TW201711696A

TW201711696A - 用於促進傷口癒合的吳郭魚抗菌胜肽

Info

Publication number: TW201711696A
Application number: TW105112850A
Authority: TW
Inventors: 吳彰哲; 陳志毅
Original assignee: 中央研究院; 國立臺灣海洋大學
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2016-04-25
Publication date: 2017-04-01
Also published as: CN106063929B; US20160310564A1; TWI610682B; CN106063929A; US9925235B2

Abstract

本發明係關於一種吳郭魚抗菌胜肽(TP)用於製備促進傷口癒合藥物的用途，其中該TP係選自由TP1、TP2、TP3、TP4、TP5、及上述之組合所組成之群組。

Description

用於促進傷口癒合的吳郭魚抗菌胜肽

本發明係關於一種用於促進傷口癒合的新藥物，具體而言是治療傷口抗甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)感染的新藥物。

抗生素的發現已成為現代醫學最偉大的成就之一。然而，在感染性疾病的管理中，無論是在醫院環境或是在社區，抗生素的抗藥性都被認為是世界性的重大問題。不過，由於多重抗藥性的生物體，例如抗甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌(Methicillin-rcsistant Staphylococcus aureus,MRSA)，傷口感染正持續增加。

抗甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌(MRSA)是受傷患者感染的主要原因，而且醫療保健相關的(HA)和社區相關的(CA)MRSA近年來已經變得普遍。MRSA的出現是過度使用某些抗生素的結果。MRSA通常不會在沒有受傷之下引起感染。當MRSA通過割傷或擦傷進入人體時，MRSA可能會藉由避開身體的自然保護機制而引起感染。這使得替代療法的使用成為必要的，替代療法理想上不會通過連續的選擇性壓力而導致抗藥性。MRSA感染近年來已被使用莫匹羅星、克林黴素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、強力黴素、米諾環素、利奈唑胺、萬古黴素、達托黴素、及特拉萬星治療[Bjorn et al.,Anti-infectious and anti-inflammatory effects of peptide fragments sequentially derived from the antimicrobial peptide centrocin 1 isolated from the green sea urchin,Strongylocentrotus droebachiensis.AMB Express 2012,2：67]。同時，萬古黴素、利奈唑胺、達托黴素(Cubicin)、替加環素(Tygacil)、及特拉萬星(Vibativ)據報告可在醫院治療皮膚和軟組織的嚴重MRSA感染。主要用於治療MRSA的萬古黴素具有高的最低抑制濃度(MIC)值和其他限制[Palazzolo-Ballance et al.,Neutrophil microbicides induce a pathogen survival response in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus.J Immunol 2008,180：500-9]。

陽離子基因編碼的宿主防禦胜肽(host defense peptidesm,HDP)是自然界最多樣化且類型豐富的抗生素。HDP被稱為抗微生物胜肽(antimicrobial peptide,AMP)的子類可發揮直接的抗微生物活性。抗微生物胜肽(AMPs)是廣泛的無脊椎動物、植物、及動物的宿主防禦系統的一部分[Lee et al.,A helix-PXXP-helix peptide with antibacterial activity without cytotoxicity against MDRPA-infected mice.Biomaterials.5 2014；35：1025-1039；Wimley & Hristova,Antimicrobial peptides：successes,challenges and unanswered questions.The Journal of membrane biology.2011；239：27-34]。抗微生物胜肽通常對範圍廣泛的細菌、病毒、真菌及原生動物表現出有效的抗微生物活性。抗微生物胜肽的主要特徵在於他們是短的、雙性的、及陽離子型的，抗微生物胜肽擁有快速的滅殺能力，而且他們以細胞的膜和內部成分為目標[Brogden,10 Antimicrobial peptides：pore formers or metabolic inhibitors in bacteria,Nature reviews Microbiology.2005；3：238-250；Yount & Yeaman,Immunocontinuum：perspectives in antimicrobial peptide mechanisms of action and resistance.Protein and peptide letters.2005；12：49-67；Yeaman & Yount,Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance.Pharmacological reviews.2003；55：27-55；Hancock & Scott,The role of antimicrobial peptides 15 in animal defenses.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2000；97：8856-8861]。

抗菌胜肽(Piscidin)AMPs被發現是由多達21~44個殘基組成並具有雙性螺旋結構[Maisetta et al.,In Vitro Bactericidal Activity of Human β-Defensin 3 against Multidrug-Resistant Nosocomial Strains.Antimicrobial Agents and 20 Chemotherapy 2006；50：806-809；Winkler et al.,Unexpected Challenges in Treating 432 Multidrug-resistant Gram-negative Rods：Resistance to Ceftazidime-Avibactam in Archived Isolates of Pseudomonas aeruginosa.Antimicrob Agents Chemother 2014]。在2012年，五種名為吳郭魚抗菌胜肽1-5(tilapia piscidin 1-5,TP1-5)的新抗菌胜肽被從尼羅河吳郭魚(尼羅口孵非鯽，Oreochromis niloticus)分離出[Peng et al.,Five Different Piscidins from Nile Tilapia,Oreochromis niloticus：25 Analysis of Their Expressions and Biological Functions.PloS ONE 2012；7(11)：e50263]。

然而，仍需要開發用於傷口癒合的新治療或新療法，尤其是治療傷口MRSA感染。

意外地發現到五種分離自吳郭魚的抗菌胜肽顯示可有效促進傷口癒合，具潛力作為傷口癒合的治療劑、尤其是傷口MRSA感染的治療劑。

在一方面，本發明提供一種吳郭魚抗菌胜肽(tilapia piscidin,TP) 用於製備促進傷口癒合藥物的用途。

在另一方面，本發明提供一種吳郭魚抗菌胜肽用於製備預防或治療傷口抗甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)感染藥物的用途。

在一個進一步方面，本發明提供一種用於預防或治療傷口MRSA感染的組合物或醫藥組合物。

在又一個方面，本發明提供一種預防或治療傷口MRSA感染的方法，包含施予有需要的個體治療有效量的吳郭魚抗菌胜肽(tilapia piscidin,TP)。

在本發明的一個具體實施例中，該吳郭魚抗菌胜肽(TP)TP係選自由TP1、TP2、TP3、TP4、TP5、及上述之組合所組成之群組。

在本發明的一個特定實例中，該TP為TP3或TP4。

當結合附圖一起閱讀時，將更好地理解前面的概述、以及以下本發明的實施方式。為了說明本發明的目的，在圖式中有圖示出目前較佳的具體實施例。然而，應當理解的是，本發明並不限於此具體實施例。

在圖式中：

圖1圖示尼羅河吳郭魚抗菌胜肽1-5(TP1-TP5)的基因體結構和基因位置。圖1(a)提供五種TP基因的基因體組織比較；這五種尼羅河吳郭魚抗菌胜肽基因位在EXT-1a的第九與第十外顯子之間。兩者都是逆轉錄。圖1(b)圖示以方盒中的數字表示每個外顯子的編碼序列的長度，並以加底線數字表示每個內含子；其中紅色表示轉譯胺基酸序列的區域，灰色表示5’和3’未轉譯區域 (UTRs)。

圖2圖示吳郭魚抗菌胜肽3(TP3)在幼倉鼠腎細胞(BHK-21)的細胞毒性和抗菌活性。在圖2(A)、圖2(B)及圖2(C)中，使用不同劑量的TP3治療BHK-21細胞24小時；而且分別藉由中性紅、LDH及MTT試驗量測細胞存活率。(r=3；n=6)。在圖2(D)中，MRSA是在不同濃度的TP3中培養；而相對細菌增生是在600nm下基於光密度測得。(r=3；n=6)。經ANOVA測定，不同字母的值顯示顯著差異(p<0.05)。

