剂、流变学调节物、软化剂、稳定剂、引发剂或反应交联的单体(例如，甲基丙烯酸酯)可以在优选的组合物中。

本发明到组合物尤其用于生理卫生、物理疗法和预防领域中并且含有至少一种本发明微生物或其衍生物、突变体、片段或类似物。

所述组合物和/或微生物也可以用作消毒剂例如，用作表面消毒剂如尤其用作隐形眼镜的清洁液。

使用本发明组合物的剂量和施用取决于相应的用途和相应的患者-尤其年龄、重量、总体健康等-并且处于将使用这种组合物的本领域技术人员的能力和评价能力范围内。

本发明组合物可以是化妆产品、医药产品或药物产品。该组合物优选地以按重量计0.001重量％至10重量％、优选地0.005重量％至5重量％、特别优选地0.01重量％至3重量％含有乳酸菌。完全令人惊讶的是使用0.001重量％至10重量％的量尤其将导致分解作用较长时间可用，即保持稳定。如果以0.005重量％至5重量％的量使用乳酸菌，这令人惊讶地导致对组合物的流变学特性产生积极效果并且导致组合物具有较低粘度，因此更好地分布在皮肤上或更容易引入口腔中。以按重量计0.01重量％至3重量％的量使用乳酸菌已经令人惊讶地导致该组合物的组分彼此更好结合和以缩短的工作时间供应均匀组合物的可能性，这转而导致生产成本降低。然而，不证自明的是，也可以使用用于特定应用领域的不同于本文所述量的其他量。

如上文所解释，根据优选的实施方案，所述组合物和/或微生物可以在生理卫生领域用来凝集即结合前述致病微生物。这些共凝集物可以随后例如通过将它们淋洗去而轻易地移除，尤其在悬液的情况下，从而有利地实现致病微生物的数目减少。乳酸菌和/或含有它们的组合物可以因此以多种方式用于这个目的。例如，它们可以用于沐浴露、沐浴液、护肤液、液体皂、皂、沐浴油或消毒溶液、呼吸器中的滤器系统、鼻喷雾剂、隐形眼镜清洁液、毛巾或清洁毛巾中。本发明因此也涉及用于生理卫生和医用产品及预防领域并含有本发明乳酸菌的全部产品。上文描述的实施方案也因此适用于哺乳动物中的治疗、疗法和预防领域。所述微生物和/或含有它们的组合物可以因此以多种方式使用。

尤其是如果发明的组合物和/或本发明的微生物用来生产药用药物、用于治疗或预防糖尿病、皮肤疾病、皮肤损伤、中毒性休克综合征、葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征以及由肠毒素引起的中毒性感染、由金黄色葡萄球菌引起的疖、痈、窦炎、骨髓炎如败血症和随后脑膜炎和/或心肌炎和心包炎以及因铜绿假单胞菌所致的肺炎伴发囊性纤维化、尿路感染、小肠结肠炎，脑膜炎、外耳炎、烧伤面上感染，则这是优选的。

通过本发明微生物和含有它们组合物可获得可以有利治疗和/或预防这些疾病的药剂。所述微生物和/或含有它们的组合物可以用于人类和兽用药物中，尤其如上文所示，用于犬、猴、猫、马和啮齿类(野兔、兔、仓鼠、豚鼠)及商品动物如鸡、猪和牛、羊、山羊以及其他家养和商品动物中。

本发明的组合物和/或微生物-或其片段、衍生物或突变体-可以尤其用作食品添加剂、用作卫生产品、用作含有所述微生物的卫生产品或用作药物制品。这类卫生产品也可以例如处于试剂盒的形式，除了生理卫生装置或设备、冲洗液、糊膏等之外，所述试剂盒还可以含有本发明的微生物或含有它们的组合物。

本发明也涉及一种用于鉴定和/或选择具有本发明特性的乳杆菌属微生物的方法，其中所述方法至少包括以下步骤：a)孵育一批选自金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌的致病微生物以便形成生物被膜，b)添加待研究的乳杆菌属微生物并且孵育该批次以形成在致病微生物和待研究的乳杆菌属微生物之间的特异性结合，c)通过移走上清液分离未结合的乳杆菌属微生物；以及d)就结合和凝集的乳杆菌属微生物来测定生物被膜。

