CN108135947A - 提高免疫应答和皮肤和/或粘膜屏障功能的材料和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过采用以微生物为中心的治疗方法来治疗人皮肤病的组合物和方法。本发明的优选实施方式提供药物和化妆品组合物及其使用方法，其包含源自人微生物群并能够在生物膜表型中生长的发酵乳酸杆菌菌株或其生物活性提取物。

Description

提高免疫应答和皮肤和/或粘膜屏障功能的材料和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年7月20日提交的申请号为62/194,630的美国临时申请的权益，其全文通过引用并入本文。

技术领域

由于人类微生物组多样化的寄居共生微生物群，其在健康和疾病中发挥的关键作用方面受到了广泛关注。

背景技术

作为防止外来入侵者的最初防线，皮肤是多种多样的微生物的家园。这些微生物包括寄居共生体、过渡体(transients)和病原体。为了在极具挑战性的皮肤环境中生存，微生物通常表现出生物膜表型，这为生存和生长提供了竞争优势。可以发现许多皮肤病原体作为共生体存活于皮肤上；微生物生态失调、宿主遗传变异和免疫状态可能推动从共生体到病原体的转变。

过敏性皮炎(AD)是一种多因素慢性炎症性皮肤病，涉及遗传因素如丝聚合蛋白缺乏(1)和环境触发因素，包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，并且通常是“过敏性过程”的首发症状。在全世界范围内，AD影响大约20％的儿童和5％的成人，典型地临床上表现为具有偶发性急性发作(flares)的慢性干燥的瘙痒性湿疹性皮炎。AD常伴有哮喘和过敏性鼻炎。受AD影响的个人的生活质量明显被破坏，与疾病相关的经济负担沉重，估计年度国家直接成本从3.64亿美元到38亿美元(4,5)变化。AD代表了对更有效的治疗方法的巨大的、未满足的需求。

共生细菌如表皮葡萄球菌(S.epidermidis)具有多种抑制病原菌的抗菌机制。多项研究表明来自共生表皮葡萄球菌的丝氨酸蛋白阻止了金黄色葡萄球菌(S.aureus)的致病菌株的生长(40，41)。来自共生表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的新型脂肽通过TLR2/CD36-MAPK增加HβD2和HβD3，从而增强抗病原体感染的抗微生物防御作用(42，43)。其他研究表明，人皮肤微生物组中的表皮葡萄球菌产生次生发酵代谢物以抑制其他的致病性细菌菌株的生长(44)。此外，增强如表皮葡萄球菌的共生菌也可能具有其他有益的作用。例如，皮肤表皮葡萄球菌在控制局部炎症环境和调节宿主T淋巴细胞功能方面具有自主作用，从而对皮肤病原体产生保护性免疫(45)。

皮肤生态失调与常见的皮肤疾病有关，包括AD、痤疮和红斑痤疮(21)。急性AD发作期间的皮肤微生物组测序与病原体金黄色葡萄球菌和共生表皮葡萄球菌在发作期间水平升高有关，随后在应用标准药物如外用类固醇和抗生素时出现下降(22)。

皮肤生态失调可以引发关键的生化和免疫触发物，研究发现大量葡萄球菌与AD病变临床恶化有关；例如，携带MRSA的患者的全身临床皮炎评分更高(15，29-31)。

脂磷壁酸主要通过TLR 2(32-34)发挥免疫学作用，这可能涉及过敏性皮炎的恶化(31，35)。研究表明，在AD患者的儿童中，与健康对照相比，在三个疾病阶段发生了皮肤微生物群的暂时变化：基线、发作和发作后。特别是，在发作期皮损细菌多样性减少，同时金黄色葡萄球菌相对丰度增加，但在发作后皮损细菌多样性增加，表明疾病严重程度与微生物多样性之间的联系(21，22)。

丝聚合蛋白缺乏症、金黄色葡萄球菌定殖、先天免疫缺陷和皮肤微生物生态失调是疾病进展的主要潜在因素。多达90％的AD患者被金黄色葡萄球菌定殖；AD中MRSA患病率为10-30.8％(15)。

皮肤屏障在AD发病机制中的作用现已清楚(18-20)。在这种情况下，迄今为止与AD最密切的遗传关联已被证实为编码重要的屏障蛋白(前丝聚合蛋白)的丝聚合蛋白(FLG)基因中的功能丧失突变(8，9)。丝聚合蛋白在AD的病理生理中起到多个作用，这就解释了为什么表皮分化复合物的单一组分的较低表达可能对皮肤屏障的整个功能有如此大的影响。皮肤屏障功能是皮肤共生菌群平衡的主要决定因素。皮肤屏障蛋白质FLG确保细菌的致病菌株不能渗透到更深层。在最近的研究中，丝聚合蛋白敲除导致表皮金黄色葡萄球菌定殖显著增加，以及金黄色葡萄球菌诱导的IL-8表达上调(16)。

然而，在大多数AD个体中FLG突变是缺失的；继发性丝聚合蛋白缺乏在AD中很常见(6)。这被认为是因为各种环境因素，例如AD炎症中常见的Th2/Th22细胞因子环境，细菌外毒素，与皮肤金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)有关的AD皮肤生态失调，与抓挠、皮肤脱水和局部刺激有关的机械损伤(9-14)。

AD中较低的丝聚合蛋白水平易于金葡菌定植(11,12)，较低水平的抗微生物肽与先天免疫缺陷和金黄色葡萄球菌的细胞外粘附素增加有关(16,17)。

控制致病生物膜及其在皮肤上的代谢产物是恢复共生皮肤菌群与皮肤健康共生的重要组成部分。然而，目前的治疗主要集中在症状控制而不是调节整个微生物组以抑制生长并减少致病性生物膜活性的粘附和附着，同时促进共生生物膜在人类皮肤上的生长。

发明内容

本发明提供了通过采用以微生物组为中心的治疗方法来治疗人皮肤病(和其它)病症的组合物和方法。本发明的优选实施方式提供药物和化妆品组合物及其使用方法。

在优选的实施方式中，组合物包含发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)菌株或其生物活性提取物。在优选的实施方式中，当细菌作为生物膜生长时获得细菌提取物。本发明还提供了包含冻干的、冷冻干燥的和/或裂解物形式的发酵乳酸杆菌或其生物活性提取物的组合物。

在本发明的一些实施方式中，皮肤屏障功能的增强通过利用本发明的细菌组合物上调皮肤屏障蛋白的表达来实现。在其他实施方式中，通过利用本发明的细菌和组合物上调皮肤固有免疫肽和/或炎性细胞因子的表达来提供皮肤先天免疫功能的增强。

另一方面，本发明提供治疗人类皮肤病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的组合物，其中所述组合物优选包含一种或多种LfQi6生物膜的生物活性提取物。

有利地，本文提供的优选组合物和治疗方法在治疗人类皮肤屏障功能障碍、生态失调、皮肤先天免疫功能障碍和/或炎性皮肤病中是有效的，并且改善皮肤的外观和/或肌理。根据本发明治疗的受试者可以体验缓解的症状严重程度，减少急性发作的发生率并改善生活质量。

一方面，本发明提供了用于治疗人皮肤病的治疗组合物，其包含细菌菌株或其生物活性提取物和药学上可接受的赋形剂。所述组合物优选具有选自抑制抗微生物活性、致病生物膜生长、抑制致病生物膜粘附，促进致病生物膜分离，促进共生生物膜生长，增强皮肤屏障功能和增强皮肤先天免疫功能的一种或多种生物学活性。

在示例性实施方式中，致病性细菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，共生细菌是表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。

在一些实施方式中，细菌菌株是发酵乳酸杆菌Qi6，在本文中也称为Lf Qi6。在一个实施方式中，本发明提供了分离的或生物纯的Lf Qi6培养物。在另一个实施方式中，本发明提供了作为生物膜生长的生物纯的Lf Qi6培养物。本文具体教导了用于诱导和鉴定生物膜表型的方法。本文进一步提供了利用生物膜表型以及生物膜表型的提取物及其裂解物的方法。在优选的实施方式中，药物组合物包含Lf Qi6生物膜的生物活性提取物。

另一方面，本发明提供了用于改善人类皮肤状况的化妆品组合物，其包含Lf Qi6和/或其生物活性提取物，并且与一种或多种化妆品可接受的赋形剂一起。在优选的实施方式中，化妆品组合物包含Lf Qi6生物膜的生物活性提取物。

