CN103547670B - 新的乳酸菌和含有其的抗细菌性感冒的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种乳酸菌目的微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合，其中所述微生物、其类似物、片段、衍生物、突变体或组合能够与化脓性链球菌共凝集。

Description

新的乳酸菌和含有其的抗细菌性感冒的组合物

本发明涉及一种乳酸菌目的微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合，其中所述微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或其组合可以与化脓性链球菌共凝集。此外，本发明涉及含有这些微生物，尤其用于个人卫生和治疗疾病方面的组合物。尤其，本发明涉及新乳酸菌和/或含有其的组合物用于治疗和/或预防所有可能由化脓性链球菌引起的疾病的用途。

此外，这里描述的开发是GRAS微生物和/或乳酸菌形式的新的生物产品，所述生物产品可以用作抗微生物添加剂，所述抗微生物添加剂具有预防和局部治疗口和咽喉区域（即，口咽间隙）内炎症和针对上呼吸道及皮肤感染的特异性作用。

另外，本发明涉及本发明的微生物、其类似物或片段在组合物或药物产品或医疗产品（口腔卫生）中的用途，例如，以喷雾剂、漱口水形式或作为喉糖或片剂、菱形片、包衣丸剂、气溶胶、牙膏、果汁、糖浆或作为食品添加剂和/或作为食品补充物。

背景

大多数人已经患过咽喉痛或扁桃体炎（咽炎）。这些疾病可能具有病毒性和细菌性病因。大约20-30%的咽喉痛或扁桃体炎病例是细菌源的。在任何情况下，其涉及化脓性链球菌感染。化脓性链球菌是最常见的人类病原菌之一。细菌性咽炎由飞沫传染传播。年龄在5岁和15岁之间的儿童和少年是最常见受这种感染影响的组，但是老年人在拥挤的人类条件下也存在感染风险（Bisno 1995）。在美国，化脓性链球菌感染的数目据估计每年在一千万例（Kilian 2002）。在美国，相关的成本据估计接近每年10亿美元（Reid等人,2001）。在德国，急性链球菌性咽炎病例数目估计每年在100万至150万。仅一部分的感染具有临床表现过程，即，传播的病原体的储存较大。

化脓性链球菌（A群链球菌，也称作GAS）是属于形成长链的革兰氏阳性球菌的人类病原体。如同许多其他的病原体，链球菌也具有表达多种毒力因 子的能力。化脓性链球菌发病过程中的第一步骤是细菌粘附到宿主细胞的表面。根据一个普遍认可的模型，粘附以两个阶段发生：第一阶段由与人细胞表面的微弱的相对非特异性的相互作用组成，其直接导致高亲和力的组织特异性相互作用（Hasty等人,1992；Courtney等人,1999；Cunningham2000）。早在1976年，Beachey等人能够鉴定脂磷壁酸（LTA）作为细菌水平上介导初始粘附的分子。在上皮水平，已经鉴定纤维粘连蛋白作为LTA的受体（Simpson和Beachey,1983）。对于粘附的第二阶段，因为赋予与上皮细胞结合，已经鉴定了细菌表面上的至少11种其他结构。因化脓性链球菌所致的发病的第二步骤是细菌侵入上皮宿主细胞（La Penta等人,1994）。La Penta及同事已经显示GAS可以感染人上皮细胞，其频率有时高于传统的细胞内的人类病原体如沙门氏菌属（Salmonella）或李斯特菌属（Listeria）的频率。

宿主细胞内的病原菌具有高的复制潜力，这可以导致急性感染。以休眠状态存活可以导致粘膜和上皮的细菌性感染再次发生，这可以解释口咽粘膜的反复感染。尤其咽峡炎是一种儿童中十分普遍的由GAS引起的反复感染。

化脓性链球菌是许多急性疾病，如咽炎、猩红热、脓疱病、蜂窝织炎的病原。侵入性产毒性感染，如坏死性筋膜炎、肌炎和链球菌引起的中毒性休克综合征以及免疫介导的后遗症（如风湿热和肾小球肾炎）的发展均由化脓性链球菌引起。

据估计总体上5%和15%之间的人群是这种细菌的携带者（通常在他们的喉中），同时没有任何疾病征兆。作为正常菌群的组分，化脓性链球菌可以在免疫系统削弱时造成感染。化脓性链球菌的组织（例如，呼吸道或皮肤）定植接着与相关症状如喉咙沙哑、喉咙痛和吞咽困难有关的疾病暴发发生。

另外，化脓性链球菌的感染可以导致因感染扩散至下呼吸道（中耳炎、窦炎、肺炎）或扩散入血流及扩散成脑膜炎以及骨（骨髓炎）和关节（关节炎）感染所致的并发症。

定植中的一种要素是细菌粘附于细胞表面和/或粘附于粘膜表面。细菌具有介导与细胞表面结合的庞大的粘附库（例如，M蛋白、纤维粘连蛋白结合蛋白、LTA、胶原蛋白结合蛋）。相互作用，即，与细胞表面结合，在宿主细胞的定植以及在化脓性链球菌的发病中发挥初始作用。

因而，用于预防和治疗的治疗剂的早期使用对减少总GAS微生物计数和有效阻止结合即化脓性链球菌侵入方面十分重要。

在现有技术中已经描述能够减轻咽喉区域中由化脓性链球菌引起的症状的治疗剂。

现有技术

急性疾病的标准治疗是施用抗生素。因为自二十世纪八十年代中期以来青霉素耐药性的发生率增加，连同其他原因，这种疾病在最近数十年已经再次在工业国家上升（Kaplan 1991；Musser和Krause 1998）。不存在预防，因为迄今没有开发出有用的疫苗。这归因于所用的主要抗原-来自细菌细胞壁的M蛋白的多样性和其他候选抗原与人类蛋白的免疫交叉反应性。

总体上已经显示，尽管用可能具有严重副作用的抗生素（通常青霉素或红霉素）治疗，然而无论如何，感染在大部分患者中平息。

市场上目前可用的制剂基本上包括糖菱形片、片剂、咽喉洗剂和咽喉喷雾剂，在一些情况下，混合有使咽喉区域的症状缓解的局部麻醉药（利多卡因、苯佐卡因），但是这些制剂不灭活化脓性链球菌。

通常使用乳酸菌作为益生细菌以保护病原体引起的胃肠道疾病，因为除乳酸之外，它们经常还产生抗菌物质。乳酸杆菌（乳酸菌）是能够将糖代谢成乳酸（乳酸发酵）的革兰氏阳性厌氧至耐氧细菌。这些包括乳杆菌科（Lactobacillaceae）、气球菌科（Aerococcaceae）、肉杆菌科（Carnobacteriaceae）、肠球菌科（Enterococcaceae）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）和链球菌科（Streptococcaceae）。这些乳酸杆菌被视为非致病的并且通常用作益生细菌以改善胃肠道菌群和用于胃肠道症状的治疗。乳酸杆菌尤其对食品工业重要，在“功能性食品”领域它们发挥重要作用。在过去，两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）种划归为乳酸杆菌（双歧乳杆菌（Lactobacillus bifidum），但是根据如今的理解，这个物种在系统进化上与该目并不密切相关。然而，就代谢而言，仍将它视为乳酸菌。乳酸菌在食品工业中也极端重要，因为它们用来产生乳产品，但是它们也可能作为有害物出现（例如，在啤酒酿造厂中）。将乳酸菌划归为非致病性。

在现有技术中已经描述益生细菌对于多种应用的用途。例如，WO 2010/130563公开了益生细菌用于餐具洗涤剂的用途，因而减少手工餐具洗涤对皮肤的不利后果。另外，这些细菌对皮肤具有保护作用。

这类微生物在美容性皮肤治疗药中的用途已经是已知的。例如，US 6,790,434描述了这类微生物在美容性皮肤治疗药中与植物胞外基质的提取物组合来抵抗由UV辐射造成的皮肤损伤的用途。然而，其中没有公开这些微生物在洗涤剂和清洁剂中的用途。

此外，某些芽孢杆菌（Bacillus）种在卫生清洁剂中的用途也是已知的。因此，WO97/25865描述了芽孢杆菌种在用于卫生目的的清洁剂中的用途，据称它们防止病原体的繁殖并能够降解有机污垢。公开的用途经常涉及孢子形式的灭活细菌。孢子由底物再活化并且因遗传缺陷而不应当繁殖。然而，其中的缺点在于不能彻底排除细菌的繁殖和/或突变，因此仍存在细菌也可能以失控方式繁殖的残余风险。

同时，益生细菌口服剂型已经在WO 2005/117921中公开，其中该剂型含有至少一个属的益生菌微生物，其中剂型和/或细菌设有纤维素醚的包衣。

体外实验已经显示一些乳杆菌属（Lactobacillus）菌株能够阻止GAS与人细胞系结合。乳杆菌属菌株与GAS竞争细胞的表面结构并且因此阻止GAS侵入宿主细胞。化脓性链球菌与宿主细胞的粘附是发病中的第一步骤，并且进入宿主细胞的侵入过程以非常短暂的顺序发生，因此该方法被视为不利于治疗GAS感染。与细胞表面发生结合之前，浮游性化脓性链球菌细胞的共凝集在此将是有利的并且可以诱导免疫反应。

本发明的目的是提供一种用于治疗和预防由化脓性链球菌所致的感染的药剂或组合物，所述药剂或组合物不具有现有技术的不足或缺点。

发明简述

本发明的目的由独立权利要求实现。有利的实施方案源自从属权利要求。

在第一方面，本发明涉及一种乳酸菌目的微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合，其中所述微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或其组合可以与至少一种致病微生物共凝集，其中该致病微生物是化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）。完全令人惊讶的是与化脓性链球结合的微生物是可以获得，这种微生物是乳酸菌。在一个特别优选的实施方案中，该微生物或其 类似物、片段、衍生物、突变体或组合属于乳杆菌属。

同样完全令人惊讶的是在优选实施方案中，该优选实施方案采用微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合，对致病微生物的共凝集能力甚至在生物学、化学或物理处理后存在。对致病微生物的共凝集能力甚至在大约3和大约8之间的pH存在。该微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合优选具有抑制致病微生物的生物被膜形成的能力。微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合还优选具有阻止化脓性链球菌与纤维粘连蛋白结合的能力。在一个优选实施方案中，微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合不具有与皮肤或粘膜的共生微生物共凝集的能力。

这种微生物优选地选自乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、詹氏乳杆菌（Lactobacillus jensenii）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、食淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylovorus）、德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）、戈氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）、约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）、食果糖乳杆菌（Lactobacillus fructivorans）、希氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）、绿色乳杆菌（Lactobacillus viridescens）、两歧双歧杆菌、乳杆菌属L.ingluviei（Lactobacillus ingluviei）或其类似物、衍生物、片段或突变体。

有利地，微生物选自以下已经保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心，编号DSM25972、DSM 25987、DSM 25988、DSM 25989和DSM 25973的微生物。

在另一个方面，本发明涉及包含至少一种微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合的组合物。该组合物可以优选地包含可药用或可化妆品用的载体或赋形剂。组合物优选以固体、液体、粘稠形式或作为气溶胶存在。该组 合物优选地为糊状物、软胶囊、硬胶囊、粉末、颗粒、小丸、圆颗粒、泡腾片剂、锭剂、口含片、咀嚼片剂、舌下片剂、溶液剂、酊剂、乳液、果汁、浓缩物、糖浆、喷雾、饮用安瓿、凝胶、漱口水、牙粉、口香糖、片剂、包衣丸剂或夹心糖的形式。