圖3圖示TP3治療對感染MRSA小鼠的效果。圖3(A)圖示，小鼠被注射MRSA(1 x 10⁶cfu/小鼠)，而且單獨的組(n=5)隨後被注射TP3、萬古黴素及甲氧苯青黴素。在每天的基礎上監測存活率長達8天。圖3(B)圖示TP3的治療潛力，其中小鼠先被注射MRSA(1 x 10⁶cfu/小鼠)，然後在10、60、120、或180分鐘後被注射TP3(0.005mg/g)。在這些注射時間時，MRSA實驗組分別表現出100%、80%、60%、及40%的存活率。

圖4圖示在T3治療之後乾淨的和受污染傷口的閉合效果，其中從受傷的時間直到閉合量測全厚度傷口的區域(最初直徑1公分)。圖4(A)圖示所有全厚度無菌傷口都在第25天之前閉合。Meth.，甲氧苯青黴素；Vanc.，萬古黴素。圖4(B)圖示被微生物污染的全厚度傷口大小最初增大，而TP3治療的傷口並沒有表現出初始膨脹，而且比萬古黴素治療的傷口稍快閉合(第25天)。

圖5圖示小鼠體內TP3調節的基因表現分佈。在感染MRSA的小鼠中使用TP3和抗生素治療成年小鼠，而對照組是未治療的。不同天之後，將總RNA從傷口分離並逆轉錄用於即時qPCR分析TNF-α、IL-6及CXCL5基因表現。R>3；n>3。經ANOVA測定，不同符號顯示顯著差異(P<0.05)。表示如下：n.s.，不顯著；*，顯著(P<0.05)；**，顯著(P<0.001)。

圖6圖示TP4對人類纖維母細胞細胞株(Hs68)沒有表現出細胞毒性作用，而且實際上會刺激增生活性。在圖6(A)-(C)中，使用不同劑量的TP4治療Hs68細胞48小時，並藉由中性紅、LDH、及MTT試驗量測細胞存活率。(r=3；n=6)。在圖6(D)-圖6(F)中，使用TP4(6.25μg/ml)治療實驗Hs68細胞，而對照組細胞未治療。48小時之後，分離出總RNA，並逆轉錄用於即時qPCR分析。每個試驗分析六個複製孔。結果表示來自三個獨立實驗的平均值±SEM。(學生的t試驗(Student’s-test)：*，P<0.05；**，P<0.01，n.s.：不顯著)。

圖7圖示TP4對人類角質細胞細胞株(HaCaT細胞)沒有表現出細胞毒性作用，並且實際上刺激增生活性。在圖7(A)-(C)中，使用不同劑量的TP4治療HaCaT細胞48小時，並藉由中性紅、LDH、及MTT試驗量測細胞存活率(r=3；n=6)。在圖7(E)和圖7(F)中，使用TP4(6.25μg/ml)治療實驗HaCaT細胞，而對照組細胞未治療。48小時之後，分離出總RNA，並逆轉錄用於即時qPCR分析。每個試驗分析六個複製孔。結果表示來自三個獨立實驗的平均值±SEM。(學生的t試驗：*，P<0.05；**，P<0.01，n.s.：不顯著)。

圖8圖示TP4治療對感染MRSA小鼠的效果。在圖8(A)中，小鼠被注射MRSA(1 x 10⁶cfu/小鼠)，而且單獨的組(n=10)隨後被注射TP4、萬古黴素及甲氧苯青黴素。在每天的基礎上監測存活率長達8天。圖8(B)，為了測得治療潛力，小鼠先被注射MRSA(1 x 10⁶cfu/小鼠)，然後在10、60、120、或180分鐘後被注射TP4(0.005mg/g)。在這些注射時間時，MRSA實驗組分別表現出100%、80%、60%、及50%的存活率。

圖9圖示乾淨的和受污染傷口的閉合；其中從受傷的時間直到閉合量測全厚度傷口的區域(最初直徑1公分)。圖9(A)圖示所有全厚度無菌傷口都在第25天之前閉合。Meth.，甲氧苯青黴素；Vanc.，萬古黴素。圖9(B)圖示被微生物污染的全厚度傷口大小最初增大，而TP4治療的傷口並沒有表現出初始膨脹，而且比萬古黴素治療的傷口稍快閉合(第21天)。。(r=3；n=6)。

圖10圖示TP4調節MRSA介導誘導的TNF、IL-6、及IL-1。從無麻醉小鼠的腹部取出約1平方公分的皮膚區塊，並使傷口感染50ml含有單獨10⁶個cfu的MRSA或連同抗甲氧苯青黴素、萬古黴素、或TP4的培養液混合物。在感染後不同天，藉由ELISA檢測血清中的(A)TNF、(B)IL-6、及(C)IL-1。(r=3；n=6)。經ANOVA測定，不同字母的值顯示顯著差異(P<0.05)。

圖11圖示TP4影響傷口受感染的小鼠體內的細胞增生基因的表現分佈。使成年小鼠感染MRSA，並使用TP4或抗生素治療，而對照組則受感染但未治療。在指定的天數，將總RNA從傷口分離並逆轉錄用於即時qPCR分析EGF、TGF-β、及VEGF的基因表現(r=3；n=6)。經ANOVA測定，不同字母的值顯示顯著差異(P<0.05)。

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語皆具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識之人士一般理解的相同的含義。

除非內文以其他方式清楚指明，否則本文中使用的單數形「一」及「該」包括複數的指示對象。因此，舉例來說，提及「一樣品」包括複數個這樣的樣品及所屬技術領域中具有通常知識者習知的該樣品之同等物。

吳郭魚抗菌胜肽

如Peng等人揭示的，收集吳郭魚的脾臟組織用於萃取RNA，並使用來自PubMed GenBank數據的GR649653.1(名為TP1)、GR604642.1(XM 003456635；名為TP2)、GR645750.1(XM 003456614；名為TP3)、GR634176.1(XM 003456613；名為TP4)、及GR648328.1(名為TP5)藉由聚合酶鏈反應(PCR)放大尼羅河吳郭魚抗菌胜肽編碼區。使用以下的引子。

引子序列：

TP1 5'(5'-ATGAAGTCTGCTGTGATCTTTCTTGTGC)(序列編號：1)

3'(5'-CTAGTCAAATTCCCGTTGACGCA)(序列編號：2)

TP2 5'(5'-ATGAAGTGTGCTGCAGTATTTCTTATGCTGTCC)(序列編號：3)

3'(5'-CTAGTCAAAATTAAGTCGACGAGGGT)(序列編號：4)

TP3 5'(5'-ATGAAGTGCACCATGCTGTTCCTTGTGCTGTCGATGGTT)(序列編號：5)

3'(5'-CTAGTTAAAAGCAGCCCTTTCCC)(序列編號：6)

TP4 5'(5'-ATGAAGTGCACTATACTGTTCCTTGTGCTGTCGATGGTG)(序列編號：7)

3'(S'-CTAGTTAAAAGCAACTCTCTCTCGTTTG)(序列編號：8)

TP5 5'(5'-ATGAAGTCTGCCATAATCTTTCTTGTAT)(序列編號：9)

3'(5'-CTATGACATCACAGCATCTTCAAATTC)(序列編號：10)

將PCR產物複製到pCR-Blunt(美國加州Invitrogen公司)並轉入DH5α大腸桿菌菌株中，而且選擇重組殖株來定序並識別吳郭魚抗菌胜肽。

由GL Biochem(中國上海)使用Fmoc化學的固相程序合成TP的肽。將粗肽萃取、凍乾、並藉由反相高效液體層析術(HPLC)純化。分別藉由質譜術和HPLC驗證純化肽的分子量和純度。在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；pH 7.4)中重組純度>95%的合成肽用於實驗。將尼羅河吳郭魚抗菌胜肽1-5(TP1-TP5)的基因體結構和基因位置圖示於圖1。從複製的cDNA獲得尼羅河吳郭魚抗菌胜肽的胺基酸序列。

胺基酸序列：

TP1：FDWDSVLKGVEGFVRGYF(序列編號：11)

TP2：GECIWDAIFHGAKHFLHRLVNP(序列編號：12)

TP3：FIHHIIGGLFSVGKHIHSLIHGH(序列編號：13)

TP4：FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR(序列編號：14)