在一个优选实施方案中，本发明的方法还包括步骤：研究对致病微生物形成生物被膜的抑制。本文中在孵育形成生物被膜的致病微生物期间添加待研究的乳酸菌。在移走未结合的细胞后，通过与不添加待测试微生物的对照相比来测量光密度，尤其在结晶紫染色后，优选地将生物被膜的形成定量。

不证自明的是上文提到的特征和下文待描述的那些不仅可以在给出的特定组合中使用，还可以单独使用而不超出本发明的范围。

根据本专利申请的教导内容由以下特征来表征：

–不同于现有技术中的惯例，

–对象的新描述，

–迫切需要对于长时间尚未解决但是由本发明解决的问题的解决方案，

–先前在部分技术领域的不成功工作，

–本解决方案的简单性显示发明的创造性，尤其它替代了更复杂的教导内容，

–在不同方向上进行的科学技术发展，

–导致进一步发展的成果，

–在技术领域中涉及相应问题解决方案的有缺陷概念(对技术进步的偏见，例如：改进、增加性能、降低成本、节约时间、材料、工作步骤、获得原料的成本或困难、增加的可靠性、消除缺陷、提高品质、无需维护、功效更大，更高产率、技术可能性增加、提供另一种手段、开辟第二途径、开辟新领域、某问题的第一解决方案、保留手段、替代物、经济化的可能性、自动化或微型化或药物资源富集，

–幸运偶然，因为已经从多种可能性选出一种具体可能性，不可能已经预测到结果，因此这是可以申请专利的幸运发现，

–技术文献中的错误和/或本发明主题的非常矛盾的陈述，

–新技术领域

–组合发明，即，组合多个已知的要素以产生具有令人惊讶效果的组合，

–许可证的发放，

–技术领域的赞扬，和

–经济成功。

具体而言，本发明的有利实施方案具有至少一个或多个前述优点。

附图说明

本发明将基于附图和实施例在下文作为实施例来解释，但是，不限于这些实施例。

图1：在洗去未结合的细胞3次后，本发明微生物(DSM 25906、DSM 25907、DSM 25908)的一个示例性实施方案与金黄色葡萄球菌形成的生物被膜的特异性结合和/或凝集(结合分析)，与之相比，不属于本发明并能够与结合金黄色葡萄球菌的额外乳杆菌属菌株(乳杆菌属物种1和乳杆菌属物种2和乳杆菌属物种3)；基于荧光量值(485/535nm)，对96孔微量滴定平板中CFDA-标记的本发明乳杆菌属菌株与生物被膜的结合和/或凝集的具体定量。

图2：在洗去未结合的细胞3次后，本发明微生物(DSM 25909、DSM 25910、DSM 25911)的示例性实施方案与铜绿假单胞菌形成的生物被膜的特异性结合和/或凝集(结合分析)，与之相比，不属于本发明并不能够与结合铜绿假单胞菌的额外乳杆菌属菌株(乳杆菌属物种1和乳杆菌属物种2和乳杆菌属物种3)；基于荧光量值(485/535nm)，对96孔微量滴定平板中CFDA-标记的本发明乳杆菌属菌株与生物被膜的结合和/或凝集的具体定量。

图3：照相记录系统中，本发明微生物的示例性实施方案(DSM 25909、DSM 25910、DSM 25911)与铜绿假单胞菌细胞在共凝集后特异性结合的宏观对照和单独的本发明乳杆菌属菌株及靶菌株。

图4：本发明微生物的示例性实施方案(DSM 25909、DSM 25910、DSM25911)与铜绿假单胞菌细胞在共凝集后特异性结合的微观对照和单独的本发明乳杆菌属菌株及靶菌株。显微照片(对比度，放大率1000×)。

图5：照相记录系统中，本发明微生物的示例性实施方案(DSM 25906、DSM 25907、DSM 25908)与金黄色葡萄球菌细胞在共凝集后特异性结合的宏观对照和单独的本发明乳杆菌属菌株及靶菌株。

