TWI578994B

TWI578994B - 燒燙傷口癒合組合物

Info

Publication number: TWI578994B
Application number: TW103111570A
Authority: TW
Inventors: 陳志毅; 吳彰哲; 黃瀚寧
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2017-04-21
Also published as: TW201536310A

Description

燒燙傷口癒合組合物

本發明有關於一種用於傷口癒合的新穎方法或組合物，具體而言是燒燙傷口。

抗生素的發現是現代醫學最偉大的成就之一，但是其過度使用已經篩選出抗藥性細菌。感染案例由於多重抗藥性生物體，例如抗二甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus；MRSA)及抗萬古黴素腸球菌(vancomycin-resistant Enterococcus；VRE)，持續增加。同時，新的抗菌療法發展趨緩。

抗微生物胜肽(Antimicrobial peptides；AMPs)可代替抗生素作為抵抗病原體入侵的第一道防線，同時亦有助於調控宿主免疫反應。其中一種AMP為石斑魚抗菌胜肽-1(Epinecidin-1；Epi-1)，係為21個胺基酸的胜肽，其首次發現於一魚類物種石斑魚(點帶石斑魚(Epinephelus coioides))〔Pan et al.,Gene expression and localization of the epinecidin-1 antimicrobial peptide in the grouper(Epinephelus coioides),and its role in protecting fish against pathogenic infection.DNA Cell Biol 2007,26：403-13；台灣專利號I-299335〕。就結構上而言，該胜肽係類似於魚類抗菌胜肽(pleurocidin)，一種冬季比目魚(美洲鰈(Pleuronectes americanus))的蛋白質。合成的Epi-1在數種宿主身上具有免疫調節及保護作用以對抗革蘭氏陰性菌的感染，包括小鼠的綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染、斑馬魚的創傷弧菌(Vibrio vulnificus)感染、及鴨的鴨疫黎氏桿菌(Riemerella anatipestifer)感染〔Lin et al.,Epinecidin-1,an antimicrobial peptide from fish(Epinephelus coioides)which has an antitumor effect like lytic peptides in human fibrosarcoma cells.Peptides 2009,30：283-90；Lee et al.,The antimicrobial peptide,epinecidin-1,mediates secretion of cytokines in the immune response to bacterial infection in mice.Peptides 2012,36：100-8；Pan et al.,Insights into the antibacterial and immunomodulatory functions of the antimicrobial peptide,epinecidin-1,against Vibrio vulnificus infection in zebrafish.Fish Shellfish Immunol 2011,31：1019-25；Pan et al.,Antimicrobial peptides of an anti-lipopolysaccharide factor,epinecidin-1,and hepcidin reduce the lethality of Riemerella anatipestifer sepsis in ducks.Peptides 2010,31：806-15〕。同時亦證實口服投予重組型Epi-1可保護石斑魚(點帶石斑魚)及斑馬魚(斑馬丹尼魚(Danio rerio))免於革蘭氏陰性菌創傷弧菌的感染〔Pan et al.,Oral administration of recombinant epinecidin-1 protected grouper (Epinephelus coioides)and zebrafish(Danio rerio)from Vibrio vulnificus infection and enhanced immune-related gene expressions.Fish Shellfish Immunol 2012,32：947-57〕。Epi-1亦具有對抗革蘭氏陽性菌株的抗菌活性，以及抗真菌及抗病毒活性〔Pan et al.,In vitro activities of three synthetic peptides derived from epinecidin-1 and an anti-lipopolysaccharide factor against Propionibacterium acnes,Candida albicans,and Trichomonas vaginalis.Peptides 2009,30：1058-68；Wang et al.,Inactivation of nervous necrosis virus infecting grouper(Epinephelus coioides)by epinecidin-1 and hepcidin 1-5 antimicrobial peptides,and downregulation of Mx2 and Mx3 gene expressions.Fish Shellfish Immunol 2010,28：113-20；Pan et al.,Evaluation of the epinecidin-1 peptide as an active ingredient in cleaning solutions against pathogens.Peptides 2010；31：1449-58〕。此外，據報導Epi-1能藉由穩定宿主細胞之細胞骨架網絡而促進對於細菌感染之抵抗〔Huang and Chen,Proteomic and functional analysis of zebrafish after administration of antimicrobial peptide epinecidin-1.Fish Shellfish Immunol 2013,34：593-8〕。