TP5：QLQGKQVSGEVVQKVLQELIQSVAKP(序列編號：15)

將五個不同抗菌胜肽序列的cDNA編碼區分離和特徵化。名為TP1-5的五個cDNA序列分別編碼68、77、76、89、及64個胺基酸。預測訊號肽的可能分裂位點為TP1在Pro19和Gly20之間、TP2在Pro19和Gly20之間、TP3在Pro19和Gly20之間、TP4在Ala17和Glu18之間、及TP5在Leu22和Gln23之間。此外，發現到，尼羅河吳郭魚抗菌胜肽TP4胺基酸序列中的一個共識核定位序列(NLS)位在胺基酸編號43(RRRR)。

吳郭魚抗菌胜肽3(TP3)

吳郭魚抗菌胜肽3(TP3)是從尼羅河吳郭魚(尼羅口孵非鯽，Oreochromis niloticus)分離的AMP，並被特徵化。吳郭魚抗菌胜肽3(TP3)是以苯丙胺酸(F)開始並以組胺酸(H)結束的23個胺基酸的肽。TP3是具有α螺旋結構的成孔肽，其賦予對抗細菌的選擇性細胞溶解活性。除了破壞細菌的細胞膜之外，吳郭魚α螺旋抗微生物肽已被報告可刺激免疫原性、誘導TH1細胞的免疫反應、並作為魚接種疫苗的佐劑(Acosta等人，吳郭魚α螺旋抗微生物肽與子單元抗原的共同施予促進小鼠和吳郭魚的免疫原性，Vaccine.2014；32：223-229)。TP3具有對抗革蘭氏陽性和陰性細菌的抗微生物活性。此外，臨床案例的研究顯示，施加抗微生物肽到嚴重感染的皮膚創傷可以清除感染並改善癒合(O'Meara等人，S,Cullum N、Majid M及Sheldon T，傷口護理管理的系統性檢視：(3)用於慢性傷口的抗微生物劑；(4)糖尿病足潰瘍，Health Technol Assess.2000；4：1-237)。因此，TP3具有許多與抗生素一致的特徵，但可能有更廣泛的應用，而且可以避免或減少細菌抗藥性的擔憂。

吳郭魚抗菌胜肽4(TP4)

吳郭魚抗菌胜肽4(TP4)是從尼羅河吳郭魚(尼羅口孵非鯽，Oreochromis niloticus)分離的AMP，並被Peng等人特徵化。吳郭魚抗菌胜肽4(TP4)是以苯丙胺酸(F)開始並以組胺酸(H)結束的23個胺基酸的肽。TP4是具有α螺旋結構的成孔肽，其賦予對抗細菌的選擇性細胞溶解活性。除了破壞細菌的細胞膜之外，吳郭魚α螺旋AMPs已被報告可刺激免疫原性、誘導TH1細胞的免疫反應、並作為魚接種疫苗的佐劑(Acosta等人)。TP4具有既對抗革蘭氏陽性細菌又對抗革蘭氏陰性細菌的抗微生物活性。

如實施例1證明的，TP3提供抗菌活性而不誘導抗藥性，並與抗生素的使用相容，而且不具有任何明顯的免疫毒性作用。在TP3的預防疾病效果而且沒有能力引起抗藥性的前提之下，TP3可以適用於有高感染風險的情況。得出的結論是，TP3可有效作為用於傷口癒合、以及傷口MRSA感染的良好治療劑。

此外，還在實施例2示範的是，TP4提供抗菌活性而不誘導抗藥性，並與抗生素的使用相容，而且不具有任何明顯的免疫毒性作用。發現的是， TP4誘導上皮細胞增生，這可能是由於膠原蛋白I、膠原蛋白III、角質細胞生長因子(KGF)、及角蛋白10的改變基因表現。除了對先天免疫系統的宿主防禦功能和調節作用之外，TP4可以在降低感染風險中發揮重要的作用。還得出的結論是，TP4可有效作為用於傷口癒合、以及傷口MRSA感染的良好治療劑。

因此，本發明提供一種用於傷口癒合的方法，包含施予有需要的個體治療有效量的吳郭魚抗菌胜肽，具體而言是用於預防或治療傷口的抗甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌(MRSA)感染。

TP係選自由TP1、TP2、TP3、TP4、TP5、及上述之組合所組成之群組。在本發明的一個具體實例中，TP為TP3或TP4。

還提供一種用於預防或治療傷口MRSA感染的組合物或醫藥組合物、及一種TP用於製造用於預防或治療傷口MRSA感染的藥物之用途。

本文中使用的「治療有效量」乙詞是指與未接收該量的相應個體相比導致疾病、失調、或副作用之治療、痊癒、預防、或改善效果、或疾病或失調之進展速度減緩的藥物或藥劑量。該詞還包括在其範圍內可有效增強正常生理功能的量。

對於治療的用途，治療有效量的肽、或該肽之功能性變體可被配製成用於施予的醫藥組合物。因此，本發明進一步提供一種包含治療有效量的肽及一種或更多種醫藥上可接受載體、稀釋劑、或賦形劑的醫藥組合物。

載體、稀釋劑、或賦形劑必須是在與製劑的其他成分相容的意義上為可接受的，而且對於被施予該醫藥組合物的個體不會有害。所屬技術領域中公知的或使用的任何載體、稀釋劑、或賦形劑都可被用於本發明，取決於醫藥製劑的要求。

依據本發明，該醫藥組合物可適用於藉由任何適當的途徑施予，該途徑包括但不限於口服的、直腸的、經鼻的、局部的、陰道的、或腸胃外的途徑。在本發明的一個特定實例中，該醫藥組合物被配製用於口服施予。這樣的製劑可以藉由配藥學技術領域中習知的任意方法製備。

在本發明的一個實例中，用於口服施予的醫藥組合物可以呈現分離的單元，例如膠囊或片劑；粉末或細粒；溶液或懸浮液、及其類似物。在一個特定的實例中，醫藥組合物是片劑的形式。

現在將參照以下實施例更特定地描述本發明，提供該等實施例是為了示範而不是限制的目的。

實施例

實施例1 TP3之功效實驗

材料與方法

1.1細胞與小鼠

在補充有10%熱失活胎牛血清的羅斯韋爾園區紀念學院介質(RPMI-1640)中培養幼倉鼠腎細胞株(BHK-21)。使用Balb/c雌性小鼠進行實驗。讓所有小鼠住在無特定病原體條件下的籠子中，並且在實驗過程中給予水和隨意的標準實驗室食物。所有的動物處置程序均符合國立台灣海洋大學(NTOU)的指導方針。所有程序都經台灣基隆NTOU的動物照護及使用委員會批准。

1.2試劑

使用蘇木紫-曙紅(H&E)(目錄號105175，德國達姆施塔特默克)和吉姆薩染色溶液(目錄號51811826，美國密蘇里州Sigma)來測定組織學。使用針對巨噬細胞(目錄號550282，美國加州BD Biosciences)、淋巴細胞(CD3e)(目錄號550277，美國加州BD Biosciences)、及CD8a(目錄號14008182，美國加州eBiosciences)的抗體用於免疫組織化學(IHC)。

1.3體外毒性

在平底96孔盤中以每孔5×10⁴個細胞的密度培養細胞，並補充各種組合的AMPs。在24小時後，分別藉由中性紅、LDH及MTT試驗量測細胞存活率。

1.4吳郭魚抗菌胜肽3肽的合成和抑菌分析

由GL Biochem(中國上海)使用Fmoc化學的固相程序合成TP3肽。將粗肽萃取、凍乾、並藉由反相高效液體層析術(HPLC)純化。分別藉由質譜術和HPLC驗證純化肽的分子量和純度。在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；pH 7.4)中重組純度>95%的合成肽用於實驗。TP3序列為FIHHIIGGLFSVGKHIHSLIHGH。在沒有修飾之下基於線上方法(http：//cmdr.ubc.ca/bobh/methods/MODIFIEDMIC.html；加拿大不列顛哥倫比亞省不列顛哥倫比亞大學微生物和免疫學系的Hancock實驗室方法)藉由培養液微稀釋分析測定肽的最小抑制濃度(MIC)。

