KR20180101375A - 감염된 상처를 위한 활성화된 줄기 세포 및 전신적 치료 방법 - Google Patents

Abstract

활성화된, 주입 준비된 동종이계 간엽 줄기 세포의 집단, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 조성물이 본원에 제공된다. 또한, 유효량의 활성화된 간엽 줄기 세포를 포유류에 투여함으로써 그 포유류에서 감염된 상처를 치료하는 방법이 제공된다.

Description

감염된 상처를 위한 활성화된 줄기 세포 및 전신적 치료 방법

관련 출원

본 출원은 2015년 12월 7일에 제출된 미국 출원 제62/264,077호를 우선권으로 주장하며, 상기 미국 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로는 감염된 상처의 치료를 위한 활성화된 간엽 줄기 세포의 용도에 관한 것이다.

상처 치유는 피부 조직의 파괴가 발생할 때마다 활성화되는, 복잡하고 역동적이며 잘 조직된 과정이다. 광범위한 현상이 상처 치유 과정에 걸쳐 발생한다. 상처 감염은 조직 손상, 예컨대 외상 및 수술 상처, 만성 상처와 궤양, 및 화상의 가장 흔하고 심각한 합병증이다.

그러나, 항생제 내성의 세계적인 증가로 인해, 당업계에는 상처 감염의 치료를 위한 추가의 비전통적 요법에 대한 충족되지 않은 중요한 요구가 남아있다.

톨 유사 수용체 3(TLR3) 작용제, 톨 유사 수용체 9(TLR9) 작용제, 톨 유사 수용체 4(TLR4) 작용제, 핵 올리고이량체화 도메인(nuclear oligodimerization domain: NOD) 수용체 작용제, RIG-I 수용체(RLR) 작용제, 사이토솔 DNA 센서(cytosolic DNA sensor: CDS) 작용제, 및/또는 STING 수용체 작용제로부터 선택된 하나 이상의 활성화제에의 노출에 의해 활성화된, 주입 준비된(infusion ready) 동종이계 간엽 줄기 세포의 집단, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 조성물이 본원에 제공된다. 예를 들어, 상기 조성물은 정맥내 투여를 위해 제제화될 수 있다.

간엽 줄기 세포는 당업계에 공지된 임의의 공급원, 예를 들어 골수, 지방 조직, 제대혈, 조직 생검물(예컨대, 피부 생검물 또는 치아 생검물) 또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 수득되거나 유도될 수 있다.

일부 실시양태에서, 동종이계 간엽 줄기 세포의 집단은 하나 이상의 활성화제로 2시간 이상 시험관내 및/또는 생체외 인큐베이션하는 것에 의해 활성화된다.

적합한 TLR3 작용제의 비제한 예로는 폴리아데닐산-폴리우리딜산(폴리(A:U)), 폴리이노신산-폴리시티딜산(pIC) 및/또는 UV 불활성화된 바이러스 입자(예컨대, 폭스바이러스 입자)가 있다.

적합한 TLR9 작용제의 비제한 예로는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODN), 억제성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), 정제된 DNA, 및/또는 정제 또는 합성 플라스미드 DNA가 있다.

TLR4 작용제의 비제한 예로는 세균성 지질다당류(LPS), 모노포스포릴 지질 A(MPLA) 및/또는 가열 사멸된 그람 음성균이 있다.

NOD 수용체 작용제의 비제한 예로는 NOD1 작용제(예컨대, 디펩티드 IE-DAP(iE-DAP(γ-D-Glu-mDAP)), NOD2 작용제(예컨대, 무라밀디펩티드(MDP) 및/또는 이의 합성 유도체, 예컨대 미라부티드(mirabutide)), 및/또는 NOD1/2 혼합 작용제(예컨대, 그람 양성균 및/또는 합성 분자 MurNAc-L-Ala-감마-D-Glu-mDAP(PGN 유사 분자)가 있다.

일부 실시양태에서, RLR 수용체 작용제가 이중 가닥 RNA, 합성 pAT RNA, 및/또는 합성 pIC RNA이고/이거나; CDS 작용제는 세균으로부터 단리된 이중 가닥 DNA이고/이거나; STING 수용체 작용제가 3,3 환형 gAMP, 2,3 환형 gAMP, 2,2 환형 gAMP, 및 환형 Di-GMP 및/또는 환형 di-UMP를 포함하나 이들로 한정되지 않는 환형 디뉴클레오티드이다.

한 실시양태에서, 활성화제는 10 ㎍/ml의 폴리이노신산:폴리시티딜산(pIC)이다.

본원에 기술된 임의의 조합은 유효량의 하나 이상의 항미생물제, 예컨대 살균성 항생제 및/또는 정균 항생제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 살균성 항생제의 비제한 예로는 페니실린 유도체(페남), 세팔로스포린(세팜), 모노박탐, 카르바페넴, 반코마이신, 답토마이신, 플루오로퀴놀론, 메트로니다졸, 니트로푸란토인, 코트리목사졸, 텔리트로마이신, 및/또는 아미노글리코시드계 항생제를 들 수 있다. 정균 항생제의 비제한 예로는 테트라사이클린 항생제, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 클린다마이신, 및/또는 리네졸리드를 들 수 있다.

부가적으로, 일부 실시양태에서, 활성화된 간엽 줄기 세포는 투여 전에 하나 이상의 항생제로 예비 로딩될 수 있다.

적합한 동종이계 간엽 줄기 세포는, 인간 간엽 줄기 세포를 포함하는 포유류 간엽 줄기 세포이다.

본원에 기술된 조성물은 포유류에서 MDR 세균에 의해 만성 감염된 상처의 치유를 증진한다.

유효량(예컨대, 포유류의 체중 kg당 2×10⁶ 세포)의 활성화된 간엽 줄기 세포를 포유류에 투여함으로써, 포유류에서 만성 감염된 상처를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 예를 들어, 세포는 정맥내 카테터에 의해 15분의 시간에 걸쳐 투여될 수 있다.

당업자는, 유효량의 본원의 기술된 임의의 조성물이, 포유류에서 만성 감염된 상처를 치료하는 방법에 사용될 수도 있음을 인식할 것이다. 이러한 방법에서, 활성화된 간엽 줄기 세포 또는 조성물은 감염된 상처에서 세균 제거(bacterial clearance)를 유도하거나, 세균 부하(bacterial burden)를 감소시키거나, 또는 세균 제거를 유도하고 세균 부하를 감소시킨다.

바람직하게는, 활성화된 간엽 줄기 세포는 포유류에게 전신적으로(즉, 정맥내로) 투여된다.

본원에 기술된 임의의 방법에서, 간엽 줄기 세포는 시험관내 또는 생체외에서 톨 유사 수용체 3(TLR3) 작용제, 톨 유사 수용체 9(TLR9) 작용제, 톨 유사 수용체 4(TLR4) 작용제, 핵 올리고이량체화 도메인(NOD) 수용체 작용제, RIG-I 수용체(RLR) 작용제, 사이토솔 DNA 센서(CDS) 작용제 및/또는 STING 수용체 작용제로부터 선택된 하나 이상의 활성화제와의 인큐베이션에 의해 활성화된다.

적합한 TLR3 작용제의 비제한 예로는 폴리아데닐산-폴리우리딜산(폴리(A:U)), 폴리이노신산-폴리시티딜산(pIC) 및/또는 UV 불활성화된 바이러스 입자(예컨대, 폭스바이러스 입자)가 있다.

적합한 TLR9 작용제의 비제한 예로는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODNs), 억제성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODNs), 정제된 DNA, 및/또는 정제 또는 합성 플라스미드 DNA가 있다.

TLR4 작용제의 비제한 예로는 세균성 지질다당류(LPS), 모노포스포릴 지질 A (MPLA), 및/또는 가열 사멸된 그람 음성균이 있다.

NOD 수용체 작용제의 비제한 예로는 NOD1 작용제(예컨대, 디펩티드 IE-DAP(iE-DAP(γ-D-Glu-mDAP)), NOD2 작용제(예컨대, 무라밀디펩티드(MDP) 및/또는 이의 합성 유도체, 예컨대 미라부티드), 및/또는 NOD1/2 혼합 작용제(예컨대, 그람 양성균 및/또는 합성 분자 MurNAc-L-Ala-감마-D-Glu-mDAP(PGN 유사 분자))가 있다.

일부 실시양태에서, RLR 수용체 작용제가 이중 가닥 RNA, 합성 pAT RNA, 및/또는 합성 pIC RNA이고/이거나; CDS 작용제가 세균으로부터 단리된 이중 가닥 DNA이고/이거나; STING 수용체 작용제가 3,3 환형 gAMP, 2,3 환형 gAMP, 2,2 환형 gAMP 및 환형 Di-GMP 및/또는 환형 di-UMP를 포함하나 이들로 한정되지 않는 환형 디뉴클레오티드이다.

한 실시양태에서, 간엽 줄기 세포는 투여 전에 폴리이노신산:폴리시티딜산(pIC)에 의해 활성화된다. 예를 들어, 간엽 줄기 세포는 시험관내에서 10 ㎍/ml의 폴리이노신산:폴리시티딜산(pIC)과 2시간 이상 인큐베이션함으로써 활성화된다.

본원에 기술된 임의의 방법은, 유효량의 하나 이상의 항미생물제, 예컨대 살균성 항생제(예컨대, 페니실린 유도체(페남), 세팔로스포린(세팜), 모노박탐, 카르바페넴, 반코마이신, 답토마이신, 플루오로퀴놀론, 메트로니다졸, 니트로푸란토인, 코트리목사졸, 텔리트로마이신, 및/또는 아미노글리코시드계 항생제) 및/또는 정균 항생제(예컨대, 테트라사이클린 항생제, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 클린다마이신, 및/또는 리네졸리드)의 투여를 추가로 포함할 수 있다.

간엽 줄기 세포는 포유류 간엽 줄기 세포(예컨대, 동종이계 간엽 줄기 세포 및/또는 인간 간엽 줄기 세포)이다.

본원에 기술된 임의의 방법에서, 활성화된 간엽 줄기 세포 또는 이의 조성물은 포유류에서 감염된 상처의 치유를 증진한다. 비제한 예로서, 감염된 상처는 찰과상, 열상, 타박상, 진탕, 자창, 피부 베임(skin cut), 수술 상처, 총상, 화상, 일광 화상, 동상, 화학적 상처, 물린 상처, 쏘인 상처 및 전기적 상처로부터 선택된다.

다양한 실시양태에서, 상처는 고도의 약물 내성 세균에 의해 감염된 만성 상처, 또는 1 초과(즉, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상)의 세균의 종 또는 균주에 의해 감염되어 있는 만성 상처일 수 있다.

부가적으로, 본원에 기술된 임의의 방법은 I형 또는 II형 진성 당뇨병 환자에서 상처를 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 환자는 만성 상처 및/또는 감염된 상처의 치료를 어렵게 하는 면역 결함이 있는 것으로 알려져 있다.

본원에 기술된 방법 및 용도에서 이용되는 활성화된 간엽 줄기 세포는 활성화되지 않은 간엽 줄기 세포에 비해 증가된 항미생물 활성을 갖는다.

한 바람직한 실시양태에서, 활성화된 MSC는 정맥내 투여되며, 살균 또는 정균 항생제를 포함한 항생제 요법과 동시에 투여된다.

본원에 기술된 임의의 방법 또는 용도에서, 활성화된 간엽 줄기 세포는 상처 발생시에 또는 상처 발생 후에 투여될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 포유류에서 만성 감염된 상처를 치료하는 데 사용하기 위한 활성화된 간엽 줄기 세포를 제공한다. 활성화된 간엽 줄기 세포는 치료학적 유효량으로 투여하기 위한 것이다.

추가의 양태에서, 본 발명은 포유류에서 만성 감염된 상처를 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명의 조성물을 제공한다. 예를 들어, 이 조성물은 치료학적 유효량으로 투여하기 위한 것이다.

치료 방법의 임의의 특징(예컨대, 본원에 기술된 간엽 줄기 세포 및/또는 조성물의 특징)은 본 발명의 치료 방법과 의학적 사용 양태 모두에 동등하게 적용 가능하다.

본원에 기술된 임의의 양태 및 실시양태는, 본원에서 요약서, 도면, 및/또는 본 발명의 하기 구체적이고 비제한적인 실시예/실시양태를 포함한 발명의 상세한 설명에 개시된 임의의 다른 양태 또는 실시양태와 조합될 수 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 과학 용어는, 본 출원이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 있어서, 문맥에서 달리 명확히 나타내지 않은 한, 단수형은 복수형을 포함한다.

본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본원의 실시 및 시험에 사용될 수 있긴 하지만, 적절한 방법 및 재료를 하기에 기술힌다. 본원에 언급 된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 참고로 인용된다.

본원에서 인용된 참고문헌은 청구된 출원에 대한 선행 기술인 것으로 인정되지 않는다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 한정하고자 하는 것은 아니다.