豹鰨毒素(Pardaxin)亦稱作GE33，為一種33個胺基酸的胜肽，其始於甘胺酸(glycine，G)並止於麩胺酸(glutamic acid，E)〔Oren and Shai,A class of highly potent antibacterial peptides derived from pardaxin,a pore-forming peptide isolated from Moses sole fish Pardachirus marmoratus.Eur J Biochem 1996,237：303-10，或美國專利號6,172,038〕。GE33係一具有α-螺旋結構之孔隙形成胜肽，其具有選擇性細胞溶解活性以對抗細菌〔Oren et al.,A repertoire of novel antibacterial diastereomeric peptides with selective cytolytic activity.J Biol Chem 1997,272：14643-9〕。據報導GE33具有抗微生物活性以對抗革蘭氏陽性及陰性細菌。此外，臨床案例研究顯示GE33應用於嚴重感染的皮膚創傷可清除該感染物並改進癒合功效。因此，GE33具有許多與抗生素一致的特徵，不過具有更廣泛的應用性，並可避免或減少細菌抗藥性的顧慮〔Hsu et al.,Pardaxin-induced apoptosis enhances antitumor activity in HeLa cells.Peptides 2011,32：1110-6；Huang et al.,Pardaxin,an antimicrobial peptide,triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 cells.Mar Drugs 2011；9：1995-2009；Shai and Oren,Diastereoisomers of cytolysins,a novel class of potent antibacterial peptides.J Biol Chem 1996；271：7305-8〕。

抗二甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌(MRSA)係受傷患者的主要感染成因，而近年來與健康照護有關的(healthcare associated；HA)及社區有關的(community associated；CA)MRSA已開始盛行。其出現係由於特定抗生素過度使用之結果。MRSA一般在無傷口時不會造成感染。當MRSA經由切口或擦傷進入體內時，其可能藉由躲避體內的天然保護機制而造成感染。此需替代療法之使用，使其在理想情況下不會經由持續性的選擇性壓力而產生抗藥性。近年來，MRSA的感染已可被莫匹羅星(mupirocin)、克林達黴素(clindamycin)、三甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲異噁唑(trimethoprim/sulfamethoxazole)、去氧羥四環素(doxycycline)、米諾四環素(minocycline)、利奈唑胺(linezolid)、萬古黴素(vancomycin)、達托黴素(daptomycin)、及特拉萬星(telavancin)所治療〔Bjorn et al.,Anti-infectious and anti-inflammatory effects of peptide fragments sequentially derived from the antimicrobial peptide centrocin 1 isolated from the green sea urchin,Strongylocentrotus droebachiensis.AMB Express 2012,2：67〕。同樣地，萬古黴素、利奈唑胺、達托黴素(救必辛(Cubicin))、替加環素(老虎黴素(Tygacil))、及特拉萬星(黴必替(Vibativ))據報導可用於治療院內的皮膚及軟組織的嚴重MRSA感染。萬古黴素，為MRSA的主要療法，具有高的最低抑制濃度(minimum inhibitory concentration；MIC)值及其他限制〔Palazzolo-Ballance et al.,Neutrophil microbicides induce a pathogen survival response in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus.J Immunol 2008,180：500-9〕。已有報告顯示皮膚的皮膚受傷時會誘發AMP(例如，毒蛇抗菌胜肽(cathelicidin))釋放；然而，該AMP對於MRSA感染的功效尚未被完整探討〔Dorschner et al.,Cutaneous injury induces the release of cathelicidin anti-microbial peptides active against group A Streptococcus.J Invest Dermatol 2001,117：91-7.27〕。據此，目前沒有方法可以證實AMP係有效於傷口癒合，具體而言是燒燙傷口。

本發明人非可預期地發現石斑魚抗菌胜肽-1(Epi-1)係有效於傷口癒合。據此，本發明提供一種用於傷口癒合的新穎方法及藥劑，具體而言是燒燙傷。在本發明之一具體實施例中，該方法或藥劑包含石斑魚抗菌胜肽-1(Epi-1)或豹鰨毒素(GE33)之使用，選擇地併入膠原蛋白。

在一方面，本發明提供一種用於傷口癒合的方法，其包含在有需求之個體的傷口塗敷一含有石斑魚抗菌胜肽-1(Epi-1)或豹鰨毒素(GE33)之組合物，並連同一醫藥上可接受之載體。在本發明之一具體實施例中，該方法係有效於燒燙傷治療。

在另一方面，本發明提供一種組合物在製備用於傷口癒合藥劑之用途，其中該組合物包含Epi-1或GE33，並連同醫藥上可接受之載體。

在一其他方面，本發明提供一種用於傷口癒合的方法，具體而言是燒燙傷，其包含在有需求之個體的傷口塗敷包含一Epi-1或GE33併入膠原蛋白之組合物，並連同醫藥上可接受之載體。

在又一方面，本發明提供一種組合物在製備用於傷口癒合藥劑之用途，具體而言是燒燙傷，其中該組合物包含以Epi-1或GE33併入膠原蛋白，並連同醫藥上可接受之載體。

在又一方面，本發明提供一用於燒燙傷口癒合之醫藥組合物，其包含以Epi-1或GE33併入膠原蛋白，並連同醫藥上可接受之載體。

前述的發明內容，以及後面的本發明詳盡說明，將因配合附圖而有更好的理解。為了闡釋本發明，圖式具體實施例之顯示為較佳之呈現。然而，應理解的是，本發明未侷限於該具體實施例。