1.5體內毒性

為了測定TP3的毒性，將TP3溶於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；pH 7.4)，並在左大腿以肌肉內推注施予(2mg/小鼠)。觀察小鼠的全身毒性症狀。為了研究治療對生物化學的效果，使用PBS(對照組)處理小鼠(每組n=6)。在最後注射TP3之後，在第1天、第3天及第6天收集血液樣品(0.2ml)，並用於測定麩胺酸草乙酸轉胺酶(GOT)、麩胺酸丙酮酸轉胺酶(GPT)、血脲氮(BUN)、肌酸酐(CRE)、總葡萄糖(GLU)、及肌酸磷酸激酶(CPK)的血清水平。

1.6 MRSA膿毒症的小鼠模型中的治療用途

將雌性Balb/c小鼠(6-8週齡)每隻小鼠腹膜內注射10⁶CFU的MRSA。注射MRSA之後十分鐘，將小鼠腹膜內注射萬古黴素(0.01mg/小鼠體重g)、甲氧苯青黴素(0.01mg/小鼠體重g)、或TP3(0.005mg/小鼠體重g)。在第二組實驗中，在注射MRSA之後10、60、120、或180分鐘給予小鼠腹膜內注射TP3(0.005mg/小鼠體重g)。每24小時記錄存活率和狀態持續長達192小時。為了檢查細菌傳播，在注射抗生素或TP3之後48小時犧牲小鼠，並記錄血液、腹膜、脾、肝、及腸繫膜淋巴結中的細菌數量。將來自稀釋細菌溶液的菌落數量相對於在治療開始時的表示。這些實驗由四個組組成，每個組含有5隻小鼠。

1.7用於傷口癒合的小鼠模型

將雌性Balb/c小鼠(6-8週齡)用於傷口癒合的實驗。將所有小鼠單獨圈養，以防止打架和進一步傷害傷口，並且隨意提供小鼠食物和水。將小鼠保持在室溫下12小時的光：暗循環，並在實驗使用之前使小鼠適應環境至少一週。處理小鼠時，所有的研究人員都穿戴帽子、無菌手套、隔離衣及鞋套。藉由剃毛從小鼠的背去除毛髮，然後在暴露區域中作出全厚度傷口(直徑1cm)。每個傷口使用50μl含有10⁶個cfu(菌落形成單元)的金黃色葡萄球菌的培養液混合物接種。在接種後5分鐘施加總體積0.1ml的50μl TP3(2mg/ml)。治療後30分鐘，使用Tegaderm(明尼蘇達州聖保羅市3M)覆蓋傷口以保持均勻性，並防止小鼠移除治療。基於最初的實驗，我們在受傷後0、3、5及19天檢視傷口，以免干擾感染。這樣的檢視截取從發炎到再生、及再生到傷口癒合的解決階段的過渡。動物隨後藉由吸入二氧化碳安樂死並評估傷口。在每個實驗的每個時間點檢查每一組的四個個體。量測每個傷口，然後從動物移出傷口，並從對側背部取出未受傷的皮膚作為對照。將每個活檢等分，且三個切片被用於張力量測和組織學，而兩個切片用於定量測定微生物負載。重複三次傷口癒合的研究。

1.8傷口閉合量測

受傷後立即進行描記。對於未受污染的傷口，每隔一天測定傷口的大小。對於受污染的傷口，在第3、5、19天將小鼠安樂死並製作傷口邊緣的描記。使用麥金塔Adobe Photoshop程式、直方圖分析測得傷口面積。計算傷口收縮的百分比如下：傷口收縮%=(A0-At)/A0 x 100，其中A0是原始傷口面積，At是每兩天活檢時的相應傷口面積。

1.9傷口感染評估

選取通常與人體的傷口感染有關的金黃色葡萄球菌多重抗藥性菌株來產生多微生物溶液。MRSA菌株是來自從台北市立醫院(和平婦幼分院)獲得的糞便的臨床分離物。藉由在37℃下在胰蛋白酶大豆培養液(TSB)中培養需氧菌整夜來製備初始接種物，隨後將培養液以1000rpm離心15分鐘，並用15%的甘油、或切碎的肉萃取物與15%甘油(用於需氧菌)再懸浮於TSB中。將濃度調整到10⁶cfu/50μl並儲存於-80℃。在傷口施加之前，培養液混合物含有10⁶cfu(菌落形成單元)的金黃色葡萄球菌。在接種後5分鐘施加總體積0.1ml的50μlTP3(2mg/ml)。治療後30分鐘，使用Tegaderm(明尼蘇達州聖保羅市3M)覆蓋傷口以保持均勻性，並防止小鼠移除治療。基於最初的實驗，我們在受傷後0、3、5及19天檢視傷口，以免干擾感染。這樣的檢視截取從發炎到再生、及再生到傷口癒合的解決階段的過渡。動物隨後藉由吸入二氧化碳安樂死並評估傷口。在每個實驗的每個時間點檢查每一組的四個個體。量測每個傷口，然後從動物移出傷口，並從對側背部取出未受傷的皮膚作為對照。將每個活檢等分，且三個切片被用於張力量測和組織學，而兩個切片用於定量測定微生物負載。重複三次傷口癒合的研究。

1.10傷口閉合量測

受傷後立即進行描記。對於未受污染的傷口，每隔一天測定傷口的大小。對於受污染的傷口，在第3、5、19天將小鼠安樂死並製作傷口邊緣的描記。使用麥金塔Adobe Photoshop程式、直方圖分析測得傷口面積。計算傷口收縮的百分比如下：傷口收縮%=(A₀-A_t)/A₀ x 100，其中A₀是原始傷口面積，At是每兩天活檢時的相應傷口面積。

1.11傷口感染評估

選取通常與人體的傷口感染有關的金黃色葡萄球菌多重抗藥性菌株來產生多微生物溶液。MRSA菌株是來自從台北市立醫院(和平婦幼分院)獲得的糞便的臨床分離物。藉由在37℃下在胰蛋白酶大豆培養液(TSB)中培養需氧菌整夜來製備初始接種物。隨後將培養液以1000rpm離心15分鐘，並用15%的甘油、或切碎的肉萃取物與15%甘油(用於需氧菌)再懸浮於TSB中。將濃度調整到10⁶cfu/50μl並儲存於-80℃。在傷口施加之前，將細菌原料重新混合。藉由直接電鍍來測定微生物負載，隨後與接種同時進行冷凍-解凍和cfu計數。將接種物藉由無菌移液管遞送到開放性傷口的中心。安樂死之後(在第0、3、5、或19天)，使用UPMC臨床微生物實驗室操作手冊中所述用於人體傷口活檢培養的協議利用兩個等分的組織片段來測定微生物負載。將組織活檢稱重並放在1.5ml的TSB中，然後在組織研磨機中均質化。將一滴勻質物放在載玻片上並進行革蘭氏染色用於粗估(假使一種或更多種細菌存在於油浸視野內，則預計組織中的數量為至少10⁵cfu/g)。使用蒸餾水連續稀釋(1：10(0.1+0.9))組織勻質物。計算組織的cfu/g如下：cfu/g=盤數量(1/稀釋)×10/均質組織的重量。

1.12免疫組織化學(IHC)

如前所述取出並固定皮膚組織[25]。簡言之，用4%甲醛固定冷凍切片，並使用蘇木紫/曙紅、吉姆薩、或革蘭氏染色將組織樣品染色。由三個獨立的研究者分析IHC。使用BX-51顯微鏡(日本Olympus)擷取影像。