图6：本发明微生物的示例性实施方案(DSM 25906、DSM 25907、DSM25908)与金黄色葡萄球菌细胞在共凝集后特异性结合的微观对照和单独的本发明乳杆菌属菌株及靶菌株。显微照片(对比度，放大率1000×)。

图7：共凝集测定法中本发明微生物的示例性实施方案(DSM 25909、DSM25910、DSM 25911)与铜绿假单胞菌(DSM 22644)、表皮葡萄球菌(DSM 20044)、杰氏棒状杆菌(DSM 7171)和藤黄微球菌(DSM 20030)的特异性凝集；通过在600nm测量单独的靶微生物的光密度以及单独的乳杆菌属菌株的光密度和共凝集定量混合物的光密度，对凝集作用的具体定量。

图8：共凝集测定法中本发明微生物的示例性实施方案(DSM 25906、DSM25907、DSM 25908)与金黄色葡萄球菌(DSM 18587)、表皮葡萄球菌(DSM20044)、杰氏棒状杆菌(DSM 7171)和藤黄微球菌(DSM 20030)的特异性凝集；通过在600nm测量单独的靶微生物的光密度以及单独的乳杆菌属菌株的光密度和共凝集定量混合物的光密度，对凝集作用的具体定量。

图9：共凝集测定法中本发明微生物的示例性实施方案(DSM 25906、DSM25907、DSM 25908)在进行或不进行胰蛋白酶处理的情况下与金黄色葡萄球菌(DSM 18587)的特异性凝集；通过在600nm测量单独的靶微生物的光密度以及单独的乳杆菌属菌株的光密度和共凝集定量混合物的光密度，对凝集作用的具体定量。

图10：共凝集测定法中本发明微生物的示例性实施方案(DSM 25906和DSM 25907)在进行或不进行胰蛋白酶处理的情况下与金黄色葡萄球菌(DSM18587)和金黄色葡萄球菌(DSM 20232)的特异性凝集；通过在600nm测量单独的靶微生物的光密度以及单独的乳杆菌属菌株的光密度和共凝集定量混合物的光密度，对凝集作用的具体定量。

图11：用PBS中洗涤的乳杆菌悬液、热灭活的乳杆菌悬液和热灭活的乳杆菌悬液的上清液孵育6小时后本发明微生物的示例性实施方案(DSM 25914和DSM 25915)抑制由金黄色葡萄球菌形成的生物被膜；通过96孔微量滴定平板中的结晶紫染色在590nm测量光密度，对生物被膜定量。

图12：用PBS中洗涤的乳杆菌悬液、热灭活的乳杆菌悬液和热灭活的乳杆菌悬液的上清液孵育6小时后本发明微生物的示例性实施方案(DSM 25912和DSM 25913)抑制由铜绿假单胞菌形成的生物被膜；通过96孔微量滴定平板中的结晶紫染色在590nm测量光密度，对生物被膜定量。

实施例

实施例1

为了鉴定和选择本发明的微生物，来自乳杆菌属菌株库的各种菌株由一个4步骤筛选方法测试，其中首先就与致病性皮肤微生物(下文也称作“靶微生物”微结合的能力测试它们(结合分析)，并且随后，在共凝集测定法中以微量滴定平板规模测试第一步骤中鉴定的菌株，其中使用双目立体显微镜定性测量与相应靶生物的共凝集。另外，研究了共凝集的强度和与靶微生物结合的稳定性以及预防生物被膜的能力，这最终导致根据本发明鉴定的示例性微生物(乳杆菌)。

结合分析

为了能够对所选择的乳杆菌属菌株的结合活性定量，建立一种结合分析，其允许定量检测96孔板中乳杆菌属菌株与致病微生物的结合。乳杆菌属细胞与靶生物的结合活性与共凝集活性和/或共凝集能力相关。实验地检验这一点。在这方面，图2显示乳杆菌属菌株DSM 25909、DSM 25910、DSM 25911和铜绿假单胞菌DSM 22644的共凝集的例子，并且图1显示乳杆菌属菌株DSM25906、DSM 25907、DSM 25908和金黄色葡萄球菌DSM 22644的共凝集。