본 출원의 다른 특징 및 이점은 실시예와 관련하여 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

도 1은 생물막 형성이 있는 마우스 만성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 상처 감염 모델에서의 항미생물성 줄기 세포 치료의 효과를 도시하는 일련의 사진이다. [본원에 참조로 인용되어 있는 문헌(Walton et al., Comp Med. 64(1):25-33 (2014)) 참조].
도 2는 마우스 S. 아우레우스(S. aureus) 상처 감염 모델에 있어서, 활성화된 MSC 및 항생제에 의한 치료 후 상처 조직에서 시간 경과에 따른 세균 부하의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 3은 활성화된 MSC와 항생제를 이용한 치료가 상처 조직에서 세균 수를 감소시키는 것을 보여주는 그래프이다.
도 4는 만성 상처 감염의 치료에 있어서 활성화된 MSC의 IV 대 직접 상처 주사의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 5는 마우스 만성 감염 모델에서 미세 상처 치유 조직학에 대한, 활성화된 MSC 투여와 항생제의 효과를 보여주는 일련의 현미경 사진이다.
도 6은 정맥내 투여 후, 활성화된 MSC가 상처 감염 부위로 효율적으로 이동하는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 7은 활성화된 MSC를 이용한 전신적 치료에 의해 상처 치유가 촉진되는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 8은 정맥내 투여 후, DiR로 표지한 활성화된 MSC가 감염된 상처 부위로 이동하는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 9는 MSC에 의한 시험관내 세균 사멸을 보여주는 그래프이며, 여기서 ***은 비파라미터 t-검정에 의해 평가된 p<0.001을 나타낸다.
도 10은 MSC가 항생제 요법과 병용될 때, 상승적 세균 사멸과 고도의 항생제 내성의 역전을 나타냄을 보여주는 그래프이다.
도 11은 활성화된 MSC에 의해 생성된 케모카인이 시험관내 단핵구 이동을 촉진한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 12는 활성화된 MSC의 전신 투여가 상처 감염 부위로의 단핵구 모집을 촉발시키는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 13은 활성화된 MSC를 이용한 요법이 상처 부위에서 상처-치유 대식세포의 분화를 촉진하고, 활성화된 MSC릴 이용한 치료가 대식세포 분극화를 M1에서 M2 표현형으로 이동시키는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 14는 MSC가 미생물성 카텔리시딘 펩티드 LL-37을 생성한다는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 15는 MSC에 의한 세균 사멸이 카텔리시딘 LL-37의 생성에 부분적으로 의존하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 16은 활성화된 MSC에 의해 생성된 인자가 호중구에 의한 세균성 세균 식균작용의 증가를 촉발시킨다는 것을 입증한다.
도 17은 활성화된 MSC의 정맥내 투여가, 감염된 외상성 발 손상을 가진 개의 감염된 발 상처에서, 복수 균주의 약물 내성 세균을 제거하는 것을 촉발시킴을 입증하는 그래프이다.
도 18은 활성화된 MSC의 전신 투여가 감염된 외상성 발 손상을 갖는 개에서 상처 치유를 촉진하는 것을 보여주는 일련의 사진이다.
도 19는 개에서의 비치유된 감염 발 상처에 대한, 활성화된 개의 동종이계 지방 유래 MSC의 효과를 도시한다.
도 20은 활성화된 MSC로 치료하는 것에 의한, MRSA로 감염된 개에서의 만성적 수술 후 관절 감염의 해상도를 보여주는 일련의 사진이다.
도 21은 MDR 엔테로코커스(MDR Enterococcus)가 있는 피부 감염을 가진 개에서의 상처 치유를 보여주는 일련의 사진입니다.
도 22는 활성화된 MSC 및 항생제 요법을 이용한 개에서의 골수염 및 골 플레이트(bone plate) 감염의 치료를 도시한다.
도 23은 항생제와 함께, 정맥내 투여한 활성화된 고양이 MSC를 이용한 일련의 치료 후에, 고양이에서 만성 감염된 큰 상처의 치유를 보여주는 일련의 사진이다.
도 24는 항생제와 함께 활성화된 개의 MSC의 단일 정맥내 투여로 치료된, 진성 당뇨병 및 만성 감염된 수술 후 상처 감염을 가진 개로부터의, 일련의 치료 전후 사진 및 배양 결과이다.
도 25는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 유래된 MSC도 항미생물 활성을 나타내는 것을 보여주는 그래프이다.
도 26은 MSC의 활성화가 그들의 이동을 증가시키는 것을 보여주는 그래프이다.
도 27은 활성화된 MSC가 S. 아우레우스 생물막을 파괴하는 것을 보여주는 그래프이다.

만성 상처 감염은, 만성 상처 및 상처 감염에 걸리게 하는 진성 당뇨병과 같은 질환의 보다 큰 발생률 및 약물 내성 세균의 증가하는 유병률에 의해 부분적으로 유발되는, 이환율 및 사망률의 주요 원인이 되어 오고 있다. (문헌[Owens et al., J. Hosp. Infect 70(Suppl. 2):3-10 (2008); Vinh et al., J. Long Term Eff. Med. Implants 15(5):467-88 (2005); Tuttle et al., Adv. Wound Care (New Rochelle) 4(1):1-11 (2015); 및 Edmiston et al., Adv. Exp. Med. Biol. 830:47-67 (2015)] 참조). 거의 대부분 카테터 또는 정형외과 장치와 같은 임플란트의 표면에서 발생하는 세균성 생물막의 발달을 특징으로 하는 감염은 항생제 요법 단독으로는 관리하기가 어려워, 수주에서 수개월의 지속적인 요법을 요하는 경우가 많다. 공격적인 항생제 요법에도 불구하고, 다수의 경우에서, 이러한 만성작 감염을 완전히 해결하기 위해 생물막에 감염된 장치 또는 임플란트를 제거해야 한다.

간엽 줄기 세포(MSC)로서, 이들의 항미생물 활성 및 상처 치유 활성을 증가시키기 위해 특정 면역 활성화 화합물을 사용하여 시험관내 또는 생체외에서 활성화시킨 MSC가 본원에 제공된다. 이러한 활성화된 MSC는, 단독으로 또는 하나 이상의 추가 항생제 요법(즉, 하나 이상의 살균성 항생제 및/또는 정균 항생제)과 조합하여, 종래의 직접적인 주사로 접근하기 어려울 수 있는 부위의 만성 상처 감염(예컨대, 정형외과 임플란트의 감염)에 도달하여 치료하도록, 특정한 정맥내(i.v.) 주입 기술을 사용하여 전신 투여될 수 있다.

이러한 활성화된 MSC(및 그의 임의의 조성물)는 생물막을 형성하여 치료를 특히 어렵게 만드는 다중 약물 내성 세균을 포함하는 경우가 많은 만성, 외상성 및/또는 수술 후 상처 감염의 치료에 사용될 수 있다. 실시양태에서, 활성화된 MSC 및 이의 조성물은, 항생제 약물 내성이 높은 감염, 및/또는 동일하거나 상이한 항생제들의 복수의 균주에 의해 유발된 감염의 치료에 유용할 것이다.

또한, 활성화된 MSC는 환자(예컨대, 진성 당뇨병 환자)의 상처를 치료하는데 사용될 수 있으며, 여기서 숙주 면역 상태는 종종 항생제 요법 단독으로는 완전히 효과적이지 못하나는 요인이고, 선천적 면역과 적응 면역의 결함이 잘 확인된다.

본원에 기술된 임의의 방법 또는 용도에서, 효과적인 세균 제거를 달성하기 위해, 상처 감염 세균이 저항하는 항생제는 활성화된 MSC와 여전히 함께 투여될 수 있는데, 부분적으로는 MSC가 항생제의 유효성을 증진하는 능력이 있기 때문이다. 실제로, 본원에 기술된 임의의 방법 또는 용도에서, 항생제(감염 세균이 저항하는 것조차도)가 활성화된 MSC와 함께 투여되는 것이 필수적이다.

전신 투여되는, 활성화된 MSC는 항생제 및 숙주 선천 면역계와 상호 작용하여 세균 부하를 감소시키고 상처 치유를 촉진한다. 따라서 전신적인 활성화된 MSC 투여는 만성적이고 심부적인 상처 감염에 대한 종래의 항미생물성 요법의 효능을 증진하는 신규한 비-항생제 접근법이다.

MSC와 항생제 요법 사이의 상호 작용의 최종 결과는, 심지어 S. 아우레우스 또는 이 콜라이(E coli ) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 또는 엔테로코커스 또는 생체내에서 생물막을 형성하는 임의의 수의 세균에 의해 피복된 메쉬와 같은 고도로 감염된 합성 임플란트 재료로부터 박테리아가 상당히 제거된다는 것이다. 또한, MSC 투여는 상처 치유의 촉진 및 상처와 관련된 염증 및 섬유증의 감소를 비롯한 또 다른 유익함도 나타내었다.

다수의 보완 작용 메카니즘이 상처 감염을 관리하는 데 조력하는 활성화된 MSC의 능력의 이유가 되는 것으로 보인다. 따라서 세균 부하에 대한 MSC 투여의 순 효과는 직접적 및 간접적 작용 메카니즘의 합을 반영하는 것으로 보인다. 입증된 항균 작용의 한가지 직접적인 메카니즘은, MSC에 의한 카텔리시딘과 같은 항미생물성 펩티드의 분비였다. MSC에 의한 세균 제거의 간접적 메카니즘은 활성화된 MSC와 숙주의 선천적 면역 반응의 상호 작용을 포함한 것이었다.

정의

본 개시내용에서, "포함하다", "포함하는", "함유하는", "갖는" 등은 미국 특허법에서 그들에게 부여한 의미를 가질 수 있으며, "구성한다", "구성하는" 등을 의미할 수 있다. 마찬가지로 용어 "실질적으로 이루어지는" 또는 "실질적으로 이루어진다"는 미국 특허법에서 부여된 의미를 가지며, 이들은 제한을 두는 것이 아니므로, 기재된 것의 기본적이거나 신규한 특성이, 기재된 것 이상의 존재에 의해 변화되지 않는 한, 기재된 것 이상의 존재를 허용하지만, 선행 기술의 구현예는 배제한다.

구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않은 한, 본원에서 사용될 때, 용어 "한", "하나" 및 "그"는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.

구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않은 한, 본원에서 사용될 때, 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다.

본원에서 사용될 때, 용어 "약"은, 달리 명시되지 않은 한, 언급된 값, 예컨대 양, 용량, 온도, 시간, 백분율 등 ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2% 또는 ±1%을 가리킨다.

용어 "상처"는 막(예컨대, 피부)의 열상을 수반할 수 있고 하부 조직의 손상을 초래할 수 있는 베임, 타격 또는 다른 충격에 의해 유발된, 생체 조직에 대한 손상을 가리킨다. 상처는 열린 상처와 닫힌 상처 모두를 포함한다. "상처"의 예로는 비관통 상처(예컨대 찰과상, 열상, 타박상, 진탕); 관통 상처(예컨대 자창, 피부 베임, 총상, 외상성 상처 및 자동차 사고로 인한 골절 또는 다른 외상); 열적 상처(예컨대 화상, 일광 화상, 동상); 화학적 상처(예컨대, 산 또는 알칼리); 물린 상처 및 쏘인 상처(예컨대 인간, 개, 박쥐, 설치류, 뱀, 전갈, 거미 및/또는 진드기로부터의 상처); 및 전기적 상처를 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 중요한 상처 범주에는, 연조직 수술 부위(예컨대, 종양 절제술, 심장 수술, 장기 이식)의 감염을 포함할 수 있는 수술 후 상처 감염, 정형외과 임플란트(예컨대, 감염된 무릎 또는 고관절 보철물)의 감염, 이식된 장치의 감염(예컨대, 감염된 심박 조율기), 및 만성 카테터의 감염(예컨대, PIC 라인 또는 유치 도뇨관의 감염)이 포함된다.

"감염된 상처"는, 명백한 숙주 반응(호중구 및 대식세포 침윤, 육아 조직, 섬유증)과 함께, 세균과 같은 미생물에 의해 침투된 임의의 상처를 가리킨다.

상처는 만성이거나 급성일 수 있다. "만성 상처"는 단정 가능한 양의 시간 내(즉, 초기 상처 발생의 수주 또는 수개월 이내)에, 그리고 정연한 단계 세트로, 치유되지 않는 상처이다. 또한 이 상처는, 인공 이식물의 표면에 형성될 수 있으나 숙주 조직(예컨대 당뇨병성 족부 궤양)에서도 발생할 수 있는 세균성 생물막을 형성하는 세균의 잠복 집단인 것이 일반적이다. 세균성 생물막 상태의 발달은, 특히 국소적 치료가 불가능한 부위에 성처가 존재할 때, 항생제 또는 다른 제제를 이용한 세균의 치료를 훨씬 어렵게 한다. 또한, 만성 상처는 항생제 치료의 오랜 과거력 때문에 다중 약물 내성의 세균을 보유할 가능성이 훨씬 높다. 따라서, 만성 상처는 세균 내성 메카니즘 및 약물 내성에 대한 항생제 선택 압력의 공동 진화 때문에 거의 항상 치료하기가 더욱 어렵다. 이 감염은 또한 일반적으로 하나 이상의 다중 약제 내성(MDR) 균주의 세균을 포함한다. 이러한 세균은 그람 음성 병원균(예컨대, 이 콜라이, 아시네토박터(Acinetobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 엔터로박터(Enterobacter), 슈도모나스) 및 그람 양성 병원균(예컨대, 스타필로코커스, 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스)을 포함한다. 또한 그람 음성균과 그람 양성균 모두의 균주가 사실상 생체내에서 생물막을 형성할 수 있다는 것도 주지해야 한다. 만성 상처는 고도의 약물 내성의 세균 감염의 결과, 및/또는 동일하거나 상이한 세균의 다수의 균주 또는 종에 의한 감염의 결과일 수 있다.

비제한 예로서, 만성 감염 상처는 압력 궤양, 욕창 궤양, 동맥 궤양, 정맥 궤양, 정맥 울부 궤양, 당뇨병성 족부 궤양, 외상성 궤양 및/또는 화상 궤양, 그리고 임플란트 감염(무릎, 발목, 고관절 보철물), 의료 기기 감염(유치 정맥 접근 카테터 또는 요로 카테터, 심박 조율기, 제세동기, 정맥 또는 동맥 협착증용 스텐트), 메쉬 임플란트(예컨대, 질 및 복막 슬링, 혈관 필터) 및 정형외과적 수리 감염(예컨대, 골 플레이트, 나사, 핀 및 기타 고정 장치의 감염)을 포함할 수 있다. 만성 상처는, 상처 치료를 어렵게 만드는 면역 결핍을 갖는 것으로 알려진 당뇨병 환자에서 나타날 수도 있다.

대조적으로, "급성 상처"는 급속히(즉, <1주) 발생하고, 예측 가능한 항생제 치료 요법으로 예측 가능한 양의 시간 내에 어떠한 합병증 없이 치유하는 손상이다.