在一些实施方式中，化妆品可接受的赋形剂包含用于选自洗剂、乳膏、乳剂、软膏、油状物、凝胶、精华素及其组合的制剂的物质。

另一方面，本发明提供了一种改善人类皮肤病症的方法，包括给予受试者有效量的包含细菌菌株和/或其生物活性提取物以及一种或多种化妆品可接受的赋形剂的组合物。与治疗组合物一样，化妆品组合物优选具有选自抑制致病性生物膜生长、抑制病原性生物膜粘附、促进致病性生物膜脱离、促进共生生物膜生长、增强皮肤屏障功能、增强皮肤先天免疫功能的一种或多种生物学活性，以及它们的组合。在优选的实施方式中，细菌菌株是Lf Qi6。

附图说明

图1示出了Lf Qi6培养程序。步骤1：在MRS琼脂平板上培养LfQi6；步骤2：在37℃在5ml MRS培养液中培养Lf Qi6 24小时；步骤3：将0.1ml培养物转移到含有25ml MRS培养液的T-150组织培养板中；步骤4：每48小时更换25ml MRS培养基，生物膜LfQi6作为菌苔在底部生长；步骤5：培养物生长7天，在底部得到厚的生物膜层；步骤6：刮下生物膜层并悬浮在新鲜培养基中。冷冻储备液可以用甘油制备，储存在-80°。

图2示出了一个Lf Qi6放大培养过程。步骤1：将生物膜表型Lf Qi6在10ml新鲜MRS培养基中于37℃培养24小时；步骤2：将10ml培养物接种到含有500g无菌玻璃棉的25L MRS培养基中；步骤3：在37℃的静态条件下培养72小时。每24小时将培养物轻轻摇匀混合；步骤4：收获培养基和玻璃棉。超声处理玻璃棉以分离生物膜细胞；步骤5：离心细胞浓缩生物膜Lf Qi6。悬浮在无菌水中。

图3说明了一个Lf Qi6下游处理的实施例。步骤1：将50g生物膜表型Lf Qi6悬浮在1L无菌水中；步骤2：将悬浮液在室温下轻轻混合24小时以被动释放生物活性物质；步骤3：然后使用OmniSonic Ruptor 400将混合物超声处理30分钟(50KHz，200瓦特)，获得均匀的裂解物；步骤4：将超声的裂解物冷冻；步骤5：将冷冻裂解物冻干成细粉。

图4说明了放大培养中基质中Lf Qi6的生物膜生长。

图5说明了示出由Lf Qi6生物膜表型制备的生物提取物中的独特蛋白质的SDS条带。与浮游生物表型相比，箭头表示生物膜表型中的独特蛋白质。

图6说明了分子筛HPLC，其示出由Lf Qi6生物膜表型制备的生物提取物中的独特蛋白质。

图7说明了分子筛HPLC，其示出由Lf Qi6生物膜表型制备的生物提取物中的独特蛋白质。

图8说明了具有高抗MRSA抗生物膜活性的Lf Qi6生物膜提取物。

图9示出了生物膜中的MRSA菌落形成单位。

图10示出了>50kDA Qi6培养基组分(CV染色)促进的共生表皮葡萄球菌生物膜。

图11示出生物膜中的表皮葡萄球菌菌落形成单位。

图12示出共生的表皮葡萄球菌生长控制。

图13说明了LfQi507在离体人皮肤器官培养系统中快速分离MRSA生物膜。

图14A说明了在6孔板体内共培养模型中通过Lf Qi601生物膜调节致病性MRSA和共生表皮葡萄球菌的比较。图14B说明在离体皮肤外植体共培养模型中通过Lf Qi601生物膜调节致病性MRSA和共生表皮葡萄球菌。数据表示为平均值±SEM(平均值的标准误差)，单因素方差分析用于确定治疗方法之间的差异(P<0.05)。具有相同方案(letter)的方法彼此没有显著差异(P<0.05，纽曼-科伊尔斯(Newman-Keuls)多重比较测试)。

图15A-15F说明了来自Lf Qi6的生物提取物上调角质形成细胞中皮肤屏障蛋白丝聚合蛋白(FLG)的表达。图15A示出未用Lf Qi6生物提取物处理的同种对照。图15B示出了PBS基线。图15C是用0.5mg/mL Lf Qi6生物提取物处理的离体皮肤外植体。图15D是用1mg/mL Lf Qi6生物提取物处理的离体皮肤外植体。图15E示出用PBS，0.5mg/mL Lf Qi6生物提取物或1mg/mL Lf Qi6生物提取物处理的皮肤外植体的定量免疫比。图15F示出用PBS，0.5mg/mL Lf Qi6生物提取物或1mg/mL Lf Qi6生物提取物处理的皮肤外植体的定量FLGELISA。数据表示为平均值±SEM(平均值的标准误差)，单因素方差分析用于确定治疗方法之间的差异(P<0.05)。**表示P<0.01，***表示P<0.001。

图16说明了Lf Qi6的生物活性增加角质形成细胞中的PPARβ和γ。

图17说明了LFQi507增加人β防御素的表达。

图18A示出与万古霉素和美罗培南相比，Lf Qi6生物提取物对MRSA生物膜的抑制百分比。

图18B示出与万古霉素和美罗培南相比，Lf Qi6生物提取物对MRSA生物膜粘附的降低百分比。

图18C示出万古霉素、美罗培南或Lf Qi6生物提取物治疗后MRSA生物膜分离的百分比。

图18D示出了在6孔板中用考马斯(coomassie)生物膜染色用Lf Qi6生物提取物处理的MRSA生物膜的抑制

图18E示出在用苏木精-伊红染色的离体皮肤上形成的MRSA生物膜，箭头指示强烈的生物膜形成。数据表示为平均值±SEM(平均值的标准误差)，单因素方差分析用于确定治疗方法之间的差异(P<0.05)。当发现显著差异时，使用纽曼-科伊尔斯多重比较测试比较方法。同一个方案(letter)的方法彼此没有显著的不同。

图19A表示Lf Qi6生物提取物对人β-防御素2的上调。

图19B示出用Lf Qi6生物提取物处理的离体皮肤模型中人β-防御素3的上调。

图19C示出通过HPLC从Lf Qi6生物提取物处理的组织培养基鉴定β-防御素2。数据表示为平均值±SEM(平均值的标准误差)，单因素方差分析用于确定治疗方法之间的差异(P<0.05)。***表示P<0.001。

具体实施方式

本发明提供了用于治疗人类皮肤病症的组合物和方法。本发明的优选实施方式提供了药物和化妆品组合物及其使用方法，其包含源自人微生物群并能够生长为生物膜表型的发酵乳酸杆菌菌株和/或其一种或多种生物活性提取物。本发明还提供了包含冻干的、冷冻干燥的和/或裂解物形式的发酵乳酸杆菌和/或其生物活性提取物的组合物。

有利地，本文提供的优选组合物和治疗方法在治疗人类皮肤屏障功能障碍、生态失调、皮肤先天免疫功能障碍、炎症性皮肤病以及改善皮肤外观和/或肌理方面是有效的。因此，以这种以微生物为中心的方法治疗的受试者可以体验缓解的症状严重程度，减少急性发作的发生率和改善生活质量。

在一些实施方式中，细菌菌株是发酵乳酸杆菌Qi6，在本文中也称为Lf Qi6。在一个实施方式中，本发明提供了分离的或生物纯的Lf Qi6培养物。在另一个实施方式中，本发明提供了作为生物膜生长的生物纯的Lf Qi6培养物。本文具体教导了用于诱导和鉴定生物膜表型的方法。本文进一步提供了利用生物膜表型以及生物膜表型的提取物及其裂解物的方法。在优选的实施方式中，药物组合物包含Lf Qi6生物膜的生物活性提取物。

发酵乳酸杆菌微生物的培养物已经保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801大学路，马纳萨斯，弗吉尼亚州20110-2209USA。该保藏被储藏库分配保藏号为ATCCNo.PTA-122195，于2015年6月10日保藏。

目标培养物在以下条件保存，确保在本专利申请审理期间将由根据37CFR 1.14和35USC 122确定的专利和商标委员会能够获得培养物的条件。根据在递交了本申请的同族专利或分案的国家中外国专利法的要求，可以获得该保藏。然而，应该理解的是，保藏可用性并不构成对由政府行为所授予的专利权的减损中执行本发明的许可。

此外，将按照“布达佩斯微生物保藏条约”的规定，将目标培养物保藏储存起来并向公众开放，也就是说，将采取所有必要照料以保持其活力，且无污染储存，至少在最近请求提供保藏样品的五年之后的一段时间，并且在任何情况下，至少在保藏日期之后30年(30年)的一段时间内，或者在任何可能会公开培养物的专利的可执行期限内。由于保藏条件的限制，在请求后保藏所不能提供样品时，保藏人有责任更换保藏。所有对目标保藏公开的可获得性的限制，在公开目标保藏的专利获得授权后将不可撤销地予以消除。