测量方法基于本发明菌株与生物被膜中所结合的靶菌株的特异性结合。将限定量的本发明菌株用荧光染料(CFDA溶液，Invitrogen)标记并且与限定量的与生物被膜结合的靶生物混合用于分析。在洗涤几次后使用荧光光度计测量结合的本发明菌株在靶菌株上的持续存在。

为了进行这些实验，使用用于铜绿假单胞菌的TSB(胰蛋白酶解酪蛋白大豆培养液)和用于金黄色葡萄球菌的TSY(胰蛋白酶解酪蛋白大豆酵母提取物培养基)，根据标准方法培养靶微生物-铜绿假单胞菌(DSMZ 22644)和金黄色葡萄球菌(DSMZ 18587)。

在MRS培养基中于37基中厌氧培养乳杆菌属菌株(de Man等人,1960)。

为了制作靶微生物，在达到初始稳态生长阶段后，收获细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)洗涤3次并且置于PBS中。随后将100μL悬液置于96孔微量滴定平板的每个孔中。

在6-小时有氧孵育期间，生物被膜由靶菌株形成。在孵育后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)洗涤3次移除未结合的细胞。

为了制作乳杆菌属菌株，在培养24小时后，将它们收获并用PBS洗涤3次，置于PBS中并通过添加CFDA溶液(Invitrogen)进行荧光标记。

为进行结合分析，将100μL结合乳杆菌悬液添加至每个孔中生物被膜内所结合的靶菌株。平行携带不添加乳杆菌悬液的对照定量混合物。在30℃下于培养箱中孵育1小时后，将未结合的细胞分离并且用PBS洗涤3次。在每个洗涤步骤后，荧光平板光度计(Em 485nm/Ex 535nm)中测量荧光。

与不含乳杆菌属细胞的对照相比，含有乳杆菌属菌株的定量混合物中荧光(Em 485nm/Ex 535nm)的增加与生物被膜乳杆菌属细胞的量相关。结合乳杆菌属细胞后所测量的荧光对应于结合强度。这个值越高，标记的乳杆菌属细胞与生物被膜中所结合的靶菌株结合得越好并且测试的乳杆菌属细胞的结合活性越大。

实验已经显示在移除未结合的细胞后，对于结合分析中的靶生物菌株/靶菌株铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌而言，测试的乳杆菌属菌株导致三次洗涤后因生物被膜中结合的标记乳杆菌属细胞的结合所致的荧光增加3至17倍。图2显示乳杆菌属DSM 25909、DSM 25910和DSM 25911与铜绿假单胞菌的结合分析的结果，并且图1是作为本发明微生物示例的DSM 25906、DSM25907和DSM 25908与金黄色葡萄球菌的结合分析的结果。此外，出于比较目的，图1和图2也显示了不属于本发明的不能够特异性结合靶生物的乳杆菌属菌株(乳杆菌属物种1和2)的数据。

实施例2

共凝集测定法

以下在体积0.8mL和/或在24孔平板中的验证用来显示所选择的乳杆菌属菌株的共凝集活性。

在这种方法中，单独考虑乳酸杆菌的共凝集行为和靶菌株的共凝集行为，并且最终考虑混在一起的乳杆菌和靶菌株的共凝集作用。通过使用24孔平板的照片宏观地进行以及微观地进行这种分析。

为了进行这些试验，使用用于铜绿假单胞菌的TSB(胰蛋白酶解酪蛋白大豆培养液)和TSY(胰蛋白酶解酪蛋白大豆酵母提取物培养基)，根据标准方案培养靶微生物-铜绿假单胞菌(DSMZ 22644)和金黄色葡萄球菌(DSMZ 18587)。

在MRS培养基中于37基中厌氧培养乳杆菌属菌株(deMan等人,1960)。

为了制作靶微生物，在16小时后，收获细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)洗涤3次并且调整至OD₆₀₀＝4。

为了制作乳杆菌属菌株，在16小时后，收获它们，用PBS洗涤2次并随后置于1体积PBS中并且因此调整至OD₆₀₀＝8。

为进行共凝集测定法，将400μL标记的靶微生物的悬液连同400μL靶微乳杆菌悬液一起置于24孔平板中的每个孔内。平行制备含有400μL相应靶生物外加400μL PBS(对照1)或400μL相应乳杆菌悬液外加400μL PBS(对照2)的对照定量混合物。在台式搅拌器上于25照定后30分钟孵育，通过照相记录系统，宏观地观察定量混合物，以及通过转移来自每个孔中心的3μL混合物至显微镜载玻片，微观地观察定量混合物。