본원에서 사용될 때, "장애"는 상처 치유(급성 상처, 열혈 상처 및 서서히 치유되는 지연 치유 상처 및 만성 상처를 포함함)를 개시, 가속화, 촉진 또는 증진하는 제제로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 장애, 질환 또는 병태를 가리킨다. 이러한 상처는, 당뇨병 환자의 상처(예컨대, 족부 궤양 또는 다른 피부 감염), 또는 말초 혈관 질환(예컨대, 욕창성 궤양, 피부 감염, 사지 감염)으로 인해 혈액 공급이 감소된 환자의 상처를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 제제는 염증을 감소시키고/시키거나, 흉터를 감소 또는 줄이고/줄이거나, 흉터의 질을 개선하고/하거나, 섬유증을 감소시키고/시키거나, 유착을 감소시킬 것으로 기대된다. 예를 들어, 질환, 장애 및 병태로는 급성 상처, 열혈성 상처, 그리고 서서히 치유되는 지연 치유 상처 및 만성 상처가 있다.

중요하게는, 이 치료가 감염의 해결을 유도하는 데 필요한 치료 기간을 현저히 단축시키고, 또한 치료 횟수 및 필요한 항생제의 용량을 감소시킬 수 있을 것으로 기대된다.

세포외 기질 내의 섬유질 물질의 초과 생성을 포함하여, 섬유질 물질의 초과 생성을 특징으로 하는 질병, 장애 및 병태; 비정상적, 비기능적 및/또는 과도한 기질 관련 성분의 축적에 의한 정상 조직 요소의 대체를 특징으로 하는 질병, 장애 및 병태; 유착 형성을 특징으로 하는 질병, 장애 및 병태; 및/또는 상처 치유를 촉진하고/하거나 붓기, 염증 및/또는 흉터 형성(켈로이드 흉터, 비대상 흉터, 광범위(늘어져 있는) 흉터 및 위축성(함몰된) 흉터를 포함하는, 비정상적이고 과도한 흉터를 포함함)을 감소시키는 제제로부터 이득을 얻을 수 있는 질병, 장애 또는 병태가 또한 포함된다. 예를 들어, 수술이나 외상으로 인한 상처, 예상되는 속도로 치유되지 않는 상처(예컨대 서서히 치유되는 상처, 불완전하게 치유되는 상처, 만성 상처 및 열개성 상처), 그리고 신경병증, 허혈성, 미세혈관 병리학, 뼈 부위에 대한 압력(꼬리뼈(천골), 고관절(돌기), 둔부(좌골) 또는 발 뒤꿈치 또는 발가락), 재관류 손상 및 밸브 역류 병인 및 병태와 관련된 이상과 연관된 상처가 포함된다. 또한, 본원에 기술된 바와 같은 세포 이동의 증진, 세포 유착, 흉터 및 염증의 감소로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 장애 및 병태가 포함된다.

본원에서 사용될 때, 용어 "환자" 또는 "대상"은 인간, 가축 및 경작 동물, 및 동물원, 스포츠 및 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 그리고 소, 양, 돼지, 염소를 포함하는 농업용 동물을 포함하는 임의의 포유류를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 하나의 바람직한 포유류는 성인, 어린이 및 노인을 포함하는 인간이다. 만성적인 비치유성 감염 상처를 갖는 I형 또는 II형 당뇨병 환자가, 보다 선호되는 인간일 수 있다. 대상은 개, 고양이 및 말을 포함하는 애완용 동물일 수도 있다. 바람직한 농업용 동물은 소 및 염소일 수 있다.

용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은, 본원에서 사용될 때, 달리 명시되지 않은 한, 상기 용어가 적용되는 질환, 장애 또는 병태, 또는 상기 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 역전, 경감, 과정 억제 또는 예방하는 것을 가리키며, 증상 또는 합병증의 발병을 예방하거나, 증상 또는 합병증을 경감하거나, 상기 질병, 병태 또는 장애를 제거하기 위해서 본원에 기술된 임의의 조성물, 약학 조성물 또는 제형을 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 치료는 치유적 또는 개선적이다.

본원에서 사용될 때, "예방"은 예방되어야 하는 물질 또는 사건, 예를 들어 질병, 장애 또는 병태의 생성 또는 발생을 전부 또는 일부의 예방하거나, 개선 또는 관리하거나, 또는 감소 또는 중지시키는 것을 의미한다.

"치료학적 유효량" 및 "유효량" 등의 구절은, 본원에서 사용될 때, 치료 효과, 예컨대 개선, 또는 대안으로 치유 효과를 달성하기 위해서 환자의 세포, 조직 또는 장기에 투여하는 데 필요한 양을 나타낸다. 유효량은 연구원, 수의사, 의사 또는 임상의가 추구하는 세포, 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적이거나 의학적인 반응을 이끌어 내기에 충분한 것이다. 적절한 유효량 또는 치료학적 유효량의 결정은 당업자의 일상적 수준에 속한다.

용어 "투여하는", "투여하다", "투여" 등은, 본원에서 사용될 때, 치료제를 그 치료제에 의한 치료를 필요로 하는 대상에게 이송, 전달, 도입 또는 운반하는 임의의 방식을 가리킨다. 그러한 방식은 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 피내, 비강내 및 피하 투여를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본원에서 사용될 때, 용어 "살균성", "살균성 항생제" 등은, 세균의 성장 또는 증식을 늦추는 항생제인 "정균 항생제"와는 대조적으로, 세균을 사멸시키는 항생제를 가리킨다. 살균성 항생제는 세포벽 합성을 억제하고/하거나 세균 효소 또는 단백질 번역을 억제함으로써 세균을 사멸시킨다. 살균성 항생제의 예로는 베타 락탐 항생제[예컨대, 페니실린 유도체(클라불란산과 같은 베타 락타마아제 억제제가 존재하거나 부재하는 페니실린 및 반합성 페니실린), 세팔로스포린(세팜), 모노박탐 및 카르바페넴] 및 반코마이신, 답토마이신, 플루오로퀴놀론, 메트로니다졸, 니트로푸란토인, 코트리목사졸, 텔리트로마이신, 및 아미노글리코시드 항생제가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 그러나, 활성화된 MSC를 이용한 치료가 클로람페니콜 및 테트라사이클린을 포함하는 정균 항생제에 의한 세균 제거를 향상시킬 수 있다는 것도 주지해야 한다. 다수의 부류의 항생제(즉, 하나 이상의 살균성 항생제 단독, 또는 하나 이상의 정균 항생제와의 조합)가 사용될 수 있다.

"톨 유사 수용체(TLR)"는 선천적 면역계에서 중요한 역할을 하는 단백질의 부류를 가리킨다. 이들 단백질은 대식세포 및 수지상 세포와 같은 면역계의 센티넬 세포에서 발현되는 것이 일반적이다. 이들은 미생물 유래의 구조적으로 보존된 분자를 인식한다. TLR의 예로는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 및 TLR13이 있다. TLR2, TLR3, TLR4, TLR7/8 및/또는 TLR9를 포함하여, MSC에 의해 발현되는 것으로 알려진 TLR이 가장 바람직할 것이다.

"뉴클레오티드 결합 올리고머화 도메인(NOD) 수용체"는 또한 선천적 면역 반응의 조절에서 중요한 역할을 한다. 이들은 림프구, 대식세포, 수지상 세포 및 비면역 세포(즉, 상피 및 MSC)에서 발견되며, TLR과 협력하거나 단독으로 작용하여 염증 반응을 조절할 수 있다.

RIG-1 또는 STING 또는 CDA 수용체를 비롯한 선천성 면역 수용체의 다른 부류는 자극성 리간드, 특히 바이러스 및 세균 핵산의 세포내 도입 후, 선천적 면역 반응의 활성화에서 중요한 역할을 한다. 이들은 림프구, 대식세포, 수지상 세포 및 비면역 세포(즉, 상피 및 MSC)에서 발견되며, TLR과 협력하거나 단독으로 작용하여 염증 반응을 조절할 수있다.

본원에서 사용될 때, 용어 "작용제"는 수용체와 결합될 때 생리학적 반응을 개시하는 물질을 가리킨다. 대조적으로, "길항제"는 다른 것의 생리 작용을 방해하거나 억제하는 물질이다.

상처 치유

상처 치유는 신체 조직(즉, 피부)이 외상 또는 손상 후 자체적으로 치료하는 과정으로서 일반적으로 여러 단계: 지혈(혈액 응고), 염증, 증식(조직 성장) 및 성숙(조직 재형성)으로 나뉜다.

피부 조직 손상 및 혈관 파괴에는 피브린 응괴의 형성이 후속되고, 이는 추가의 출혈을 늦추거나 방지하고 상처로의 세포 이동을 위한 기질을 제공힌다. 이것은 상처 치유의 지혈 단계이다.

그 다음, 염증 단계에서, 다양한 분자에 유인되는 호중구는 이물질 및 세균을 탐식하고, 대식세포로 분화하는 단핵 세포에 의해 급속히 결합된다. 이제, 대식세포는 미생물, 세포외 기질의 분절, 피브린, 호중구, 적혈구 및 기타 잔해물을 탐식하고, 또한 효과적인 상처 치료에 결정적인 것으로 여겨지는 다양한 분자를 분비한다. 만성 상처에서는, 이 단계의 구성요소들 중 하나 이상이 조절 기능을 상실하여, 상처 치유가 지연될 수 있다. M2 표현형의 대식세포는 상처 치유의 촉진에 가장 효과적인 것으로 여겨진다.

증식 단계 동안, 혈관 신생, 콜라겐 침착, 섬유 형성 및 육아 조직 형성, 상피화 및 상처 수축이 발생한다. 마지막으로, 성숙 및 재형성 단계 동안에, 콜라겐이 재배열되고 상처의 인장 강도가 증가하며 임의의 불필요한 세포가 세포사멸로 제거된다.

이러한 상처 치유 단계는 일반적으로 예측 가능한 방식으로 진행되지만, 그렇지 않을 경우, 만성 상처 또는 병리학적 흉터가 발생할 수 있다. 상처 치유가 진행되는 비율, 속도 및/또는 효능은 국소적 및/또는 전신적 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 국소적 요인에는 수분, 기계적 요인, 부종, 허혈 및 괴사, 이물질 존재, 낮은 산소 장력 및/또는 재관류가 포함될 수 있다. 전신적 요인에는 염증, 당뇨병, 영양 상태, 대사성 질환, 면역 억제, 결합 조직 장애, 흡연, 연령 및/또는 음주가 포함될 수 있다.

상처 치유의 합병증은 만성 감염, 부족하거나 과도한 흉터 형성, 과도한 육아 및/또는 부족한 상처 축소를 포함할 수 있다. 이러한 합병증 중 가장 심각한 것은 만성 감염, 특히 피부 및 골 조직의 감염을 포함하는 생물막 형성과 관련된 감염, 정형외과적 또는 수술적 임플란트의 감염, 또는 금속성 정형외과 재료(플레이트, 나사, 핀), 메시(혈관 필터, 재건 메시) 및 의료용 임플란트(심박 조율기, 션트) 및 혈관 진입 포트와 카테터를 포함하는 수술적 수리에 사용되는 재료의 감염의 발생이다. 이러한 감염은 일반적으로 세균의 다중 약물 내성(MDR) 균주를 또한 포함한다. 이러한 세균은 그람 음성 병원균(예컨대, 이 콜라이, 아시네토박터, 클레브시엘라, 엔터로박터, 슈도모나스) 및 그람 양성 병원균(예컨대, 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스)을 포함한다. 또한 그람 음성균과 그람 양성균의 모든 균주가 사실상 생체내에서 생물막을 형성할 수 있다는 것도 주지해야 한다.

간엽 줄기 세포

간엽 줄기 세포(MSC)는 골아 세포, 연골 세포, 근육 세포 및 지방 세포로 분화할 수 있는 다능성 줄기 세포이다. 조직 배양 조건에서 MSC는 가소성 점착성을 나타내며 매우 흔하게 CD73⁺, CD90⁺, CD105⁺, CD11b⁺, CD14^-, CD19^-, CD34^-, CD45^-, CD79a^- 및 HLA-DR^- 세포로 분류되지만, 상이한 조직 공급원으부터 단리된 MSC는 상이한 표면 표현형을 나타낼 것이라는 것을 주지해야 한다. MSC의 항균성은 조직의 종류에 따라 달라질 수 있으므로 세균 감염 퇴치를 위한 효과의 면에서 다소 예측 불가능한 것으로 여겨진다.

간엽 줄기 세포(MSC)는 낮은 수로 신체 중 대부분의 조직에 존재하는 신경 말단 기원 세포의 아집단이다. 다양한 공급원으로부터의 간엽 줄기 세포는 동물 모델에서 패혈증, 상처 치유 및 감염에 항미생물 활성을 갖는 것으로 나타났다. (문헌[Krasnodembskaya, et al., Stem Cells 28(12):2229-38 (2010); Krasnodembskaya, et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 302(10):L1003-13 (2012); Al-Anazi et al., "Chapter 9: Mesenchymal Stem Cells - Their Antimicrobial Effects and Their Promising Future Role as Novel Therapies of Infectious Complications in High Risk Patients", dx.doi.org/10.5772/60640 (2015); Maxson, et al., Stem Cells Trans Med 1(2):142-49 (2012); 및 Mei, et al., Am J Respir Crit Care Med 182(8):1047-57 (2010)] 참조). MSC 상의 톨 유사 수용체(TLR)의 존재 및 MSC 활성에 대한 TRL 리간드의 영향이 또한 연구되었다. (문헌[Lieneke I. Bouwman, Thesis entitled, "Microbial ligands alter the fate of stem cells - TLR activation influences survival, proliferation, differentiation, and function of stem cells", Universiteit Utrecht, Faculty of Veterinary Medicine, department Infectious Diseases & Immunology, July 13, 2009] 참조). 이들 연구의 결과는, 궁극적으로 결과가 되는 특성에 대한 MSC의 영향과 관련하여 종종 모순되는 정보가 많았다. 예를 들어 연구자들은 TLR3의 리간드에 의한 MSC의 활성화가 MSC의 면역 억제 기능을 실제로 증가시킨다는 것을 보여주었으며, 그 효과는 일반적으로 상처 치료에 금지될 수 있다. (문헌[Zhou et al., Nat Commun 5:3619 (2014); Cassatella, et al., Stem Cells 29(6): 1001-11 (2011); 및 Zhao et al., Stem Cells 32(2): p. 521-33 (2014)] 참조). 따라서 TLR을 통한 MSC의 사전 활성화로 인한 순 효과(양성 또는 음성)는, 특히 세균과 세균 생물막 사이의 복잡한 상호 작용을 나타내는 만성 감염 상처의 치료와 관련하여 예측하기가 매우 어려우며, 면역 반응은 시간이 지남에 따라 발달한다.