该组合物可以有利地包含益生菌、防腐剂或其他活性抗菌物质和/或可以优选地还含有选自以下物质的一种或多种：抗氧化剂、维生素、辅酶、脂肪酸、氨基酸和辅因子

在本发明的一个优选实施方案中，该组合物是药物组合物、兽用组合物或化妆品组合物或食品补充物或食品补充物组合物。该组合物优选地含有一种或多种增稠剂、一种或多种甜味剂和/或一种或多种人工甜味剂，其中增稠剂优选地选自纤维素醚、多糖，所述多糖选自包括黄原胶、明胶、高度分散的二氧化硅、淀粉、海藻酸盐、黄芪胶、琼脂、阿拉伯树胶、果胶和聚乙烯酯的组，并且甜味剂选自包括葡萄糖、果糖、蔗糖和葡萄糖糖浆、山梨醇、甘露醇、木糖醇和麦芽糖醇、糖精、甜蜜素钠、乙酰磺胺酸钾和/或阿斯巴甜的组。

在本发明的意义下，优选的药物产品包括鼻淋洗液、漱口水和牙科淋洗液：漱口溶液、鼻喷雾剂、口用喷雾剂、咽喉喷雾剂、滴鼻剂、滴剂、酊剂、用于咳嗽、喉咙痛、感冒或口、咽喉或颈区域内感染的果汁或糖浆剂、润喉片、夹心糖、咀嚼夹心糖、包衣丸剂和用于咽喉症状或喉咙痛的菱形片以及气溶胶。

在本发明的意义下，优选的医疗产品包括鼻淋洗液、漱口水和牙科淋洗液：漱口溶液、鼻喷雾剂、口用喷雾剂、喉喷雾剂、滴鼻剂、滴剂、酊剂、用于咳嗽、喉咙痛、感冒或口、颈或咽喉区域内感染的果汁或糖浆剂、润喉片、夹心糖、咀嚼夹心糖、包衣丸剂和用于咽喉症状或喉咙痛的菱形片以及气溶胶。

在本发明的意义下，优选的化妆产品包括牙膏、洗剂、震荡合剂、粉末、鼻洗液、漱口水和牙科洗液、含漱溶液、鼻喷雾剂、口用喷雾剂、咽喉喷雾剂、口香糖、水凝胶、涂敷至皮肤表面的乳霜、乳剂（cresa）、软膏、基于脂肪的软膏或糊状物。

在本发明的意义下，优选的食品和营养补充剂包括泡腾片剂、维生素片、矿物质片、微量元素片、饮料粉、饮料、果汁、乳饮料、酸奶、矿泉水、未加气的水、夹心糖、咀嚼夹心糖、口香糖、果汁或糖浆、润喉片、包衣丸剂和菱 形片以及气溶胶。另外，组合物也可以含有增洁剂、酶、电解质、pH调节剂、增稠剂、去污剂、荧光增白剂、灰暗抑制剂、染料转移抑制剂、泡沫调节剂和/或着色剂。

在组合物中微生物可以有利地以活的或死的形式存在。此外，可以优选的是，微生物以封装、喷雾干燥和/或冻干的形式存在，并且也可以优选的是，微生物以细胞裂解物的形式存在。此外，优选的是，微生物在组合物中按重量计以0.001重量%至20重量%，优选地0.005重量%至10重量%、特别优选地0.01重量%至5重量%的量存在。

在另一个方面，本发明涉及一种用于鉴定和/或选择具有共凝集化脓性链球菌的特性的乳酸菌的方法，其中所述方法至少包括以下步骤：

a.孵育所述致病微生物以形成生物被膜，

b.添加待测试的乳酸菌并孵育它以形成混合物，以便在致病微生物和待测试的乳酸菌之间形成共凝集，

c.通过去除上清液分离未结合的乳酸菌，并且

d.测定对于共凝集的乳酸菌的生物被膜。

另外，该方法可以另外包括以下方法步骤：

研究因致病微生物所致的生物被膜抑制，其中在孵育形成生物被膜的致病微生物期间添加待研究的乳酸菌，和/或优选地

通过测量与未添加待测试的乳酸菌的对照相比的光密度，对在移除未结合的细胞后的生物被膜形成进行定量。

此外，本发明涉及该组合物用于制造用于处理、预防和/或治疗皮肤、粘膜和口腔的微生物疾病的药品、医疗产品或化妆品的用途。

优选的组合物也可以用于局部预防和/或治疗皮肤、粘膜和口腔的微生物疾病或炎性疾病。优选的组合物用于预防和/或治疗口腔的微生物疾病并且还包含一种或多种调味物质。此外，优选的是该组合物用于局部预防和/或治疗微生物疾病或炎性疾病，优选地口腔的微生物疾病或炎性疾病，其中该组合物以咀嚼丸块、口香糖、夹心糖、菱形片、牙膏或漱口水的形式使用。

可以有利的是，一种或多种抗炎或抗微生物物质用于组合物中。此外，可以优选的是，该组合物与溶剂、载体、赋形剂、填充剂、调味物质、香味物质 和/或添加剂组合使用。在一个优选实施方案中，组合物可以用来制备用于处理表面的清洁剂或消毒剂。也优选的是组合物用于制造在医疗产品和/或预防领域使用的产品。如果该组合物用来制备用于口服、舌下、口含摄入的药物，则这是优选的。

在一个优选实施方案中，该组合物可以用来制造用于局部治疗口咽间隙中的炎症和上呼吸道及皮肤的感染的抗微生物添加剂。如果该组合物口服、舌下、口含给药，则它可以是优选的。

另外，本发明涉及用于卫生处理的套装，所述套装包含用于生理卫生装置或器具、淋洗液和/或糊状物的优选微生物或优选组合物。该套装可以用于治疗口或咽喉区域内的细菌性感染，其中这些感染尤其由化脓性链球菌引起或这个物种至少参与所述感染。

本发明优选地涉及，尤其涉及新的乳酸菌、其类似物、突变体、衍生物或其片段以及含有它们的组合物在婴儿、学步儿童、儿童、健康人、老年人、免疫抑制人群、单次发生或反复发生化脓性链球菌感染的人和/或咽喉和扁桃体细菌性感染（咽炎）的人中用于治疗或预防。本发明也可以令人惊讶地用于动物。

因此，优选的是使用该组合物制备药品，所述药品有益于治疗或预防喉症状、喉咙痛、咽喉红肿以及咽喉和扁桃体的化脓性和非化脓性炎症，其中给予乳酸菌是满足需要的。优选的组合物可以被治愈地或预防地使用，例如，作为益生菌。

优选的微生物，即属于乳酸菌属的微生物或其类似物、衍生物、突变体或片段尤其具有与化脓性链球菌特异性结合的共凝集能力。完全令人惊讶的是，优选的乳酸菌不引起共生微生物如唾液链球菌（Streptococcus salivarius）的任何共凝集或结合。唾液链球菌存在于健康人的咽喉区域内的粘膜中并且为健康的微生物平衡做出贡献，因此其聚集在本发明的范围内不是优选的。

换而言之，优选的乳酸菌与病原菌化脓性链球菌特异性共凝集。这种类型的构思无一源自现有技术。现有技术仅描述乳酸菌阻止化脓性链球菌在人细胞系内和/或在其上侵入和复制。然而，粘附是细菌致病机制中必要的第一步骤，从而这个方案不能在没有副作用的情况下使用。与此相反，优选的乳酸菌在浮 游性化脓性链球菌细胞（作为实例如DSM编号ATCC 12344和ATCC 19615的菌株所代表）可以与宿主细胞结合之前与它们特异性共凝集。本发明可以因此视为不同于寻常，因为在现有技术中存在降低化脓性链球菌与上皮细胞结合的趋势。然而，未曾报道致病性细胞可以在口腔中被共凝集，从而与上皮细胞的结合从一开始就不能发生。这也具有以下重要优点：将细胞聚集物随唾液一起或借助漱口水被吞咽并且化脓性链球菌细胞在胃肠道中被灭活。这因此也是一种方便使用者的应用，因为例如吐出漱口水通常被认为令人不快和不方便。对于优选的用途而言，这种类型的行为均不是必要的。

本领域技术人员知道，健康的皮肤和/或粘膜密集地定植有微生物如细菌和真菌，它们被称作共生和/或共有（mutual）。这些微生物构成皮肤表面的天然组分并且尤其统称为皮肤菌群。包括在“固有菌群”中微生物是保护皮肤本身和身体作为整体免受致病微生物伤害的重要前提并且是微生物菌群的部分。在这方面，特别有利的是，优选的乳酸菌不产生皮肤菌群的不平衡，而仅与致病菌化脓性链球菌结合和/或与其共凝集。

尤其，本发明的微生物阻止与纤维粘连蛋白结合并且因此阻止细胞的侵入。鉴于以下事实：优选的乳酸菌与化脓性链球菌共凝集和/或相对于这些细菌具有粘附特性，这尤其导致遮掩以及因此隐藏致病因素，随后使得细菌荷载降低和/或与纤维粘连蛋白和/或咽喉区域内细胞的结合被抑制。

虽然本发明具体涉及乳酸菌群，但是根据本专利申请在教导方面存在一致性。要求保护的微生物具有共同特性或作用。结构或功能共性的总和导致共凝集化脓性链球菌、不结合皮肤和/或粘膜共生微生物和阻止化脓性链球菌与纤维粘连蛋白结合的功能关系。因此这些共同特征不代表任何特征总和，反而构成所提到的要求保护的微生物的共同特征，可以说是，所述共同特征有利地允许和表征用于这种目的的这些微生物的适用性。另外，已经令人惊讶地发现，本发明微生物的出人意料特性，即共凝集化脓性链球菌，在唾液中和在糖存在下都不受抑制。这是尤其有利的，因为给予该微生物和该组合物的优选部位是在口腔中，并且从现有技术中已知共凝集过程通常被高糖浓度抑制。然而，试验已经显示对于本发明的微生物，尤其乳酸菌而言，情况不是这样，因为这些微生物将仍与化脓性链球菌共凝集，甚至在高糖浓度也是如此（例如，发生在 唾液中以及可能的剂型中，诸如泡腾片、维生素片、矿物质片、微量元素片、饮料粉、饮料、果汁、乳饮料、酸奶、夹心糖、咀嚼夹心糖、口香糖、果汁或糖浆、润喉片、包衣丸剂和气溶胶中）。

也令人惊讶的是，优选的微生物也可以在皮肤上使用，在那里它也将与化脓性链球菌共凝集。本领域技术人员清楚，化脓性链球菌也称作致病性创伤生物，因此特别有利的是，优选微生物的共凝集能力不限于口腔，还可以适用于皮肤区域。