在圖式中：圖1(A)至1(B)顯示該MRSA感染之傷口所造成的小鼠死亡情形；其中自未麻醉小鼠腹部移除1平方公分的皮膚部位，並以含有指定之cfu的50μlMRSA混合培養液感染傷口，小鼠的每日存活率如圖1(A)所示，而圖1(B)提供以10⁶cfu之MRSA感染後第3、7、及14天的傷口部位照片，其中「致死」代表處理以後無小鼠存活。

圖2(A)至2(B)提供該石斑魚抗菌胜肽-1的體外抗菌活性及體內傷口癒合活性；其中MRSA係培養於不同濃度的Epi-1，並以600nm光學密度測定相對細菌增生能力，自未麻醉小鼠腹部移除約1平方公分的皮膚部位，並以含有10⁶cfu之MRSA單獨、或結合Epi-1或Epi-1結合膠原蛋白的50μl混合培養液感染傷口。結果顯示於圖2(A)，而圖2(B)提供感染後第3、7、及14天的傷口部位照片。

圖3(A)至3(C)顯示Epi-1可增進傷口癒合及血管新生，並減少MRSA感染小鼠的細菌量。自未麻醉小鼠腹部移除1平方公分的皮膚部位，並以含有10⁶cfu之MRSA單獨、或結合萬古黴素、Epi-1、或Epi-1及膠原蛋白的50μl混合培養液感染傷口。圖3(A)係顯示感染後第3、7、及14天的傷口部位。圖3(B)係提供指定之治療組別之傷口皮膚的血管形成的照片。在圖3(C)中，以取自指定天數的皮膚切片進行培養，並以菌落形成單位(colony forming unit；CFU)表示細菌量。

圖4(A)至4(G)顯示Epi-1可消除感染區域之MRSA；其中自未麻醉小鼠腹部移除約1平方公分的皮膚部位，並以含有10⁶cfu之MRSA單獨、或結合二甲氧苯青黴素、萬古黴素、Epi-1、或Epi-1及膠原蛋白的50μl混合培養液感染傷口，如圖4(A)至4(F)所示。在接種後第三天，以指定之治療組別的組織切片進行革蘭氏染色。圖4(G)係顯示感染小鼠以指定之化合物治療後24h小時MRSA CFUs。

圖5(A)至5(C)顯示Epi-1調控MRSA媒介TNF-a、IL-6、及MCP-1之誘導發；其中自未麻醉小鼠腹部移除約1平方公分的皮膚部位，並以含有10⁶cfu之MRSA單獨、或結合二甲氧苯青黴素、萬古黴素、Epi-1、或Epi-1結合膠原蛋白的50μl混合培養液感染傷口；並在治療後24小時以ELISA檢測血清(A)IL-6、(B)TNF-α、及(C)MCP-1。

圖6顯示Epi-1調節感染傷口中的紅血球細胞及血小板的累積；其中自未麻醉小鼠腹部移除約1平方公分的皮膚部位，並以含有10⁶cfu之MRSA單獨、或結合二甲氧苯青黴素、萬古黴素、或Epi-1的50μl混合培養液感染傷口。在治療後第0、3、4、7、及14天將受傷區域之皮膚樣本固定並進行吉姆沙(Giemsa)染色。

圖7(A)至7(R)顯示Epi-1調節感染傷口的單核細胞及巨噬細胞之補充量，以及VEGF之產生；其中自未麻醉小鼠腹部移除約1平方公分的皮膚部位，並以含有10⁶cfu之MRSA單獨、或結合二甲氧苯青黴素、Epi-1、或Epi-1結合膠原蛋白的50μl混合培養液感染傷口；以及在治療後三天將受傷區域的皮膚樣本固定並進行抗單核細胞、巨噬細胞、及VEGF之抗體的染色。

圖8(A)至8(D)顯示以GE33治療乾淨及感染傷口的閉合情形；其中測量自受傷開始至閉合全層傷口面積(起始為直徑1.5cm)。圖8(A)顯示所有的全層無菌傷口在第25天閉合。圖8(B)係顯示以微生物混合物感染之全層傷口於開始時增加其大小，而GE33處理之傷口未出現剛開始擴張的情形且閉合速度(第21天)快於萬古黴素處理之傷口。圖8(C)提供各代表性傷口的照片，其中「致死」代表無小鼠存活。圖8(D)顯示細菌負載量數據，在各時間點包含平均四隻小鼠；並與各小鼠的初次接種進行對照。

圖9(A)至9(B)係以組織革蘭氏染色提供傷口及皮膚成熟作用的評估結果。圖9(A)係顯示在第3天以革蘭氏進行感染小鼠(未處理之對照組或以指定之抗生素或GE33/膠原蛋白處理之小鼠)的傷口活體組織切片染色，其中革蘭氏陽性微生物呈現紫色斑點。相較於未處理組，以GE33處理之小鼠革蘭氏陽性微生物減少(箭頭表示組織中之菌叢；各照片代表兩次實驗的結果，每次三重複)。圖9(B)係提供真皮及表皮成熟作用的評估結果(放大倍率：x100；顯微照片之長度及高度：500μm)。