그러나, 만성적 생물막 감염을 치료하기 위한 MSC(또는 그의 조성물)의 사용은 이전에 평가되지 않았다.

MSC는, 예를 들어 골수, 지방 조직, 태반, 양수, 제대 조직, 제대혈, 성인 근육, 각막 기질, 피부 조직 및/또는 치과용 펄프를 포함하는 다양한 조직으로부터 수득되거나 유도될 수 있다.

MSC를 사용한 대부분의 실험 및 임상 연구에서는 골수(BM-MSC) 또는 지방 조직(Ad-MSC)에서 추출한 세포를 사용한다. 그러나 BM-MSC 및 Ad-MSC를 사용하면, 자가 MSC를 사용할 때, 나이가 든 환자 또는 동물의 세포는 일반적으로 덜 기능적이므로 기증자의 연령이 MSC의 면역 및 항균성에 크게 영향을 미치기 때문에 잠재적으로 단점이 있다. 게다가, 비관련 기증자(즉, 동종이계 MSC)로부터의 MSC가 사용될 때에는, 기증자 대 기증자 가변성 및 병원체 무함유 MSC의 보증과 관련된 문제가 있다. 또한 MSC는 노화가 일어나서 효과가 없어지기 전에 시험관내에서만 제한된 증식을 겪을 수 있으므로, 단일 기증자로부터 생성될 수 있는 MSC의 수를 크게 제한한다.

이 문제에 대한 한가지 해결책은, 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유래하는 MSC를 사용하는 것이다. iPSC는 다수의 성인 조직에서 생성되어 MSC로 분화될 수 있으며, 여기서는 그것을 "iMSC"로 일컫는다. iMSC 사용과 관련된 몇 가지 장점은, 이들이 무제한으로 전파될 수 있고, 늙은 개체에서 유래하는 경우에도 젊은 MSC의 기능을 회복하며, 다수의 환자의 치료를 위한 세포의 단일 공급원으로서의 역할을 할 수 있다는 사실을 포함한다.

따라서 iMSC 계통은 마우스 및 개 iPSC에서 모두 개발되었으며 시험관내에서 세균 사멸 활성을 나타내는 그들의 능력을 평가하였다. 그러나 이전에 지적한 MSC 항균 활성의 예측 불가능성은 iMSC의 항균 활성을 예측하는 것을 불가능하게 만들었다. 또한, iMSC는 기존의 BM-MSC 또는 Ad-MSC와는 매우 다른 표면 표현형을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

그러나 마우스 유래의 활성화된 iMSC는, 시험관내에서 스타필로코커스의 사멸 능력을 보인다는 점에서 마우스 ad-MSC와 동등한 것으로 밝혀졌다(도 25 참조). 개 Ad-MSC와 비교한 개 iMSC에서도 항균 활성의 면에서 유사한 결과를 얻었다.

따라서, iMSC는 약물 내성의 만성 세균 감염의 치료에 사용될 수 있는 MSC의 또 다른 공급원이다. 또한 iMSC의 아집단은, 임상 환자에게 사용하기 전에 보다 큰 항미생물 활성을 위해서 iMSC 세포주로부터 시험관내에서 잠재적으로 추가로 선택될 수 있으며, 이는 iMSC가 기존의 BM-MSC 또는 Ad-MSC보다 훨씬 더 효과적이게 한다.

MSC의 활성화

MSC는 항미생물성 펩티드의 분비를 통해 세균에 대한 항매생물 효과를 발휘하는 것으로 나타났다(본원에 참고로 인용되어 있는 문헌[Krasnodembskaya et al., Stem Cells 28(12):2229-2238 (2010)] 참조). MSC는 또한 배양물에서 자발적으로 항미생물성 인자를 분비하는 것으로 나타났다(도 9 참조). 예를 들어, 쥐, 개 및 인간 MSC는 모두 그람 음성균과 그람 양성균 모두를 사멸시키는 중요한 항미생물성 펩티드인 세포내 Cramp를 생성한다(도 14 및 15 참조).

톨 유사 수용체(TLR) 리간드를 이용한 MSC의 활성화는 이러한 항미생물 효과를 증진하는 것으로 나타났다(본원에 참고로 인용되어 있는 문헌[Johnson et al, The Journal of Immunology 190(1): Supplement 180.11 (2013) 참조; 또한 문헌[Zhao et al., Stem Cells 32(2):521-33 (2014)]도 참조). 그러나 Johnson의 참고문헌에서, 항미생물 활성은 시험관내에서만 입증되었으며, 완전히 항미생물 감수성인 스타필로코커스 아우레우스 균주에 대해서만 입증되었다. 또한 Johnson 등의 문헌에서, 시험관내에서의 MSC의 활성화가 실제로 시험관내 세균 사멸 분석에 의해 평가한 바로는, 그들의 항미생물성 활성을 사실상 증가시키지 않았다는 것을 발견하였다. 따라서, 활성화된 MSC가 만성 상처 감염에 대해 생체내에서 활성이 있다는 것을 예측하는 것은 불가능할 것이고, 실제로 Johnson 등의 발행물은 활성화된 MSC의 생체내 사용으로부터는 떨어져서 교시한다. 또한, 비약물 내성 S. 아우레우스 이외의 세균의 균주에 대한 MSC 활성을 예측하는 것도 불가능할 것이다. 또한 생체내에서 고도의 약물 내성의 세균 균주에 대한 활성을 예측하는 것도 불가능할 것이다. 마지막으로, 고도의 약물 내성인 세균의 다수의 상이한 균주를 함유하는 혼합된 감염(예컨대, MDR 이 콜라이 및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)를 함유하는 감염)에서 MSC 활성을 예측하는 것도 불가능할 것이다.

대조적으로, 본원에서 입증된 바와 같이, 활성화된 MSC의 생체내 정맥 투여는 상처 조직에서 경시적으로 세균 부하를 감소시키고(하기 실시예 2 참조), 상처 부위에서 생존 가능한 세균을 감소시키며(하기 실시예 3 참조), 시험관내에서 세균을 사멸시키는 것으로 나타났다(하기 실시예 9 참조). 또한, 만성 상처 감염의 치료에 있어서 활성화된 MSC의 정맥내 투여가 생체내에서 유효한 것으로 나타났다(하기 실시예 4-5, 7, 10 및 17-20 참조, 또한 도 18-24 참조). 마찬가지로, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 활성화된 MSC는 생체내에서 고도의 약물 내성의 세균 균주에 대해 효과적이었고, 고도의 약물 내성의 세균의 다수의 상이한 균주에 대해 동시에 효과적이었다.

또한, 예를 들어 만성 박테리아 감염을 제어하는 능력을 제한하는 심각한 면역 결핍을 가지고 있는 것으로 알려진 당뇨병 환자에서는, 고도의 약물 내성의 감염에 대한 MSC의 활동을 예측하는 것이 훨씬 더 어려울 것이다. 특정 이론에 구속되고자 하는 바는 아니나, 증거는 활성화된 MSC가 당뇨병 상처와 같이 혈관 형성이 감소된 조직에서는 제한될 것으로 예상되는 면역 매개 메카니즘을 통해 작용한다는 것을 암시한다(도 11-13, 16 참조). 그러나, 당뇨병, 및 항생제 요법의 반복된 회차에 반응하지 않은 만성(6개월) 수술후 감염을 가진 개에서의 활성화된 개 MSC의 강력하고 예기치 않은 활성이 입증되었다. MSC를 단일 정맥내 투여한 후(도 22 참조), 상처가 부분적으로 치유되었으며, 가장 중요하게는 상처 배양물이 몇 달 만에 처음으로 음성이 되었다.

또한, 본원에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 TLR3, TLR9, TLR4 및/또는 NOD 수용체 작용제를 이용한 MSC의 활성화는 이들 세포의 항미생물 효과를 증진한다. 적합한 TLR 활성화제의 예로는 폴리아데닐산-폴리우리딜산(폴리(A:U)), 폴리이노신산-폴리시티딜산(폴리(I:C) 또는 pIC), CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODN), 억제성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), 세균성 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 이중 가닥 DNA 또는 단일 가닥 RNA, 세균성 지질다당류(LPS), 모노포스포릴 지질 A(MPLA) 및/또는 TLR7/8 리간드(예컨대, 이미퀴모드)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 또한, MSC 활성화는 펩티도글리칸, 요산, 고농도의 칼륨, 단일 가닥 RNA를 포함하는 NOD 리간드 및 그 밖의 NOD 리간드를 사용하여 달성할 수도 있다.

MSC 활성화는 유효량의 활성화제로 MSC를 시험관내 또는 생체외 인큐베이션함으로써 일으킬 수 있다. 예를 들어, MSC는 활성화제(즉, pIC)와 함께 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 활성화제의 적절한 농도의 결정은 당업자의 일상적인 수준에 속하지만, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ㎍/ml 또는 그 이상의 농도가 고안된다. 한 실시양태에서, MSC는 110 ㎍/ml의 pIC로 2시간 동안 시험관내 인큐베이션함으로써 활성화된다.

MSC의 활성화는 그들의 이동을 또한 증가시킨다. 예를 들어 MSC가 케모카인 구배에 반응하여 이동하는 능력을, 하부 챔버에 SDF-1(줄기 세포 유래 인자-1, MSC에 대한 케모카인)을 함유하고 상부 챔버에 MSC를 함유하는 Boyden 챔버를 사용하여 평가하였다. pIC로 활성화된 MSC의 이동은 활성화되지 않은 MSC보다 현저히 큰 것으로 밝혀졌다(도 26 참조). 감염된 상처가 고도의 SDF-1을 생성하기 때문에, 활성화된 MSC의 염증 부위로의 증가된 이동은 정맥내 주사 후 감염된 상처로 가는 길을 찾는 그들에 능력에 중요하다.

또한, 활성화된 MSC는 상처 부위로의 이동 및 숙주 면역 효과 세포(즉, 호중구 및 단핵구)의 모집에 대해 우수한 면역학적 특성을 가지며(도 16 참조), 활성화된 간엽 줄기 세포는 활성화되지 않은 간엽 줄기 세포에 비해 증가된 항미생물 활성을 나타낸다.

만성 감염 상처에서 세균을 박멸한다는 면에서, 활성화된 MSC와 항생제 사이에 강력한 상승적 상호작용이 있다.

투여

본원에 기술된 유효량의 활성화된 MSC 또는 임의의 조성물은 투여의 경구, 국소, 정맥내(i.v.), 동맥내, 안구내, 복강내, 경막내, 심실내, 요도내, 흉골내, 두개내, 근육내 또는 피하 경로를 통해 대상에게 투여될 수 있다.

한 실시양태에서, 활성화된 MSC는 정맥내 투여된다. 도 4에 도시된 바와 같이, MSC의 정맥내 투여는 SC 투여보다 상처 세균 부하를 줄이는 데 훨씬 더 효과적이다. 또한, 정맥내 투여되는 활성화 MSC는 처음에는 폐에 갇혀있지만, 폐를 빠져나와 신체 전반의 염증 부위로 이동할 수 있다(도 6 및 8 참조).

당업계에 공지된 임의의 적합한 투여 프로토콜을 이용하여 본원에 기술된 활성화된 MSC 또는 조성물을 투여할 수 있다. 간엽 줄기 세포 및/또는 조성물은 1회 투여량으로 투여되거나, 다중회(즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 이상의) 투여량으로 투여될 수 있다.

일반적으로 환자는 1회 투여량 초과(즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회 또는 그 이상)의 투여량의, 본원에 기재된 임의의 조성물 및/또는 활성화된 MSC를 투여받을 수 있다. 1회 초과의 투여량이 투여될 경우, 규칙적 또는 불규칙한 간격으로 회분이 투여될 수 있다. 비제한적 예로서, 투여량은 매일, 매주, 격주, 매월 또는 격월로 투여될 수 있다. 예를 들어 투여량은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12주마다; 및/또는 이들의 임의의 조합으로 투여될 수 있다.

하나의 비제한적 예에서, 3개의 개별적인 투여량(즉, 3회 치료)을 6주간에 걸쳐(즉, 2주마다) 투여한다.

일부 실시양태에서, 체중 kg당 1×10⁴ 내지 1×10⁸ 세포가 각 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 체중 kg당 약 2×10⁶ 세포가 정맥내 카테터에 의해 15분에 걸쳐 서서히 투여될 수 있다.

특정한 상처 유형의 치료에 사용하기 위한 (체중 kg당 활성화된 간엽 줄기 세포의) 적절한 투여량, 투여 속도, 투여 횟수 및/또는 투여 빈도의 결정은, 당업자의 일상적인 수준에 속하는 것이다.

본원에 기술되는 활성화된 MSC 및 조성물은 유효량의 하나 이상의 항미생물제, 예컨대 살균성 항생제(예컨대, 페니실린 유도체(페남), 세팔로스포린(세팜), 모노박탐, 카르바페넴, 반코마이신, 답토마이신, 플루오로퀴놀론, 메트로니다졸, 니트로푸란토인, 코트리목사졸, 텔리트로마이신, 및/또는 아미노글리코시드계 항생제)를 부가적으로 함유할 수 있다. 적절한 살균성 항생제 및 그의 효과적인 투여량의 선택은 당업자의 일상적인 수준에 속하는 것이다. 부가적으로, 일부 실시양태에서, 하나 이상의 정균 항생제가 (단독으로 또는 하나 이상의 살균성 항생제와 조합되어) 투여될 수 있다.

활성화된 MSC의 전신 투여는, 항생제 요법과 조합될 때, 만성 감염 상처와 관련된 세균의 제거에 효과적이었다. 또한 MSC의 전신 투여는 만성 감염 모델에서의 상처 치유에 대한 보다 상세한 내용과도 관련이 있다.