1.13傳訊(m)RNA的分離和即時PCR

從傷口組織分離出總RNA，並使用Qiagen RNeasy套組純化。按照製造商的建議使用iScript cDNA合成套組(USA BIO-RAD)進行反轉錄成cDNA。按照製造商的說明使用即時聚合酶鍊反應(PCR)分析來分析基因表現。將iQSYB® Green Supermix(USA BIO-RAD)和特異性引子對用於選定的基因，並使用用於GAPDH的引子對作為參考基因。按照以下條件進行定量PCR：在95℃1分鐘、在55℃30秒、及在72℃1分鐘40個循環。使用0.5ml的cDNA、2倍的SYBR Green PCR Supermix、以及500nM的正向和反向引子以BIO-RAD軟體計算臨界循環數(Ct)。使用△Ct法且GAPDH作為從同一樣品放大的參考基因來計算相對轉錄量。△Ct是選定基因的傳訊(m)RNA之臨界循環相對於GAPDH mRNA之臨界循環的差異。每個實驗組進行即時PCR重複三次。

引子序列：

TNF-α：F-GGTGTTCATCCATTCTCTAC(序列編號：16)

R-CCCAGCATCTTGTGTTTC(序列編號：17)

IL-6：F-TCCATCCAGTTGCCTTCTTG(序列編號：18)

R-TTTCTCATTTCCACG ATTTCCC(序列編號：19)

CXCL5：F-CTGACCCCAGTGAAGATAAG(序列編號：20)

R-CCGATAGTGTGACAGATAGG(序列編號：21)

GAPDH：F-ACAATGAATACGGCTACAG(序列編號：22)

R-GGTCCAGGGTTTCTTACT(序列編號：23)

1.14統計分析

以三次或更多次的重複進行實驗，並重複至少3次。誤差條表示標準差。組織學和體內研究結果代表三個獨立的實驗。每個治療使用一組7隻的小鼠，而且重複實驗三次。

1.15結果

TP3的體外毒性和功效

為了評估TP3在BHK-21細胞中的細胞毒性，將藉由中性紅、LDH及MTT試驗測得的細胞毒性試驗結果圖示於圖2(A)、圖2(B)及圖2(C)，在高達40μg/ml的各種濃度下的TP3不影響細胞存活力。TP3對抗MRSA的最小抑制濃度(MIC)>3.9μg/ml。同樣地，>3.9μg/ml的TP3可有效殺死懸浮於10mM磷酸鈉緩衝液、pH 7.2的MRSA(圖2(D))。

TP3 沒有在小鼠體內施展急性毒性作用

經由肌肉(i.m.)注射遞送TP3到小鼠體內來檢查TP3的毒性並量測血液中的生化因子。用2mg TP3治療的小鼠並沒有在麩胺酸草乙酸轉胺酶(GOT)、麩胺酸丙酮酸轉胺酶(GPT)、血脲氮(BUN)、肌酸酐(CRE)、總葡萄糖(GLU)、及肌酸磷酸激酶(CPK)的水平上誘發任何明顯的變化(表1)。

將p<0.05的差異視為是統計學上顯著的。

結果表明，TP3不會誘發全身性毒性作用，即使是在最高的測試濃度(2mg/小鼠)。

TP3 增強感染MRSA的小鼠之存活

在使用TP3或抗生素治療之前藉由監測感染MRSA的小鼠之存活來研究TP3的體內殺菌作用。所有感染MRSA的未治療小鼠在感染72小時內死亡，而使用TP3共同治療降低了死亡率，參見圖3(A)。在感染MRSA之後8天，分別使用TP3(0.005mg/g)、萬古黴素(0.01mg/g)、及甲氧苯青黴素(0.01mg/g)處理的小鼠存活率為100%、80%、及0%。在感染MRSA的小鼠中，未治療組在48小時內的致命率為20%，而使用TP3或萬古黴素治療大大降低了死亡率(表2)。細菌評估顯示，感染任一菌株的未治療小鼠表現出100%的陽性血培養物及對於所有測試器官的高水平細菌移生(CFU/g的數量不低於10⁶)(表2)。

表2 每隻小鼠腹腔內注射1×10 ⁶ CFU的MRSA之後TP3、甲氧苯青黴素及萬古黴素對小鼠存活的影響

注射TP3或抗生素之後監測致死率2天。

與未治療的對照組(P<0.05)相比，TP3治療明顯減少所有檢查器官的細菌負荷。這些數據表示，TP3可以在感染小鼠的器官中有效地控制MRSA。為了測定治癒潛力，先將小鼠注射MRSA，然後在10、60、120、或180分鐘後注射TP3(0.005mg/g)。在這些注射時間時，MRSA實驗組分別表現出100%、80%、60%、及40%的存活率，參見圖3(B)。使用TP3治療的小鼠之存活率一致高於未治療的小鼠(PBS治療的對照小鼠)。這些數據表示，立即施加TP3(0.005mg/g)對於防止嚴重感染是很重要的。在感染MRSA的10至60分鐘內施加使TP3能夠充當有效治療劑。TP3被用於傷口癒合感染實驗的測試和探究抗菌活性並促進傷口修復。

TP3在體內傷口閉合的療效

在以無菌方式促進傷口癒合中測定TP3的作用，參見圖4(A)。在未治療傷口和Tegaderm^TM或抗生素治療傷口的區域之間未觀察到統計差異，且全部都在>25天閉合。這並不令人意外，因為健康小鼠的皮膚傷口可有效癒合，而這個過程不太可能會明顯改善。然而，未治療的受感染傷口導致在第一週死亡，參見圖4(B)。使用萬古黴素治療導致與對照組類似的傷口閉合時間，而傷口閉合被單獨TP3治療加速。在未受污染的傷口沒有觀察到這種傷口閉合的增加，表示TP3藉由打擊感染來促進傷口恢復。不像未受污染的傷口，在所有的治療組中，在一週後傷口尺寸大部分保持不變，參見圖4(B)。在14天，TP3治療組的傷口尺寸小於萬古黴素治療組的傷口尺寸(P<0.05)。然而，這兩組都在第30天結束前顯現完全閉合。

經治療傷口中的微生物負載

未經治療的受污染傷口的傷口尺寸增加以及MRSA和MRSA+Meth(甲氧苯青黴素)治療組(圖4B)沒有閉合表示活性傷口感染。這可由傷口菌落的定量評估(表3)支持。

在MRSA和MRSA+Meth組中，每種生物體約4.5~5.2x10⁴cfu/10μl的初始接種物在第3天增加到約6.7~7.3x10⁸cfu/10μl。在第3天和第5天之間，MRSA+Vanc和MRSA+TP3組的菌落數量減少，且在TP3組觀察到最快速的減少(在第5天與另一組相比明顯不同)。在臨床實施中，由於現場的需氧性質，通過培養來自皮膚傷口的厭氧菌來計數MRSA菌落的嘗試常常導致低估。

利用組織的革蘭氏染色評估傷口，以確定皮膚上的厭氧菌是否超過藉由定量需氧菌所實現的數量。定量上真皮中每高倍率視野的革蘭氏陽性生物體之數量反映出定量的細胞數量。正如所料，使用抗微生物劑治療時更快速地減少了細菌負載。

真皮和表皮成熟的評估

以上展現增強的傷口閉合的數據表示使用單獨TP3治療促進真皮基質的成熟。進行這種通過常規組織學的分析。真皮的成熟一般是在增生、重構、及成熟階段進行評估。使用TP3治療的傷口在所有這三個階段都表現出加速的進展。還在表皮隔室中注意到加速癒合。

從無麻醉小鼠的腹部取出約1平方公分的皮膚區塊，並使傷口感染50ml含有單獨10⁶個cfu的MRSA，或連同抗甲氧苯青黴素、萬古黴素、或TP3的培養液混合物處理。將來自受傷部位的皮膚樣品固定，並在治療後第0、5及19天進行吉姆薩染色。觀察傷口變化，發現使用TP3治療的傷口如同正常皮膚是多層的，而且在第25天之前完全成熟。上皮的角質化和再生表示沒有不整的跡象，而使用Tegaderm^TM和MRSA+Vanc治療的傷口與TP3組相比顯現在整體表皮成熟上有所障礙。因此，在治療受感染小鼠之後測試TP3促進先天免疫反應和細胞激素產生的作用。吉姆薩染色顯示，在使用MRSA處理的感染小鼠的皮膚中有免疫細胞累積。