本发明因此也涉及微生物，尤其乳酸菌、其类似物、突变体、衍生物或片段以及含有它们的组合物的用途，尤其用于在婴儿、学步儿童、儿童、健康人、老年人、免疫抑制人群、存在病理性皮肤变化（尤其葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征、触染性脓疱病、浅表毛囊炎、脓疱化、皮肤脓肿、疖（疖病）、痈（脓肿）、蜂窝组织炎、皮肤干燥、皮肤发痒、皮肤发红、刺激性皮肤、极度油性皮肤、座疮、糖尿病足、褥疮、神经性皮炎、急性淋巴结炎、藏毛囊肿（包括潜毛性瘘、藏毛窦、尾骨瘘、尾骨囊肿）、其他的皮肤和皮下组织的局部感染（例如，脓皮病、脓性皮炎（purulent dermatitis）、脓毒性皮炎（septic dermatitis）、化脓性皮炎（suppurative dermatitis））的人群中治疗或预防；它们也可以用于治疗多种形式的皮炎和湿疹（例如，异位性湿疹、脂溢性湿疹、尿布疹或皮炎、变应性接触性皮炎、脂溢性皮炎、剥脱性皮炎、中毒性接触性皮炎、慢性单纯性苔藓（chronic lichen simplex）、痒疹、瘙痒症和其他形式的皮炎）；还用于治疗丘疹鳞屑性皮肤疾病（银屑病、副银屑病）、皮肤附属物疾病（例如，伴发瘢痕的脱发，包括脱发性毛囊炎）、以及皮肤和皮下组织的其他疾病（例如，腿部溃疡）、具有先前存在的皮肤损伤（例如，皮肤干燥）的人群、人类中或商品动物及家养宠物的皮肤损伤（例如，包括事故或手术后的疮痂、伤口）。

在本发明的意义下，在优选的实施方案中，将皮肤具体理解为是人类或动物身体的外部器官，所述外部器官起到界定内部与外部的作用。在优选的实施方案中，本发明意义下的皮肤区域包括皮肤顶层组分、真皮或皮下组织。根据本发明，皮肤的顶层（表皮）也由如下层组成：角质层、透明层、粒层（颗粒层）、棘状层（棘层）和/或基底层（基层）。对这个区域内细胞的每种修饰构成本发明意义下的皮肤面积内的细胞修饰。根据本发明，也可以作皮肤区域的 组分的真皮优选地由结缔组织纤维组成并且用于向皮肤提供营养和锚定作用。在边界区域内的毛细血管化血管系统连同表皮也属于本发明意义下的皮肤区域，皮脂腺和汗腺也是如此。本发明意义下的真皮可以再分成乳头层和网状层。此外，本发明意义下的皮肤区域可以是任何区域，即，在皮下组织（皮下层）或在身体内部的组织或任何器官或器官部分中或其上的任何位置。区分器官与其周围结构的组织屏障可以是本发明意义下的皮肤。此外，本发明的皮肤区域概念也可以理解成包括皮肤附属物如毛发、皮脂腺、竖毛肌、指甲、角和汗腺、尤其外分泌汗腺和顶浆分泌汗腺，还有乳腺。任何细胞改变，尤其偏离正常的细胞生长，可以用本发明的药物治疗，优选地，而不限于皮肤外部区域。然而，本发明意义下的皮肤区域也可以包括真皮，如手指或足趾上的真皮，网状皮和与之相关的皮肤附属物。

尤其，优选的组合物可以包含于皂，洗液，粉末，合成清洁剂或合成洗涤剂，泡沫、棒、乳液、喷雾剂、乳霜、凝胶、洗发液、液体皂或除臭剂中。尤其还优选的，该组合物作为益生菌使用，其中可以将所述益生菌添加至洗涤剂、淋洗剂、清洁剂或消毒剂（例如，皂、粉末、糊状物、溶液、乳剂、洗液）、清洁和/或消毒衣物或者毛巾、洗发液、用于皮肤、毛发和/或头皮的淋洗液或应用、乳霜、软膏剂、皮肤清洁露和/或皮肤护理洗液、用于眼、耳、口、鼻部或咽喉内或其上的溶液剂（例如，作为滴剂、喷雾剂、淋洗液）中和/或可以掺入绷带或伤口敷料内以抑制致病微生物的形成，结合它们以将它们作为聚集物除去和/或抑制它们或灭活它们从而降低它们的数目。

完全令人惊讶的是本发明组合物的优点可以通过将它并入前述药用形式中再次改进。本领域技术人员熟悉将本发明组合物导入中载体物质的其他制剂构思，例如，如用于皮肤应用的乳液或其他产品，例如，可以优选含水或无水的液体形式，其中含水形式可以划分成本发明的单相体系和多相体系。此外，可以为无水或含水的半固态形式，其中可以再次将它们划分成单相体系和多相体系，其中含水半固态形式也是可能存在的。也可以优选地使用亲脂或亲水的固态形式。除上文已经提到的那些形式之外，这类形式的例子还包括例如基于脂肪的软膏剂、泡沫剂、粉末、棒、凝胶膏、水分散体凝胶剂、薄（非粘性）乳剂、洗剂、软膏剂、喷雾和乳霜。本领域技术人员在此明白，这类载体物质 可以首先基于皮肤上的感觉区分成丰富/高品质的和清淡的载体物质，并且其次，就粘度而言，可以区分成具有低粘度和具有高粘度的载体物质，其中水凝胶或水乳和/或O/W乳液或W/O乳液具有高粘度。当使用液体应用形式时，如上文解释，它们可以再次划分成含水和无水体系。对于无水体系，非极性体系、无乳化剂的极性体系和含乳化剂的极性体系是特别优选的。对于含水体系，单相体系如溶液和微乳液是优选的；对于多相体系，多相乳液W/O乳液或O/W乳液是优选的。对于固态/液体体系，优选的形式包括悬浮液或液/固/液体系如悬浮液体系/乳液体系。本领域技术人员知晓供应这类载体的各种可能。对于O/W乳液，优选的主要药用物质包括O/W乳化剂、W/O乳化剂、液体亲水成分和液体亲脂成分。对于W/O乳液，优选的主要药用物质包括W/O乳化剂、O/W乳化剂、液体和半固态亲脂成分、凝胶形成剂、液体亲水成分和/或盐。

对于优选的半固态载体物质，对各种应用含水体系和无水体系均是优选的。无水体系可以由极性体系或无乳化剂的非极性体系如脂质体凝胶、油凝胶或聚乙二醇凝胶组成，和/或可以由基于O/W吸收基质或W/O吸收基质的含乳化剂的非极性体系组成。含水体系可以优选地由单相体系诸如水凝胶或微乳凝胶，或多相体系诸如O/W乳霜、W/O乳霜或两性体系组成。优选的半固态制备物是用于在室温和皮肤温度之间的温度范围涂敷至皮肤的可涂抹制备物或涂敷到粘膜的可涂抹制备物，其中它们具有局部用作用，它们运送有效成分或对皮肤具有软化或保护作用。优选的制备物包括更狭义上的软膏、乳霜、凝胶和/或糊状物。除软膏、乳霜、凝胶和糊状物之外，油凝胶也可以作为半固态透明单相体系使用。本领域技术人员从美国专利6,187,323或Aiache等人,2001知道用于配制半固态体系的各种无水混合物，其包括，例如，油凝胶和水凝胶的混合物，根据本发明其可以称作双-凝胶。此外，水分散体凝胶或各种脂类可以用来提供本发明的载体物质。当使用脂类时，有机硅化合物如有机碳化合物可以用来在分散体系中提供脂质相，例如有机碳化合物可以被提供，例如借助不可水解脂类或可水解脂类（甘油）或蜡酯。这类体系的优点包括皮肤柔顺性的改善和弹性的增加以及取决于脂质构成的增加物质释放及其渗透效果的能力。例如，本领域技术人员熟悉他们必须使用哪种脂质以在时间参数内增加或减少渗透。

额外优选的载体物质包括，例如，水分散体凝胶和/或微胶囊、微球粒或微丸（大珠）。提到的载体用于增加稳定性并确保皮肤上最短涂敷时间。优选的半固态单相体系可以借助以下主要药用物质制备：液体亲水成分尤其水和（多元）醇，亲水性凝胶形成物质，成盐物质和W/O乳化剂，O/W乳化剂，液体、半固态和固态亲脂成分以及亲脂性凝胶形成物质和增洁剂。本领域技术人员将知道他们必须怎样组合这些物质以实现某种效果。

本领域技术人员也将知道用于皮肤产品的其他药物制品。根据本专利申请，例如，由Daniels和Knie在JDDG;2007,5:367-383在引文中公开的全部药用化合物。本领域技术人员知道不同药物制品对皮肤具有不同作用并且他们将以不同的量施加草本制剂组合物至皮肤。将JDDG;2007,5:367-383的内容在此并入根据本专利申请教导的公开内容。本发明的优选产品包括，例如，亲脂性或亲水性溶液，亲脂性或亲水性乳液，亲脂性或亲水性悬浮液，专用液体制剂，疏水性或亲水性软膏，水乳化软膏，亲脂性、亲水性或两性乳膏剂，水凝胶，疏水性或亲水性糊状物和/或粉末。

优选的微生物，尤其乳酸菌选自包含以下微生物的组：乳酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、詹氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、食淀粉乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、戈氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、食果糖乳杆菌、希氏乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、绿色乳杆菌、两歧双歧杆菌、乳杆菌属L.ingluviei（Lactobacillus ingluviei）或其类似物、衍生物、片段或突变体；这些微生因彼此的功能关系相关以形成本发明的统一构思，从而它们共有多种特性和/或作用，即它们与致病菌化脓性链球菌特异性地共凝集，且不结合皮肤和/或粘膜的任何共生微生物，还阻止化脓性链球菌与纤维粘连蛋白结合和/或它们破坏与纤维粘连蛋白结合的化脓性链球菌细胞。这些乳酸菌尤其包括选自如下组的微生物或其类似物、片段、衍生物、突变体或组合，所述组包括保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心编号DSM 25972、DSM 25987、DSM 25988、DSM 25989和DSM 25973。完全令人惊讶的可能鉴定到具有相同有利特性的乳酸菌群。还未描述过任何综合全部这些特性同时还是非致病性的并且不对皮肤天然菌群造成任何损伤或影响的细菌，尤其乳酸 菌。也已经发现，应用优选的乳酸菌，无论是作为组合物还是以其他方式，均阻止化脓性链球菌结合和侵入宿主细胞。这种情况的原因是迄今未知的，但是应当由额外的实验确定。

优选的微生物，尤其乳酸菌的另一个令人惊讶的优点是它们也可以预防性地使用。这意味可以预防性给予乳酸菌和/或含有它们的组合物（优选地以锭剂或夹心糖形式），因而不损害口腔和咽喉的粘膜或固有菌群。

在本发明的意义下，在优选的实施方案中，将皮肤和/或粘膜优选地理解为特指人类或动物身体的外部器官，所述外部器官用来界定内部与外部。在优选的实施方案中，本发明意义下的皮肤区域包括粘膜部分。

在皮肤和粘膜上的乳酸菌可耐受性是成功治疗咽喉区域中涉及链球菌群微生物的细菌性炎症、感染、疾病或症状的前提之一。尤其，优选的组合物应当作为益生菌以锭剂、夹心糖或包衣丸剂、果汁或糖浆、淋洗液、喷雾剂或气溶胶的形式导入以抑制主要致病性微生物的形成和其与宿主细胞结合来结合这些病原体以将它们作为聚集物去除和/或抑制和/或灭活它们从而降低它们的数目。