为了对共凝集作用定量，通过离心分离所产生的共凝集物(10秒，300g)。随后将100μL上清液转移至96孔平底平板并且在平板光度计中在600nm测量光密度。

以下式用于计算共凝集活性的百分比：

靶微生物的光密度以及乳杆菌属菌株的光密度和共凝集定量混合物的光密度用于共凝集活性百分比的计算。

实验已经显示，对于共凝集中的靶微生物/靶菌株-金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌，选择的乳杆菌属菌株导致混合物中的团块(凝集物)，这些凝集物因孔内的暗区域而是宏观可见的。在仅含有靶菌株和/或本发明乳杆菌属菌株的孔中无凝集物形成。这因孔内缺少形成的暗区域而是可见的。图5显示所选择的乳杆菌的共凝集定量混合物中靶微生物菌/靶菌株金黄色葡萄球菌的宏观结果，并且图3显示靶菌株铜绿假单胞菌的结果。在显微镜观察中，本发明的全部乳杆菌属菌株的显微镜观察结果中发现针对相应靶菌株的清晰亲和力，所述亲和力导致微观考虑凝集作用时不同的凝集物尺寸。图4显示所选择的乳杆菌的共凝集定量混合物中图6中靶微生物菌/靶菌株金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌的微观结果。

实施例3

另外，进行实验以显示蛋白酶对本发明乳杆菌属菌株的影响和它们的凝集特性对靶微生物的影响。

本发明的乳杆菌属菌株和靶菌株因此如实施例2中所述那样处理。

本发明的乳杆菌属菌株用蛋白酶(在此显示的蛋白酶例子)胰蛋白酶处理。在处理乳杆菌属菌株后，将它们用胰蛋白酶在37白酶处理60分钟(12.4单位/mg，Sigma)。随后，细胞再次用PBS洗涤两次并且如实施例2中所述定量凝集特性。

这些实验已经显示，用蛋白酶处理后，本发明的乳杆菌属菌株在靶微生物的共凝集测定法中针对靶微生物菌/靶菌株铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌具有50-76％凝集作用。作为本发明微生物的实例，图9显示在采用和不采用胰蛋白酶处理金黄色葡萄球菌处理的情况下乳杆菌DSM 25906、DSM 25907和DSM 25908的共凝集测定法的结果。

实施例4

采用额外的共生性皮肤微生物进行实验以显示本发明乳杆菌属菌株针对靶微生物的凝集特性的特异性。选择表皮葡萄球菌(DSM 20044)、杰氏棒状杆菌(DSM 7171)和藤黄微球菌(DSM 20030)。本发明的乳杆菌属菌株和靶微生物如实施例2中所述那样培养和制作。

为了进行这些试验，使用用于铜绿假单胞菌的TSB(胰蛋白酶解酪蛋白大豆培养液)和用于金黄色葡萄球菌(DSMZ 18587)、表皮葡萄球菌(DSM 20044)、杰氏棒状杆菌(DSM 7171)和藤黄微球菌(DSM 20030)的TSY(胰蛋白酶解酪蛋白大豆酵母提取物培养基)，根据标准方案培养全部待测试的靶微生物，即，铜绿假单胞菌(DSMZ 22644)、金黄色葡萄球菌(DSMZ 18587)、表皮葡萄球菌(DSM 20044)、杰氏棒状杆菌(DSM 7171)和藤黄微球菌(DSM 20030)。

如实施例2中所述那样进行靶菌株和C凝集测定法。

实验已经显示，不存在与通过本发明乳杆菌属菌株所研究的额外靶菌株的凝集作用，相反，这些是十分特异的特性。图8显示乳杆菌属DSM 25909、DSM 25910和DSM 25911与金黄色葡萄球菌相对于本发明微生物的共凝集测定法的结果，并且图7显示乳杆菌属DSM 25909、DSM 25910和DSM 25911与铜绿假单胞菌的结果。