圖10(A)至10(B)係顯示GE33之抗菌及免疫調節功能；其中圖10(A)係提供指定濃度之GE33對抗MRSA的活性；以及圖10(B)係提供Balb/c小鼠在以MRSA接種傷口後第3天的皮膚組織病理學代表圖(吉姆沙染色，原始放大倍率：x100)。

圖11係顯示以GE33處理感染小鼠可增進巨噬細胞及單核細胞浸潤，並增加VEGF；其中小鼠在第3天犧性；而傷口部位的冷凍切片以甲醛固定，並以如所示之抗巨噬細胞(MΦ)、單核細胞(Mono)、或VEGF專一性抗體進行免疫化學分析(r=3；n=3)。

圖12(A)至12(C)係顯示以GE33處理MRSA感染小鼠可減少MCP-1、IL-6、及TNF的釋放；其中小鼠傷口於MRSA感染後以GE33處理，並以ELISA測量細胞介素分泌，TNF之結果顯示於圖12(A)、IL-6之結果顯示於圖12(B)且MCP-1之結果顯示於圖12(C)(r>3；n=3；有不同字母的數值代表顯著差異(p<0.05)，係以ANOVA分析)。

除非另有定義，本文所使用的技術性及科學性術語具有本領域之技術人員所能常規理解的意義。

本文所使用的單數形式「一」、「一者」、及「該」係包括其複數參考物，除非文中另有清楚指明。因此，舉例而言，參考「一樣本」包括本領域習知之複數個此類樣本及其等同物。

本文所使用的「石斑魚抗菌胜肽-1」或「Epi-1」乙詞是指石斑魚抗菌胜肽或其衍生物、片段或變體。一實例為21個胺基酸胜肽的石斑魚抗菌胜肽-1，其最早在魚類物種石斑魚(點帶石斑魚)中發現，由Pan等人[DNA Cell Biol 2007,26：403-13；或台灣專利號I-299335]所提供，其胺基酸序列如下：Gly-Phe-Ile-Phe-His-Ile-Ile-Lys-Gly-Leu-Phe-His-Ala-Gly-Lys-Met-Ile-His-Gly-Leu-Val(SEQ ID NO：1)。

Epi-1之實例包括但不限於，所有的石斑魚抗菌胜肽-1、其衍生物、片段或變體，如台灣專利號I-299335所揭示。

本文所使用的「其功能性衍生物、片段或變體」乙詞是指胜肽之衍生物、片段或變體能維持相同或類似之活性，並具有相同或類似之性質。

本文所使用的「豹鰨毒素」或「GE33」乙詞是指豹鰨毒素胜肽或其衍生物、片段或變體。豹鰨毒素之較佳實例是指具有33個胺基酸之胜肽，其始於甘胺酸(G)並止於麩胺酸(E)，如Oren與Shai[Eur J Biochem 1996,237：303-10，或美國專利號6,172,038]所述，其胺基酸序列如下：Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Pro-Lys-Ile-Ile-Ser-Ser-Pro-Leu-Phe-Lys-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Val-Gly-Ser-Ala-Leu-Ser-Ser-Ser-Gly-Gly-Gln-Glu(SEQ ID NO：2)。

豹鰨毒素之實例包括但不限於，所有的豹鰨毒素胜肽、其衍生物、片段或變體，如美國專利號6,172,038所揭示。

在實施例1至4中證實，Epi-1為抗生素的有效輔助療法，其係根據以下之發現：(i)使用胜肽如Epi-1不會誘發抗藥性，係因AMP並非直接作用於微生物；(ii)Epi-1可與抗生素相容使用，且不具有任何明顯的免疫毒性效應；(iii)據發現Epi-1有預防功效，且不會產生抗藥性，顯示Epi-1適合用於高危險性的感染情況；以及(iv)在傷口閉合時，局部塗敷Epi-1可有效治療MRSA感染，並且以其併入膠原蛋白時可加速傷口癒合。

在實施例5至7中亦證實，GE33可輔助GE33之使用，其係根據以下之發現：(i)GE33不會誘發抗藥性，係因其並未直接作用於微生物；(ii)GE33可選擇性調控先天性免疫反應，從而提供預防或治療廣域之感染，同時平衡或控制隨之而來的發炎反應；(iii)GE33可增加巨噬細胞及單核細胞的補充；以及(iv)GE33亦可刺激多種訊息路徑，並誘發重要的趨化介素。

在實施例中亦證實，Epi-1或GE33改善單核細胞及巨噬細胞的過度補充，並增加VEGF表現，以及減少MCP-1、IL-6、及TNF的誘發。

據此，本發明提供一種用於傷口癒合的方法，其包含在有需求之個體的傷口塗敷含有石斑魚抗菌胜肽-1(Epi-1)或豹鰨毒素(GE33)之組合物，並連同一醫藥上可接受之載體。