本发明的组合物优选地作为夹心糖、锭剂或包衣丸剂使用。首先，作为夹心糖，锭剂或包衣丸剂的剂型允许配方在大多数情况下具有愉快味道（包括添加糖、糖替代品、调味品）以及在患者和顾客当中赢得巨大接受性。其次，在吮吸锭剂时也分泌的唾液润湿粘膜，从而当存在喉咙痛或扁桃体的症状时体验到一些缓解。当吸吮夹心糖、锭剂或包衣丸剂时，本发明的组合物在一段延长的时间范围内缓慢释放，并且对于该应用方面而言，这是有利的。另外，在技术上非常容易实施将本发明的组合物掺入用于夹心糖、锭剂或包衣丸剂的组合物。在这个方面，完全令人惊讶的是可能获得这样的微生物，所述微生物不仅在体温具有活性，在70°至90℃的热处理时也存活，以这种方式甚至在处理后它们仍将具有优选的能力，尤其与化脓性链球菌共凝集的能力。这是特别有利的，因为在制备夹心糖时经常达到70℃温度，以致对于以夹心糖形式使用该微生物或组合物而言是有利的，因为甚至在制备夹心糖后该微生物仍具有共凝集能力。这种类型的构思均不从现有技术得知。因此优选的微生物具有使它们与已知微生物明确区分的能力。此外，令人惊讶的是具有含所述微生物的组 合物的夹心糖将在口中更缓慢地溶解，因此该夹心糖将取得更好和更长的效果。对于发明人而言，这是完全令人惊讶的。另外，实验已经显示，尤其通过微生物的缓慢释放，口腔中的基本上所有的化脓性链球菌细胞可以被共凝集。

本领域技术人员知道什么将属于术语“体温”并且怎样可以测定它。在此体温基本上涉及人和动物。本领域技术人员也熟悉术语“夹心糖”并且也知道在哪种标准文献中查找用于制备夹心糖的成分或方法。本发明不限于简单夹心糖，相反本发明可以基本上与本领域技术人员熟悉的全部夹心糖组合。对本领域技术人员而言，夹心糖和它们的制备在相应的可自由获取的技术文献中公开，例如，在Candy Ind.27,161（1996）；H.Hoffmann,W.Mauch,W.Untze,Sugar and Sugar Products,第2版,Behr′s:Hamburg（2002）；R.Lees,B.Jackson,Sugar Confectionery and Chocolate Manufacture,Leonard Hill Books:Plymouth（1999）；Federal Association of the German Confectionery Industry（BDSI）,编辑Confectioner′s Handbook,Molberg,Bonn（2001）；Handbook for the FoodChemist,Food Leader,Thieme,Stuttgart（1995）中公开。

夹心糖可以优选为多种形状、味道取向、质地和颜色。它们通常是很小的片。夹心糖可以是实心或填充的、圆形、椭圆、长方体或立方体形状。取决于残留水含量，它们是坚硬（硬饴糖）或是柔软和咀嚼的（软饴糖）。根据添加剂，特别在润喉糖和咳嗽糖、水果味饴糖和提神夹心糖之间作出区分。夹心糖的作用和味道可以由使用草药提取物、精油（例如，桉树油）和有效成分如薄荷醇所决定。在水果味夹心糖的情况下，调味物质和酸组分可以产生独特味觉。也可以添加天然果实和植物提取物或食品染料以赋予夹心糖颜色。饴糖夹心糖尤其由乳产品如炼乳、黄油和奶油制备。通过调味和添加各种添加剂，如坚果、扁桃、蜂蜜、可可、椰子等的味道变体是可能的。另外，咀嚼夹心糖，切割、压花、模铸或叠层的夹心糖是优选的。有利的夹心糖可以具备多种成分，例如，维生素、氨基酸、油、草本植物、脂肪、各种糖类或糖替代物、增味剂和/或乳化剂。硬质夹心糖尤其含有蔗糖和葡萄糖，优选地通过使用赋予气味的物质和赋予味道的物质、着色物质和影响夹心糖特性的物质制备。因为1-3%的低的残留水含量，硬饴糖具有坚硬和通常光滑的质地。硬饴糖也可以通过使用甜味剂和糖替代品在无糖情况下制备。

软饴糖尤其指一组夹心糖产品，与硬饴糖相反它们具有咀嚼质地，并且具有6-10%的含水量，通过分批或连续烹调，由主要成分制备，所述主要成分是蔗糖、其他类型的糖、甜味剂和/或糖醇以及葡萄糖糖浆，优选地还含有脂肪、乳成分、增稠剂、乳化剂、赋予风味和味道的物质作为添加剂。在具有填料或不具有填料的情况下，它们也可以被制成多种形状和颜色。

此外，已经证明，如果夹心糖具有多腔体系，从而维生素或其他辅因子存在于一个腔中，优选的微生物或组合物存在于其他的一个或多个腔中，则是有利的。通过这种腔体系，可以确保微生物在最佳时间点并且任选地以不同的剂量释放。维生素或其他辅因子也可以促进微生物的活性。例如，已经令人惊讶地发现蔓越橘具有防止生物被膜形成的作用，因此它们是优选的微生物的最佳补充物。试验已经显示如果还存在蔓越橘成分或溶液，则化脓性链球菌的共凝集效率增加50%。

实验已经显示，优选的乳酸菌，尤其乳杆菌细胞，与化脓性链球菌细胞接触而形成共凝集物。通过形成共凝集物，尤其阻止化脓性链球菌增殖并侵袭咽喉区域的细胞。化脓性链球细胞，尤其它们的细胞表面，被乳酸菌尤其乳杆菌细胞遮掩，从而优选地化脓性链球菌细胞不再能够与皮肤和粘膜的上皮细胞结合。通过阻碍化脓性链球菌与皮肤和粘膜的上皮细胞结合阻止炎症反应。完全令人惊讶的是，这是可能的，即在极早期提供与化脓性链球菌共凝集的微生物，因此将从开始就阻止化脓性链球菌与上皮细胞结合。这是完全令人惊讶的并且是现有技术中未知的。因此优选的微生物已经可以化脓性链球菌在口腔中共凝集。另外，完全令人惊讶的是，优选的微生物不受唾液中存在的酶或其他因子的抑制，即，它们的化脓性链球菌共凝集能力不被抑制。

此外，天然唾液含有抗微生物物质，诸如溶菌酶，其充当细菌防御者并且尤其可以直接攻击革兰氏阳性细菌的细胞壁。然而，优选的微生物的特征在于，尽管存在天然唾液以及尽管其中含有的抗微生物物质，优选的微生物仍能够特异性共凝集化脓性链球菌。这是完全令人惊讶的并且是胜过现有技术的巨大优点。

在本发明的意义下，益生微生物包括对人类身体和/或动物身体具有有利影响的细胞。优选的组合物作为益生菌成分使用并含有对人类和/或动物身体 具有有利影响的乳酸菌。有利影响尤其可以在于降低由化脓性链球菌造成的颈及咽喉区域的微生物负载。具体而言，固有菌群中不想要的微生物诸如化脓性链球菌可以通过不想要的微生物与益生菌微生物之间间接的相互作用而被抑制，尤其通过基于益生微生物的表达产物抑制不想要的微生物的代谢的间接相互作用而被抑制。试验已经显示，在与优选的乳酸菌共凝集后，致病性化脓性链球菌微生物不再显示出任何生长，即，不存在进一步的细胞群增殖，尤其相反细胞被遮掩和/或灭活。

本发明的另一个方面涉及本文所述的乳酸菌的类似物、突变体、衍生物或类似物或片段，尤其通过生物学、化学或物理处理所述乳酸菌而产生的，并且令人惊讶地甚至在处理后它们表现出有利的特性。该乳酸菌有利地选自乳酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、詹氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、食淀粉乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、戈氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、食果糖乳杆菌、希氏乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、绿色乳杆菌、两歧双歧杆菌、乳杆菌属L.ingluviei（Lactobacillus ingluviei），优选地它们选自以下保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心的微生物编号为DSM 25972、DSM 25987、DSM25988、DSM 25989、DSM 25973。

另外，令人惊讶的是，甚至在物理、化学或生物灭活后，乳酸菌、其片段、衍生物、突变体、类似物或组合仍将具有有利的特性。例如，优选的菌株，即DSM 25972、DSM 25987、DSM25988、DSM 25989和DSM 25973导致病原体的共凝集，阻止与纤维粘连蛋白结合并且还不显示与共生微生物的任何结合，甚至在70℃热处理20分钟或用超声处理后也是如此。因此，在优选的组合物实施方案中，有利地乳酸菌、片段、衍生物、突变体、类似物或其组合可以还以灭活的方式存在。以这种方式，组合物的稳定性和使用性可以大幅度延长。另外，组合物在其他不允许使用活的微生物的应用领域中使用，该组合物通过生物学、化学或物理灭活方法尤其通过热灭活或冻干而制备，借以甚至在灭活或喷雾干燥后，该类似物或片段仍具有特异性结合致病微生物的能力，所述微生物选自化脓性链球菌群。完全令人惊讶的是，乳酸菌以活的或非活的（死的）形式存在于组合物中并且仍特异性结合致病微生物和/或与其共凝集。

另外，本发明也涉及含有本发明的微生物或其类似物、片段、衍生物的组合物，所述组合物具有特异性结合上文所述的致病微生物的能力并且尤其作为食品、食品添加剂、动物饲料或饮料使用。优选的组合物含有本发明的乳酸菌或其类似物、片段、突变体或衍生物，本发明的乳酸菌或其类似物、片段、突变体或衍生物具有特异性结合和/或共凝集来自化脓性链球群的至少一种致病微生物的能力，借以所述组合物用于治疗或预防感冒。

优选的本发明微生物由乳酸菌属代表，即，通过发酵葡萄糖产生乳酸的革兰氏阳性细菌。本发明的微生物在一方面其特征为：它们具有特异性结合能力，即共凝集选自化脓性链球菌群的至少一种致病微生物的能力。这种结合导致形成本发明的微生物和被特异性结合的致病微生物的凝集物。归因于凝集物的形成，后者，即，致病微生物可以物理上地移除，例如通过将它们在靶向且简易的方法中将它们冲洗掉，这在采用过去已知的方法时是不可能的。

在本发明意义下以及通常在微生物学和卫生学，尤其人类微生物学和生理卫生学领域，术语“特异性结合”或“共凝集”被理解为遗传上属于不同细胞类型的细胞相互识别和粘附。在本发明的意义下，将共凝集尤其理解为粘附、相互作用、结合、特异性结合、亲和或相互作用，并且尤其以优选的微生物与化脓性链球菌形成团聚体的能力为特征。在它们的细胞表面上，在此细菌表达用于粘附于其他细胞类型的受体和结构，所述受体和结构用于细胞之间的粘附。这种粘附在致病微生物以及共生微生物的定植中发挥优异作用，从而在这种粘附作用中的介入可能导致深远的结果。归因于事实：本发明的微生物具有特异性结合，尤其共凝集，来自化脓性链球菌群的至少一种微生物，从而形成本发明的微生物和致病微生物的凝集物的能力。所产生的共凝集物可以轻易被去除，例如，通过淋洗表面、皮肤、组织和/或其他一些定植或储存的部位，从而明确地降低致病微生物的数目。此外，通过遮掩致病微生物的表面结构防止和/或减少对表面、皮肤、组织和/或其他定植或储存部位的初始/或重新粘附。如果细胞彼此结合并形成凝集物，则这个过程特别称作凝集。如果仅一个细胞种类参与这种凝集物形成，则这称作自凝集或自我凝集。如果至少两种不同细胞种类参与凝集物的形成，这种过程特别称作共凝集。

在本发明的意义下，“特异性结合少一种致病微生物”尤其理解成指本发明 的微生物特异性结合来自化脓性链球菌群的至少一种细菌的特性。

根据本发明微生物的一个优选实施方案，它们还具有如下特征，与至少一种致病微生物特异性结合的能力甚至在生物学、化学或物理处理后（例如，在最低70℃热处理）仍存在。换而言之，优选的乳酸菌可以优选地以灭活形式在优选的组合物中存在，因为与病原菌，尤其化脓性链球菌，特异性相互作用或结合的能力不受影响并且因此结合或相互作用可以建立。