如本文所用，对“分离的”微生物的提及是指已经从自然界中其存在的材料中除去的微生物。微生物可以从例如土壤、血液、粘液或牛奶中分离出来，使得它们从自然界的材料中被去除，并且不再与这些材料混合或与之相关。与微生物在自然状态下表现出的特性相比，这种分离可用于赋予微生物明显不同的特征，例如产生不同的或不同量的化合物。

在一个方面，本发明提供了用于治疗人皮肤病的药物组合物，其包含生物纯的细菌菌株，和/或其生物活性提取物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，所述菌株及其提取物能够生长在浮游生物和生物膜表型中，所述组合物具有选自常规抗微生物活性、抑制致病生物膜生长、抑制致病生物膜粘附、促进致病生物膜分离、促进共生生物膜生长、增强皮肤屏障功能和增强皮肤先天免疫功能的一种或多种生物活性。

如本文所用的术语“提取物”是指通过处理生物膜培养物获得的组合物。处理可能涉及如物理和/或化学处理。物理和/或化学处理可包括例如过滤、离心、超声处理、加压处理、放射处理、裂解、用溶剂或其他化学品处理，以及这些处理的组合。提取物可以是如上清液的形式，如通过离心产生的上清液。提取物还可以包括通过离心获得的细胞块。细胞可以是完整的或不完整的，有活力的或无活力的。提取物可以包含细胞膜成分和/或细胞内成分。在某些实施方式中，提取物为细胞块重量的至少80％、85％、90％或95％。在某些实施方式中，至少95％的完整细胞是无活力的。在某些实施方式中，提取物中细胞块重量的小于10％是完整的细胞。

人的皮肤包括两个隔室，深隔室(真皮)和表面隔室(表皮)。皮肤构成防止外部攻击的屏障，特别是化学、机械或传染性攻击，以及针对环境因素(例如气候、紫外线和烟草)和/或异生物质(如微生物)的许多防御性反应。这种性质被称为皮肤屏障功能，主要由表皮的最表层即角质层(horny layer)(被称为角质层(stratum corneum))提供。屏障的有害变化可以通过如皮肤不适、感觉现象和/或皮肤干燥反映出来。

根据本发明的一些实施方式的组合物可用于防止屏障功能的降低和/或修复或再生屏障功能。与皮肤和/或粘膜屏障破坏有关的疾病包括但不限于牛皮癣，鱼鳞病，结节病，动脉粥样硬化，炎性肠病，痤疮(包括化脓性汗腺炎)，烧伤，尿布疹，奈瑟顿综合征(Netherton's syndrome)，光化性角化病，真菌皮肤病，皮肤病或外胚层发育异常，遗传过敏性皮炎，接触性皮炎，皮脂溢性皮炎，寻常型，嗜酸性食管炎，丝聚合蛋白缺乏症和其他与皮肤和/或粘膜屏障的损伤或破坏相关的病症。

在一些实施方式中，屏障的修复或再生包括修复或再生粘膜。粘膜包括口腔黏膜(包括面颊粘膜，软腭，舌头，包括舌下表面和口底)，鼻，喉(包括咽粘膜，喉，气管和食道)，支气管，肺，眼睛，耳朵，胃肠道，阴道，阴茎，尿道，膀胱和肛门。在某些实施方式中，本发明的组合物也可以用于治疗急性和慢性病毒感染。特别是慢性EB病毒、巨细胞病毒和其他疱疹病毒感染的治疗，这些病毒在人群中无处不在，并且与免疫监督的降低有关。

本文提供的药物组合物还可以包括本领域技术人员已知的其它药学上可接受的成分，包括但不限于药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、掩蔽剂和着色剂。该制剂可以进一步包含其他活性剂，包括例如其他治疗剂或预防剂。

如本文所提供的，“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或批准的，或在美国药典或其他公认的药典中列出的，用于包括人在内的动物。

“药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂”是指可以与活性成分一起施用于受试者并且不破坏其药理活性并且以足以递送的治疗量的本文提供的组合物施用时无毒的赋形剂、载体或佐剂。

在一些实施方式中，生物纯菌株是发酵乳酸杆菌Qi6，以下也称为Lf Qi6。在优选的实施方式中，本文提供的药物组合物包含Lf Qi6在生物膜表型中生长后获得的一种或多种Lf Qi6的生物活性提取物。

“浮游生物”是指在液体培养基中自由浮游的微生物(细菌，真菌，和/或原生动物，伴有噬菌体和其他病毒)典型的表型。另一方面，“生物膜”是包埋在细胞外聚合物基质(EPS)中的微生物的堆积物，并粘附于固体生物或非生物表面。已经观察到并且在本文提供的实施例中报道了除了拥有典型的浮游生物表型之外，Lf Qi6可以形成生物膜。

用于生长生物膜的方法在本领域中是已知的，并且例如描述于WO2012/118535中，其全文通过引用并入本文，包括该参考文献中引用的出版物，例如在第26-31中引用的。

然而如金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌)的致病菌的生物膜可引起很高的抗细菌感染，已发现Lf Qi6的生物膜及其提取物具有抗生态失调和抗生物膜(例如致病菌)性质、皮肤屏障增强以及对人角质形成细胞和离体人皮肤培养物的免疫调节作用。

此外，共培养研究已经显示，0.5-1.0mg/ml的Lf Qi6生物膜提取物减少了皮肤上的致病生物膜的负担，同时促进了共生细菌的生长。提高寄居共生细菌的相对比例可以减少表面致病菌生物膜的负荷。

在示例性实施方式中，致病性细菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，共生细菌是表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。

在疾病引起微生物侵入身体组织的部位发生感染。这些微生物和它们产生的毒素与身体组织发生反应，常常引起感染宿主的免疫反应。感染可能是由细菌、病毒、类病毒、真菌和其他寄生虫引起的。感染可能通过身体的任何组织发生，例如皮肤、肠道或膜。在具体的实施方式中，本发明提供了用于治疗和/或预防身体外表面，特别是皮肤感染的组合物。感染可能由细菌引起，如致病性葡萄球菌。本文提供的药物组合物可以分开施用，依次或同时暴露于感染剂例如MRSA。在其他实施方式中，本发明提供了用于治疗肠内和其他内部疾病的材料和方法。

金黄色葡萄球菌主要是在身体的湿润、温暖的区域，如腹股沟、腋窝和前鼻孔中，是一种皮肤的暂时性寄居者。高达60％的人口是间歇性携带者，而另外20％的人口可能会稳定寄居。尽管正常的携带是无症状的，但是金黄色葡萄球菌可能侵入组织(例如，通过破损的皮肤)，在那里它引起疾病，从较小的脓疱和烫伤的皮肤症状到危及生命的疾病如败血病。此外，金黄色葡萄球菌感染常常是具有如遗传过敏性皮炎(AD)的潜在病症的皮肤中的继发现象。

本发明提供的示例性组合物可用于治疗许多致病菌的感染，包括但不限于葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、腐生葡萄球菌(Staphyloccus saprophyticus)、木糖葡萄球菌(Staphyloccocus xylosus)、路邓葡萄球菌(Staphyloccocus lugdunensis)、施氏葡萄球菌(Staphyloccocus schleiferi)、山羊葡萄球菌(Stapylococcus caprae)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、耐万古霉素肠球菌(vancomycin-resistant Enterococcus，VRE)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)、唾液链球菌(Streptococcus salivariu)，变异链球菌(Streptococcus mutans)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)。本领域技术人员将容易地认识到其他致病菌。

本文提供的某些组合物显示出抗金黄色葡萄球菌尤其是MRSA活性，因此可用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染，包括抑制细菌生长、抑制细菌粘附和促进细菌分离。

根据本发明，已经发现Lf Qi6在体内和在活的离体人类皮肤外植体模型中都具有抗粘附、抗MRSA生物膜的抑制和分离活性。Lf Qi6MRSA抗生物膜活性有几种潜在的机制。例如，Lf Qi6或其提取物可以含有抗生物膜肽或热休克蛋白，和/或(p)ppGpp-阻断剂。来自LfQi6的全基因组测序的蛋白质组分析给出几种独特的热休克蛋白和其他相关的应激蛋白。

本发明的一些实施方式提供了通过上调皮肤屏障蛋白的表达来实现皮肤屏障功能的增强。在其他实施方式中，通过调节皮肤固有免疫肽和/或炎性细胞因子的表达来提供皮肤先天免疫功能的增强。