另一方面，本發明提供一種組合物在製備用於傷口癒合藥劑之用途，其中該組合物包含Epi-1或GE33，並連同一醫藥上可接受之載體。

在本發明之一特定之實施例中，Epi-1或GE33係有效用於燒燙傷口癒合之治療。

此外，本發明提供用於一種組合物在製備用於傷口癒合藥劑之用途，其中該組合物包含Epi-1或GE33，並連同一醫藥上可接受之載體。

同時也發現以Epi-1或GE33併入膠原蛋白可提供在傷口癒合的增進功效，具體而言是燒燙傷口。

據此，本發明提供一種用於傷口癒合的方法，係使用Epi-1或GE33併入膠原蛋白；以及一種組合物在製備用於傷口癒合藥劑之用途，具體而言是燒燙傷口，其中該組合物包含以Epi-1或GE33併入膠原蛋白，並連同一醫藥上可接受之載體。

此外，本發明提供一種用於燒燙傷口癒合的醫藥組合物，具體而言是燒燙傷口癒合，其包含以Epi-1或GE33併入膠原蛋白，並連同一醫藥上可接受之載體。

在本發明中，該醫藥組合物可以任何本領域之技術人員習知的標準技術或常規方法配製。

本文所使用的「治療有效量」乙詞係指一定量之藥物或藥劑，相較於未接受此量之相對應的個體，其能導致疾病、失調、或副作用的治療或癒合功效，或降低疾病或失調的發展速度。本詞亦包括在其範疇內可有效強化正常生理功能的量。

用於治療時，治療有效量之胜肽、或其功能性變體可配製成醫藥組合物而投予。據此，本發明進一步提供醫藥組合物，其包含治療有效量之胜肽或其功能性衍生物、片段或變體，並伴隨一或多個醫藥上可接受之載體。

本文所使用的「醫藥上可接受之載體」乙詞係指載體、稀釋劑、或賦形劑為醫藥上可接受，其在意義上係相容於配方之其他成分且不會危害欲接受醫藥組合物投予之個體。本發明可使用本領域常規習知或使用的任何合載體、稀釋劑或賦形劑，取決於醫藥配方之需求。

依據本發明，該醫藥組合物可以任何適用之途徑投予，包括但不限於，局部、直腸、鼻、陰道、經口或非經口途徑。在本發明之一具體實施例中，該醫藥組合物係配製成局部投予。可以藥學領域之任何習知方法製備此類配方。本發明之一實施例為覆蓋物、沉積物、或填充物形式之醫藥組合物。

本發明現將參考下列實施例以更特定地說明，而實施例之提供係旨在闡述而非侷限本發明。

實施例

材料及方法

小鼠及細菌培養

實施例中使用六至八週大的雄性Balb/C小鼠。進行MRSA的培養及定量，並將懸浮液進行系列稀釋並平鋪在LB瓊脂(Luria-Bertani agar)培養盤上，每組二重複並靜置24小時。在培養期過後，計數菌落形成單位 (CFU)、計算平均值並以CFU/ml表示。所有的動物處理流程皆根據國立台灣海洋大學(National Taiwan Ocean University；NTOU)的指導原則進行。所有的流程皆經由NTOU動物照護及使用委員會同意。

該鼠科巨噬細胞株J774A.1(ATCC，種原收集號TIB-67)係培養在含有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素的RPMI 1640(完整培養基；Life Technologies,Grand Island,New York)。J774A.1細胞係以1×10⁴細胞/mL培養在內含5% CO₂的37℃加濕培養箱。

試劑

以MCP1(目錄編號555260，BD Biosciences,CA,USA)、IL-6(目錄編號555240，BD Biosciences,CA,USA)、及TNF(目錄編號558534，BD Biosciences,CA,USA)之Elisa套組測定細胞介素量。以抗巨噬細胞(目錄編號550282，BD Biosciences,CA,USA)、抗單核細胞(目錄編號101301，BioLegend,London,UK)、及抗VEGF(目錄編號550549，BD Biosciences,CA,USA)之抗體進行免疫組織化學(immunohistochemistry；IHC)試驗。魚鱗膠原蛋白胜肽(fish scale collagen peptides；FSCPs)係分離自吳郭魚(Oreochromis sp.)，其由台灣行政院農業委員會水產試驗所水產加工組(Seafood Technology Division,Fisheries Research Institute,Council of Agriculture,Taiwan)所提供。

統計分析

所有實驗皆進行三次，且每次三個生物學重複。誤差槓代表標準差，並以ANOVA計算各組別之間的顯著差異(p=0.05)。誤差槓上方的不同字母顯示各組別之間的顯著差異。用於體內分析之小鼠每組為四隻；每一體內實驗重複進行至少二次。

以皮膚切除法誘發小鼠發炎性創傷

將小鼠隔離安置以防止打鬥及傷口進一步損傷，並分別使其自由攝食及飲水。小鼠在室溫下維持12小時/12小時之光照/避光循環，並在實驗前使其於該環境中適應至少一週。將各小鼠之背部毛髮剔除，並在小鼠背上產生全層切除傷口(直徑1cm)。