实施例5

另外，采用与皮肤微生物相同属和种的其他微生物进行实验以确定本发明乳杆菌属菌株针对相同属和种的靶微生物的结合特性和/或凝集特性的特异性。为此目的，选择金黄色葡萄球菌(DSMZ 20232)以展示其在测试时对靶微生物的凝集特性。

本发明的乳杆菌属菌株和靶微生物因此如实施例2中所述那样培养和制作。

为了进行这些试验，使用TSY(胰蛋白酶解酪蛋白大豆酵母提取物培养基)，根据标准方案培养全部待研究的靶微生物，即在这个实施例中金黄色葡萄球菌(DSMZ 18587)和金黄色葡萄球菌(DSMZ 20232)。

处理靶菌株和如实施例2中所述那样进行共凝集测定法。

这些实验已经显示，相同属和种的其他微生物也能够因本发明的乳杆菌属菌株而结合和/或凝集。图10显示乳杆菌DSM 25906和DSM 25907的共凝集测定法的结果，使用金黄色葡萄球菌DSMZ 18587和DSMZ 20232作为本发明微生物的例子。

实施例6

生物被膜的抑制

为鉴定和选择本发明的微生物，在筛选方法中按微量滴定平板规模测试来自乳杆菌数据库的各种菌株。筛选的目的确定致病性皮肤微生物(下文也称作“靶微生物”微在防止生物被膜形成中的特性。防止生物被膜特性的强度与靶微生物的不受影响的生物被膜形成定量相关并且进行分析，最终导致鉴定到本发明的微生物(乳杆菌)。

为了研究它们对致病性靶微生物金黄色葡萄球菌(DSM 18587)或铜绿假单胞菌(DSM 22644)形成生物被膜的影响，将乳杆菌属菌株和/或其级分直接添加至处于形成生物被膜状态的靶微生物并孵育至多到6小时。在移走不结合的细胞并用PBS洗涤生物被膜2次后，通过整个定量混合物的结晶紫染色后测量光密度，将生物被膜定量。

为进行这些试验，根据如上文进一步描述的标准方案培养靶菌株，并且在MRS培养基中厌氧培养乳杆菌属菌株。

为了制作乳杆菌属菌株，在16小时后，将它们在培养后用PBS洗涤两2次并随后置于PBS中。

用PBS洗涤后，将一些乳杆菌属菌株经70℃下巴斯德消毒后，热灭活30分钟。

此外，在用PBS洗涤后，一些热灭活的乳杆菌属菌株用来获得上清液。通过将悬液离心做到这一点并且随后使用上清液。

为了制作靶菌株，将它们培养并且直至实现平均指数生长期才收获，并且随后调整至600nm(mL-1)＝3.5，用PBS洗涤2次并置于PBS中。

为进行生物被膜形成测定法，将乳杆菌属菌株直接添加至处于形成生物被膜状态的靶微生物并在37行生厌氧孵育6小时。平行携带不添加乳杆菌悬液的对照定量混合物。在移走浮游细胞并洗涤生物被膜后，通过在结晶紫染色(0.1％，Merck)具有和不具有乳杆菌属和/或乳杆菌属级分的结合的靶微生物，将生物被膜定量。为此，在结晶紫染色后，通过乙酸溶解相应批次的结合细胞并且随后将所述结合的细胞置于悬液中并在590nm光密度测量。与不附带乳酸杆菌的靶微生物的对照相比，在590nm的光密度的下降与阻碍的生物被膜的强度相关。这种下降表述为相对于不附带乳酸杆菌的靶微生物的抑制生物被膜形成百分比。作为本发明微生物的示例，图11显示结果乳杆菌属DSM 25914和DSM 25915抑制金黄色葡萄球菌生物被膜，并且DSM 25912和DSM 25913抑制铜绿假单胞菌被膜如图12中所示。实验已经显示，这导致在使乳杆菌属菌株和/或其级分的代谢活性失活或不失活的情况下，本发明乳杆菌属菌株抑制56-93％的金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌生物被膜形成。