在一些实施方式中，从Lf Qi6生物膜提取的生物活性剂对过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)即PPAR-α、PPAR-β/δ和/或PPAR-γ具有对抗活性。PPAR是一组核受体蛋白质，并作为转录因子调节基因表达以响应各种生理刺激。它们的结构高度保守，由氨基末端激活结构域(AF1)、锌指DNA结合结构域、配体结合羧基末端结构域和c末端第二激活结构域(AF2)组成。

PPAR-α在代谢活性组织如棕色脂肪、肝脏、心脏、肌肉、肾脏、免疫细胞中表达。其配体包括二十二碳六烯酸(DHA)、WY 14643、氯贝丁酯、氧化磷脂、邻苯二甲酸酯和各种除草剂。已知前三种配体增加丝聚合蛋白和热休克蛋白27(HSP27)。PPAR-α是肝脏脂质代谢的主要调节剂，在能量隗帆的条件下被激活以启动酮生成，适应长时间禁食。PPAR-α合成配体包括抗高血脂的贝特类药物。因为PPAR-α配体调节肝脏脂质代谢，所以它们可用于治疗脂肪性肝炎或脂肪肝。

PPAR-β/δ在包括皮肤、肠道、肝脏、心脏、骨骼肌、肺、脑、胸腺、脾脏、角质形成细胞和各种免疫细胞的代谢活性组织中表达。其配体包括GW1514和视黄酸。PPAR-β/δ的激动作用改变了人体对葡萄糖到脂质的燃料偏好，但也被证明在脑胼胝体的髓鞘形成、表皮细胞增殖以及分化、脂质积累、定向感应、极化和角质形成细胞迁移中起作用。

PPAR-γ是无处不在表达的，尽管主要存在于脂肪组织、结肠和巨噬细胞中。由于其配体包括噻唑烷二酮(TZD)罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮，PPARγ也被称为“格列酮”受体。作为脂肪细胞分化的调节剂，其作为脂肪酸储存和葡萄糖代谢的调节剂是重要的。具有PPAR-γ位点活性的化合物作为糖尿病、胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖症、动脉粥样硬化性心脏病和其他代谢障碍状态的口服、注射或其他全身治疗具有特别有价值的药理学潜力。尽管配体介导的PPARγ受体活化是负责抑制培养的人乳腺癌、胃癌、肺癌、前列腺癌和其他癌细胞系的生长(46)。

因为PPAR对抗细胞凋亡和细胞分化、抗炎活性以及脂质和葡萄糖代谢具有显著影响，所以本发明的实施方式还提供了Lf Qi6生物提取物作为局部或全身药学试剂在各种由于PPAR激动的失调具有特别有价值的用途，包括代谢障碍、慢性炎症状态、肥胖症、胰岛素抵抗、糖尿病、代谢综合征、动脉粥样硬化、脂肪性肝炎、阿尔茨海默氏病以及皮肤病如脱发、急慢性伤口、慢性皮肤病炎症如遗传过敏性皮炎、红斑痤疮、痤疮、皮脂溢性皮炎以及被认为涉及呼吸道中性粒细胞增多的疾病如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和慢性阻塞性肺病(COPD)。代谢紊乱的治疗可以包括例如调节脂质、葡萄糖和/或脂肪酸储存。

在本发明的一些实施方式中，皮肤屏障功能的增强通过上调一种或多种选自例如丝聚合蛋白1、丝聚合蛋白2、兜甲蛋白、外皮蛋白、连接蛋白和/或桥粒蛋白的皮肤屏障蛋白的表达来实现。

在一些实施方式中，通过调节一种或多种天然免疫肽和/或炎性细胞因子的表达来实现皮肤固有先天免疫功能的增强，所述一种或多种先天免疫肽和/或炎性细胞因子已经与减少的皮肤表面上的致病生物膜负荷相关联。

在一些实施方案中，先天免疫肽选自人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3、人抗菌肽(cathelicidins)(LL-37)及其组合。

在一些实施方式中，炎性细胞因子选自白介素-1α、白介素-4、白介素-13、胸腺基质淋巴蛋白(TSLP)及其组合。

本领域技术人员将容易地识别出调节人皮肤屏障、免疫和抗炎症功能的其它蛋白质、肽和细胞因子。

在某些实施方式中，本发明还提供了清洁产品、洗涤剂、表面涂层或其他组合物形式的抗菌组合物，其不用于人体或动物体的医学治疗。因此，在具体的实施方式中，这些组合物被用于消毒无生命的表面。

另一方面，本发明提供了治疗人类皮肤病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述组合物优选包含一种或多种Lf Qi6生物膜的生物活性提取物。

如本文所用，“受试者”意指人类或非人类动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、山羊、非人灵长类动物或鸟类，如鸡，以及任何其他脊椎动物或无脊椎动物。

本文提供的药物组合物的施用优选以“治疗有效量”，这是足以引起正在治疗的细胞、组织、系统、动物或人的生物或医学反应的量。实际给药量以及给药的速度和时间过程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度以及受试者。治疗的处方，例如决定剂量等，是一般执业医师和其他医生的责任，并且通常考虑到要治疗的病症、个体患者的状况、递送部位、给药方法和执业医师已知的其他因素。

组合物可以单独施用或与其它治疗组合施用，或者依赖于待治疗的病症同时或依次施用。本文提供的药物组合物可以溶解于、悬浮于或混合于一种或多种其他药学上可接受的成分中。组合物也可以存在于脂质体或其他微粒中。

在优选的实施方式中，药物组合物被配制用于局部给药，特别是用于皮肤或应用于皮肤上。这样的制剂可用于去除、杀死或防止诸如MRSA的致病细菌在生物或非生物表面上的粘附和积聚，或抑制细菌的作用或生长。此外，在具体的实施方式中，包含Lf Qi6的生物膜或其提取物的组合物具有促进人皮肤微生物组中的共生细菌生长的优点。共生细菌的非限制性实例包括但不限于表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、轻型链球菌(Streptococcus mitis)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

本文提供的药物组合物可以合适地提供为用微生物生物膜和/或其一种或多种提取物以及任选的一种或多种其他药学上可接受的成分，包括例如穿透剂、增透剂和吸收促进剂，浸渍或涂覆的贴剂、绊创膏、绷带、敷料或类似物。

根据本发明的实施方式的抗菌组合物可用于在施用到或治疗受试者之前处理生物材料、植入物和假体(包括支架、瓣膜、眼睛、助听器、胃带、假牙、人造关节替代物等)、手术器械或其他医疗装置。所述抗菌组合物可用于处理易于定植或暴露于细菌的表面，例如扶手、食物准备表面、厨房表面或设备、桌子、水槽、马桶或其他浴室配件。

抗微生物组合物可以包含除微生物(例如Lf Qi 6)生物膜或其生物活性提取物之外的试剂，例如清洁剂、稳定剂、阴离子表面活性剂、香料、螯合剂、酸、碱、缓冲剂或去污剂。这样的试剂可促进或增强组合物的抗菌性能，如杀灭或抑制细菌，或防止清洁表面的重新定植。

示例性实施方式假设受试者是受选自皮肤屏障功能障碍、皮肤生态失调、皮肤先天免疫功能障碍及其组合的病症影响的受试者。

本文提供的实施方式可用于治疗例如牛皮癣、鱼鳞病、结节病、动脉粥样硬化、炎性肠病、痤疮(包括化脓性汗腺炎)、皮炎、伤口愈合、痤疮(包括化脓性汗腺炎)、烧伤、尿布疹、奈瑟顿综合征、光化性角化病、皮肤真菌病、皮肤病或外胚层发育不良、遗传过敏性皮炎、接触性皮炎、皮脂溢性皮炎、寻常型、嗜酸性食管炎、丝聚合蛋白缺乏症和/或与皮肤屏障损伤或破坏有关的其他病症。

在一些实施方式中，屏障的修复或再生包括修复或再生粘膜。粘膜包括口腔黏膜(包括面颊粘膜、软腭、舌头，包括舌下表面和口底)、鼻、喉(包括咽粘膜、喉、气管和食管)、支气管、肺、眼睛、耳朵、胃肠道、阴道、阴茎、尿道、膀胱和肛门。

在某些实施方式中，本发明的组合物还可以有效用于治疗急性和慢性病毒感染。特别是慢性EB病毒、巨细胞病毒和其他疱疹病毒感染的治疗，这些病毒在人群中无处不在，并且与免疫监视的降低有关。

另一方面，本发明提供了用于改善人类皮肤状况的化妆品组合物，其包含生物纯的细菌菌株和/或其一种或多种生物活性提取物以及化妆品可接受的赋形剂。在优选的实施方式中，组合物包含Lf Qi6生物膜的生物活性提取物。