以含有10⁶CFU指定微生物之50μl混合培養液接種至各傷口。以本發明之抗微生物胜肽處理傷口，並在接種5分鐘後以膠原蛋白處理。在處理30分鐘後，傷口以傷口護理敷料(Tegaderm)覆蓋以維持均勻並防止材料在治療時流失。在產生傷口後第3、7、及14天進行傷口檢查，且每隔一天檢查未經感染的傷口。檢查傷口以評估該傷口癒合的發炎至再生及再生至解決等轉變期。在試驗期結束時，以吸入CO₂的方式犧牲動物，並評估傷口。針對各實驗，每一時間點各組別以四隻動物進行試驗。測量各傷口並隨後自動物身上移除，而未受傷之皮膚則取自腹部對側以作為對照組。

傷口感染評估

在磷酸鹽緩衝液(PBS)中將組織樣本均質化。將均質物依序稀釋，其分液於37℃之LB瓊脂上培養18小時，接著計算每公克組織之cfu。穩定之傷口感染定義為每公克組織10⁶cfu。

組織學檢查

收取全層組織以進行微生物及組織學分析。以4%緩衝之三聚甲醛(paraformaldehyde)固定各實驗樣本。組織樣本係以蘇木精/伊紅 (hematoxylin/eosin)或吉姆沙(Giemsa)進行染色，並以三位獨立研究人員進行免疫化學(IHC)分析。以BX-51顯微鏡(Olympus,Japan)拍攝影像。

傷口閉合測量

在受傷後立即進行追蹤。在未經感染的傷口方面，每隔一天測量傷口大小。在經感染的傷口方面，在第3、7、14、或17天犧牲小鼠，並追蹤傷口邊緣。以Macintosh Adobe Photoshop程式及組織學檢查測定傷口面積。傷口收縮百分比之計算方式如下：傷口收縮百分比(%)=(A₀-A_t)/A₀ x 100%其中A₀為原始傷口面積，而A_t為第3、7、14、及17天之傷口面積。

微生物接種

選擇常見的與人體傷口感染相關的多重抗藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株製成多重微生物溶液。該初培養物係將該好氧菌在37℃下整夜培養於胰蛋白酶大豆培養液(Tryptic Soy Broth；TSB)所製備。培養液係接續以1,000rpm離心15分鐘，並重新懸浮於含15%甘油之TSB，或含15%甘油之碎肉萃取物(針對好氧菌)。該濃度係調整至10⁶cfu/50μl，並保存在-80℃。在塗敷傷口之前，將細菌儲液重新混合。微生物負載量係以直接平板法(direct plating)予以確定，接著進行凍融(freeze-thaw)及cfu計數，並同時進行接種。該接種係以無菌滴管尖將接種體移至開放傷口中央處。在犧牲後(於第0、3、7、14、或17天)，以二對分之組織片段測定微生物負載量，係使用人體傷口活體組織切片培養法，如UPMC Clinical Microbiology Laboratory Procedure Manual所述。將活體組織切片秤重，並置於1.5ml之TSB中，接著在組織研磨機中均質化。將一滴均質物置於玻片上，並以革蘭式染色進行初步評估(若一或多個細菌出現在油浸視野之內，則組織內的預期量為至少10⁵cfu/g)。以蒸餾水序列稀釋(1：10(0.1+0.9))組織均質物。每公克組織之cfu的計算方式如下：cfu/g=平板計數量(1/稀釋倍數)x 10/均質化組織之重量。

實施例1 Epi-1之體外抗微生物功效

進行最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration；MIC)及最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration；MBC)抗微生物試驗。在MIC評估方面，該抗微生物胜肽Epi-1係稀釋為最終濃度100、50、25、12.5、6.26、3.125、1.582、或0.78μg/ml。以20μl之各稀釋液在微量滴定盤中混合20μl之適當細菌指示劑懸浮液及160μl之金黃色葡萄球菌之胰蛋白酶大豆培養液(TSB)，使總體積達到200μl。各金黃色葡萄球菌菌株、化合物、及濃度皆三重複進行。陽性對照組含有水而非化合物，而陰性對照組含有化合物但不具細菌懸浮液。微生物之生長情形係以600nm之光學密度儀(Bioscreen C,Labsystem,Helsinki,Finland)自動測定。將微培養盤培養於25℃下觀察植物病原體，並培養於37℃下觀察食物傳播細菌之菌株。每隔一小時觀察吸光值，並持續48小時。每次測量前搖晃培養盤20秒。重複實驗二次。在實驗結束時，以最低濃度所產生的零生長作為MIC。

欲確認MRSA劑量是否造成皮膚外傷鼠科模型死亡，進行下列程序。在各小鼠背上切除一皮膚區域，並以溶於50μl懸浮液之不同CFU計數量的MRSA感染傷口。每日偵測感染小鼠的存活狀況。所有接受10⁸、10⁷、或10⁶CFU的小鼠分別在二、三、或四天內死亡，而未暴露小鼠則無死亡(圖1A)。基於該等觀察，以10⁶CFU之MRSA進行後續實驗。欲確認該 MRSA菌株是否具有二甲氧苯青黴素抗藥性，傷口係以MRSA單獨或結合二甲氧苯青黴素或市售的萬古黴素處理。以MRSA單獨或MRSA及二甲氧苯青黴素處理的小鼠在四天內死亡，而對照組(未經感染)及以MRSA結合萬古黴素處理的小鼠則存活，其中切除部位觀察到重新上皮化(re-epithelialization)的情形(圖1B)。這證明本研究所使用的MRSA為二甲氧苯青黴素抗藥性菌株。