TP3 的活性機制

檢視TP3的直接抗微生物活性的根本機制。使用IHC和即時PCR(參見圖5)量測TP3調節小鼠免疫細胞的能力。將受傷小鼠感染後第3天犧牲，將傷口部位的冷凍切片固定在甲醛中，並使用針對巨噬細胞、淋巴細胞或CD8 的特異性抗體進行免疫組織化學分析，使用細胞表面標記抗體的IHC顯示，在抗生素治療的感染傷口中巨噬細胞、淋巴細胞、及CD8(細胞毒性細胞)的浸潤明顯增加，而在TP3組較少發現。其原因可能是抗微生物肽直接滅殺細菌、減少小鼠先天免疫反應的影響區域。促炎性細胞激素IL-6充當先天免疫的強效調節劑，而趨化介素CXCL5增加巨噬細胞到傷口周圍組織的募集。在治療後1、3及5天量測感染MRSA的小鼠體內的傷口組織趨化介素和細胞激素的水平。使用感染MRSA的小鼠作為正對照組，以確認細胞激素的活化。與正對照組相比，TP3治療減少了TNF-α、IL-6及CXCL5的誘導(參見圖5)。

【符號說明】

總之，鑑於在體外和體內皆證實了TP3的傷口閉合活性，故TP3具有抗微生物活性。TP3在高達40μg/ml都沒有影響幼倉鼠腎細胞的存活力，而且測定TP3對抗MRSA的MIC。在小鼠模型中發現，TP3對於打擊由MRSA引起的腹膜炎和傷口癒合感染是高效的，而且不會引起不良的行為效果或肝臟或腎臟毒性。結果顯示，TP3通過抗微生物和免疫調節作用兩者提高了感染細菌病原體MRSA的小鼠的存活率，表示TP3可以被開發作為用於傷口癒合、具體而言是感染MRSA的傷口的新型外用劑。

實施例2 TP4的療效實驗

材料與方法

2.1.細茵、細胞及小鼠

選取通常與人體的傷口感染有關的MRSA菌株來產生多微生物溶液。MRSA菌株是來自從台北市立醫院(和平婦幼分院)獲得的糞便的臨床分離物。菌株是藉由常規實驗室方法鑑定，並被儲存在-80℃下的20%(體積/體積) 甘油中。使用胰蛋白酶大豆培養液(TSB)作為培養基。在37℃的潮濕培養箱中、在5% CO₂和95%空氣下在含有10%(v/v)FBS、0.37%(w/v)NaHCO₃、青黴素(100單位/ml)、鏈黴素(100μg/ml)、0.1mM NEAA、及1mM丙酮酸鈉的DMEM中生長HaCaT人體角質細胞細胞株和HS-68人體包皮纖維母細胞細胞株。在約90%聚集(約10⁶個細胞/10-cm培養皿)時獲取細胞。使用Balb/c雌性小鼠進行實驗。讓所有小鼠住在無特定病原體條件下的籠中，並在實驗過程中隨意給予水和標準實驗室食物。所有的動物處置程序均符合國立台灣海洋大學(NTOU)的指導方針。所有程序都經NTOU的動物照護及使用委員會批准。

2.2肽、試劑及抗體

試劑和化學品是向Sigma(密蘇里州聖路易斯)購得。依據CLSI的指導方針使用並製備甲氧苯青黴素的標準實驗室粉末(目錄號51454；密蘇里州聖路易斯Sigma)和萬古黴素(目錄號v2002；密蘇里州聖路易斯Sigma)。藉由固相肽合成法合成吳郭魚抗菌胜肽4(TP4)(HFIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR-OH)並由GL生物化學(目錄號080571；中國上海)藉由反相高效液體層析術純化到>98.19%的等級。使用用於介白素-1(目錄號559603，美國加州BD Biosciences)、腫瘤壞死因子(目錄號560478，美國加州BD Biosciences)、及介白素-6(目錄號555240，美國加州BD Biosciences)的ELISA套組來測定細胞激素的水平。使用對抗VEGF的抗體(目錄號550549，美國加州BD Biosciences)進行免疫組織化學法(IHC)。

2.3細胞增生

在平底96孔盤中以每孔5×10⁴個細胞的密度培養細胞。在次聚集下，將細胞使用各種刺激和各種濃度的TP4培育48小時。按照製造商的說明藉由中性紅、LDH、及MTT試驗量測細胞增生。在顯微鏡下觀察細胞形態(BX-51，日本奧林巴斯)。

2.4膠原蛋白I、膠原蛋白III、KGF、角蛋白10、及角蛋白17表現的量測

從HaCaT和Hs-68細胞分離出總RNA，並使用Qiagen RNeasy套組純化。按照製造商的建議使用iScript cDNA合成套組(USA BIO-RAD)進行反轉錄成cDNA。按照製造商的說明使用0.5ml的cDNA、2倍的iQSYBR® Green Supermix(USA BIO-RAD)、及500nM對抗選定基因或GAPDH(參考基因)的正向和反向引子進行即時聚合酶鍊反應(PCR)來分析基因表現。在以下條件下進行定量PCR：在95℃1分鐘、在55℃30秒、及在72℃1分鐘40個循環。以BIO-RAD軟體計算臨界循環數(Ct)。使用△Ct法且GAPDH作為內部參考基因來計算相對轉錄量。△Ct是選定基因的傳訊(m)RNA之臨界循環相對於GAPDH mRNA之臨界循環的差異。每個實驗組進行即時PCR重複三次。

引子序列：

GAPDH 同義 CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC(序列編號：24)

(Nm_002046) 反義 TTGACTCCGACCTTCACCTTCC(序列編號：25)

膠原蛋白I 同義 ACAGGGCGACAGAGGCATAAAG(序列編號：26)

NM_000088 反義 CCAGGAGCACCAGCAGAGC(序列編號：27)

膠原蛋白III 同義 TCCAAAGGGTGACAAGGGTGAAC(序列編號：28)

NM_000090 反義 AGGAGGACCAATAGGACCAGTAGG(序列編號：29)

KGF 同義 GCAACTGAACTTACTACGAACTG(序列編號：30)

S81661 反義 TCATTGACCTCTTCCTATCTGTG(序列編號：31)

角蛋白10 同義 CTGCGTAGGGTGCTGGATGAG(序列編號：32)

AF264085 反義 TTCCTCCTCGTGGTTCTTCTTCAG(序列編號：33)

角蛋白17 同義 CTGGCTGCTGATGACTTCC(序列編號：34)

NM_000422 反義 CCTCCTCGTGGTTCTTCTTC(序列編號：35)

2.5吳郭魚抗菌胜肽4肽和抑菌分析

使用標準協議進行最小抑制濃度(MIC)抗微生物試驗。對於MIC評估，將化合物稀釋到100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.582、或0.78g/ml的最終濃度。在微量滴定盤中將20μl的每種稀釋液與20μl的適當細菌指示劑懸浮液和160μl用於金黃色葡萄球菌的胰酪酶大豆培養液(TSB)混合到總體積200μl。檢視每個金黃色葡萄球菌菌株、化合物、及濃度的三次重複試驗。正對照組包含取代化合物的水，負對照組包含化合物而無細菌懸浮液。在600nm下藉由光密度量測自動測定微生物的生長(芬蘭赫爾辛基Labsystem Bioscreen C)。微孔盤在25℃下培育植物病原體，並在37℃下培育食物媒介的細菌菌株。在48小時的期間每隔一小時讀取吸光度讀數。在每次量測之前搖動微孔盤20秒。重複實驗兩次。將實驗結束前產生零生長的最低化合物濃度視為MIC。