这里使用的“化妆品”是非治疗性的。这样的组合物不针对通过治疗来治疗人或动物。例如，该组合物可以增强皮肤的水合度。已知提高的水合度水平改善了皮肤的外观并导致更健康的美容外观。

在一些实施方式中，化妆品可接受的赋形剂包含用于选自洗剂、霜剂、乳剂、软膏剂、凝胶剂、精华素及其组合的制剂的物质。

根据本发明的实施方式的化妆品组合物具有屏障保持和修复活性。如此，它们可用于防止屏障功能减少和/或加强屏障功能。这对于改善皮肤的水合和/或改善皮肤的外观可能是有用的。

适合于皮肤和/或经皮给药的制剂包括但不限于凝胶、糊剂、软膏、乳霜、洗剂和油剂，以及贴剂、绊创膏、绷带、敷料、补给剂(depots)、胶合剂(cements)、胶水和储液。

软膏通常由本文提供的化妆品组合物和石蜡或水可混溶的软膏基质制备。

通常由本文提供的化妆品组合物和水包油乳霜基质制备乳霜。如果需要，乳霜基质的水相可以包括例如至少约30％w/w的多元醇，即具有两个或更多个羟基的醇，例如丙二醇、丁烷-1,3-二醇、甘露糖醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇以及它们的混合物。

如本领域技术人员将容易理解的，根据本发明的制剂还可以包含其他醇，如异丙醇或乙醇，并且还可以包括其他醇基制剂，例如基于酒精的手部消毒剂。

局部制剂可以理想地包括增强活性化合物通过皮肤或其他受影响的区域的吸收或渗透的化合物。这种皮肤渗透促进剂的实施例包括二甲基亚砜和相关的类似物。

乳液通常由本文提供的化妆品组合物和油相制备，可任选仅包含乳化剂(emulsifier)(也称为乳化剂(emulgent))或者其可包含至少一种乳化剂与脂肪或油或两者的混合物。优选地，将亲水乳化剂与作为稳定剂的亲脂性乳化剂一起包括在内。包括油和脂肪两者也是优选的。有或者没有稳定剂的乳化剂一起构成所谓的乳化蜡，并且蜡与油和/或脂肪一起构成所谓的乳化软膏基质，其形成乳霜制剂的油性分散相。

合适的乳化剂和乳化稳定剂包括吐温60、司盘80、鲸蜡硬脂醇、肉豆蔻醇、甘油单硬脂酸酯和十二烷基硫酸钠。用于制剂的合适的油或脂肪的选择是基于获得所需的美容特性，因为活性化合物在可能用于药物乳剂制剂中的大多数油中的溶解度可能非常低。因此，乳霜应该优选是不油腻的、不污染和可洗的产品，具有合适的稠度以避免从管或其他容器泄漏。直链或支链的一元或二元烷基酯如二异己二酸酯(di-isoadipate)、异鲸蜡醇硬脂酸酯、椰子脂肪酸丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己酯或可以使用被称为Crodamol CAP的支链酯，后三个是优选的酯。这些可以单独或组合使用，取决于所需的性能。或者，可以使用高熔点脂质如白色软石蜡和/或液体石蜡或其它矿物油。其他制剂包括牙科喷雾剂、漱口水、牙膏、锭剂、抗菌洗剂、饮料(例如牛奶、酸奶)、食品(如酸奶、冰淇淋、糖果)或粉状食品(如奶粉)。

在一些实施方式中，化妆品组合物具有选自抑制致病生物膜生长、抑制致病生物膜粘附、促进致病生物膜分离、促进共生生物膜生长、增强皮肤屏障功能、增强皮肤先天免疫功能及其组合的生物活性。

另一方面，本发明提供了一种改善人类皮肤状况的方法，包括向受试者施用美容有效量的包含生物纯的细菌菌株和/或其一种或多种生物活性提取物的组合物和化妆品可接受的赋形剂，所述细菌菌株及其提取物能够在浮游生物和生物膜表型两者中生长，所述组合物具有选自抑制致病生物膜生长、抑制致病生物膜粘附、促进致病生物膜分离、促进共生生物膜生长、增强皮肤屏障功能、增强皮肤先天免疫功能，以及它们的组合。在优选的实施方式中，细菌菌株是Lf Qi6。

美容治疗可用于改善皮肤的外观和/或肌理。在一个示例性实施方式中，该方法涉及改善皮肤的水合度或外观。如本文所用，术语“美容方法”不是指通过手术或疗法治疗人体或动物体的方法或在人体或动物体上实施的诊断方法。

被治疗的受试者可以是任何动物或人类。受试者可以是非人类哺乳动物，但更优选是人类。受试者可能是男性或女性。在一些实施方式中，受试者不需要修复他或她的皮肤屏障，或需要治疗感染，如细菌感染。在一些实施方式中，受试者不需要在要施用美容治疗的部位进行治疗。

根据本发明的美容方法优选涉及“美容有效量”的施用。这涉及以有效诱导美容益处的量施用化合物、成分、材料、组合物、剂型等。这属于相关从业人员合理判断的范围。本领域技术人员将会理解，活性化合物的合适剂量以及包含活性化合物的组合物可以根据受试者的不同而不同。

本文提供的药物组合物或化妆品组合物可以包含单一(单位)剂量的益生菌或其裂解物或其提取物。益生菌(完整的、裂解的或提取的)的合适剂量可以在104至1012cfu的范围内，例如104至1010、104至108、106至1012、106至1010或106至108cfu中的一个范围。在一些实施方式中，剂量可以每天施用一次或两次。在一些实施方式中，根据本发明使用的组合物可以包含至少约0.01wt％，约0.05wt％，约0.1wt％，约0.2wt％，约0.3wt％，约0.4wt％，约0.5wt％，约0.6wt％，约0.7wt％，约0.8wt％，约0.9wt％，约1.0wt％，约1.5wt％，约2.0wt％，约3.0wt％，约4.0wt％，约5.0wt％，约6.0wt％，约7.0wt％，约8.0wt％，约10.0wt％，约11.0wt％，约12.0wt％，约13.0wt％，约14.0wt％，约15.0wt％，约16.0wt％，约17.0wt％，约18.0wt％，约19.0wt％，约20.0wt％，约25.0wt％，约30.0wt％，约35.0wt％，约40.0wt％，约45.0wt％，约50.0wt％的Lf Qi6提取物。在一些实施方式中，组合物可以包含至少约0.01wt％至约30wt％，约0.01wt％至约20wt％，约0.01wt％至约5wt％，约0.1wt％至约30wt％，约0.1wt％至约20wt％，约0.1wt％至约15wt％，约0.1wt％至约10wt％，约0.1wt％至约5wt％，约0.2wt％至约5wt％，约0.3wt％至约5wt％，约0.4wt％至约5wt％，约0.5wt％至约5wt％，约1wt％至约5wt％之一的Lf Qi6提取物。

为了本发明的目的，缩写cfu应指“菌落形成单位”，其定义为通过琼脂平板上的微生物计数显示的细菌细胞的数量。

本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开申请均以其与本说明书的明确教导不矛盾的程度全文通过引用并入本文，包括所有附图和表格。

材料和方法

细菌菌株和培养基

将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)ATCC 33591(ATCC，马纳萨斯，维吉尼亚州)在含有20％(v/v)甘油的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)(赛默科技，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中于-80℃贮存。将培养物在37℃培养过夜，在110rpm的摇床振荡器上好氧培养。用分光光度计(SpectraMax Plus384，分子器件，森尼维尔市，加利福尼亚州)读取过夜培养物的光密度并稀释至0.2OD₆₀₀。使用已建立的方案对菌株进行代谢当量和当量空气压PCR以确认MRSA状态(23)。发酵乳酸杆菌Qi6(Lf Qi6)在37℃下在MRS培养基中生长。Lf Qi6是专有菌株。测序该菌株的基因组(基因库登录号LAIK00000000)。Lf Qi6基因组序列的描述其全文通过引用并入(24)，并且其中具体包括的是来自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/LAIK00000000的对全基因组序列的网络访问。从人类微生物群中分离和鉴定表皮葡萄球菌K7，并且使用台面式晶体管、甲酸脱氢酶、电子稳定系统、当量空气压基因的标准PCR测试验证菌株的共生性质(25-26)。

Lf Qi6生物膜的培养

图1示出了种Lf Qi6培养物的过程。Lf Qi6经分离鉴定后，在MRS琼脂平板上培养。然后将培养物在5ml MRS肉汤中在37℃下培养24小时。将1ml培养物转移到具有25ml MRS肉汤的T-150组织培养板中。每隔48小时更换25ml MRS培养基，使得Lf Qi6的生物膜在培养板底部生长成菌苔。然后将培养物培养7天以产生厚的生物膜层。随后将生长的生物膜层刮下并悬浮在新鲜培养基中。用甘油制成冷冻原液并储存在-80°。