这些实验和实施例已经显示仅选择到优选的微生物，其中已经对全部优选的微生物实验地证实联合有利特性。本领域技术人员将从实施例和附图中学会怎样在重现本发明并且例如重现优选微生物的共享有利特性方面取得进展。

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de Man et al.，(1960)”A medium for the Cultivation of Lactobacilli”，J.Appl.Bact.23(130-135)

Claims (44)

1.一种用于鉴定和/或选择具有与选自包含金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌的组中的致病微生物共凝集的能力的乳酸菌的方法，其中，所述方法至少具有以下步骤：

a.孵育所述致病微生物以形成生物被膜；

b.添加待研究的乳酸菌并孵育以形成在致病微生物和待研究的乳酸菌之间诱导共凝集的混合物；

c.通过移走上清液分离未结合的乳酸菌；以及

d.就共凝集的乳酸菌而言测定生物被膜。

2.根据权利要求1所述的方法，额外地包括以下步骤：

研究致病微生物对生物被膜的抑制，其中添加待研究的乳酸菌在孵育形成生物被膜的致病微生物期间进行。

3.根据权利要求1或2所述的方法，额外地包括以下步骤：

通过与不添加待测试的乳酸菌时的对照相比测量光密度，将移除未结合的细胞后生物被膜的形成定量。

4.由权利要求1-3任一项所述的方法所制备的属于乳酸菌类的微生物或其混合物，其中，所述属于乳酸菌类的微生物或其混合物可以与至少一种致病微生物共凝集，其中所述致病微生物选自包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和/或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的组，所述属于乳酸菌类的微生物选自包含以下微生物的组：已经保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心并配有保藏编号DSM 25906、DSM 25907、DSM 25908、DSM 25909、DSM 25910、DSM 25911、DSM 25912、DSM 25913、DSM 25914和DSM 25915的微生物。

5.根据权利要求4所述的微生物或其混合物，其中，共凝集所述至少一种致病微生物的能力在生物、化学或物理处理后也存在。

6.根据权利要求4或5所述的微生物或其混合物，其中，共凝集所述至少一种致病微生物的能力在3和8之间的pH值下存在。

7.根据权利要求4或5所述的微生物或其混合物，其中，所述微生物或其混合物具有抑制所述至少一种致病微生物的生物被膜的形成的能力。

8.根据权利要求6所述的微生物或其混合物，其中，所述微生物或其混合物具有抑制所述至少一种致病微生物的生物被膜的形成的能力。

9.一种组合物，包含至少一种根据权利要求4-8中任一项所述的属于乳酸菌类的微生物或其混合物。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述组合物包含选自含以下溶媒或赋形剂的组中的溶媒或赋形剂：化妆品可用溶媒或赋形剂、可药用溶媒或赋形剂或皮肤学可用溶媒或赋形剂。

11.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，所述组合物为粉剂、棒剂、乳膏剂、分散体剂、乳剂、泡沫剂、软膏剂、喷雾剂、气溶胶剂、毛巾剂、洗剂、混悬剂、溶液剂、凝胶剂的形式或在基底上。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述组合物为护肤霜、皮肤洗液或皮肤软膏形式。

13.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，所述组合物为固体、液体、粘稠形式或作为气溶胶。

14.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述护肤霜、皮肤洗液或皮肤软膏为固体、液体、粘稠的形式或作为气溶胶。

15.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，所述组合物包含益生菌、防腐剂或其他抗菌有效成分。

16.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，所述组合物是药用、兽用、化妆或食品用组合物。

17.根据权利要求9或10所述的组合物，额外地含有促净剂物质、表面活性剂、酶、有机和/或无机过氧化合物、过氧化物激活剂、水可溶混性有机溶剂、掩蔽剂、电解质、pH调节剂、增稠剂、去污有效成分、荧光增白剂、发灰抑制剂、染料转移抑制剂、泡沫调节剂和/或着色剂。

18.根据权利要求9或10所述的组合物，额外地包含选自以下组中的至少一种物质：

a.对皮肤状况具有积极影响的有效成分，

b.用于重建结缔组织的促进剂，

c.支持干性皮肤上皮肤功能的有效成分，和

d.用于减轻和/或积极影响炎性皮肤状态的有效成分。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述对皮肤状况具有积极影响的有效成分是对老年皮肤具有积极影响的有效成分。