2.6體內毒性

為了測定TP4的毒性，將TP4溶於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；pH 7.4)，並在左大腿以肌肉內推注施予(2mg/小鼠)。每組包含10隻小鼠。使用PBS(對照)處理對照組。在最後注射TP4之後，在第1天、第3天及第6天收集血液樣品(0.2ml)，並用於測定麩胺酸草乙酸轉胺酶(GOT)、麩胺酸丙酮酸轉胺酶(GPT)、血脲氮(BUN)、肌酸酐(CRE)、總葡萄糖(GLU)、及肌酸磷酸激酶(CPK)的血清水平。

2.7 MRSA膿毒症的小鼠模型中的治療用途

將雌性Balb/c小鼠(6-8週齡)每隻小鼠腹腔內注射106CFU的MRSA。注射MRSA之後十分鐘，將小鼠腹腔內注射萬古黴素(0.01mg/小鼠體重g)、甲氧苯青黴素(0.01mg/小鼠體重g)、或TP4(0.005mg/小鼠體重g)。在第二組實驗中，在注射MRSA之後10、60、120、或180分鐘給予小鼠腹腔內注射TP4(0.005mg/小鼠體重g)。每24小時記錄存活率和狀態持續長達192小時。為了檢查細菌傳播，在注射抗生素或TP4之後48小時犧牲小鼠，並記錄血液、腹腔、脾、肝、及腸繫膜淋巴結中的細菌數量。將來自稀釋細菌溶液的菌落數量相對於在治療開始時的表示。這些實驗由四個組組成，每個組含有10隻小鼠。

2.8用於傷口癒合的小鼠模型

將雌性Balb/c小鼠(6-8週齡)用於傷口癒合的實驗。將所有小鼠單獨圈養，以防止打架和進一步傷害傷口，並且隨意提供小鼠食物和水。將小鼠保持在室溫下12小時的光：暗循環，並在實驗使用之前使小鼠適應環境至少一週。處理小鼠時，所有的研究人員都穿戴帽子、無菌手套、隔離衣及鞋套。藉由剃毛從小鼠的背去除毛髮，然後在暴露區域中作出全厚度傷口(直徑1cm)。每個傷口使用50μl含有10⁶個cfu(菌落形成單元)的金黃色葡萄球菌的培養液混合物接種。在接種後5分鐘施加總體積0.1ml的50μl TP4(2mg/ml)。治療後30分鐘，使用Tegaderm(明尼蘇達州聖保羅市3M)覆蓋傷口以保持均勻性，並防止小鼠移除治療。基於最初的實驗，我們在受傷後3、7、14及21天檢視傷口，以免干擾感染。這樣的檢視截取從發炎到再生、及再生到傷口癒合的解決階段的過渡。動物隨後藉由吸入二氧化碳安樂死並評估傷口。在每個實驗的每個時間點檢查每一組的四個個體。量測每個傷口，然後從動物移出傷口，並從對側背部取出未受傷的皮膚作為對照。將每個活檢分成六個切片，且三個切片被用於張力量測和組織學，而三個切片用於定量測定微生物負載。重複三次傷口癒合的研究。

2.9傷口閉合量測與細胞增生基因表現

受傷後立即進行描記。對於未受污染的傷口，每隔一天測定傷口的大小。對於受污染的傷口，在第3、5、19天將小鼠安樂死並製作傷口邊緣的描記。使用麥金塔Adobe Photoshop程式、直方圖分析測得傷口面積。計算傷口收縮的百分比如下：傷口收縮%=(A0-At/A0)x 100，其中A0是原始傷口面積，At是活檢時的相應傷口面積。使用上述方法藉由即時PCR進行細胞增生基因表現。

引子序列：

GAPDH 同義 CTCCAAGGAGTAAGAAACCC(序列編號：36)

GU214056.1 反義 TGGAAATTGTGAGGGAGATG(序列編號：37)

EGF 同義 CATATGTGATGGCTACTGCT(序列編號：38)

AF125256.1 反義 TTAATGTTCCTCAGGGAAGC(序列編號：39)

TGF-b 同義 CGTGCTCTTCTTCGACAATA(序列編號：40)

M57639 反義 AACATGAACAAACAGTCCCT(序列編號：41)

VEGF 同義 ACCTTTGGGAAGAAGATGTC(序列編號：42)

AB086118.1 反義 CAATAGAACCCTCGAGTGAG(序列編號：43)

2.10細胞激素的IHC和ELISA

如前所述取出並固定皮膚組織[28]。簡言之，用4%甲醛固定冷凍切片，並使用VEGF將組織樣品染色。由三個獨立的研究者分析IHC。使用BX-51顯微鏡(日本Olympus)擷取影像。如前所述進行ELISA[29]。

2.11統計分析

在三個生物學複製品上以一式三份進行全部實驗。誤差條表示標準差，並使用變異數分析(ANOVA)測得各組之間的顯著差異(P<0.05)。使用條上方的不同字母表示各組之間的顯著差異。每個治療使用一組10隻的小鼠，而且每個實驗重複三次。

2.12結果

藉由TP4增生的體外毒性和刺激

使用中性紅、LDH、及MTT試驗測試TP4在纖維母細胞細胞株(HS-68)和角質細胞細胞株(HaCaT)的細胞毒性；觀察到TP4在Hs-68株中>20g/ml的濃度會影響細胞存活力，參見圖6(A)、圖6(B)及圖6(C)。此外，低劑量(2.5-10g/ml)明顯增加了細胞增生，如與未治療組相比的細胞存活力變化所反映的。這也由光顯微影像定性支持。TP4治療也增加了形式為附著於表面的波紋狀區域的細胞聚集物的量。接著，研究TP4對細胞增生因子的影響。膠原蛋白和角質細胞生長因子(KGF)是細胞增生的重要性能因素。在TP4治療的Hs-68細胞中分析膠原蛋白I和III、及KGF基因表現。與對照組的表現相比，藉由TP4治療增強了所有基因的表現，參見圖6(D)~圖6(F)。

在TP4處理的HaCaT細胞上也觀察到類似的結果。在測試濃度(降到10μg/ml)下的TP4並不影響HaCaT細胞的生存力，參見圖7(A)-(C)。此外，較低的濃度(1.25-10μg/ml)實際增強了細胞增生。在此角質細胞細胞株 (HaCaT)的增生和分化介質中，角蛋白10和17是特別重要的，因為他們在協調蛋白質合成和細胞生長的機制中發揮主要的作用。如圖7(D)所示，TP4明顯增加了角蛋白10的基因表現，但並不影響角蛋白17的基因表現，參見圖7(E)。因此，結果表示，TP4增強了Hs-68和HaCaT細胞的增生，可能是通過活化編碼膠原蛋白I和III、KGF、及角蛋白10的基因。

TP4在小鼠體內的急性毒性作用

經由肌肉(i.m.)注射遞送TP4到小鼠體內來檢查TP4的毒性，並於隨後量測血液中的生化因子。用2mg TP4治療的小鼠並沒有在麩胺酸草乙酸轉胺酶(GOT)、麩胺酸丙酮酸轉胺酶(GPT)、血脲氮(BUN)、肌酸酐(CRE)、總葡萄糖(GLU)、或肌酸磷酸激酶(CPK)的水平上展現任何明顯的變化(表4)。我們的結果顯示，即使在最高的測試濃度(2mg/小鼠)，TP4也沒有引發系統性毒性作用。

TP4增強感染MRSA的小鼠之存活

在使用TP4或抗生素治療之前藉由監測感染MRSA的小鼠之存活來評估TP4的體內殺菌作用。所有感染MRSA的未治療小鼠在感染72小時內死亡，而使用TP4共同治療降低了死亡率，參見圖8(A)。在感染MRSA之後8天，分別使用TP4(0.005mg/g)、萬古黴素(0.01mg/g)、及甲氧苯青黴素(0.01mg/g)治療的小鼠之存活率為100%、80%、及0%。在48小時，未治療和感染的小鼠中的致命率為60%；使用TP4或萬古黴素治療大大降低了死亡率(表5)。細菌評估顯示，感染任一菌株的未治療小鼠表現出100%的陽性血培養物及對於所有測試器官的高水平細菌移生(CFU/ml的數量不低於106)(表5)。與未治療的對照組(P<0.05)相比，TP4治療明顯減少所有檢查器官的細菌負荷。這些數據表示，TP4可以在感染小鼠的器官中有效地控制MRSA。