图2示出了Lf Qi6生物膜的放大生产。将冷冻原液中的Lf Qi6的生物膜表型在10ml新鲜的MRS培养基中在37℃下培养24小时。将10ml培养物接种到具有500g无菌玻璃棉的25L MRS培养基中。然后将生物膜在37℃的静态条件下培养72小时。每24小时轻轻摇动将培养物混合，然后收集培养基和玻璃棉。随后通过超声处理将生物膜细胞从玻璃棉上分离。将细胞进一步离心以浓缩Lf Qi6的生物膜，然后将其悬浮于无菌水中。该放大生产产生浓度为50g/25L的生物膜培养物。图4中进一步说明Lf Qi6生物膜生长，其中如本文所述在放大的培养物中的基质上培养生物膜。

Lf Qi6生物膜下游处理

Lf Qi6生物膜的下游处理如图3所示。将50g Lf Qi6的生物膜表型悬浮在1L无菌水中。将悬浮液在室温下温和混合24小时以允许多种生物活性剂的被动释放。然后使用OmniSonic Ruptor 400将混合物超声处理30分钟(50KHz，200瓦特)，获得均匀的裂解物。然后将超声后的裂解物冷冻并冻干成细粉。

人类角质形成细胞系的培养

HEKa细胞购自美国生命科技公司(Life Technologies)(格兰德岛，纽约，美国，Cat#C-005-5C)。将HEKa细胞维持在补充有人角质形成细胞生长补充剂(Cat#S-001-5)的培养基154(美国生命科技公司，格兰德岛，纽约，美国，Cat#M-154-500)中。

人类离体器官培养

整容手术后获得人体皮肤的手术标本。所有样本均来自已知情同意的患者，使用过量皮肤标本进行研究。在补充有1％抗生素-抗真菌溶液(青霉素、链霉素、两性霉素)(Hyclone，赛默科技，洛根，犹他州)的具有L-谷氨酰胺(ATCC，马纳萨斯，维吉尼亚州)的新鲜Eagle氏最低必需培养基(EMEM)中将皮肤运输到实验室。(切割前将培养基和皮肤保存在4℃)。培养物的培养基由补充有人重组表皮生长因子(0.2ng/ml EGF)、牛垂体提取物(30μg/ml BPE)(美国生命科技公司，格兰德岛，纽约)和1％抗生素-抗真菌溶液的角质形成细胞完全无精华素培养基组成。6孔板用每孔用1.3ml培养基和一个Millicell-CM细胞培养池(0.4μm，直径30mm)(EMD Millipore，比勒利卡，马萨诸塞州)制备。通过在无菌培养皿中用新鲜补充的EMEM温和洗涤来制备用于切割的外植体样品。用无菌钳将外植体移至含有EMEM的新鲜培养皿中，使用无菌外科剪刀切成1cm²的小块，并置于6孔板中的细胞培养池上，使皮肤的下侧部分暴露于空气(空气-液体界面)。在实验方案的基础上，在37℃，5％CO₂的条件下，在细胞培养池上在气-液界面上培养5-7天，每天更换培养基。

从益生菌制备Lf Qi6

发酵乳酸杆菌Qi6使用专有培养方法在MRS培养基中生长。然后再次使用专有培养方法将细菌继代培养到500ml MRS培养基中一段时间。将细菌超声处理(Reliance Sonic550，STERIS公司，曼托尔，俄亥俄州，USA)，以10,000g离心，将细胞团块分散于无菌水中，裂解收获的细胞(Sonic Ruptor 400，OMNI国际，肯尼索，GA，USA)并再次以10,000g离心，并将可溶的部分离心(50kDa Amicon超滤膜过滤器，EMD Millipore Corporation，达姆施塔特，德国，Cat#UFC905008)。将得到的部分分配成0.5ml等分试样，在液氮中快速冷冻并在-80℃下储存。

生物膜抑制测定

将MRSA加入无菌聚苯乙烯，组织培养(TC)处理的平底板(Genesee Scientific，圣地亚哥，加利福尼亚州，Cat#25-109)的孔中。TSB作为无菌控制。生长对照孔接受相等部分的MRSA和培养基。加入选定浓度的Lf Qi601或其他测试剂，将平板在37℃培养18小时，然后按照染色和生物膜定量部分所述对生物膜定量。

生物膜分离测定

将MRSA加入到无菌TC平板的孔中并在37℃下培养18小时。使用BioTek 405选择性LS微型板清洗仪(BioTek，威努斯基，VT)将板用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)(ThermoScientific，沃尔瑟姆，MA)洗涤三次。每孔加入新鲜的TSB。加入选定浓度的LfQi6，然后将平板置于37℃的培养箱中10分钟。如下所述将剩余的生物膜染色和定量。

抗生物膜粘附分析

TC板的孔用选定浓度的LfQi6或其他测试剂涂覆；生长对照和阴性对照孔接收PBS，并在4℃静态过夜培养。使用BioTek微型板清洗仪用PBS洗涤平板三次。洗涤后，加入MRSA，将平板在4℃培养5小时。粘附的生物膜被染色和定量。

染色和生物膜定量

使用BioTek板清洗仪将板洗涤三次，并置于47℃培养箱中1小时以热固定生物膜。将平板冷却至室温，用0.1％(v/v)结晶紫染色15分钟，然后用微型板清洗仪用去离子水洗涤。加入100％乙醇30分钟以溶解结晶紫染料。使用分光光度计(SpectraMax Plus384，Molecular Devices，森尼维尔市，加利福尼亚州)在590nm和600nm读取板。

离体皮肤生物膜研究

使用Hochstim等人开发的苏木精-曙红染色方案确认了离体皮肤中生物膜的组织学检查(2010)(27)。用选定浓度的Lf Qi6处理离体皮肤培养物，接种100μl低或高密度MRSA培养物，过夜培养。然后将皮肤组织均质化、稀释并在TSB平板上培养以定量每个样品的菌落形成单位(CFU)。

体外致病和共生共培养研究

六孔板用Lf Qi6或细菌培养物处理5小时。在TSB中制备具有相同光密度(OD)的MRSA和表皮葡萄球菌K7接种物。将两毫升这些混合物一式三份地接种在6孔板的处理孔和对照孔中。

人类皮肤外植体离体致病和共生共培养研究

将皮肤外植体表面用Lf Qi6处理，化学洗涤剂0.2％Triton作为阳性对照或PBS作为阴性对照处理，并在37℃，5％CO₂下培养过夜。在TSB中制备具有相同光密度的MRSA和K7培养物。皮肤表面接种50μl的每种细菌培养物并在37℃培养过夜。然后将皮肤组织匀浆，稀释，并在TSB和ORSAB平板上培养以量化和区分每个组织的致病性CFU和共生性CFU。

丝聚合蛋白ELISA

使用人丝聚合蛋白ELISA试剂盒(EIAab，武汉，中国，Cat#1186h)来定量丝聚合蛋白。处理过的皮肤外植体组织用1ml与蛋白酶抑制剂混合物(赛默科技，Cat#78425)混合的PBS匀化，并在-20℃冷冻过夜。然后将样品进行两次冷冻解冻循环以破坏细胞膜。匀浆物以10000×g离心5分钟。将上清液等分并在-20℃/-80℃储存2-5天。按照制造商的说明来量化皮肤外植体匀浆中丝聚合蛋白的水平。测定在一式三份/样品的条件下进行。使用Pro软件(Molecular Devices，森尼维尔市，加利福尼亚州，USA)在MolecularDevice公司的SpectraMax Plus384上分析ELISA结果。使用GraphPad Prism版本6.03(GraphPad Software，Inc.，拉荷亚，加利福尼亚州，USA)进行统计分析。

免疫组织化学

在5μm石蜡包埋的NEM切片上进行形态学和免疫荧光分析。为了分析形态，将皮肤外植体固定在10％福尔马林中，切片，去石蜡，再水化，并用苏木精和伊红(HE)染色。为了分析丝聚合蛋白表达，将切片切割，脱蜡并再水化，然后进行热介导的抗原修复。在使用含有1％牛精华素白蛋白(BSA，Sigma)和2％正常人精华素(NHS，Sanquin，Leiden，荷兰)的PBS阻断非特异性结合之后，将切片与丝聚合蛋白第一抗体在4℃培养过夜(1:1000；Covance，鹿特丹，荷兰)。用PBS洗涤后，将切片与二级山羊抗兔抗体(罗丹明红，1:300，Jackson ImmunoResearch，阿姆斯特丹，荷兰)培养。然后将切片与链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶在室温下一起培养10分钟。用缓冲液冲洗4次。将DAB色原添加到切片中以显现染色5分钟。载玻片用苏木精溶液复染1分钟。制备不加抗体的阴性对照。同型对照也包括在方案中。使用含有DAPI的防荧光淬灭封片剂(Vectashield)安装切片，以观察细胞核(Vector实验室，阿姆斯特丹，荷兰)。通过修改Tuominen等人开发的方案(2010)(28)进行来自免疫染色载玻片的不同的8-9个区域的定量免疫分析。