조성물

하나 이상의 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 비히클과 함께, 그들의 항미생물성 효과를 증진하기 위해 활성화된, 주입 준비된 MSC의 집단이 본원에 제공된다. 그 조성물은 포유류에서 감염 상처 또는 심부 상처의 치유를 증진한다.

용어 "약학적으로 허용되는" 및 "수의학적으로 허용되는"은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 지칭한다. 각 성분은 약학 제제의 다른 성분들과 양립할 수 있다는 의미에서 "약학적으로 허용되는" 또는 "수의학적으로 허용되는" 것이어야 한다. 또한, 합리적인 유익성/위험성 비율에 부합하면서. 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성 또는 기타 문제/합병증 없이, 인간 및 동물의 조직이나 장기와 접촉하여 사용하기에 적합해야 한다(문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th Edition; Rowe et al., Eds., The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2005; 및 Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd Edition; Ash and Ash Eds., Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, Gibson Ed., CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2004)] 참조).

다양한 실시양태에서, 활성화된 MSC의 집단은 동종이계 또는 자가 조직일 수 있다.

본원에 기술된 임의의 조성물은 유효량의 하나 이상의 항미생물제, 예컨대 살균성 항생제(단독으로 또는 하나 이상의 정균 항생제와 조합하여)를 부가적으로 함유할 수 있다. 예시적 살균성 항생제는 페니실린 유도체(페남), 세팔로스포린(세팜), 모노박탐, 카르바페넴, 반코마이신, 답토마이신, 플루오로퀴놀론, 메트로니다졸, 니트로푸란토인, 코트리목사졸, 텔리트로마이신, 아미노글리코시드계 항생제, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 항생제와 활성화된 MSC가 조합되는 경우, 강력한 상승작용이 관찰되었다(도 10 참조). 대안적으로, 활성화된 MSC와 정균 항생제, 예컨대 클로람페니콜, 에리트로마이신, 클린다마이신 또는 테트라사이클린의 조합이 고려될 수 있다.

본 개시내용의 약학 조성물은 의도된 투여 경로(즉, 비경구, 정맥내, 동맥내, 피내, 피하, 경구, 흡입, 경피, 국소, 경점막, 복강내 또는 흉막내 및/또는 직장 투여)와 양립 가능하도록 제제화된다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음 성분: 살균 희석제, 예컨대 주사 용수, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충액, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 장력 조절제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함할 수 있다. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절될 수 있다. 비경구제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 넣어질 수 있다.

주사 용도에 적합한 약학 조성물은 세포의 멸균된 주사 가능한 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL^TM(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에서, 조성물은 멸균되어야 하고 주사하기 쉬울 정도로 유동적이어야 한다. 이것은 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하며 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수있 다. 미생물 작용의 방지는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균 및 항진균 제제에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 등장화제, 예를 들면 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장시간 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 유도될 수 있다.

멸균 주사 용액은, 필요에 따라 활성 화합물을 적절한 용매에 상기 열거 한 성분들 중 하나 또는 그들의 조합물과 혼합한 후, 필요에 따라 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들 중 필요한 다른 성분을 함유하는 무균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 활성 성분과 이전에 멸균 여과된 그의 용액으로부터의 원하는 임의의 추가 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다.

일부 실시양태에서, MSC는 또한 감염된 상처의 부위에 항생제의 전달을 증가시키기 위해, 투여 전에 항생제로 사전 로딩될 수 있으며, 이때 MSC는 전달 메카니즘의 역할을 한다. 이 전달 방법에 특히 바람직한 항생제는 플로로퀴놀론, 클로람페니콜, 테트라사이클린 및 메트로니다졸을 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 세포내 용해도가 높은 항생제를 포함한다. MSC를 항생제로 사전 로딩하는 것은, 항생제가 로딩된 MSC를 숙주에 투여하기 전에, 세포막을 통해 자유롭게 용해되는 하나 이상의 항생제로 MSC를 배양함으로써 달성될 수 있다.

구강 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 봉입하거나 정제로 압축할 수 있다. 구강 치료학적 투여의 목적상, 활성 화합물은 부형제와 혼입될 수 있고, 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강 세정제로서 사용하기 위해 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있으며, 여기서 유체 담체 내의 화합물은 경구 투여되고 씻기고 뱉어지거나 삼켜지게 된다. 약학적으로 상용성인 결합제 및/또는 보조제 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키 등은 하기 성분: 결합제, 예컨대 미결정질 셀룰로오스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토오스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분; 활제, 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로트; 유동화제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로오스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료, 또는 유사한 성질의 화합물 중 임의의 것을 함유 할 수 있다.

흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 적합한 추진체, 예를 들어 이산화탄소와 같은 기체 또는 분무기를 수용하는 가압 용기 또는 분배기로부터의 에어로졸 분무 형태로 전달된다.

전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투될 장벽에 적합한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, 예를 들어, 점막 투여를 위해, 세제, 담즙 염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 수행될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 당업계에 일반적으로 공지된 도포제, 연고, 겔 또는 크림으로 제제화된다.

화합물은 직장 전달을 위해 좌제(예컨대, 코코아 버터 및 기타 글리세라이드와 같은 통상적 좌약 기제를 사용) 또는 정체 관장자의 형태로 또한 제조될 수 있다.

한 실시양태에서, 활성 화합물은 임플란트 및 미세 캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제제와 같이, 신체로부터의 신속한 제거로부터 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체 적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 상기 물질은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 현탁액(바이러스성 항원에 대해 단일 클론 항체로 감염된 세포를 표적으로 하는 리포솜을 포함함)을 또한 약학적으로 허용되는 담체로 사용할 수 있다. 이들은, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같이, 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.

투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 제형으로 경구 또는 비경 구 조성물을 제제화하는 것이 특히 바람직하다. 본원에 사용된 단위 제형은 치료될 대상에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위를 가리키며, 이때 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 개시내용의 단위 제형에 대한 사양은, 활성 화합물의 고유한 특성, 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 개인의 치료를 위한 그러한 활성 화합물을 배합하는, 당업계에 존재하는 제한 사항에 의해 결정되고, 그에 직접적으로 의존한다.

키트 , 의약 및 제조 물품

활성화된 MSC는, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료제(예컨대, 하나 이상의 살균성 항생제)와 조합하여, 의약, 예를 들어 감염 상처 또는 심부 상처를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.

본원에 기술된 임의의 조성물을 함유하는, 만성 감염 상처를 치료하기 위한 키트가, 선택적으로 사용 설명서와 함께, 또한 제공된다.

본원에 기술된 임의의 조성물을 함유하는 용기 및 대상에서 감염 상처 또는 심부 상처의 치료에 대한 사용법을 포함하는 제조 물품이 또한 제공된다.

본원에 기술된 임의의 조성물은 투여 설명서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.

치료 방법

포유류에서 다중 약제 내성 세균에 의해 만성 감염된 상처를 치료하기 위해서, 본원에 기술된 임의의 조성물이 사용될 수 있다. 마찬가지로, 유효량의 활성화된 MSC가 만성 감염된 상처의 치료에 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, MSC의 조성물은 고도로 약물 내성인 감염의 치료에 사용될 수 있다.

만성 상처 감염 치료를 위한 활성화된 MSC의 사용에 대한 특정한 지시는, 감염에 대한 면역 손상이 있는 당뇨병 환자의 치료를 포함한다(도 24 참조). 예를 들어 이러한 환자의 특정한 만성 상처에는 감염된 궤양(다리, 발, 팔), 감염된 임플란트, 감염된 카테터 및 골수염 및 다른 심부 조직의 만성 감염이 포함된다. 상처 감염 치료를 위한 활성화된 MSC에 대한 다른 지시로는, 그람 음성균과 그람 양성균 감염이 혼합된 감염, 그리고 상이한 그람 양성균 또는 그람 음성균과의 혼합 감염을 포함하는, MDR 세균의 다수의 종 또는 균주를 함유하는 감염 치료가 포함된다(도 17-19 참조).

조성물 또는 활성화된 간엽 줄기 세포가 하나 이상의 항미생물제, 예컨대 살균성 항생제 및/또는 정균 항생제와 함께 (예를 들어, 조성물 또는 활성화된 간엽 줄기 세포의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여 후에) 투여되는 방법이 또한 제공된다. 심부 조직에서 세균 감염을 효과적으로 제거하기 위해서는 본원에 기술되어 있는 활성화된 MSC 또는 조성물과, 살균성 항생제 요법의 특정 조합이 필요하며, 심부 세균 감염의 치료를 위해 항생제와 활성화된 MSC를 생체내에서 조합하는 경우, 강력한 상승작용이 관찰된다(도 10 참조).

예를 들어, 활성화된 MSC와 경구 항생제의 조합은 세균 부하를 현저하게 감소시킨다(도 2 참조). 마찬가지로, 이 조합은 또한 심한 상처 감염의 부위에서 살아있는 세균의 수를 현저하게 감소시켰다(도 3 참조).

부가적으로, 활성화된 MSC는 S. 아우레우스 생물막을 저해할 수 있다. MSC가 S. 아우레우스 생물막을 저해하는 능력은 생물막 페그 검정법을 이용하여 시험관내에서 평가하였다. 활성화된 MSC와 함께 생물막 상태의 세균을 인큐베이션하면, 생물막 단독 또는 비활성화 MSC로 인큐베이션된 생물막과 비교하여, 생물막의 파괴가 나타났다(도 27 참조). 또한, 슈도모나스 애루기노사 세균의 생물막에서 생물막의 더 큰 파괴가 관찰되었다. 생물막 생성과 관련된 임플란트의 감염은 종래의 항생제 요법으로는 근절하기가 극히 어렵기 때문에, 본원에 기술된 병용 치료(즉, 활성화된 MSC와 항생제 사용)가 유용할 것이다.

본원에 기술된 임의의 조성물 또는 활성화된 간엽 줄기 세포의 투여는 세균 제거를 유도하고/하거나, 감염된 상처의 세균 부하를 감소시키며, 이어서 이는 감염된 상처의 치유를 증진할 수 있다.

적합한 조성물 및/또는 활성화된 간엽 줄기 세포(단독으로, 또는 하나 이상의 살균성 및/또는 정균 항생제와의 조합으로)는, 상처 발생시에 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 부가적으로, MSC는 또한 하나 이상의 항생제로 사전 로딩될 수 있다.

본 발명에 따른 치료 실체의 투여는 개선된 이동, 전달, 내성 등을 제공하기 위해 제제에 혼입되는 적합한 담체, 부형제 및 다른 제제와 함께 투여될 수 있음이 이해될 것이다. 모든 제약 화학자에게 공지되어 있는 Blaug, Seymour의 처방집[Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975))], 특히 이의 제87장에서 다수의 적절한 조제법을 찾을 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들어 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포(예컨대 Lipofectin^TM), DNA 접합체, 무수 흡수성 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀션, 에멀션 카르보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔, 및 카르보왁스 함유 반고체 혼합물을 포함한다. 상기 혼합물 중 임의의 것은 본 발명에 따른 치료법 및 요법에서 적절할 수 있으며, 단, 제제 중의 활성 성분이 제형에 의해 불활성화되지 않고 제형이 투여 경로와 생리학적으로 양립 가능하고 허용된다. 또한, 제약 화학자들에게 널리 공지된 제제, 부형제 및 담체에 관한 추가 정보에 대해서는, 문헌[Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)] 및 그 안의 인용문헌을 참조할 수 있다.

본 발명을 기술하였으며, 하기의 실시예는 제한이 아닌 예시의 방식으로 제공하는 것이다.

실시예

실시예 1: 활성화된 MSC는 , 심부 조직의 스타필로코커스 아우레우스 감염의 마우스 모델에서 세균성 상처 감염을 억제한다.

CD-1 마우스(그룹당 n=5)에게 생물막이 S. 아우레우스의 루시페라아제 발현 균주(Xen36)로 확립된 외과적 메쉬를 이식하여, 생물발광 이미지화를 이용하여 감염을 추적할 수 있게 하였다(본원에 참고로 인용된 문헌[Walton et al., Comp Med. 64(1):25-33 (2014)]을 참조). 메쉬는 심부의 외과적 임플란트 감염을 모방하기 위해 피하에 이식하였다. 임플란트 식립 후 2일째에 무작위로 마우스를 다음 치료 그룹: 항생제 치료(아목시실린-산, 식수 중 지속적 치료); 비처리된 MSC의 정맥내 투여에 의한 치료; 활성화된 MSC의 정맥내 투여에 의한 치료; 비처리된 MSC + 항생제 투여에 의한 치료; 활성화된 MSC + 항생제에 의한 치료의 그룹로 배정하였다.

활성화된 MSC를 마우스당 5×10⁵ 세포의 용량으로, 3일 간격의 4회 치료로 정맥 투여하였다. MSC는 합성 TLR3 리간드를 사용하여 활성화시켰다.

세균 부하에 대한 치료 효과를 평가하기 위해, 메쉬 이식 후 2-3 일마다 IVIS 이미징으로 마우스를 촬영하였다. 각 치료 그룹의 한 마우스에서의 상처의 대표적인 IVIS 이미지는 도 1에 도시되어 있다.

그 이미지는 항생제와 활성화된 MSC로 치료한 마우스의 감염 소실되는 반면, 다른 그룹의 마우스에서는 감염이 지속됨을 보여준다. 치료 효과는 다음 3 가지 핵심 요인에 의해 좌우되는 것으로 나타났다: (1) MSC의 활성화; (2) MSC 투여와 동시적 항생제 치료를 병용하는 것; 및 (3) MSC의 정맥 투여.

이러한 발견은, MSC를 상처에 국소적으로 직접 주사하면 세균 감염을 효과적으로 제어하지 못하고, 항생제가 포함된 활성화되지 않은 MSC를 투여해도 감염을 제어하지 못한다는 사실을 입증한다(도 3 참조). 또한, 활성화된 MSC 단독 투여로도 감염된 상처에 피하 주사시 세균 제거율이 향상되지 않았다. 따라서, 활성화된 MSC와 살균성 항생제 요법의 특정 조합이, 심부 조직에서 박테리아 감염을 효과적으로 제거하기 위해 필요하다.

실시예 2: 마우스 S. 아우레우스 상처 감염 모델에서의, 활성화된 MSC 및 항생제를 이용한 치료 후, 상처 조직에서의 경시적인 세균 부하의 감소.