為了測定治療潛力，先對小鼠注射MRSA，然後在10、60、120、或180分鐘後注射TP4(0.005mg/g)。在這些注射時間時，MRSA實驗組分別表現出100%、80%、60%、及50%的存活率，參見圖8(B)。使用TP4治療的小鼠之存活率一致高於未治療的小鼠(PBS治療的對照小鼠)。這些數據表示，立即施加TP4(0.005mg/g)對於防止嚴重感染是很重要的。在感染MRSA 10至60分鐘內施加使TP4能夠充當有效治療劑。因此，評估TP4促進傷口修復的效果。

如表5所示，在感染MRSA的小鼠的指定器官中的最後治療之後48小時的細菌計數。受感染的小鼠未治療、或使用TP4、甲氧苯青黴素、或經由腹膜內注射的萬古黴素治療。隨後記錄血液、腹腔、脾、肝、及腸繫膜淋巴結中的細菌數量。將來自稀釋細菌溶液的菌落數量相對於在治療開始時的表示。每個值表示三個測定的平均值±標準差(SD)。具有不同數值的數據明顯不同(P<0.05)。

注射TP4或抗生素之後監測致命性2天。

TP4在體內傷口閉合上的療效

在以無菌方式促進傷口癒合中檢視TP4的作用，參見圖9(A)。在未治療傷口和TegadermTM或抗生素治療傷口的區域之間未觀察到統計差異，且全部都在>25天閉合。這並不令人意外，因為健康小鼠的皮膚傷口可有效癒合，而這個過程不太可能會明顯改善。使用萬古黴素治療導致與對照組類似的傷口閉合時間，而傷口閉合被單獨TP4治療加速。在未受污染的傷口沒有觀察到這種傷口閉合的增加，表示TP4可以藉由打擊感染來促進傷口恢復。不像未受污染的傷口，在所有的治療組中，在一週後傷口尺寸大部分保持不變，參見圖9(B)。在14天，TP3治療組的傷口尺寸小於萬古黴素治療組的傷口尺寸(P<0.05)。然而，這兩組都在第27天結束前顯現完全閉合。

TP4減少發炎細胞激素

檢視TP4的直接抗微生物活性。藉由ELISA量測TP4調節小鼠的細胞激素的能力，參見圖10(A)-(C)。促炎性細胞激素IL-6充當先天免疫的強效調節劑，而趨化介素單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)增加單核細胞與巨噬細胞到傷口周圍組織的募集。在治療後3天評估感染MRSA的小鼠體內的血清趨化介素和細胞激素的水平。使用感染MRSA的小鼠作為正對照組，以確認細胞激素的活化。與正對照組的表現相比，TP4治療減少了IL-6和TNF的誘導，參見圖10(A)和圖10(B)。另外，介白素-1(IL-1)蛋白對於皮膚的功能是重要的，其增強表皮的傷口癒合。與對照組傷口相比，觀察到IL-1在TP4治療的傷口中有統計上明顯的增強，參見圖10(C)。

TP4在感染MRSA的小鼠體內改變細胞增生基因表現分佈

在傷口癒合期間，單核細胞在48小時開始替換嗜中性白血球，以去除傷口碎屑；接著在72小時為增生階段，在此期間多種生長因子被誘導出。表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子β(TGF-β)、及血管內皮生長因子(VEGF)分別介導細胞增生、調節分化、及刺激血管生成和血管新生。為了檢視細胞增生基因在使用TP4治療的、感染MRSA的小鼠體內的表現分佈，我們使在感染後第1、3、7、14、及21天從小鼠的傷口組織取出的RNA進行即時RT-PCR。與對照組和萬古黴素治療的小鼠中的表現相比，TP4治療增強EGF(3天)、TGF(7天)、及VEGF(14天)的基因表現，參見圖11(A)-(C)。

在受傷後第7、14、或21天犧牲小鼠，將傷口部位的冷凍切片固定在甲醛中，並使用針對VEGF的特異性抗體進行免疫組織化學分析並觀察，發現使用TP4治療受感染的小鼠增強了血管內皮生長因子(VEGF)的表現，顯示完整和結構上正常的表皮再生。這項研究表示，TP4的局部施予可用於促進傷口癒合。

得出的結論是，傷口試劑應解決癒合的所有方面；傷口試劑不僅應促進組織再生，而且還應誘導止血並限制微生物感染。後面這兩個過程是至關重要的，因為未能完成這些立即的早期步驟會防礙後續的修復。證實的是，TP4既刺激細胞增生，又發揮抗菌活性。同時，TP4似乎參與上皮細胞的某些過程的調節。在這裡，我們觀察到TP4可以通過控制纖維母細胞和角質細胞的增生和分化來調節表皮修復。我們報告的是，TP4在角質細胞細胞株(HaCaT)和纖維母細胞細胞株(Hs-68)增生上的作用可以通過活化膠原蛋白I、膠原蛋白III、角質細胞生長因子(KGF)、及角蛋白10的基因表現來介導。在臨床相關的模型中(適用於闡明傷口癒合損傷下的病理生理學及用於測試新穎的治療劑)確認了TP4的效用。據證實，TP4具有體外抗菌活性。TP4在體內展現強抗微生物活性，在接觸60分鐘內即可驗證。與感染MRSA組相比，在第1、2及3天TP4治療在感染位點造成TNF和IL-6減少。雖然與對照組相比，TP4治療導致IL-6適度增加，但這比MRSA在第1天誘導的更少。TP4的抗發炎作用可能是由於幾個相關機制的貢獻，包括IL-10的機制。此外，在第1天TP4在傷口部位減少MRSA誘導的TNF。然而，IL-1是否直接調節傷口閉合是未知的。這裡，我們證明在小鼠身上感染MRSA的傷口中IL-1表現隨著時間增加。還觀察到TP4誘導表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子(TGF)、及血管內皮生長因子(VEGF)，此舉可增強傷口閉合活性。

總之，使用TP4可以補足抗生素的使用。關鍵的是，TP4不太可能引發抗藥性、與抗生素的使用相容、而且不具有任何明顯的免疫毒性作用。此外，TP4誘導上皮細胞增生，這可能是由於膠原蛋白I、膠原蛋白III、角質細胞生長因子(KGF)、及角蛋白10的改變基因表現。除了對先天免疫系統的宿主防禦功能和調節作用之外，TP4可以在降低感染風險上發揮重要的作用。

應將本說明書所提供的敘述和申請專利範圍理解為以例示為目的，而不是以任何方式限制本發明的範圍。

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<120> 用於促進傷口癒合的吳郭魚抗菌胜肽

<130> ACA0101TW

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Claims

一種吳郭魚抗菌胜肽(tilapia piscidin,TP)用於製備促進傷口癒合藥物的用途，其中該吳郭魚抗菌胜肽(TP)係選自由吳郭魚抗菌胜肽1(TP1)、吳郭魚抗菌胜肽2(TP2)、吳郭魚抗菌胜肽3(TP3)、吳郭魚抗菌胜肽4(TP4)、吳郭魚抗菌胜肽5(TP5)及上述之組合所組成之群組。
如申請專利範圍第1項之用途，其中該TP為TP3。
如申請專利範圍第1項之用途，其中該TP為TP4。
一種吳郭魚抗菌胜肽用於製備預防或治療傷口抗甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)感染藥物的用途，其中該吳郭魚抗菌胜肽(TP)係選自由吳郭魚抗菌胜肽1(TP1)、吳郭魚抗菌胜肽2(TP2)、吳郭魚抗菌胜肽3(TP3)、吳郭魚抗菌胜肽4(TP4)、吳郭魚抗菌胜肽5(TP5)及上述之組合所組成之群組。
如申請專利範圍第4項之用途，其中該TP為TP3。
如申請專利範圍第4項之用途，其中該TP為TP4。