RNA分离，cDNA合成和qPCR分析

用于qRT-PCR的组织外植体在液氮中快速冷冻。使用RNA水溶液-4PCR试剂盒(Ambion)根据生产商的说明分离和纯化总RNA，并储存在-80℃直到逆转录。对于实时PCR分析，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，福斯特市，CA)根据制造商的说明书从0.1μg总RNA合成cDNA。使用Power SYBR Green PCR反应混合物在7500实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行定量PCR。引物选自文献(表S1)并从IDT技术获得。循环条件如下：在50℃下2分钟，在95℃下10分钟，以及在60℃下15秒和在60℃下1分钟的40个循环。反应后进行解离步骤，并评估解链曲线的引物特异性。每个模板的PCR都在96孔板中一式三份地进行。使用比较性CT(ddCT)方法和Data AssistTM软件(Applied Biosystems)将mRNA表达水平标准化为β-微球蛋白参考基因。包括每个引物组合的不含模板的阴性对照反应。

RNA分离，cDNA合成和qPCR分析

用于qRT-PCR的组织外植体在液氮中快速冷冻。使用RNA水性-4PCR试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书分离和纯化总RNA，并储存在-80℃直到逆转录。对于实时PCR分析，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，福斯特市，加利福尼亚州)根据制造商的说明书从0.1μg总RNA合成cDNA。使用Power SYBR Green PCR主混合物在7500实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行定量PCR。引物选自文献(表S1)并从IDT技术获得。循环条件如下：在50℃下2分钟，在95℃下15秒的40个循环，以及在60℃下1分钟。反应后进行解离步骤，并评估解链曲线的引物特异性。每个模板的PCR在96孔板中一式三份地进行。使用比较性CT(ddCT)方法和Data AssistTM软件(Applied Biosystems)将mRNA表达水平标准化为β-微球蛋白参考基因。每个引物组合都包括不含模板的阴性对照反应。

统计分析

各种参数的定量数据以图中的平均值±SEM(平均值的标准误差)表示。通过单向方差分析检验确定各参数的统计学显著性差异。当存在显著差异(P≤0.05)时，使用纽曼-科伊尔斯多重比较检验比较平均值。使用统计软件GraphPad Prism(GraphPad Software，Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州)进行统计分析。

我们的qRT-PCR结果显示，与PBS基线相比，用生物提取物处理的皮肤中丝聚合蛋白上调大约250倍。我们确认通过ELISA和免疫组织化学增加丝聚合蛋白生产。

以下是说明实施本发明的程序的实施例。这些实施例不应被解释为限制。

实施例1-Lf Qi6生物膜表型与浮游生物表型不同

产品提取和蛋白质评估显示生物膜和浮游生物表型之间不同的蛋白质水平，如下表1所示。图5中的SDS数据进一步证实了这种差异，如在Lf Qi6生物膜表型中表达的额外条带所示，其在浮游生物表型中不存在，表明生物膜的生物提取物中的独特蛋白质。图6和7中的分子筛HPLC数据显示了从Lf Qi6生物膜与浮游生物表型制备的生物提取物中的蛋白质之间的分子量差异。

评估在6孔板中的Lf Qi6生物膜和浮游生物表型对MRSA的抗生物膜活性，如图8所示，阴性对照是在TSB中生长的富含GC的MRSA培养物，并且阳性对照是用万古霉素处理的MRSA生物膜。将MRSA培养物用0.5％葡萄糖接种并在37℃培养过夜。在浮游生物或生物膜全细胞表型中分别以0.5mg/mL和1.0mg/mL的Lf Qi6在每个孔中在4℃下涂覆2小时。在观察中包括用于每种表型的两种不同浓度的消耗的LfQi6培养物的>50kDa残余物。很明显，Lf Qi6生物膜表型的提取物在0.5mg/mL和1.0mg/mL两种情况下均表现出对MRSA生物膜生长的抑制。这些结果被量化并呈现于图9中，其中与对照和浮游生物培养基相比，LF Qi6生物膜培养基显著降低MRSA的菌落形成单位。

评估了浮游生物和生物膜培养基的Lf Qi6培养基部分(>50kDa的提取物)对共生细菌表皮葡萄球菌的促进作用(图10)。结果清楚地表明，生物膜培养基在增加表皮葡萄球菌生长的优势在70％以上，而浮游生物表型在促进共生生物膜生长方面仅有不到40％的效果。在图11所示的图表中比较了表皮葡萄球菌在Lf Qi6生物膜和浮游生物培养基存在下的菌落形成单位的定量。此外，图12显示了对照(即表皮葡萄球菌生长培养物)、具有来自浮游生物培养基的Lf Qi6生物提取物(>50kDa)的表皮葡萄球菌和具有来自生物膜培养基的LfQi6生物提取物(>50kDa)的表皮葡萄球菌的可视比较结果。

实施例2-生物膜在体外对MRSA具有抗生物膜活性：抑制作用、抗粘附作用和分离作用

Lf Qi6的各种抗生物膜活性最初通过96孔板测定体外评估，包括抑制、抗粘附和分离。生物膜抑制测定法评估当与Lf Qi6共培养时MRSA的新的生物膜形成能力。结果证明，在24小时共培养时测得在0.5-1.0mg/mL的Lf Qi6抑制40-50％的MRSA生物膜形成(图19A)。抗粘附试验评估Lf Qi6阻止MRSA结合到表面的能力。用0.5-1.0mg/mlLf Qi6进行过夜预处理，随后进行5小时MRSA生物膜暴露，在24小时培养测定中阻断80-85％MRSA生物膜粘附(图19B)。生物膜分离测定证明了Lf Qi6去除预先形成的生物膜的能力；在5分钟的处理中，0.5-1.0mg/mL的Lf Qi6分离了30％的MRSA生物膜(图19C)，在更大格式的组织培养板(6孔板，8.5cm²，图19D)中获得了相似的结果。

实施例3在离体人皮肤器官培养系统中，LfQi6快速分离MRSA生物膜

为了将生物膜接种到从手术标本获得的活的人类皮肤外植体上，对体外器官型人类皮肤培养系统进行了优化。将MRSA生物膜培养物接种到离体表面上并使其生长48小时。通过染色观察生物膜，在24至48小时内在皮肤上形成坚固的生物膜(图19E)。比较处理前和处理后，在用0.5-1.0mg/mL Lf Qi6处理10分钟时观察到MRSA生物膜负荷的显著降低(图13)。

实施例4-Lf Qi6选择性地增强表皮葡萄球菌，同时在体外和离体皮肤上减少MRSA

利用MRSA和表皮葡萄球菌在6孔致病菌-共生共培养模型中进行了Lf Qi6生物膜调节特性的初步研究。结果表明，以0.5-1.0mg/mL施用的Lf Qi6在促进共生细菌的同时降低了MRSA生物膜病原体负荷(图14A)，在离体人类器官培养系统(图14B)中具有相似的结果。

实施例5-Lf Qi6在RNA表达和蛋白质水平上上调皮肤屏障稳态蛋白、丝聚合蛋白，并显著增加离体人类器官培养系统中的丝聚合蛋白免疫组织化学染色

丝聚合蛋白免疫组织化学显示在用0.5-1mg/ml Lf Qi6处理6小时的离体人类器官培养系统的样品的表皮上丝聚合蛋白的显著增加的染色(图15A-D)。经Lf Qf6处理的离体皮肤使用ELISA显示丝聚合蛋白增加约3倍(图15E)，以及使用定量PCR使RNA表达增加约250倍(图15F)。

实施例6Lf Qi6增加宿主先天免疫防御肽、人β防御素-1、人β防御素-2和人β防御素-3

图18比较了在不同浓度(分别为0％、0.03％和0.10％)的Lf Qi6生物膜培养物存在下，人β防御素1、人β防御素2和人β防御素3的表达增加，在HEK细胞模型中通过ELISA进行(图18)。结果表明对上述β防御素的表达的剂量依赖性作用以及Lf Qi6对每个特征性β防御素的整体效应的差异。

此外，宿主先天免疫抗微生物肽是皮肤防御系统的组成部分。定量PCR结果显示，与对照相比，用Lf Qi6生物膜处理的皮肤中的HβD-2(图19A)和HβD-3(图19B)上调大约800倍。