실시예 1에서 기술한 바와 같이, S. 아우레우스 함침 메쉬로 감염된 CD-1 마우스(1그룹당 n=5)를 활성화된 MSC 또는 항생제로, 또는 이들을 조합하여 치료하였다. 상처 부위에서의 S. 아우레우스의 수를 IVIS 이미징(생존 세균의 수에 직접 비례하는 이미지 강도)을 사용하여 정량화하고, 평균(+/- SEM) 루시페라아제 자속 강도를 처리 시간에 대해 플로팅하였다.

활성화된 MSC + 경구 항생제로 치료한 마우스는, 대조군 마우스, 또는 항생제(Abx) 또는 활성화된 MSC(Act MSC) 단독으로 처리한 마우스와 비교하여 치료 13일차에 세균 부하가 현저히 감소되었다(도 2 참조).

실시예 3: 항생제 요법과 조합하여 활성화된 MSC의 정맥내 전달 후, 상처 감염 부위에서의 살아있는 세균의 감소.

CD-1 마우스(1그룹당 n=5)를, 상기 실시예 1에 기술한 바와 같이, 이식되고, 감염된 메쉬를 사용하여 만성의, 심한 S. 아우레우스 감염을 확립하였다. 이어서, 이 마우스를 동종이계 지방 유래 마우스 MSC의 3일 간격의 3회 정맥내 주사함으로써 치료하였다. 치료 그룹은 미치료된 대조군 동물(Ctrl), 2주 동안 경구 아목시실란-클라불란산 단독(Abx), MSC 단독(MSC), 활성화 MSC 단독(Act MSC), 활성화되지 않은 MSC + 항생제(MSC + Abx), 또는 활성화된 MSC + 항생제(Act MSC + Abx)로 치료된 동물을 포함하였다. 2주의 치료 완료시, 동물을 안락사시키고 감염 부위의 상처 조직을 수집하여, LB 아가 쿼트 플레이트 상에서 정량적인 분주를 이용하여 상처 조직에서 살아있는 세균(콜로니 형성 단위, 또는 CFU)의 세균 수를 정량하도록 처리하였다.

활성화된 MSC + 항생제로 치료된 마우스는 다른 치료군의 동물에 비해 상처 부위에서의 살아있는 세균 부하가 현저히 감소하였다(도 3 참조). 도 3은 또한 활성화되지 않은 MSC가 항생제와 함께 투여될 때, 감염을 조절하는 데 효과적이지 않다는 것을 입증한다. 마찬가지로, 특정 부류의 항생제만이, MSC에 의한 항균 효과를 촉발하는 것에 활성인 것으로 나타났다.

이러한 발견들은 함께, 활성화된 MSC가 살균성 항생제와 조합될 경우, 깊은 상처 감염의 부위에서 살아있는 세균의 수를 현저하게 감소시킨다는 것을 보여준다.

실시예 4: 만성 상처 감염의 치료를 위한 정맥내 대 직접적인 상처 주사의 비교.

상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 확립된 S. 아우레우스 상처 감염을 갖는 마우스를 경구 항생제와 활성화된 MSC를 사용하여 수술전 조직(SC)에 직접 주사하거나 정맥내 투여하였다. 치료를 3일 간격으로 2회 더 반복하였다. 14일차에, 상처 조직을 수집하고, 조직에서의 세균 부하를 분주 및 콜로니 계수에 의해 결정하였다.

도 4에 도시된 결과는 MSC의 정맥내 투여가 SC 투여보다 상처 세균 부하를 상당히 더 효과적으로 감소시키는 것으로 확인됨을 입증한다.

실시예 5: 마우스 만성 감염 모델에서의 미세 상처 치유에 대한, 활성화된 MSC 투여와 항생제의 효과.

S. 아우레우스 감염된 메쉬 임플란트를 갖는 마우스를 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 치료하였다. 연구가 종료시(21일차), 마우스를 안락사시키고 감염된 상처 조직을 해부하여 임플란트 부위를 찾아내었다. 도 5는 미처리 상처(상부 패널) 및 활성화된 MSC + 항생제로 치료된 상처(하부 패널)의 대표적인 현미경 사진 (H & E로 염색된 조직 절편, 20×)을 도시한다. 치료된 상처에서는, 염증 세포 침윤이 현저히 감소되고, 염증이 섬유 아세포 치유 조직으로 대체된다(도 5 참조).

실시예 6: 활성화된 MSC는 정맥내 투여 후, 상처 감염 부위로 효율적으로 이동한다.

감염된 대조군 동물, 및 활성화 된 GFP-형질전환 MSC(마우스당 1×10⁶ MSC/주사)로 정맥내 주사된 감염 동물로부터의 상처 조직을, 상처 조직에서 MSC를 검출하기 위한 면역 형광 이미지화로 평가하였다. 도 6에서 도시된 바와 같이, 우측 이미지에서는 상처 부위에 다수의 GFP + MSC가 축적된 것이 분명하며, 이는 MSC가 정맥내 투여 후 상처로 효율적으로 이동함을 나타낸다.

이러한 결과는 대부분의 정맥내 주입되는 활성화된 MSC가 처음에는 폐에 갇히게 되더라도, 이후에 세포가 폐를 효율적으로 빠져나와서 수일 동안 신체 전반의 염증 부위로 이동할 수 있음을 나타낸다. 이 관찰은 정맥내 투여 방법의 주요 이점 중 하나, 즉 MSC가 국소적으로 또는 바늘 주입에 의해 적용될 수 있는 피부 부위뿐만 아니라 신체의 어느 곳에서나 감염된 부위에 접근할 수 있게 한다는 것을 강조한다.

실시예 7: 활성화된 MSC에 의한 전신 치료에 의해 촉진된 상처 치유.

S. 아우레우스 감염된 메쉬 임플란트를 갖는 마우스를 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 치료하였다. 연구가 완료시(21일차) 마우스를 안락사시키고 피부를 해부하여 임플란트 부위를 찾아내었다. 도 7은 미치료된 상처(대조군) 및 활성화 된 MSC + 항생제로 치료된 상처의 대표적인 사진을 나타내며, 이때 미치료된 대조군 상처(좌측 패널)와 비교하여 MSC 치료된 상처(우측 패널)에서 상당한 치유가 확인되었다. 미치료된 상처(좌측)는 고름을 함유하는 반응성 조직의 두꺼운 캡슐로 둘러싸여 있는 반면에, MSC + 항생제로 치료된 상처(우측)는 염증 및 고름 축적을 거의 나타내지 않는다. 원래 이식되어 있는 외과적 메쉬 재료는 치료된 상처의 임플란트에서는 시각화될 수도 있는 반면에, 미치료된 상처에서는 고름으로 완전히 둘러싸여 있다.

상처 치유 효과는 활성화된 MSC + 항생제로 치료된 마우스 그룹에서만 관찰되었다. 또한, 도 7의 결과는, 만성 심부 세균 감염을 근절하는 능력 외에도, 활성화된 MSC의 투여가 상처 치유와 염증 및 반응성 반흔 조직 형성의 감소에 상당한 기여를 한다는 것을 보여준다.

실시예 8: 정맥내 투여 후, 감염된 상처 부위로의 DiR 표지된 MSC의 이동.

S. 아우레우스 감염된 상처를 갖는 마우스(상세한 것은 상기 실시예 1 참조)에서, 활성화되거나 활성화되지 않은 MSC를 적외선 염료(DiIC18(7)(1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸리도트리카르보시아닌 요오다이드))로 표지하고, 살아있는 마우스에 정맥내 주사한 다음, 생체형광 이미지화기(IVIS)에서 이미지화하여, 주입 된 MSC의 이동을 검출하였다. 주사 48시간 후, DiR + 세포는 감염된 상처의 영역에서 나타났다(중간 및 우측 패널, 박스 영역).

도 8에 도시된 결과는, 활성화되지 않은 MSC를 주사한 마우스(중간 패널)에서보다, 활성화된 MSC를 주사한 마우스(우측 패널)에서 상처 부위에 실질적으로 더 많은 DiR + 세포가 있었음을 나타낸다. MSC가 주입되지 않은 대조군 마우스(좌측 패널)에서는 적외선 신호가 검출되지 않았다. S. 아우레우스에 의한 상처 감염 부위는 각 동물에서 청색 내지 녹색의 영역으로 이미지화된다(각 이미지의 좌측 패널). 각 마우스에서 큰 음영 영역은 폐이고, 상처 침윤 세포는 박스 영역에 나타내어져 있다.

정맥내 주사된 MSC는 감염된 상처로 효율적으로 이동되고, 염증 조직에 의해 생성된 케모카인에 반응하여 모집될 가능성이 높으며, 그 활성화된 MSC는 활성화되지 않은 세포보다 더 효율적으로 이동한다. 정맥내 주입된 MSC는 감염된 상처의 가장자리에 점진적으로 축적된다는 사실은, 또한 전반적인 세균 제거 효과를 유도하기 위해서 MSC의 반복 투여가 중요함을 보여준다.

실시예 9: MSC에 의한 시험관내 세균 사멸.

S. 아우레우스를 사멸시키는 MSC의 능력은 시험관내에서 MSC와 직접적으로 세균을 공동 배양함으로써 평가하였다. 96-웰 플레이트의 3개 웰에서 MSC(1×10⁵ 세포/웰)를 세균(세포당 10의 세균)과 4시간 동안 공동 배양한 다음, 상등액으로부터 박테리아를 수집하고, 수동 계수에 의해 CFU를 결정하였다. 결과를 도 9에 도시한다. MSC 배양물로부터 배양 배지를 수거하고 세균과 함께 배양한 경우에도, 유사한 결과가 관찰되었다.

이러한 발견은, MSC가 배양물에서 자발적으로 항미생물성 인자를 분비한다는 것을 보여준다.

실시예 10: MSC는 , 항생제 요법과 병용되었을 때, 상승적 세균 사멸 및 고도의 항생제 내성의 역전을 보인다.

상기 실시예 9에서 기술된 것과 유사한 실험 설계를 사용하여, 고도로 항생제 내성인 세균 균주를, 활성화된 MSC 단독, 항생제 단독(세파졸린(세파)) 또는 3 배양물로의 항생제 + 활성화된 MSC와 함께 인큐베이션하고, 4시간 후에 세균 사멸을 평가하였다. 세균이 매우 높은 용량의 항생제와 함께 인큐베이션되었을 경우, 세균 사멸은 거의 관찰되지 않았다. 마찬가지로, 활성화된 MSC 단독으로는 유의미한 세균 사멸이 관찰되지 않았다.

그러나, 활성화된 MSC와 조합된 항생제의 투여는, 활성화된 MSC 또는 항생제 단독에 비해 세균의 상승적 사멸을 나타냈다(그림 10 참조). 또한, 다른 항생제 및 다른 세균 균주에서도 유사한 결과가 관찰되었다. 또한 개와 인간 유래의 MSC는 모두 이러한 상승적 효과를 나타내었다.

이러한 발견은, 만성 감염의 치료를 위한 지속적인 항생제 요법, 심지어 세균이 내성을 바나태는 것으로 여겨지는 항생제와 함께 MSC 요법을 병용할 근거를 뒷받침해주는데, MSC 및 종래의 살균성 항생제, 예컨대 세팔로스포린 및 페니실린 및 아미노글리코시드에 의해 분비되는 인자들 사이에는, 독특하고 이전에는 인정받지 못했던 항균 작용이 있음을 입증하기 때문이다. 또한, 이 상호작용은 항생제와 활성화된 MSC가 깊은 세포 감염의 치료를 위해 생체내에서 조합되었을 때 관찰되는 강력한 상승작용을 부분적으로 설명해준다.

실시예 11: 활성화된 MSC에 의해 생성된 케모카인은 시험관내에서 단핵구 이동을 촉진한다.

MSC 배양물로부터의 조정 배지(CM)는, 이동 분석(Boyden 챔버) 및 개 혈액을 이용하여 단핵구 이동을 촉진하는 능력을 평가하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, MSC로부터의 CM과의 인큐베이션은 증진된 단핵구의 이동을 촉진하는 반면에, 활성화된 MSC로부터의 CM과의 인큐베이션(시험관내에서 pIC로 2시간 동안 활성화됨)은 단핵구의 보다 현저한 이동을 촉진하였다.

이 결과는, pIC에 의한 MSC의 활성화가 상처 부위로의 단핵구의 보다 큰 이동을 촉진할 수 있음을 보여준다(상기 실시예 12 참조).

실시예 12: 활성화 MSC의 전신 투여는 상처 감염 부위로의 단핵구 모집을 촉발시킨다.

단핵구, 대식세포 및 호중구 반응을 포함하는, 숙주 면역 반응에 대한 활성화된 MSC의 영향을 조사하기 위해 연구를 수행하였다. 염증성 단핵구가 모두 GFP를 발현하는 리포터 마우스를 사용하여, 상처 조직으로 이동하는 단핵구의 수를 측정 하였다. S. 아우레우스 감염된 마우스의 상처를, 염증성 단핵구의 검출을 위해 면역염색하였다.

만성적 S. 아우레우스 감염 상처를 갖는 마우스(상기 실시예 1 참조)를, 활성화된 MSC의 정맥내 투여에 의해 치료하였을 때, 도 12에 도시된 바와 같이, 미치료된 대조군 동물(좌측 패널)에 비해, 상처에 침윤하는 단핵구의 수가 현저히 증가하였다(우측 패널). 미치료된 동물(좌측) 또는 항생제 단독으로 치료된 동물(도시하지 않음)의 상처는 비교적 희박한 단핵구 집단을 함유한 반면에, 활성화된 MSC(우측)로 치료된 동물의 상처는 혈류에서 수집된 단핵구의 매우 조밀한 집단을 함유하였다. 또한, 활성화된 MSC로 치료된 동물에서 상처 조직으로 이동하는 단핵구의 수는, 활성화되지 않은 MSC보다 현저하게 더 컸다.