欲檢測Epi-1對抗MRSA感染的功效，進行Epi-1的MIC及MBC。如圖2A所示，Epi-1具有良好的MRSA抗菌功效。如圖2B所示，相較於單獨處理Epi-1，以Epi-1及膠原蛋白共同處理MRSA感染之切除傷口可強化癒合及重新上皮化。在切除皮膚後，每天測量未感染小鼠(作為對照組)及以萬古黴素、Epi-1、或Epi-1及膠原蛋白-1處理之感染小鼠的傷口部位面積；並且比較最初受傷與癒合的面積大小以評估傷口閉合功效。如圖3A所示，相較於萬古黴素處理之小鼠及對照組小鼠，以Epi-1及Epi-1結合膠原蛋白處理之小鼠傷口閉合速度較快。在傷口復原期間，發生血管新生作用，以供應血液至傷口部位。在光學顯微鏡下比較各處理組別之間的血管新生功效。如圖3B所示，以Epi-1處理之感染小鼠的血管新生比萬古黴素的明顯；並且如圖3C所示，以Epi-1處理之感染小鼠的細菌量亦明顯比以萬古黴素處理之小鼠的低。

實施例2 Epi-1之體內抗菌活性

欲進一步深入瞭解Epi-1的功效，以傷口部位的切片進行革蘭氏染色。革蘭氏陽性MRSA(圖4A)感染小鼠的紫染情況在以二甲氧苯青黴素、Epi-1、或Epi-1及膠原蛋白處理的感染小鼠身上完全消失(圖4B至圖4D)。此外，Epi-1對於減弱MRSA感染的功效優於萬古黴素(圖4E)。以受傷之皮膚片段繼續培養，並計算MRSA之CFU。與革蘭氏染色的觀察結果一致，相較於對照組，以Epi-1處理的MRSA CFU明顯減少(圖4G)。

實施例3 Epi-1之前發炎性細胞介素表現

如先前實施例所示，Epi-1具有對抗MRSA感染的功效，因此檢測Epi-1對於MRSA所產生之免疫反應的影響。MRSA感染會在感染後第1、2、及3天造成TNF-α及IL-6的強烈誘發，而此不受二甲氧苯青黴素處理的影響；然而，以萬古黴素或Epi-1(存在或不存在膠原蛋白)處理會明顯降低IL-6及TNF-α的誘發(圖5A及圖5B)。該化學吸引因子MCP-1係涉及受傷位置的單核細胞補充，並協助蛋白質在傷口癒合期間通過表皮障壁。MRSA造成的MCP-1誘發因處理Epi-1而減少，而非萬古黴素(圖5C)。

實施例4 Epi-1處理後之切除組織的趨化性及組織學

在傷口癒合期間，單核細胞在48小時開始取代嗜中性白血球，以移除傷口碎片；隨後在72小時進入增生期，期間誘發數種生長因子。以傷口部位的組織切片進行吉姆沙染色以顯現單核細胞(淡藍色)、淋巴細胞(深藍色)、及紅血球細胞(粉紅色)(圖6)。未處理組之切片具有單核細胞的過度累積，而Epi-1的處理可減少其補充。在傷口癒合期間會刺激VEGF產生，而其為提供抗菌活性及傷口癒合所需之氧、營養物、及免疫細胞的重要因子。欲確認是否此蛋白質的產生亦受Epi-1影響，以皮膚切片進行染色並以抗單核細胞、巨噬細胞、及VEGF之專一性抗體進行偵測。雖然MRSA感染組切片的抗單核細胞、巨噬細胞、及VEGF染色結果明顯(圖7A至圖7I)，而以Epi-1治療後則明顯減少(圖7J至圖7R)。

實施例5 GE33對於傷口閉合之功效

以GE33及膠原蛋白處理小鼠，取代先前實施例中的Epi-1。如圖8A所示，GE33可促進傷口癒合。未處理傷口及Tegaderm^TM或抗生素處理傷口區域之間未出現統計差異，其皆在第21至25天閉合，此不令人意外，因為在健康年輕的小鼠皮膚傷口能有效癒合，而此過程很難有明顯改進。然而，其發現未處理之感染傷口在第一週造成死亡(圖8B)。以萬古黴素治療所造成的閉合時間類似於對照組，而以GE33單獨或結合膠原蛋白處理可加速傷口閉合。此傷口閉合速度增加的情形在未感染傷口上並未觀察到，顯示GE33及膠原蛋白可對抗感染而增進傷口復原。與未感染傷口不同的是，所有治療組別在一週後傷口大小無明顯改變(圖8B)。在第14天時，GE33處理組的傷口大小比萬古黴素處理組的小(P<0.05)。然而，兩組別證實在第25天結束時全部閉合(圖8C)。