上文提到的热处理和/或“热处理抗性”或“热稳定性”被理解为指甚至在70℃或更高的升高温度持续至少30分钟的某个长度的时间后，细菌仍能够与选自化脓性链球菌群的至少一种致病微生物形成特异性结合的特性。死的或灭活的乳酸菌细胞可能是特别有利的，因为这种乳酸菌细胞不能触发任何代谢活性。在本发明的意义下，“死的”或“灭活的”形式尤其具有如下特征，这些形式的本发明的微生物不再能够分裂，例如，它们不能被活细胞染料染色，没有代谢上的活性并且不显示任何DNA复制或蛋白质生物例如代谢产物的合成或分泌。

除了上文描述的特性，根据乳酸菌的另一个优选的特性，即特异性结合选自化脓性链球菌群的至少一种致病微生物的能力之外，本发明的微生物也可以具有热稳定性的特征，并且它们可以在高温优选地至少大约60℃、更优选地至少65℃和甚至更优选地至少70℃，持续至少20分钟、优选地25分钟和更优选地至少大约30分钟的处理下存活，并且与前述致病微生物特异性结合的共凝集能力保持不变。

在优选的组合物的实施方案中，优选的是，乳酸菌是活的或灭活的，或是部分和片段，例如，酶促或机械裂解产物（例如，弗氏压碎器等）或这些细菌的代谢产物，因为它们仍具有共凝集能力和/或阻止与纤维粘连蛋白结合的能力。还优选的是，乳酸菌以封装、喷雾干燥和/或冻干形式使用，即以封装、喷雾干燥或冻干形式存在于优选的组合物中。另外，如果乳酸菌以消化后的细胞的形式使用，则这可以是有利的。

另外，如果本发明的乳酸菌特异性结合致病微生物的能力甚至在pH值大约3-8下还持续存在，则这是优选的。这意味乳酸菌可以处在pH3-8的介质中并且仍具有结合化脓性链球菌的能力。优选的乳酸菌可以有利地在宽pH范围 内使用和/或它们在优选的范围内具有优选的特性。因此优选的乳酸菌可以在身体的不同区域内广泛使用。本发明的乳酸菌已经令人惊讶地显示尤其在约25℃-42℃的宽温度范围内与化脓性链球菌共凝集的特性。本领域技术人员因此将明白，在本文以及在本发明中给出的由此类术语“约”或“大约”表征的范围描述中，精确的数值范围不需要用如“约”或“大约/大约”的表述表示，而即使所示数值向上或向下的微小偏移仍处于本发明的范围内。本发明的乳酸菌与所列的致病微生物结合优选地导致抑制该致病微生物的生长。

令人惊讶的是，通过致病微生物和本发明的乳酸菌的结合而形成凝集物，其中所述凝集物可以优选地尤其以300g的离心力被离心10秒并且随后作为沉积物存在，尤其优选地在室温不搅拌的情况下孵育10分钟之后。

根据另一个优选实施方案，本发明乳酸菌不具有与皮肤上共生性口咽菌群（如唾液链球菌）结合的能力，其中唾液链球菌尤其是非常不起眼的皮肤菌群的共生生物。在皮肤内或表面存在的各种微生物的相互作用中，化脓性链球菌种存在于许多哺乳动物的健康皮肤菌群中并且与其处于微生物平衡中–至少在健康皮肤上如此。在本发明的范围内，由于凝集而对这种细菌的影响以及因此对可能在存在于生理卫生中用于靶向目的其他微生物的影响是不优选的。

在一个优选实施方案中，本发明涉及乳酸菌、其类似物、片段或衍生物，借以在优选的实施方案中，乳酸菌包括优选地具有至少一个以下特征的类似物、片段、突变体、衍生物或其组合：a）热稳定性或生物学、化学和/或物理处理后的稳定性，或b）抑制化脓性链球菌粘附宿主细的能力。完全令人惊讶的是，本发明的乳酸菌甚至在生物学和/或化学和/或物理处理后仍能够特异性地结合化脓性链球菌。

本发明的乳酸菌的另一个特性是抑制化脓性链球菌与宿主细胞结合的能力，从而已经以浮游形式存在的这些细胞被特异性共凝集并且随后作为凝集物洗去。这些病原菌可以因这种共凝集而不再定植并侵入生物表面，并且因此它们也不能引起任何疾病。

因此，在本发明的意义下，短语“抑制化脓性链球菌与宿主细胞（或口咽细胞）结合”将被理解为尤其指本发明的乳酸菌与化脓性链球菌相互作用，即与它们结合或相反影响它们以致它们不再可以与口咽细胞结合。

根据一个优选的实施方案，因此本发明的微生物可以具有至少一个所述特性，即生物学、化学和/或物理处理抗性、耐热性、与化脓性链球菌特异性结合、共凝集的能力。优选的特性的组合包括，例如两种或三种特性，即例如，生物学、化学和/或物理处理的抗性；耐热性和与化脓性链球菌结合或者抗生物学、化学和/或物理处理；耐热性和对化脓性链球菌与口咽细胞结合的抑制。

在本发明的情况下，如已经陈述，表述“属于乳酸菌属的微生物”也被理解成包括其衍生物、突变体、类似物或其片段，它们仍具有本发明所述的微生物的特征和/或特点或特性。本发明的乳酸菌优选地是细菌物种：副干酪乳杆菌种副干酪亚种（Lactobacillusparacasei subspecies paracasei）、植物乳杆菌、卷曲乳杆菌和乳杆菌属L.ingluviei（Lactobacillus ingluviei）。

因此，属于乳酸菌属的前述微生物的“突变体或衍生物”，尤其作为本专利申请的部分，保藏于DSMZ保藏中心的乳酸杆菌菌种的突变体或衍生物，具有与本发明情况下针对本发明的乳酸菌，尤其与保藏于DSMZ的菌株相同的菌株所要求保护的特征相同的特征；这至少指与选自化脓性链球菌群的至少一种致病微生物特异性结合、共凝集的能力。此外，优选地具有至少一个以下特征：（i）抗生物、化学和/或物理处理的特异性结合能力，尤其抗高于70℃持续至少30分钟的热处理的特异性结合能力；（ii）不与唾液链球菌结合；（iii）与化脓性链球菌特异性结合的能力；（iv）抑制化脓性链球菌与口咽细胞结合的能力；（v）在pH3-8下存在特异性结合；（vi）在天然唾液中特异性结合的能力。这类优选的衍生物可以例如通过基因工程制备。本发明意义下的术语“通过基因工程制备”尤其包括本领域技术人员熟悉的遗传工程领域用于体外和体内修饰核酸的全部方法，从而可以通过重组DNA技术引入基因修饰并且基因可以被修饰。

因此，本发明尤其也包括本发明的乳酸菌的片段，所述片段仍具有本发明的乳酸菌的特性。本发明意义下的“片段”尤其是本发明的微生物的细胞组分，优选地是细胞膜的部分。本领域技术人员充分熟悉现有技术中获得细胞膜碎片的方法。

本发明的微生物优选地为分离或纯化的形式，其中术语“分离”尤其意指乳酸菌源自它们的培养基-例如，包括它们的天然培养基。术语“纯化”不限于绝 对纯度。

优选，除了活的形式的本发明微生物之外，灭活的形式的本发明的微生物也包括在本发明的范围内部。用于灭活的适合方法（例如，生物学、化学或物理灭活方法）是本领域技术人员充分熟悉的。然而，在本发明的情况下，微生物也可以以冻干的形式使用。在液体或固体培养基中适宜培养后，可以使得冻干的细胞再次生长。这是完全令人惊讶的并且涉及新颖和创新性的定位。现有技术包括，例如，用于清洁含有孢子的表面的溶液，其中当孢子与相应底物接触时，细菌再活化。对于优选的微生物和组合物而言，这种类型的行为均不是必要的。优选的微生物也是有活性的，即，它们与化脓性链球菌共凝集并且也具有如上文所述的其他特性，但是它们不再具有任何代谢活性并且被微生物学领域的技术人员称作“死的”。因此，微生物不再能够生长、分裂、繁殖或分泌代谢产物，而它们的使用范围大大地扩展。

在本发明的情况下，术语“灭活”或“死形式”和“衍生物”或“类似物”或“突变体”也包括本发明的微生物的裂解物、级分或提取物，其中这些裂解物、级分或提取物优选地具有乳酸菌的特性，其中“裂解物”以及术语“提取物”尤其指在本发明微生物的细胞的含水介质中的溶液或悬浮液并且包含例如，大分子，诸如DNA、RNA、蛋白质、肽、脂类、糖等以及细胞残片。裂解物优选地也包括细胞壁或细胞壁组分。制备裂解物的方法是本领域技术人员充分熟知的并且包括例如使用“弗氏压碎器”或酶促裂解、带有玻璃珠或铁珠的球磨机。细胞可以由酶促、物理或化学方法破开。酶促细胞裂解的例子可以包括单种酶以及酶混合物，例如，蛋白酶、蛋白酶K、脂酶、糖苷酶；化学裂解可以由离子载体，去垢剂如SDS，酸或碱引起；物理方法也可以通过利用高压如弗氏压碎器、渗透性、温度或热和冷交替来实施。另外，化学、物理和酶促方法当然可以组合。本发明微生物的“灭活形成”或“死形式”以及“衍生物”或“类似物”或“突变体”优选地具有与前述菌株相同的特性。“灭活形式”或“死形式”以及“衍生物”或“类似物”优选地不再具有任何代谢活性。本发明微生物的类似物是一种裂解物或片段的形式。本发明微生物的片段是细胞的部分，例如细胞膜，大分子如DNA、RNA、蛋白质、肽、脂类、糖等以及细胞残片。突变体和/或遗传改变的变体或衍生物被遗传地改变，例如，通过重组DNA技术（重组核酸的克隆、测序、 转化）以及物理诱变，例如通过紫外辐射，也借助化学剂如采用甲磺酸乙酯（EMS）进行。可以选择正向特性的变化。遗传改变的突变体含有本发明微生物的细胞并且在它们的细菌染色体和/或质粒中保留重组核酸。借助点突变的修饰也可以诱导表达/转录/翻译效应以及甚至在没有任何直接遗传操作下的自发突变。类似物或片段可以包括热灭活（死的）或冻干形式的本发明微生物，其保留它们根据本发明的特性或甚至例如通过扩大表面积改善这些特性。冻干（冷冻干燥）后的细胞在一些情况下仍是活性的。这些细胞可以通过在不同温度下的特定存储过程被灭活。死细胞可以例如具有完整的或破裂的细胞膜，但是不具有任何代谢活性。制备灭活的细胞的方法可以包括例如用玻璃珠处理，其中细胞和玻璃珠之间的剪切力作用导致细胞的破裂。其他物理方法如弗氏压碎器、高压均化、球磨机或冻融过程和高压灭菌导致灭活细胞并且也产生本发明微生物的片段，UV照射、自溶方法或在不同温度下的特定存储过程也同样如此。