이러한 발견은, MSC가 정맥내 투여 후 숙주 면역 세포(단핵구)를 조직 내로 모집함을 입증하고, 또한 MSC의 활성화가 이러한 단핵구 모집 효과를 현저히 증진한다는 것을 입증한다. 단핵구가 조직의 대식세포로 분화되고 대식세포가 상처 치유를 촉진하는 중요한 백혈구이기 때문에, 활성화된 MSC 처리의 단핵구 모집 효과는 중요하다.

실시예 13 : 활성화된 MSC를 이용한 요법은 상처 부위에서의 상처 치유 대식세포의 분화를 촉진한다.

도 13에 도시된 바와 같이, 미치료된 마우스(좌측), 활성화되지 않은 MSC로 치료된 마우스(중간 패널), 및 활성화된 MSC로 치료된 마우스(우측 패널)로부터 만성적 S. 아우레우스 상처 감염을 갖는 마우스의 상처 조직을 수집하고, 감염된 상처의 조직을 2주차에 수집하고, 유도성 산화질소를 발현하는 M1 대식세포(iNOS 발현)의 검출 및 M2 대식세포(아르기닌 발현)의 검출을 위해 처리하였다. 활성화된 MSC로 치료된 마우스(활성화되지 않은 MSC로는 치료하지 않음)는, M1 대식세포보다 M2 대식세포를 현저히 더 함유하는 상처를 가졌던 반면에, 미치료된 동물 또는 활성화되지 않은 MSC로 치료된 동물에서는 정반대로 관찰되었다.

M2 대식세포가 상처 치유에 필수적이므로, M2 대식세포 수의 증가는, 활성화 된 MSC로 치료된 동물에서 상처 치유가 촉진되는 이유를 설명하는 데 도움이 될 수 있다(상기 실시예 12 참조).

실시예 14: MSC는 카텔리시딘 항미생물성 펩티드 LL -37을 생성한다.

도 14에 도시된 바와 같이, 마우스 MSC는 항미생물성 펩타이드 LL-37(좌측 패널) 또는 무관한 동종형 대조군 항체(우측 패널)의 세포내 생성의 검출을 위해서 면역염색하였다. LL-37의 풍부한 발현은 MSC(좌측 패널)에서 관찰된 반면, 대조군 항체에 의한 염색은 거의 관찰되지 않았다.

이러한 결과는 쥐, 개 및 인간 MSC 모두가, 그람 음성균과 그람 양성균 모두를 사멸시키는 중요한 항미생물성 펩티드인 세포내 LL-37을 생성함을 보여준다.

MSC가 세파졸린과 조합되었을 때에 관찰되는 입증된 상승적 사멸은, MSC에 의한 LL-37의 방출에 기인하는 것이고, 그 LL-37가 항생제와 상승적으로 작용하여 세균 사멸을 증가시키는 것일 가능성이 있습니다.

실시예 15: MSC에 의한 세균 사멸은 카텔리시딘 LL -37의 생성에 부분적으로 의존한다.

도 15에서 도시된 바와 같이, MSC를 세균과 공동 배양하고, LL-37 중화의 효과를 평가하였다. MSC에 의한 세균 사멸을, 대조군 MSC, LL-37을 중화시키는 항체로 처리된 MSC, 및 관련성이 없는 항체로 처리한 MSC에서 평가하였다. 항-Cramp 항체의 첨가는 MSC의 세균 사멸 활동을 현저히 감소시켰으며, 이는 MSC에 의한 사멸이 부분적으로는 항미생물성 펩티드 LL-37의 분비에 의해 매개됨을 보여준다.

실시예 16: 활성화된 MSC에 의해 생성된 인자는, 호중구에 의한 세균 식균작용의 증가를 촉발시킨다.

단핵구, 대식세포 및 호중구 반응을 포함하는 숙주 면역 반응에 대한 활성화 된 MSC의 영향을 조사하기 위해 연구를 수행하였다. 호중구를 MSC로부터의 조정 배지(CM)와 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 세정하고, 스타필로코커스 아우레우스 세균과 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포외 세균을 항생제 치료에 의해 제거한 다음, 세균을 항-S. 아우레우스 항체로 면역염색함으로써 편재화하였다. CD11b 발현에 대한 면역염색으로 호중구를 편재화하였다. MSC CM과의 인큐베이션은 도 16의 하단 패널에 표시된 바와 같이 세균 섭식을 유의적으로 증가시켰다. 활성화된 MSC로부터의 상청액과 함께 인큐베이션된 호중구는, 대조군 호중구(우측 상단 패널) 또는 활성화되지 않은 MSC로부터의 호중구 인큐베이션된 인자(우측 중간 패널)보다 현저히 더 많은 식세포가 되었다(우측 하단 패널 및 좌측 패널).

이 결과는, MSC가 세균 제거를 증진하기 위해서 숙주 면역계와 상호 작용할 수 있는 한 가지 메카니즘을 나타낸다. 또한, 활성화된 MSC는 숙주의 선천적 면역계에 강한 영향을 미치며, 이는 심부 세균성 감염의 제어에 기여할 수 있다.

실시예 17: 활성화된 MSC의 정맥내 투여는, 감염된 외상성 족부 손상을 갖 는 개에서 감염된 감염된 족부 상처 내의 약물 내성 세균의 다수의 균주의 제거를 촉발시킨다.

자연 상태의 상처와 상처 감염이 있는 애완견에서 임상 연구를 실시하여 MSC 및 항생제 요법의 유효성을 평가하였다. 심하게 외상을 입었고 감염된 족부 상처를 갖는 개(도 18 및 19 참조)를, 상처 감염 제어를 위한 활성화된 MSC 요법의 효과를 평가하는 연구에 등록시켰다. 이 특정한 동물의 족부 상처는 2개의 고도의 항생제 내성 세균 단리물(이 콜라이 및 슈도모나스 애루기노사)에 감염되었으며, 연구에 참여하기 2주 전에 성공 없이 치료받았다.

발 상처를 활성화된 동종이계 개의 MSC의 3회 정맥내 주사(2주 간격으로 체중 kg당 2×10⁶의 활성화된 동종이계 MSC를 15분간 주사함)로 치료하고, 감염된 상처의 세균 수를 치료 동안에 경시적으로 수집한 연속 정량 배양물에 의해 확인하였다(도 17 참조). 개는, 또한 연구 해석을 혼란스럽게하는 것을 피하기 위해서, 세균이 내성을 나타내는 최초의 일일 항생제로 유지되었다.

MSC 치료 전에(그러나 항생제 치료를 계속하는 동안), 세균 수치는 여전히 높게 유지되었다. 2주차(첫 번째 MSC 치료 후)에, MDR 이 콜라이 및 MDR 슈도모나스의 수는 상당히 감소했으며, 3차 MSC 주입(8주차)이 완료됨에 따라 수치는 계속해서 검출 불가능한 수준으로 감소하였다.

기술한 감염된 발 상처도 상처 치유에 대해 사진으로 모니터링하였고, 그 결과를 도 18 및 19에 도시한다. 초기의 활성화된 MSC의 주사시(도 18, Inj #1, 상단 패널), 발 상처는 매우 염증이 심하고 통증이 있었으며 치유되지 않았다. 세 번째 MSC 주입시(도 18, 하단 패널), 발 상처가 현저히 치유되었고 개에게 더 이상 통증이 있지 않았다. 유사하게, 도 19는, 치료전 치유 파라미터에 비해, 2차 MSC 치료 4주 후(우측 패널)에서 상처가 실질적으로 치유되었음을 보여준다.

항생제와 조합된 활성화 된 MSC를 정맥내 주사하여 약물 내성 세균성 감염을 통제한 것의 관한 유사한 결과는, 활성화된 MSC 및 항생제로 치료된, 만성 상처 감염이 있는 추가의 4마리의 개에서 얻었다. 그에는 무릎 관절에 몇 달 동안 장기간 수술 후 감염이 있는 2 마리의 개(도 20 참조), 만성 감염된 심박 조율기 리드가 있는 개 및 만성 감염된 골 플레이트가 있는 개가 포함되었다(도 21 참조). 4가지 모든 경우에서, 활성화된 동종이계 개의 MSC의 정맥내 투여가 시작된 후, 세균 수가 현저하게 감소되거나 제거되고, 상처가 실질적인 치유를 겼었다.

활성화된 MSC로 치료된, MDR 감염을 가진 개에 대해 얻은 데이터의 요약을 하기 표 1에 제공한다. 종래의 항생제 치료에 불응하는 다양한 다른 부위에서 MDR 상처 감염이 있고, 항미생물 치료를 위해 활성화된 개 MSC로 치료 효과를 평가하는 임상 시험에 등록 및 치료된 7마리의 개로부터의 임상 데이터. 모든 개들은 6주차에 치유의 세균학적 및 미생물학적 증거에 대해 평가하였다.

종합하여, 이들 모든 발견은 활성화된 MSC 생성물이 관련이 없는 기증 동물(즉, 동종이계 세포)으로부터 수득될 수 있고 여전히 활성인 것을 설명한다. 또한, 인간 임상 사용에 대해 현실적인, 활성화된 MSC의 투여량은, 현실적인 상처 감염 모델에서 고도의 약물 내성 유기체의 복잡한 혼합물을 제거하는 데 효과적일 수 있다.

이 결과는, 고도의 약물 내성인 세균 감염이 있는 동물에서 전신 투여될 때 활성화된 MSC의 강력한 치유 활성을 입증한다. 추가로, 상기 결과는 자발적이고 현실적인 인간 세균 감염 동물 모델에서 얻었기 때문에, 이러한 결과를 사람 또는 동물의 감염 치료에 쉽게 적용할 수 있다.

실시예 18: 수술후 감염이 있는 개에서의, 활성화된 MSC + 항생제에 의한 만성 관절 감염의 치료.

2회의 추가 수술과 복수의 항생제 치료 과정을 거쳐 지속된 1년 기간의 비결장성 수술 후, 해소되지 않은 후슬 감염을 갖는 개를, 활성화된 개 MSC의 항균성을 평가하기 위한 연구에 등록시켰다. 연구 기간 동안, 개는 2주 간격으로 활성화된 동종이계 개의 지방 유래 MSC를 3회 주입하면서 원래의(비효율적인) 항생제 체계를 유지하였다. 관절천자에 의해 얻어지는, 관절 유동 세포학의 연속적인 평가로 치료에 대한 반응을 관찰하였다(도 20 참조).

초기 관절액에는 많은 염증 세포가 있었으며, 치료 동안에 신속하게 사라지기 시작하여, 연구 8주차에 관절액이 정상적으로 되었다. 또한 개는 임상적으로 극적으로 개선되어 8주까지 다리를 정상적으로 다시 사용할 수 있게 되었다. 이 개는 1년 후 임상적으로 정상인 상태로 유지되었다.

따라서 이러한 결과는, 항생제와 조합되는 활성화된 MSC 요법이, 무릎 관절과 같은 부위의 심부 감염, 및 인간의 수술후 감염과 매우 유사한 자생적인 질환 모델에도 효과적일 수 있음을 보여준다.

실시예 19: MDR 엔테로코커스에 의한 피부 감염이 있는 개에서의 상처 치유.

개는 외상성 피부 상처의 외과적 치료 후 MDR 엔테로코커스 종에 감염되었고, 이 감염은 항생제 치료에 반응하지 않았다. 따라서, 이 개를 상처 감염을 해결하고 상처 치유를 촉진하기 위해, 활성화된 개의 MSC의 능력을 평가하기 위한 임상 시험에 등록시켰다. 연구 기간 동안, 개는 8주간에 걸쳐 활성화된 개의 동종이계 지방 유래 MSC의 정맥 주사를 3회 받았다. 연구 완료시, 치료전과 비교하여 상처가 실질적으로 치유되었고(도 21, 좌측 패널), 엔테로코커스는 더 이상 상처에서 배양할 수 없었다(도 21, 우측 패널).

실시예 20: 활성화된 MSC 및 항생제 요법에 의한, 개에서의 골수염 및 골 플레이트 감염의 치료.

개는 골 플레이트로 골절을 치료한 후 만성 및 항생제 내성의 감염이 발생하였다(도 22, 좌측 패널). 이어서, 이 개를 원래 항생제를 유지하면서, 2주 간격으로 활성화된 동종이계 개의 MSC의 3회 주입으로 치료하였다. 정량적인 배양은, MDR 세균의 다양한 다른 종에 감염된 골 플레이트를 갖는 개로부터 치료전과, 활성화된 MSC의 정맥내 주입 2주 후에 실시하였다. 한 번의 MSC 주사 후 감염된 상처로부터 단리된 세균의 수가 치료 4주차에 현저하게 감소하였다(도 22, 우측 패널).

이 결과는, 활성화된 MSC의 전신 투여가, 항생제만으로 치료하는 것이 매우 어려운 골 플레이트와 같은 임플란트 감염에도 효과적일 수 있음을 보여준다. 이러한 공지된 어려움에도 불구하고, 활성화된 MSC와 항생제 요법의 조합은, 단지 MSC 투여 2주 이내에 세균 수를 현저히 감소시켰다.

실시예 21: 활성화된 고양이 간엽 줄기 세포에 의하 전신적 요법 후, 고양 이에서의 만성적 MDR 상처 감염의 치유 및 제거.

고양이가 자생적으로 혈관염이 발병하여 목과 등 부위의 많은 피부를 잃었다. 상처는 빈번한 붕대 교체로 관리하였으나, 이후 여러 가지 세균 단리물에 감염되었다. 고양이는 항생제(엔로플록사신)로 치료하였으나, 상처는 계속 감염되어 심하게 괴사되었고, 고양이는 전신적으로 질환을 갖게 되었다.

항미생물성 줄기 세포 연구의 등록시에, 상처 배양물에는 고도로 약물 내성인 스타필로코커스 인테르메디우스가 성장하였다. 그 다음, 고양이는 활성화된 고양이 동종이계 MSC의 일련의 정맥내 주입을 받고, 체중 kg당 2×10⁶ 세포의 용량으로 투여받았으며, 3회 치료를 위해 2주마다 투여받았다. 치료 시험 기간 동안, 고양이는 스타필로코커스 단리물에 내성을 나타내는 엔로플록사신으로만 치료를 지속하였다.