未處理之感染傷口組的傷口大小增加，以及MRSA及MRSA+Meth(二甲氧苯青黴素)處理組的閉合缺乏(圖8B)，顯示有活躍的傷口感染情況。此由傷口菌叢的定量評估證實(圖8D)，其顯示MRSA及MRSA+Meth組別在第3天時，各生物體由約10⁴cfu/10μl之初接種體增至約10⁸cfu/10μl；在第7與17天之間，MRSA+Vanc(萬古黴素)、MRSA+GE33、及MRSA+GE33+膠原蛋白組別的菌落量減少，其中減少最快的組別出現在GE33組(在第14天時與其他組別相較有明顯不同)。

實施例6 GE33對於真皮及表皮成熟作用之功效

在臨床上，由於處於有氧環境，企圖透過培養取自皮膚傷口的厭氧菌而計數MRSA菌落常會有低估的情形。利用組織的革蘭氏染色評估傷口，以確認是否皮膚上的厭氧菌數量大於好氧菌的量(圖9A)。真皮上部每一高倍視野之革蘭氏陽性菌數的定量反映了量化的細胞數目。如預期，以抗微生物藥劑處理時，細菌負載量的減少更迅速。

上述數據證實了增強的傷口癒合效果，顯示以GE33單獨或結合膠原蛋白處理可增進皮膚基質的成熟作用。我們以常規的組織學分析進行檢查(圖9B)。一般在增生、重組、及成熟階段評估皮膚成熟作用。以GE33合併膠原蛋白治療傷口可加速三個階段的進程。在表皮部分亦觀察到癒合加速(圖9B)。以GE33單獨或結合膠原蛋白治療的傷口在第7天開始表皮化作用，不過未出現在對照組或抗生素治療傷口組。以GE33或GE33合併膠原蛋白治療的傷口會有如正常皮膚的多層化情形，並在第21天完全成熟。表皮的角化及再生未有不規則的徵狀，而相較於GE33組，以Tegaderm^TM及MRSA+Vanc處理的傷口則出現整體表皮熟化減損的情形。結論為，GE33具有對抗MRSA的體外抗菌活性。

實施例7 GE33之抗微生物活性評估

如圖10A所示，GE33對抗MRSA的最小抑制濃度(MIC)為>6.25mg/L。同樣地，MIC大於6.25mg/L的GE33可有效殺死懸浮於10mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.2)中的MRSA，顯示以GE33處理MRSA的最佳劑量為6.25mg/L。在感染小鼠之傷口癒合後，評估GE33促進先天性免疫反應及細胞介素產生的功效。吉姆沙染色顯示免疫細胞累積於以MRSA處理之感染小鼠的皮膚(圖10B)。

此外，建立了GE33直接抗微生物活性的機制。使用IHC測量GE33調控小鼠免疫細胞的能力。如圖11所示，以IHC結合細胞表面標記物抗體顯示以GE33或GE33合併膠原蛋白處理的感染傷口單核細胞及巨噬細胞的浸潤明顯增加。此外，該等組別中，與增生相關的VEGF係予以增加(圖11)。

該前發炎性細胞介素IL-6可作為先天性免疫的潛在調節劑，而趨化介素MCP-1可增進單核細胞及巨噬細胞補充至傷口周圍的組織。在處理三天後，測量MRSA感染小鼠的血清趨化介素及細胞介素的量。該MRSA感染小鼠係作為陽性對照組以確認細胞介素活化情形。相較於陽性對照組，以GE33處理可減少MCP-1、IL-6、及TNF的誘發(圖12)。

其結論為Epi-1或GE33 Epi-1可作為抗生素的潛在輔助療法，其相容於抗生素之使用而不會有任何明顯的免疫毒性效應。

本發明所提供之說明及主張應理解為旨在闡述本發明之目的，而不是以任何方式侷限本發明之範疇。

Claims

一種抗菌胜肽在製備預防或治療對二甲氧苯青黴素具抗藥性之金黃色葡萄球菌株(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)感染之傷口藥劑之用途，其中該抗菌胜肽為石斑魚抗菌胜肽-1(Epinecidin-1；Epi-1)或豹鰨毒素(Pardaxin；GE33)。
如申請專利範圍第1項之用途，其中該Epi-1或GE33係併入膠原蛋白中。
如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該藥劑改善單核細胞及巨噬細胞的過度補充，並增加VEGF表現，以及減少免疫反應。
如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗菌胜肽為Epi-1。
如申請專利範圍第1或2項之用途，其中Epi-1係一具有如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列的胜肽。
如申請專利範圍第4項之用途，其中Epi-1係一具有如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列的胜肽。
如申請專利範圍第1或2項之用途，其中GE33係一具有如SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列的胜肽。
如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該傷口係燒燙傷口。
如申請專利範圍第8項之用途，其中該藥劑係呈一覆蓋物、一沉積物、或一填充物之形式。