20.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述对皮肤状况具有积极影响的有效成分是与生物醌、肌酸、肌酐、肉碱、生物素、异黄酮、心磷脂、硫辛酸、抗冻蛋白、牛蒡苷、啤酒花和啤酒花-麦芽提取物组合时的有效成分。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中，所述生物醌是泛醌Q10。

22.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述促进剂是异黄酮类。

23.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述支持干性皮肤上皮肤功能的有效成分是维生素C、生物素、肉碱、肌酸、丙酸、绿茶提取物、桉油、脲和无机盐。

24.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述支持干性皮肤上皮肤功能的有效成分是NaCl、海洋矿物质和渗压剂。

25.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述用于减轻和/或积极影响炎性皮肤状态的有效成分是绢毛榄仁苷、多种甘草提取物、甘草查尔酮、水飞蓟素、水飞蓟宾-磷脂复合物和/或右旋泛醇。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中，所述甘草查尔酮是甘草查尔酮A。

27.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，所述属于乳酸菌类的微生物在组合物中以灭活、活性或无活性的形式存在。

28.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，所述属于乳酸菌类的微生物以封装、喷雾干燥和/或冻干的形式存在。

29.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，所述属于乳酸菌类的微生物以细胞溶解物的形式存在。

30.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，所述属于乳酸菌类的微生物以0.001重量％至10重量％存在。

31.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，所述属于乳酸菌类的微生物以0.005重量％至5重量％存在。

32.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，所述属于乳酸菌类的微生物以0.01重量％至3重量％存在。

33.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，所述组合物为气溶胶喷雾剂。

34.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，所述组合物为泵喷雾剂。

35.根据权利要求9至34中任一项所述的组合物用于生产治疗或预防皮肤疾病的药用药物、医用产品或化妆品的用途，其中，所述皮肤疾病为葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征、触染性脓疱病、浅表毛囊炎、脓疱化、痈、脓肿、蜂窝织炎、干性皮肤、痒性皮肤、发红皮肤、炎性皮肤、极度油性皮肤、痤疮、糖尿病足、褥疮、神经性皮炎、急性淋巴结炎、藏毛囊肿、藏毛瘘、藏毛窦、球虫性瘘、球虫性囊肿、皮肤和皮下组织的局部感染、脓皮病、脓性皮炎、脓毒性皮炎、化脓性皮炎、异位性湿疹、脂溢性湿疹、尿布皮疹、过敏性接触性皮炎、脂溢性皮炎、剥脱性皮炎、中毒性接触性皮炎、慢性单纯性苔藓、痒疹、瘙痒症、丘疹鳞屑性皮肤疾病、银屑病、副银屑病、皮肤附属物的疾病、瘢痕性脱发、脱发性毛囊炎、下肢溃疡、皮肤损伤、刮伤、事故或手术后的伤口。

36.根据权利要求9-34中任一项所述的组合物用于生产处理表面的清洁剂或消毒剂的用途。

37.根据权利要求9-34中任一项所述的组合物用于生产在生理卫生、医用产品和预防领域中所使用的产品的用途。

38.根据权利要求9-34中任一项所述的组合物用于生产施加至皮肤表面的洗剂、震荡合剂、粉剂、水凝胶剂、乳膏剂、克勒萨(cresa)、软膏剂或糊膏剂的用途。

39.根据权利要求38所述的用途，其中，所述软膏剂是脂性软膏剂。

40.根据权利要求9-34中任一项所述的组合物用于生产对局部治疗伤口感染和加速慢性伤口愈合具有特效的抗微生物添加物的用途。

41.根据权利要求35-40中任一项所述的用途，其中，所述组合物的用途是预防性或治疗性的。

42.根据权利要求35-40中任一项所述的用途，其中，所述组合物是局部地施加的。

43.根据权利要求41所述的用途，其中，所述组合物是局部地施加的。

44.用于卫生处理的试剂盒，包含：

根据权利要求4-8中任一项所述的微生物或根据权利要求9-34中任一项所述的组合物；以及

生理卫生装置或设备、冲洗液和/或糊膏剂。