그 결과를 도 23에 도시한다. 첫 번째 줄기 세포 치료를 받은지 24시간 이내에, 고양이는 임상학적으로 눈에 띄게 개선되었다. 3주차의 재검사에서, 스타필로코커스가 상처액으로부터 분리되었지만, 상처는 눈에 띄게 작았고 배출물은 적었다. 5주차에, 상처가 더 작아졌고 상처 조직은 훨씬 더 건강해 보였으며, 상처 배양물은 음성이었다. 7주차에, 상처는 거의 완전히 치유되었고 상처 배양물은 음성이었다. 고양이는 더 이상의 치료를 받지 않았고, 상처는 해결된 것으로 간주되었다.

실시예 22: 진성 당뇨병을 갖는 개에서의, MDR 세균의 다수의 균주에 의한 만성 상처 감염의 치료.

도 24는 진성 당뇨병 및 만성 감염된 수술 후 상처를 가진 개에서의 감염의 상처 치유 및 해소를 도시한다. 오래 지속된 진성 당뇨병을 가진 개는 무릎 관절의 수술후 상처 감염이 일어났는데, 이는 여러 가지 상이한 항생제에 의한 치료 후 3 개월 동안 기존의 항생제 치료법에 대해 반응하지 않은 채로 남아있었다.

줄기 세포 시험에 도입했을 때, 상처는 붉고 염증이 있었으며 화농성 물질을 배출하였다. 이 개를 활성화된 동종이계 개의 MSC로 kg당 2×10⁶ 세포의 일련의 정맨내 투여로 치료하고, 이는 2주 간격으로 투여하였다. 치료전 정량적 상처 배양 물은, 고도의 MRD 스타필로코커스 에피데미디스(Staphylococcus epidermidis)의 2 가지 상이한 단리물을 밝혀내었다.

첫 번째 MSC 주입 2주 후, 상처의 외관이 개선되었고 주인은 개가 덜 절름거린다고 보고하였다. 또한, 상처 배양물은 성장 없는 상태로 돌아왔다. 두 번째 MSC 주입 후 상처의 외관이 현저히 개선되었고 상처 배양물은 다시 음성이었다. 4주차에 상처에 대해 언급된 혈청 삼출액(도 24 참조)은 무균 상태였고, 활성화된 MSC로 치료하는 동안 다른 상처에서 앞서 관찰되었으며, 이것은 일반적으로 자연적으로 해결된다.

실시예 23: 항생제 로딩된 MSC 및 항생제 요법에 의한, 만성 상처 감염의 치료.

MSC를 시험관내 배양으로 증식시킨 다음, 세포 투과성 항생제(예컨대, 퀴놀론, 테트라사이클린, 메트로니다졸)와 함께 1∼2시간 동안 인큐베이션하고, pIC에 의해 그와 동시에, 전에 또는 후에 활성화하였다. 활성화되고 로딩된 MSC를 전술 한 바와 같이 정맥내 주입하기 전에 세정하고 수거하였다. 항생제 로딩된 세포에 의한 치료는 상처가 해소될 때까지 1∼2주 간격으로 반복하였다.

이 접근법의 바람직한 환자는(항생제로 로딩되지 않은 MSC와 대비하여), 특히 약물 내성 감염(예컨대, 고도의 약물 내성의 감염)을 갖는 환자, 구강 또는 정맥내 전달 후 항생제가 조직에 잘 침투하지 않는 감염을 갖는 환자, 및 정상 세균군을 저해하지 않도록 약물을 경구 또는 비경구로 투여하지 않는 것이 바람직한 감염을 갖는 환자(예컨대, 씨. 디피실(C. difficile) 감수성 환자)를 포함할 수 있다.

균등 범위

본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부 사항은, 상기 첨부된 상세한 설명에서 개시된다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 재료를 이하에 설명한다.

전술의 상세한 설명은 단지 설명의 목적으로만 제시하였고, 본 발명을 개시된 정확한 형태로 한정하고자 하는 것이 아니며, 여기에 첨부된 청구범위에 의해서만 한정한다.

Claims (61)

1. 톨 유사 수용체 3(TLR3) 작용제, 톨 유사 수용체 9(TLR9) 작용제, 톨 유사 수용체 4(TLR4) 작용제, 핵 올리고이량체화 도메인(nuclear oligodimerization domain: NOD) 수용체 작용제, RIG-I 수용체(RLR) 작용제, 사이토솔 DNA 센서(cytosolic DNA sensor: CDS) 작용제, 및 STING 수용체 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성화제에의 노출에 의해 활성화된, 주입 준비된(infusion ready) 동종이계 간엽 줄기 세포의 집단, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 정맥내 투여를 위해 제제화되는 조성물.
3. 제2항에 있어서, 동종이계 간엽 줄기 세포의 집단이 골수, 지방 조직, 제대혈, 조직 생검물 또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 수득되거나 유도되는 것인 조성물.
4. 제3항에 있어서, 조직 생검물이 피부 생검물 또는 치아 생검물인 조성물.
5. 제1항에 있어서, 동종이계 간엽 줄기 세포의 집단은 하나 이상의 활성화제와 함께 2시간 이상 인큐베이션하는 것에 의해 활성화되는 것인 조성물.
6. 제5항에 있어서, 인큐베이션이 시험관내 또는 생체외에서 일어나는 것인 조성물.
7. 제1항에 있어서, TLR3 작용제가 폴리아데닐산-폴리우리딜산(폴리(A:U)), 폴리이노신산-폴리시티딜산(pIC) 및 UV 불활성화된 바이러스 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
8. 제7항에 있어서, UV 불활성화된 바이러스 입자가 폭스바이러스 입자인 조성물.
9. 제1항에 있어서, TLR9 작용제가 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODN), 억제성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), 정제된 DNA, 및 정제 또는 합성 플라스미드 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
10. 제1항에 있어서, TLR4 작용제가 세균성 지질다당류(LPS) 및 모노포스포릴 지질 A(MPLA) 또는 가열 사멸된 그람 음성균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
11. 제1항에 있어서, NOD 수용체 작용제가 NOD1, NOD2 및 NOD1/2 혼합 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
12. 제11항에 있어서, NOD1 수용체 작용제가 디펩티드 IE-DAP(iE-DAP(γ-D-Glu-mDAP))인 조성물.
13. 제11항에 있어서, NOD2 수용체 작용제가 무라밀디펩티드(MDP) 및 이의 합성 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
14. 제13항에 있어서, 합성 유도체가 미라부티드(mirabutide)인 조성물.
15. 제11항에 있어서, NOD1/2 혼합 작용제가 그람 양성균 및 합성 분자 MurNAc-L-Ala-감마-D-Glu-mDAP(PGN 유사 분자)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
16. 제1항에 있어서, RLR 수용체 작용제가 이중 가닥 RNA, 합성 pAT RNA 및 합성 pIC RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
17. 제1항에 있어서, CDS 작용제는 세균으로부터 단리된 이중 가닥 DNA인 조성물.
18. 제1항에 있어서, STING 수용체 작용제가 환형 디뉴클레오티드; 3,3 환형 gAMP; 2,3 환형 gAMP; 2,2 환형 gAMP; 환형 Di-GMP; 및 환형 di-UMP로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
19. 제2항에 있어서, 활성화제가 10 ㎍/ml의 폴리이노신산:폴리시티딜산(pIC)인 조성물.
20. 제1항에 있어서, 유효량의 하나 이상의 항미생물제를 추가로 포함하는 조성물.
21. 제20항에 있어서, 하나 이상의 항미생물제가 살균성 항생제인 조성물.
22. 제21항에 있어서, 살균성 항생제가 페니실린 유도체(페남), 세팔로스포린(세팜), 모노박탐, 카르바페넴, 반코마이신, 답토마이신, 플루오로퀴놀론, 메트로니다졸, 니트로푸란토인, 코트리목사졸, 텔리트로마이신 및 아미노글리코시드계 항생제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
23. 제20항에 있어서, 하나 이상의 항미생물제가 정균 항생제인 조성물.
24. 제23항에 있어서, 정균 항생제가 테트라사이클린 항생제, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 클린다마이신 및 리네졸리드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
25. 제24항에 있어서, 테트라사이클린 항생제가 테트라사이클린, 독시사이클린 및 미노사이클린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
26. 제20항에 있어서, 동종이계 간엽 줄기 세포가 포유류 간엽 줄기 세포인 조성물.
27. 제26항에 있어서, 동종이계 간엽 줄기 세포가 인간 간엽 줄기 세포인 조성물.
28. 제1항에 있어서, 포유류에서 MDR 세균에 의해 만성 감염된 상처의 치유를 증진하는 조성물.
29. 유효량의 활성화된 간엽 줄기 세포를 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 만성 감염된 상처를 치료하는 방법.
30. 제29항에 있어서, 활성화된 간엽 줄기 세포는 감염된 상처에서 세균 제거(bacterial clearance)를 유도하거나, 세균 부하(bacterial burden)를 감소시키거나, 또는 세균 제거를 유도하고 세균 부하를 감소시키는 것인 방법.
31. 제30항에 있어서, 활성화된 간엽 줄기 세포를 포유류에게 정맥내 투여하는 것인 방법.
32. 제30항에 있어서, 간엽 줄기 세포가 골수, 지방 조직, 제대혈, 조직 생검물, 혈액 또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 수득되거나 유도되는 것인 방법.
33. 제32항에 있어서, iPSC 세포가 조직 생검물 또는 혈액 세포로부터 유도되는 것인 방법.
34. 제33항에 있어서, 생검물이 피부 생검물 또는 치아 생검물인 방법.
35. 제31항에 있어서, 간엽 줄기 세포는, 시험관내 또는 생체외에서 톨 유사 수용체 3(TLR3) 작용제, 톨 유사 수용체 9(TLR9) 작용제, 톨 유사 수용체 4(TLR4) 작용제, 핵 올리고이량체화 도메인(NOD) 수용체 작용제, RIG-I 수용체(RLR) 작용제, 사이토솔 DNA 센서(CDS) 작용제 및 STING 수용체 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성화제와의 인큐베이션에 의해 활성화되는 것인 방법.
36. 제35항에 있어서, TLR3 작용제가 폴리아데닐산-폴리우리딜산(폴리(A:U)), 폴리이노신산-폴리시티딜산(pIC) 및 UV 불활성화된 바이러스 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
37. 제36항에 있어서, UV 불활성화된 바이러스 입자가 폭스바이러스 입자인 방법.
38. 제35항에 있어서, TLR9 작용제가 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODN), 억제성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), 정제된 DNA, 및 정제 또는 합성 플라스미드 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
39. 제35항에 있어서, TLR4 작용제가 세균성 지질다당류(LPS) 및 모노포스포릴 지질 A(MPLA) 또는 가열 사멸된 그람 음성균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
40. 제35항에 있어서, NOD 수용체 작용제가 NOD1, NOD2 및 NOD1/2 혼합 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
41. 제40항에 있어서, NOD1 수용체 작용제가 디펩티드 IE-DAP(iE-DAP(γ-D-Glu-mDAP))인 방법.
42. 제40항에 있어서, NOD2 수용체 작용제가 무라밀디펩티드(MDP) 및 이의 합성 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
43. 제42항에 있어서, 합성 유도체가 미라부티드인 방법.
44. 제40항에 있어서, NOD1/2 혼합 작용제가 그람 양성균 및 합성 분자 MurNAc-L-Ala-감마-D-Glu-mDAP(PGN 유사 분자)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
45. 제40항에 있어서, RLR 수용체 작용제가 이중 가닥 RNA, 합성 pAT RNA 및 합성 pIC RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
46. 제40항에 있어서, CDS 작용제는 세균으로부터 단리된 이중 가닥 DNA인 방법.
47. 제40항에 있어서, STING 수용체 작용제가 환형 디뉴클레오티드; 3,3 환형 gAMP; 2,3 환형 gAMP; 2,2 환형 gAMP; 환형 Di-GMP; 및 환형 di-UMP로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
48. 제35항에 있어서, 활성화제가 폴리이노신산:폴리시티딜산(pIC)인 방법.
49. 제48항에 있어서, 간엽 줄기 세포는, 시험관내에서 10 ㎍/ml의 폴리이노신산:폴리시티딜산(pIC)과 2시간 이상 인큐베이션함으로써 활성화되는 것인 방법.
50. 제31항에 있어서, 유효량의 간엽 줄기 세포가, 포유류의 체중 kg당 2×10⁶ 세포인 방법.
51. 제50항에 있어서, 세포가 정맥내 카테터에 의해 15분의 시간에 걸쳐 투여되는 것인 방법.
52. 제31항에 있어서, 유효량의 하나 이상의 항미생물제의 투여를 추가로 포함하는 방법.
53. 제52항에 있어서, 하나 이상의 항미생물제가 살균성 항생제인 방법.
54. 제53항에 있어서, 살균성 항생제가 페니실린 유도체(페남), 세팔로스포린(세팜), 모노박탐, 카르바페넴, 반코마이신, 답토마이신, 플루오로퀴놀론, 메트로니다졸, 니트로푸란토인, 코트리목사졸, 텔리트로마이신 및 아미노글리코시드계 항생제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
55. 제29항에 있어서, 간엽 줄기 세포가 포유류 간엽 줄기 세포인 방법.
56. 제55항에 있어서, 포유류 간엽 줄기 세포가 동종이계 간엽 줄기 세포인 방법.
57. 제55항에 있어서, 포유류 간엽 줄기 세포가 인간 간엽 줄기 세포인 방법.
58. 제52항에 있어서, 활성화된 간엽 줄기 세포가 포유류에서 감염된 상처의 치유를 증진하는 것인 방법.
59. 제58항에 있어서, 감염된 상처가 찰과상, 열상, 타박상, 진탕, 자창, 피부 베임(skin cut), 수술 상처, 총상, 화상, 일광 화상, 동상, 화학적 상처, 물린 상처, 쏘인 상처 및 전기적 상처로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
60. 제35항에 있어서, 활성화된 간엽 줄기 세포는 활성화되지 않은 간엽 줄기 세포에 비해 증가된 항미생물 활성을 갖는 것인 방법.
61. 제31항에 있어서, 활성화된 간엽 줄기 세포를 상처 발생시에 또는 상처 발생 후에 투여하는 것인 방법.

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