基于这里和下文所述的试验，例如本领域技术人员可以测试和验证属于乳酸菌属的微生物是否具有本发明的特性。本发明意义下也可以使用的术语“乳杆菌属细胞”包括乳酸菌或乳酸杆菌，并且包括需要发酵糖、尤其葡萄糖和乳糖产生乳酸并通常利用埃姆登-迈耶霍夫（Embden-Meyerh）生物合成途径的微生物。乳杆菌属细胞在分类学上划入乳杆菌科（Lactobacteriaceae）。它们是革兰氏阳性，不形成孢子并通常是不动的。乳杆菌属细胞是厌氧的，但是耐氧，虽然它们的确不含有任何的氯高铁血红素（细胞色素、过氧化氢酶）（Schleifer等人,System.Appl.Microb.18,461-467（1995）或Ludwiq等人,System.Appl.Microb.15,487-501（1992）。乳杆菌属细胞和/或物种可以基于糖类利用模式，尤其使用API试验（来自Biomerieux公司）来确定。根据本发明，这些包括尤其适合于同型发酵的乳酸发酵或异型发酵的乳酸发酵的物种。这类乳杆菌属细胞优选地也选自包括乳酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、詹氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、食淀粉乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、戈氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、弯曲乳杆菌和植物乳杆菌（其均为同型发酵）的组，还选自包括短乳杆菌、布氏乳杆菌、食果糖乳杆菌、希氏乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、绿色乳杆菌以 及两歧双歧杆菌，乳杆菌属L.ingluviei的组（其均为异型发酵）。适合作为例子并已经由申请人提交保藏的乳杆菌属细胞包括：副干酪乳杆菌种副干酪亚种（DSM 25972）、卷曲乳杆菌（DSM25987、DSM 25988）、植物乳杆菌（DSM 25989）、乳杆菌属L.ingluviei（DSM 25973），根据本发明，它们所有的均为优选的。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的微生物选自副干酪乳杆菌种副干酪亚种、卷曲乳杆菌、植物乳杆菌、乳杆菌属L.ingluviei，每种细菌已经保藏于布伦瑞克的德国微生物和细胞培养物保藏中心（DSMZ），其保藏编号为DSM 25972、DSM 25987、DSM 25988、DSM 25989、DSM 25973。上文提到的DSMZ保藏物是根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约作出的。

如上文提到，本发明也涉及含有微生物，优选地活的微生物、或其类似物、突变体、衍生物或片段以及优选地至少一种载体或赋形剂的组合物，所述载体或赋形剂选自以下的至少一种：可化妆品用载体或赋形剂、可药用的载体或赋形剂、或皮肤学可用载体或赋形剂。

本发明意义下的术语“组合物”被理解为尤其仅包括这样的组合物，所述组合物含有至少一种本发明微生物、或其片段、衍生物、类似物或突变体以及其他任选的成分如载体或赋形剂或任选地其他有效成分和盐。可化妆品用、可药用或皮肤学可用添加剂、载体或赋形剂被理解为在化妆品、药物或牙科领域任何一般的物质以化妆品或药用方面使用、给予或有效涂覆有效成分或组合物，即，在本发明的情况下，至少一种微生物、其类似物、衍生物、突变体或片段。

在本发明和权利要求的意义下，术语“粘膜”或“黏膜”被理解成指通过腺体分泌保持湿润的内层衬壁中空器官。具体而言，其指口和鼻粘膜、结缔组织、胃肠道粘膜和化学区域的粘膜。

在本说明书和专利权利要求的情境下，“炎性疾病”被理解为指涉及急性、亚急性、慢性缓和或慢性持续的涉及皮肤、粘膜或口腔的疾病状态的疾病。炎性疾病在临床上其表征为：发红、肿胀、疼痛、瘙痒、渗出、肌束震颤、角化过度、过度鳞列、侵蚀、溃疡和其他物质缺陷以及疮痂、囊泡和其他皮疹。组织结构上的炎症细胞可以存在于真皮中和/或表皮中。在本发明和专利权利要 求的意义下，“炎性疾病”或“炎性状态”被理解为尤其指多种疾病和病症，诸如，例如（但是不排除其他）湿疹、异位性湿疹、脂溢性湿疹、变应性或中毒性接触性湿疹、银屑病和其他角化过度的炎症、急性和慢性伤口、痒疹皮肤病以及稀有的炎症如扁平红苔藓、肉芽肿和副银屑性皮肤变化以及随皮肤表现的一大类自身免疫疾病。在本说明书和权利要求中，术语“预防”或“防止”被理解为包括全部类型的预防，即预防治疗健康使用者和/或患者以及预防治疗倾向于患有皮肤、粘膜或口腔的微生物疾病的那些使用者和/或患者或倾向于患有炎性疾病的使用者和/或患者（具有所谓“易染病体质”的人）。另外，预防也被理解为包括预防性治疗这样的使用者和/或患者，他们已经患过皮肤、粘膜或口腔的微生物疾病或炎性疾病一次并且同时已经战胜这种疾病，例如，通过成功疗法诸如本说明书和权利要求中提出的疗法（所谓“预防复发”）。另外，在本说明书和权利要求的意义下，预防也被理解为包括易于形成刺激的皮肤的美容性治疗以及护理和修复性治疗。

优选组合物不仅可以含有本发明的微生物之一或其类似物、突变体、衍生物或片段，还可以含有本发明的微生物的混合物或企鹅类似物、衍生物、突变体或片段的混合物或本发明微生物及其片段、衍生物、突变体或类似物的混合物。

该组合物可以优选地为固态或液体或粘稠形式或是气溶胶并且可以例如以粉末、片剂、溶液、颗粒、混悬液、乳剂、胶囊、糊状物、凝胶、喷雾剂等形式，即以适于给药的任何形式使用。如果该组合物包含额外的益生菌、抗菌剂或其他抗菌物质以及优选但任选的糖和防腐剂、调味料、甜味剂、维生素、矿物质、芳香物质等，则也是优选的。EP 2133414 A1列出可以用于优选的组合物的许多成分。明确地参考该出版物。另外，填充剂、流平剂、流变改性剂、软化剂、稳定剂或反应性交联单体（例如，甲基丙烯酸酯）可以存在于优选的组合物中。在这方面，可以优选的是，组合物含有诸如EDTA、镁、钙、SDS或盐其或相似的盐的物质。完全令人惊讶的是这些物质首先抑制化脓性链球菌形成生物被膜，还促进优选的微生物的共凝集能力。本发明到组合物尤其用于生理卫生、治疗和预防中给药并且含有至少一种本发明的微生物或其衍生物、突变体、片段或类似物。

尤其优选作为益生菌使用该组合物，即作为含有活微生物的制品，所述活微生物可以口服并且对摄取该益生菌的人和/或向其给予该益生菌的人具有促进健康的作用。此类制品可以是食品或食品添加剂或动物饲料或饲料添剂或药物。根据本发明，该组合物可以用于全部商品动物和家用宠物上，即，除人之外还用于犬、猫、马、骆驼、隼等。该微生物和/或含有它们的组合物可以以多种方式使用来实现这一点。例如，可以优选在嚼骨、咀嚼棒（chew stick）、动物治疗、动物饲料、微丸、可咬和咀嚼制品或动物玩具等中应用这种组合物。具体而言，如果将该微生物或组合物用于治疗和/或预防动物和人类中咽喉区域内细菌性感染，尤其由化脓性链球菌造成的细菌性感染，则它是优选的。

使用本发明组合物的剂量和用法本身将取决于具体用途和具体患者-尤其年龄、重量、总体状况等-并且处于将实现这种组合物用途的本领域技术人员的能力和评价能力范围内。

本发明组合物可以是化妆品、医药产品或药物产品。该组合物优选地含有0.001重量%至20重量%，优选地0.005重量%至10重量%，特别优选地0.01重量%至5重量%的量乳酸菌。完全令人惊讶的是使用0.001重量%至20重量%的量尤其将导致分解作用可用时间较长，即保持稳定。如果以0.005重量%至10重量%的量使用乳酸菌，这令人惊讶地导致对组合物的流变性能产生积极效果并且使得组合物具有较低粘度和因此更好地分布在皮肤上或更容易引入口腔中。以0.01重量%至5重量%的量使用乳酸菌已经令人惊讶地使得组合物的组分彼此更好结合和以可能在缩短的工作时间内供应均匀组合物，转而这使得制备成本降低。然而，不证自明的是不同于本文所述那些量的其他量也可以用于特定的应用。尤其令人惊讶的是，本发明的乳酸菌在人唾液中具有极高的共凝集活性。所产生的与化脓性链球菌的凝集物具有极其良好的稳定性并且因此可以通过淋洗或吞咽非常好地且高效地去除。

共凝集效率可以令人惊讶地在辅因子（EDTA、MgCl₂、CaCl₂、SDS）存在下显著地增加。绝对出乎意料的是，EDTA尤其将对本发明的乳酸菌与化脓性链球菌的共凝集产生强烈的积极的影响。如上文所提到，根据一个优选实施方案，该组合物和/或微生物可以在预防和治疗咽喉和扁桃体感染的领域中用来凝集前述致病微生物，即，用来与它们结合。可以通过吞咽或淋洗容易地去 除这种共凝集物和/或在悬浮液的情况下，它们尤其可以被冲洗掉，这有利地实现病原体数目的减少。该乳酸菌和/或含有它们的组合物可以以多种方式用于这个目的。例如，它们可以用于喷雾、含漱溶液或漱口水中，用作锭剂或润喉片、菱形片、包衣丸剂、气溶胶、牙膏、果汁、糖浆或用作食品中的添加剂和/或用作食品补充物。因此，本发明也涉及用于生理卫生和医疗产品及预防领域并含有本发明乳酸菌的全部产品。将上文描述的实施方案因此视为用于哺乳动物中的治疗、疗法和预防领域。因此该微生物和/或含有它们的组合物可以以多种方式使用。

尤其如果本发明的组合物和/或本发明的微生物用来制备用于治疗或预防由化脓性链球菌引起的咽喉症状、慢性萎缩咽炎（Pharyngitis atrophicans et sicca）、干燥性咽炎、外侧咽峡炎、扁桃体炎的药品。本发明的微生物和含有它们组合物提供了可以有利地治疗和/或预防这些疾病的药剂。该微生物和/或含有它们的组合物可以用于人用和兽用药物中，如已经指出尤其用于犬、猫、马、骆驼和隼中。本发明的组合物和/或微生物-或其片段、衍生物或突变体-尤其可以用作食品添加剂、卫生产品和/或用作含有所述微生物的卫生产品或用作药物制品。

本发明也涉及一种用于鉴定和/或选择具有本发明特性的乳杆菌属微生物的方法，所述方法包括至少以下步骤：a）孵育一批选自化脓性链球菌的致病微生物用于与纤维粘连蛋白结合，b）添加待研究的乳杆菌属微生物并且孵育该批次以形成致病微生物和待研究的乳杆菌属微生物之间的特异性结合，c）通过去除上清液分离未结合的乳杆菌属微生物以及d）就结合和凝集后的乳杆菌属微生物而言测定纤维粘连蛋白结合作用。

在一个优选实施方案中，本发明的方法也包括研究阻止化脓性链球菌结合纤维粘连蛋白的步骤。本文中在孵育与纤维粘连蛋白结合的荧光标记的致病微生物期间添加待研究的乳酸菌。优选地，在去除未结合的细胞后测量通过添加待测试的微生物与对照相比的荧光对与纤维粘连蛋白结合进行特异性定量。

不证自明的是上文提到的特征和下文待描述的特征不仅可以在给出的特定组合中使用，还单独使用，而不超出本发明的范围。

附图简述

其他的优点源自以下附图和就此方面实施的实验以及示例性实施方案。使用全部优选的乳酸菌进行实验，虽然这里仅提出一些实验。本领域技术人员可以基于这些实施例重复本发明，其中