实施例7-Lf Qi6生物膜调节过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)

由于Lf Qi6增加丝聚合蛋白生成，并且丝聚合蛋白是PPAR-α的转录产物，因此研究了Lf Qi6提取物刺激PPAR核受体的能力。已显示LfQi6生物膜提取的生物活性物质增加角质形成细胞中PPAR-β和PPAR-γ的表达，如图16中所示。特别地，小分子量级分提取物(<30kD级分，以特定的时间使用特定<30kD的过滤器，如Amicon超滤-15,30KNMWL，cat#UFC903096，通过差速离心全部提取物产生；离心提取物，4,000rpm×45分钟)呈现出具有比未分级的LfQi601提取物更有效的活性。

实施例8-Lf Qi6生物膜可用作各种保湿护肤产品的活性成分

Lf Qi6生物膜提取物可用作多种产品的活性成分，旨在改善皮肤屏障的物理和生化功能特性。例如，Lf Qi6生物膜提取物可用于减少经表皮的水分流失，进而改善皮肤水合度。以下示例性制剂涉及各种护肤产品，包括化妆水(face lotion)、眼霜、精华素和洗面奶。每种成分分别以其化妆品成分(INCI)名称的商标/品牌名称和国际命名法以百分比组成表示。还包括制备每种制剂的典型特性和方法。

表4中提供了天然保湿因子(NMF)的制剂。使用以下程序制备化妆水。在不断搅拌下将油相(除了神经酰胺)升温至75℃。将水相加热至70℃。在最佳温度，如70℃下，将油相缓慢加入到水相中，并使混合物在70-75℃下持续搅拌10分钟进行乳化。随后将混合物在搅拌下冷却至约45-50℃。将神经酰胺、防腐剂、活性物质和复合香精加入到混合物中并再搅拌10分钟。然后将混合物用手持式混合器进一步混合约2-4分钟，随后在真空混合器中剧烈混合4分钟。将所得的乳液混合物冷却至室温并包装入瓶中。下表列出了化妆水的典型特性。

使用以下程序制备眼霜。在不断搅拌下将油相(除了神经酰胺)升温至75℃。将水相加热至70℃。在最佳温度，如70℃下，将油相缓慢加入到水相中，并使混合物在70-75℃下持续搅拌10分钟进行乳化。随后将混合物在搅拌下冷却至约45-50℃。将神经酰胺、防腐剂、活性物质和复合香精加入到混合物中并再搅拌10分钟。然后将混合物用手持式混合器进一步混合约2-4分钟，随后在真空混合器中剧烈混合4分钟。将所得的乳液混合物冷却至室温并包装入瓶中。下表列出了眼霜的典型特性。

通过将表7中列出的成分以其中所示的顺序混合，并轻轻搅拌以使透明质酸完全水合并掺入混合物中来制备精华素。使用柠檬酸将pH调节至约4.5-5.0。表8中列出了精华素的典型特性。

使用以下程序制备洁面乳。首先将水加入到混合容器中，并将容器打开至低速(100-150rpm)。依次加入木糖醇、泛醇、烟酰胺、NMF、超级Geogard并溶于水中。随后将Geogard 221和Lf Qi6生物提取物加入到混合物中。然后将MiraCare Plaisant加入到混合物中并搅拌直至混合物变澄清。将Miranol超级32加入到混合物中并搅拌直至混合物变澄清，随后向混合物中加入Plaanteron 2000。然后搅拌该混合物直至变澄清，随后用柠檬酸调节其pH值。洁面乳的典型性质列于下表10中。

实施例9-嗜酸细胞性胃肠疾病的治疗

嗜酸性胃肠道疾病在过去几十年中显著上升。在这些疾病中，嗜酸性粒细胞性食管炎是最常见的。目前的治疗是困难的和/或涉及全身类固醇暴露。例如，不含食物过敏原如牛奶、小麦、海鲜和大豆的要素饮食对患者是有效的，但是负担很重。因此，经常使用外用类固醇的口服浆液。这具有将治疗组分直接递送至发炎组织的优点。尽管有效，但口服类固醇可能具有潜在的副作用，例如免疫抑制、生长速度降低和不良的骨密度效应。急需有效的、无负担的、不含类固醇的治疗嗜酸性胃肠疾病。粘膜粘附剂有利地用于增加局部组织暴露于制剂的活性成分。在这里我们描述了含有乳酸杆菌属提取物的稳定的高粘度口服凝胶型的药物制剂。如果需要，可以加入类固醇如布地奈德(例如总制剂的0.01％)。

将Lutrol F127和对羟基苯甲酸酯溶于水中加热至80℃

加入丙二醇和乳酸杆菌提取物。

保持加热直到获得透明的无色凝胶。

*可以使用替代的粘膜粘附剂，如羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或氢化羟丙基纤维素。

应该理解，这里描述的实施例和实施方式仅用于说明的目的，并且将提示本领域技术人员对其进行各种修改或改变，并且将被包括在本申请和所附权利要求书的精神和范围内。

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Claims (34)

1.一种包含生长为生物膜的分离的生物活性发酵乳酸杆菌菌株和/或包含所述生物膜的生物活性提取物的组合物，其中所述菌株和/或其提取物的生物活性选自抗微生物活性、对抗过氧化物酶体增殖激活受体（PPAR）促进共生细菌生长、增强皮肤和/或粘膜屏障功能和增强皮肤和/或粘膜先天免疫功能。

2.根据权利要求1所述的组合物，其包含发酵乳酸杆菌生物膜的生物活性提取物。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含化妆品可接受的赋形剂。

5.根据权利要求4所述的组合物，其为洗剂、乳膏、乳液、软膏、油状物或凝胶的形式。

6.根据权利要求1所述的组合物，还包含含有醇的载体。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗微生物活性选自抑制生物膜生长、抑制生物膜粘附和促进生物膜分离。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物对PPAR是有抗性的。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物引起共生细菌种群的增加和致病种群的减少。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述增强屏障功能或先天免疫功能包括增强粘膜屏障功能或粘膜先天免疫功能。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物调节代谢活性。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述代谢活性包括脂质、葡萄糖和/或脂肪酸储存。

13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细菌菌株是登录号为PTA-122195的发酵乳酸杆菌Qi6。

14.一种治疗疾病的方法，其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的权利要求1的组合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病是皮肤病学疾病。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病是粘膜或肠疾病。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病是代谢障碍。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法调节脂质、葡萄糖和/或脂肪酸储存。

19.根据权利要求14所述的方法，其中所述治疗是全身性的。

20.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法通过调节一种或多种先天免疫肽和/或炎症性细胞因子的表达来引起皮肤先天免疫功能的增强。

21.根据权利要求18所述的方法，其中所述先天免疫肽选自人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3和人抗菌肽（LL-37）。

22.根据权利要求18所述的方法，其中所述炎性细胞因子选自白介素-1α、白介素-4、白介素-13和胸腺基质淋巴蛋白（TSLP）。

23.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者具有选自皮肤屏障功能障碍、皮肤、生态失调和皮肤先天免疫功能障碍的病症。

24.根据权利要求14所述的方法，其中所述组合物包含发酵乳酸杆菌生物膜的生物活性提取物。

25.根据权利要求14所述的方法，用于治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的感染。

26.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法促进表皮葡萄球菌作为共生菌生长。

27.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，皮肤屏障功能的增强是通过上调选自丝聚合蛋白1、丝聚合蛋白2、兜甲蛋白、外皮蛋白、连接蛋白和/或桥粒蛋白的一种或多种皮肤屏障蛋白的表达来实现。

28.根据权利要求14所述的方法，其中所述细菌菌株是登录号为PTA-122195的发酵乳酸杆菌Qi6。

29.一种改善皮肤状况的方法，其中所述方法包括向受试者施用美容有效量的权利要求1的组合物。

30.一种治疗可以用PPAR激动剂治疗的病症的方法，其中所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用权利要求1的组合物。

31.一种消毒表面的方法，其中所述方法包括向所述表面施用消毒量的权利要求1的组合物。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述表面是无生命的表面。

33.一种制备具有一种或多种选自抗微生物活性、促进共生细菌生长、增强皮肤屏障功能和增强皮肤先天免疫功能的生物活性的组合物的方法；其中所述方法包括培养细菌，从而迫使所述细菌生长为生物膜，收获所述生物膜和/或生物膜的提取物，其中所述生物膜，或其提取物，具有一个或多个的所述生物活性；并用载体配制所述生物膜和/或其提取物。

34.登录号为PTA-122195的发酵乳酸杆菌Qi6的生物纯培养物。