图1显示在冲洗未结合的细胞3次后，本发明的微生物（DSM 25972、DSM 25989、DSM25973）与化脓性链球菌形成的生物被膜的特异性结合和/或凝集（结合分析）的一个示例性实施方案，并且与之相比，不属于本发明的其他乳杆菌属菌株（乳杆菌属物种1和乳杆菌属物种2）不能够与化脓性链球菌结合的；基于荧光测量（激发485nm/发射535nm），对96孔微量滴定平板中CFDA-标记的本发明乳杆菌属菌株与化脓性链球菌生物被膜的结合和/或凝集的特异性定量。以这种方式，本领域技术人员将了解到，优选的微生物可以尤其用于特别在口咽区域内出现的细菌性感染。

图2显示在24孔规模的共凝集批中本发明的微生物（DSM 25972、DSM 25987、DSM25988、DSM 25989和DSM 25973）与化脓性链球菌特异性结合的示例性实施方案以及在照相记录系统中单独的本发明的乳杆菌属菌株和化脓性链球菌靶菌株的宏观对照（24孔微量滴定平板的照片）。白色沉淀物由共凝集（和相关的沉淀）形成。凝聚物随后导致化脓性链球菌尤其不能与咽喉的上皮细胞结合。患者上的试验已经显示可以借助优选的微生物预防或减少细菌性感染。

图3显示在共凝集后本发明微生物（DSM 25987和DMS 25973）与化脓性链球菌细胞特异性结合的显微图示的示例性实施方案以及单独的本发明的乳杆菌属菌株和化脓性链球菌。显微成像（相差，1000×放大率）；可以见到作为巨大细胞凝聚物的共凝集物。

图4显示在人唾液中本发明的微生物（DSM 25972、DSM 25987、DSM 25988、DMS25989和DMS 25973）的与化脓性链球菌细胞的特异性结合（共凝集）的示例性实施方案的宏观对照（24孔微量滴定平板的照片），以及在照相记录系统中单独的本发明的乳杆菌属菌株和化脓性链球菌。白色沉积物也由共凝集（和相关的沉淀）引起。令人惊讶的是，在唾液中优选的微生物已经与化脓性链球菌结合，尤其在那共凝集并因此阻止化脓性链球菌与上皮细胞结合。 还令人惊讶的是，优选的微生物没有因唾液中存在的酶而丧失它们的优选能力。因此，优选的微生物有利于在口服药物尤其如夹心糖中使用。

图5显示本发明微生物（DSM 25972、DSM 25987、DSM 25988、DSM 25989和DSM25973）对阻止在37℃C与经PBS洗涤的（活）乳杆菌悬浮液和热处理灭活的（死）乳杆菌悬浮液孵育2小时后的化脓性链球菌菌株ATCC 19615结合纤维粘连蛋白的影响的示例性实施方案。特异性定量是CFDA-标记的化脓性链球菌与纤维粘连蛋白包被的96孔微量滴定平板的结合。这显示为化脓性链球菌结合百分比，其中100%代表单独的化脓性链球菌（ATCC19615）在不添加乳杆菌悬浮液的情况下与微量滴定平板的纤维粘连蛋白涂层的结合。发现优选的微生物阻止化脓性链球菌与咽喉中的上皮细胞结合并且因此也阻止细菌性感染。

图6显示本发明的微生物（DSM 25972、DSM 25987、DSM 25988、DSM 25989和DSM25973）对在37℃（与经PBS洗涤的（活）乳杆菌悬浮液和通过热处理灭活（死）的乳杆菌悬浮液）孵育2小时后的化脓性链球菌（菌株ATCC 12344）与纤维粘连蛋白结合的影响的一个示例性实施方案。这显示CFDA-标记的化脓性链球菌与纤维粘连蛋白包被的96孔微量滴定平板结合的特异性定量。显示化脓性链球菌的结合百分比，其中100%代表单独的化脓性链球菌在不添加乳杆菌悬浮液的情况下与微量滴定平板的纤维粘连蛋白涂层的结合。

图7显示本发明的微生物（DSM 25972、DSM 25987、DSM 25988、DMS 25989和DMS25973）和唾液链球菌在PBS缓冲液中共凝集的宏观图示（24孔微量滴定平板的照片）的一个示例性实施方案以及在照相记录系统中单独的本发明的乳杆菌属菌株和唾液链球菌。白色沉积物（和所产生的沉淀）由共凝集形成。

示例性实施方案的详述

实施例1：

为了鉴定和选择本发明的微生物，来自乳杆菌属菌株库的各种菌株由一个4步骤筛选方法测试，其中首先就与靶致病微生物化脓性链球菌（下文也称作“靶微生物”）结合的能力方面对它们进行筛选（结合分析），并随后在共凝集 测定法中以微量滴定平板规模测试第一步骤中鉴定的菌株，其中使用双目立体显微镜定性测量与相应靶微生物的共凝集。本发明意义下的，术语“共凝集”作为与术语“共聚集作用”的同义词使用。另外，研究了共凝集的强度、与靶微生物结合的稳定性以及阻止与纤维粘连蛋白结合的能力，这最终导致鉴定到本发明示例性的微生物（乳杆菌）。

结合分析

建立结合分析以便允许对所选择的乳杆菌属菌株的结合活性定量，其允许在检测96孔板中对乳杆菌属菌株与致病微生物的结合进行定量。乳杆菌属细胞与靶微生物的结合活性与共凝集活性和/或共凝集能力相关。实验上检验这一点。在这个方面，图2显示乳杆菌属DSM 25972、DSM 25987、DSM 25988、DSM 25989和DSM 25973和化脓性链球菌ATCC19615共凝集的例子。

测量方法基于本发明的菌株与生物被膜中所结合的靶菌株的特异性结合。将适量的本发明的菌株用荧光染料（CFDA溶液，Invitrogen）标记，与适量的生物被膜结合的靶微生物混合，用于分析。经洗涤几次后使用荧光光度计测量在靶菌株上结合的本发明菌株的持续存在。

为进行这些试验，根据标准方案培养靶微生物化脓性链球菌。菌株在37℃、5%CO₂气氛下在THY（Todd Hewitt培养液）培养基中在好氧条件培养。乳杆菌属菌株在MRS培养基中于37℃厌氧培养（参见de Man等人,（1960）″A medium for the cultivation ofLactobacilli（用于培养乳杆菌的培养基）,″J.Appl.Bact.23（130-135）。为了检查靶微生物，在平均指数生长期下培养5至6小时后收获细胞，随后用PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH7.4）洗涤3次并且溶解于PBS中。如此，将100μL悬浮液置于96孔微量滴定平板的每个孔中。在37℃、5%CO₂下经16小时孵育，靶微生物的生物被膜形成。在孵育后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4）洗涤3次，去除未结合的细胞。为了加工乳杆菌属菌株，在培养24小时后收获它们，随后用PBS洗涤3次，置于PBS中并且通过添加CFDA溶液（Invitrogen）用荧光进行标记。为进行结合分析，每个孔添加100μL荧光标记的乳杆菌悬浮液至生物被膜内所结合的靶菌株。不添加乳杆菌悬浮液的对照批平行进行。在37℃于培养箱中孵育1小时后，将未结合的细胞分离并且用PBS洗涤3次。在每个洗涤步骤后，在荧光平板光度计（发 射485nm/激发535nm）中测量荧光。与不含乳杆菌属细胞的对照相比，具有乳杆菌属菌株的一批中荧光（发射485nm/激发535nm）的增加与生物被膜结合的乳杆菌属细胞的量相关。结合乳杆菌属细胞后所测量的荧光对应于结合强度。这个值越高，标记的乳杆菌属细胞与生物被膜中所结合的靶菌株结合得越好，待测试的乳杆菌属细胞的结合活性越大。

这些实验已经显示在移除未结合的细胞后，对于结合分析中的靶微生物化脓性链球菌而言，本发明的乳杆菌属菌株导致荧光增加多至17倍，原因在于三次洗涤后标记的乳杆菌属细胞与生物被膜中的靶菌株结合。图1显示作为示例的本发明的微生物，乳杆菌属DSM 25972、DSM 25989和DSM 25973与化脓性链球菌的结合分析的结果。出于比较目的，图1也显示了不属于本发明的乳杆菌属菌株（乳杆菌属物种1和2）不能够特异性结合靶微生物的数据。发现优选的微生物能够防止人和动物中的细菌性感染和/或用于治疗这种细菌性感染，因为它们与化脓性链球菌特异性共凝集。以这种方式，一方面阻止化脓性链球菌与上皮细胞结合，同时另一方面，阻止化脓性链球菌形成生物被膜或溶解或破坏已经形成的任何生物被膜。

实施例2：

共凝集测定法

以1.0mL体积和/或在24孔平板中的以下验证用来显示所选择的乳杆菌属菌株的共凝集活性。

在这种方法中，单独考虑乳酸杆菌和靶菌株的共凝集行为，并且最终考虑在混合物内的乳杆菌和靶菌株一起的共凝集。通过使用24孔平板的照片宏观地以及微观地进行这种分析。为进行这些试验，根据标准方案培养靶微生物化脓性链球菌。将菌株在THY（ToddHewitt培养液）培养基中在37℃、5%CO₂气氛下好氧条件培养。将乳杆菌属菌株在MRS培养基中于37℃厌氧培养（参见de Man等人,（1960）″A medium for the cultivation oflactobacilli（用于培养乳杆菌的培养基）,″J.Appl.Bact.23（130-135）。为了检查靶微生物，细胞在培养5至6小时后在指数生长期中期收获，用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4）洗涤2次并且调整至OD₆₀₀=4。为了检查乳杆菌属菌株，将它们在培养16小时后收获，用PBS洗涤2次，随后置于一定量的PBS中并相应地调整至OD₆₀₀ =4。为进行共凝集测定，将每孔500μL份的靶微生物悬浮液与500μL乳杆菌悬浮液在24孔平板中混合。对含有500μL靶微生物外加500μL PBS，或者500μL相应乳杆菌悬浮液外加500μLPBS（对照1）的对照批进行平行测试。在台式搅拌器上25℃孵育10分钟后，除了显微地观察之外，还通过使用照相记录系统宏观地观察。为了分析灭活的乳杆菌属细胞的共凝集能力，首先通过在70℃于水浴中热处理30分钟将它们灭活并随后用于共凝集测定法中。

这些实验显示所选择的乳杆菌属菌株将与靶微生物化脓性链球菌共凝集，从而可以观察到混合物中的结块（凝集物），这是宏观可见的，借助孔中不规则的浓缩的和/或颗粒状的区域。在仅含有靶菌株和/或本发明的乳杆菌属菌株的孔中未出现结块或凝集物的形成。孔内的细胞悬浮液保持均匀。图2显示对于活或灭活的所选择的乳杆菌属菌株和靶微生物化脓性链球菌的共凝集批中的宏观结果。在显微镜观察中，本发明的全部乳杆菌属菌株存在对靶微生物的明确的亲和力，导致在显微镜观察凝集中不同的凝集物大小。图3显示例如本发明的乳杆菌属菌株DSM 25987和DSM 25973与靶微生物化脓性链球菌的共凝集批中的微观结果。优选的微生物能够阻止或消除由化脓性链球菌引起和/或化脓性链球菌参与其中的细菌性感染，尤其在患者或动物中。

实施例3:

人唾液中的共凝集

为了研究本发明的乳杆菌属菌株在天然人唾液中的共凝集能力，将它们在如实施例2中所述那样培养16小时后收获，经PBS洗涤2次并置于人唾液中。唾液已经预先由几个人采集，混合并通过在8000g离心20分钟去除颗粒物。将靶微生物如实施例2中所述那样制作，并且同样地在PBS中洗涤2次后置于人唾液中。为进行共凝集测定，在24孔平板的每孔中将500μL唾液中的靶微生物悬浮液和500μL唾液中的乳杆菌悬浮液混合。对含有500μL靶微生物外加500μL唾液，或者500μL各自的乳杆菌悬浮液外加500μL唾液的对照批（对照1）进行平行测试。在台式搅拌器上25℃孵育10分钟后，通过照相记录系统宏观地以及微观地进行观察。

试验已经显示，天然人唾液中的本发明的乳杆菌属菌株能够与靶微生物化脓性链球菌特异性共凝集。这提供了在口咽间隙中应用本发明的乳杆菌属菌株 的最佳前提。例如用于这个目的的优选微生物可以作为夹心糖口服给予，并且使得细菌性感染被缓解或甚至完全被治愈。图4显示天然人唾液中本发明的乳杆菌属菌株与靶微生物化脓性链球菌共凝集的宏观结果。

实施例4：

阻止与纤维粘连蛋白结合

为研究本发明的乳杆菌属菌株对靶致病微生物化脓性链球菌（ATCC 19615）与纤维粘连蛋白结合的影响，建立一项结合分析，其允许在纤维粘连蛋白包被的96孔板中定量检测荧光标记的靶微生物的结合。将本发明的乳杆菌属菌株在结合开始时直接添加至CFDA-标记的靶微生物并在37℃孵育2小时。在去除未结合的细胞并用PBS洗涤2次后，通过在荧光平板光度计中在发射485nm/激发535nm测量荧光，对结合的靶微生物细胞的进行特异性定量。为进行这些试验，根据标准方案培养本发明的靶菌株和乳杆菌属菌株。为了制作乳杆菌属菌株，在培养后将它们于PBS中洗涤2次并随后置于PBS中。经PBS洗涤后，通过在70℃巴斯德消毒30分钟，将一些乳杆菌属菌株灭活。为制作靶菌株，将它培养16小时直至达到稳态生长期，随后收获，通过添加CFDA荧光素进行标记并且调节至OD_600nm=3.0。为进行结合分析，将乳杆菌属菌株在结合开始时直接添加至荧光标记的靶微生物并在37℃在微需氧条件下孵育2小时。对不添加乳杆菌悬浮液的对照批进行平行定量。在去除浮游细胞并且冲洗生物被膜中存在的细胞后，通过存在或不存在乳杆菌属细胞的荧光测量，对结合的靶微生物细胞进行特异性定量。与未添加乳酸杆菌的靶微生物的对照相比，荧光的下降与靶微生物化脓性链球菌与纤维粘连蛋白包被的微量滴定平板结合的强度相关。这种下降被表示为阻碍生物被膜形成的百分比。图5显示乳杆菌属菌株DSM 25972、DSM 25987、DSM 25988、DSM25989和DSM 25973在阻碍与纤维粘连蛋白结合时所获得的结果；作为本发明的微生物的例子，即化脓性链球菌ATCC 19615，测试这些菌株。实验已经显示，由于如上文所列的活的或灭活的形式的本发明的乳杆菌属菌株，使得靶微生物与纤维粘连蛋白结合受阻。因此，这表明本发明的乳杆菌属菌株能够阻止化脓性链球菌与宿主细胞结合。另外，采用与相同属和种的其他微生物进行实验，旨在描述本发明的乳杆菌属菌株的结合特性和/或凝聚特性的特异性以及它们的阻止与纤维粘 连蛋白结合的能力，与纤维粘连蛋白结合是相同属和种的靶微生物的功能。为此目的，选择其中的化脓性链球菌ATCC 12344。为了研究它们对靶微生物化脓性链球菌ATCC 12344与纤维粘连蛋白结合的影响，在如上文所述的标准条件下培养本发明的乳杆菌属菌株和靶微生物，随后制作并用于测定中。

试验已经显示相同种和属的其他微生物也可以由本发明的乳杆菌属菌株凝集并且本发明的乳杆菌属菌株也可以防止其他靶微生物与纤维粘连蛋白结合。图6显示作为本发明的微生物的乳杆菌属菌株DSM 25972、DSM 25987、DSM 25988、DSM 25989和DSM 25973阻止化脓性链球菌（菌株ATCC 12344）与纤维粘连蛋白结合的示例的结果。完全令人惊讶的是，给予人或动物优选的微生物可以用来预防或治疗细菌性感染，化脓性链球菌的相同属和种的其他微生物也可能参与该感染。

实施例5：

唾液链球菌的共凝集

根据标准条件培养本发明的乳杆菌属菌株和唾液链球菌，在PBS中洗涤3次，用于人唾液中的共凝集测定。结果显示本发明的乳杆菌属菌株不共凝集唾液链球菌（图7）。因此可以排除可能性：作为例子由唾液链球菌代表的共生菌株不与乳杆菌属菌株共凝集以及不从它们的自然生境被去除。这尤其显示优选的乳酸菌具有针对细菌性感染的特异性作用。

参考文献列表

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Claims (49)

1.一种乳杆菌目的微生物或其组合，其中所述微生物或其组合能够与至少一种致病微生物共凝集，其中所述致病微生物是化脓性链球菌，

所述微生物选自包括如下已经保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心并且编号为DSM 25972、DSM 25987、DSM 25988、DSM 25989和DSM 25973的微生物的组。

2.根据权利要求1所述的微生物或其组合，其中所述致病微生物的共凝集能力甚至在生物学、化学或物理处理后还存在。

3.根据权利要求1或2所述的微生物或其组合，其中所述致病微生物的共凝集能力在pH3至8之间存在。

4.根据权利要求1或2所述的微生物或其组合，其中所述微生物或其组合具有抑制致病微生物的生物被膜形成的能力。

5.根据权利要求1或2所述的微生物或其组合，其中所述微生物或其组合具有防止化脓性链球菌与纤维粘连蛋白结合的能力。

6.根据权利要求1或2所述的微生物或其组合，其中所述微生物或其组合具有不与皮肤或粘膜的任何共生微生物共凝集的能力。

7.一种组合物，包含至少一种根据权利要求1～6中任一项所述的微生物或其组合。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述组合物包含可药用或可化妆品用的载体或赋形剂。

9.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述组合物为固体或液体形式，或为气溶胶。

10.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述组合物为粘稠形式。

11.根据权利要求7或8所述的组合物、其中所述组合物为糊状物、软胶囊、硬胶囊、粉末、颗粒、小丸、锭剂、溶液、凝胶、牙膏、口香糖、片剂或夹心糖的形式。

12.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述组合物为酊剂、乳液、浓缩物、糖浆或喷雾的形式。

13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述组合物为菱形片、泡腾片、口含片、咀嚼片、舌下片、果汁、漱口水、包衣丸剂的形式。

14.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述组合物包含益生菌或其他抗菌物质。

15.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述组合物包含抗菌剂。

16.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述组合物包括药物组合物或化妆品组合物或食品补充剂组合物。

17.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述组合物包括兽用组合物。

18.根据权利要求7或8所述的组合物，其另外包括选自以下物质的一种或多种：抗氧化剂、脂肪酸、氨基酸和辅因子。

19.根据权利要求7或8所述的组合物，其包含一种或多种增稠剂、一种或多种甜味剂。

20.根据权利要求7或8所述的组合物，其包含一种或多种人工甜味剂。

21.根据权利要求19所述的组合物，其中所述增稠剂选自纤维素醚、多糖，所述多糖选自包括黄原胶、淀粉、海藻酸盐、黄芪胶、琼脂、阿拉伯树胶、果胶的组；所述甜味剂选自包括葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇和麦芽糖醇、糖精、甜蜜素钠、乙酰磺胺酸钾和/或阿斯巴甜的组。

22.根据权利要求19所述的组合物，其中所述甜味剂为葡萄糖糖浆。

23.根据权利要求7或8所述的组合物，其另外包括酶、电解质、pH调节剂、增稠剂、去污剂、荧光增白剂、灰暗抑制剂、染料转移抑制剂、膜调节剂和/或着色剂。

24.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述微生物作为活的或死的微生物在所述组合物中存在。

25.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述微生物以封装、喷雾干燥和/或冻干形式存在。

26.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述微生物以细胞裂解物的形式存在。

27.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述微生物以0.001重量％至20重量％的量存在。

28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述微生物以0.005重量％至10重量％的量存在。

29.根据权利要求27所述的组合物，其中所述微生物以0.01重量％至5重量％的量存在。

30.权利要求7至29中任一项所述的组合物在制造用于处理皮肤、粘膜和口腔的微生物疾病的医疗产品或化妆品中的用途。

31.根据权利要求30所述的用途，其中所述医疗产品或化妆品用于局部处理皮肤、粘膜和口腔的微生物疾病或炎性疾病。

32.根据权利要求30或31所述的用途，其中所述医疗产品或化妆品用于处理口腔的微生物疾病，所述医疗产品或化妆品另外包含一种或多种调味物质。

33.根据权利要求30或31所述的用途，其中所述医疗产品或化妆品用于局部处理微生物疾病或炎性疾病，所述组合物以口香糖、夹心糖、菱形片、牙膏、喷雾剂或漱口水的形式使用。

34.根据权利要求33所述的用途，其中所述微生物疾病或炎性疾病为口腔的微生物疾病或炎性疾病。

35.根据权利要求30或31所述的用途，其中另外使用一种或多种抗炎和/或抗微生物物质。

36.根据权利要求30或31所述的用途，其中所述组合物与溶剂、载体和/或添加剂组合使用。

37.根据权利要求36所述的用途，其中所述添加剂为赋形剂、填充剂、调味物质和/或香味物质。

38.根据权利要求30或31所述的用途，其中所述医疗产品或化妆品预防性或治愈性地使用。

39.根据权利要求30或31所述的用途，其中所述医疗产品或化妆品口服或口含给药。

40.根据权利要求30或31所述的用途，其中所述医疗产品或化妆品舌下给药。

41.根据权利要求30所述的用途，其中所述处理皮肤、粘膜和口腔的微生物疾病为预防和/或治疗皮肤、粘膜和口腔的微生物疾病。

42.根据权利要求30所述的用途，其中所述医疗产品为药品。

43.权利要求7至29中任一项所述的组合物的用途，其中所述组合物用于制造处理表面的清洁剂或消毒剂。

44.权利要求7至29中任一项所述的组合物的用途，其中所述组合物用于制造在医疗领域中使用的产品。

45.根据权利要求44所述的用途，其中所述医疗领域为预防领域。

46.权利要求7至29中任一项所述的组合物的用途，其中所述组合物用于制造口服或口含摄入的药物。

47.权利要求7至29中任一项所述的组合物的用途，其中所述组合物用于制造舌下摄入的药物。

48.权利要求7至29中任一项所述的组合物的用途，其中所述组合物用于制造抗微生物添加剂，所述抗微生物添加剂对口咽间隙中的炎症和上呼吸道及皮肤感染具有特异性作用或局部治疗作用。

49.用于卫生处理的套装，包含根据权利要求1至6中任一项所述的微生物或其组合或根据权利要求7至29中任一项所述的组合物，以及生理卫生装置或设备，淋洗液和/或糊状物。