CN110124012B - 一种颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂的应用。本发明还公开了一种颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂的药物，其原料包括：颗粒溶素、多粘菌素类抗生素。本发明首次提出了颗粒溶素作为抗生素增效剂，增强抗生素的抑菌活性，增强多粘菌素对耐药鲍曼不动杆菌抑菌活性；通过本发明可为在临床上降低多粘菌素的使用剂量从而减少对人体肾脏、神经系统的毒性，以及阻碍MDR‑AB对多粘菌素产生诱导性耐药提供新途径，同时为应对包括MDR‑AB在内的多重耐药菌感染开辟新的治疗方法奠定理论基础。

Description

一种颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂的应用
技术领域
本发明涉及抗生素增效剂技术领域，尤其涉及一种颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂的应用。
背景技术
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)属于不动杆菌属，是一种常见的可引起医院内感染，尤其是重症监护病房(ICU)内感染的重要致病性非发酵革兰氏阴性杆菌。鲍曼不动杆菌因对大部分抗生素具有天然与获得性多重耐药特性，使临床上用于治疗其感染的药物选择极其有限，早在70年代就已备受关注。并且，随着抗生素在临床抗感染经验性治疗指导的广泛使用下，鲍曼不动杆菌的耐药性仍在不断增强，如部分菌株已由多重耐药性(Multi-drug resistant)发展至对临床常用抗生素的普遍耐药，即泛耐药性(Pan-drugresistant)或全耐药性(All-drug resistant)。当前，鲍曼不动杆菌因具有极强的耐药能力，医学界已将其列为人类的红色预警病原体之一。鲍曼不动杆菌可引起全身系统性感染，如：肺炎、脑膜炎、尿路感染、血流感染、外伤及战争伤感染等，其中以医院获得性感染为主，尤其对于ICU内的危重病人。由于多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-AB)的耐药性不断进化，对目前被称为是应对革兰氏阴性耐药菌最后一道防线—多粘菌素的耐药株也在不断增加，严重威胁患者的生命健康，并为临床治疗带来严峻挑战。
临床上一般多采用β-内酰胺酶抑制剂：舒巴坦、他唑巴坦、阿维巴坦作为抗生素增效剂与头孢菌素等抗生素联合使用对MDR-AB感染进行治疗。其中，因舒巴坦对鲍曼不动杆菌具有抑菌作用，在临床上较为常用。但随着鲍曼不动杆菌耐药性的不断增强，舒巴坦在临床上的使用剂量不断增加，且耐药率也逐步增长，已无法满足临床治疗的需要。临床调查表明，目前MDR-AB对于替加环素与多粘菌素B/E的耐药率较低，尤其是多粘菌素被认为是应对MDR-AB的最后一道防线。多粘菌主要通过静电作用与菌体细胞脂膜结合，破坏细胞膜完整性，导致内容物外漏，从而对革蓝氏阴性菌具有高效、快速的杀菌作用(Neiva LB,BorgesFT,Watanabe M,et al.Nephrotoxicity of polymyxin B:experimental study in cellsand implications for nursing practice[J].Revista Da Escola De Enfermagem Da US P,2014,48(2):272-277)；但多粘菌素对人体的肾脏毒性以及神经毒性仍不可忽视。此外，有研究表明，当多粘菌素单独用于临床治疗时，易使菌株产生诱导性耐药。因此，当前亟待开发应对MDR-AB的新型抗菌治疗策略。
颗粒溶素(granulysin,GNLY)是一种存在于人体细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocytes,CTLs)与自然杀伤细胞(NK cell)胞浆颗粒中的细胞毒性蛋白，属于皂素样蛋白家族中的成员之一。人源颗粒溶素包括15kDa和9kDa两种分子。研究表明，颗粒溶素具有广谱抗菌活性，能够破坏细菌、真菌以及病原虫的细胞膜。最新的两项研究表明，杀伤性细胞(T细胞、NK细胞)通过Perforin将GNLY和Gzms运送到被感染的细胞内，GNLY在寄生菌或病原虫的细胞膜上形成通道，介导Gzms进入寄生菌或病原虫细胞内，通过中断菌体呼吸代谢过程中的电子传递链，导致活性态氧族(ROS)在胞内积累等多个途径杀死胞内寄生菌或病原虫。另有研究表明，GNLY可以通过TLR4活化未成熟DC细胞，诱导单核细胞向DC细胞分化，与招募免疫细胞，激活宿主固有免疫防御机制。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂的应用，本发明首次提出了颗粒溶素作为抗生素增效剂，增强抗生素的抑菌活性，增强多粘菌素对耐药鲍曼不动杆菌抑菌活性，从而减少多粘菌素使用剂量；通过本发明可为在临床上降低多粘菌素的使用剂量从而减少对人体肾脏、神经系统的毒性，以及阻碍MDR-AB对多粘菌素产生诱导性耐药提供新途径，同时为应对包括MDR-AB在内的多重耐药菌感染开辟新的治疗方法奠定理论基础。
本发明提出的一种颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂的应用。
优选地，颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂在制备抗耐药菌药物中的应用。
优选地，耐药菌为多重耐药菌。
优选地，多重耐药菌为多重耐药鲍曼不动杆菌。
优选地，多重耐药菌为临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌。
本领域的耐药菌的定义为：是指具有耐药性的病原菌。
多重耐药菌的定义为：是指有多重耐药性的病原菌。
多重耐药性的定义为：是指一种微生物对三类或三类以上抗生素同时耐药，而不是同一类三种。
优选地，多粘菌素类抗生素为多粘菌素、多粘菌素药用盐、主成分为多粘菌素或其药用盐的药物。
优选地，多粘菌素类抗生素为多粘菌素。
优选地，多粘菌素为多粘菌素A、多粘菌素B、多粘菌素C、多粘菌素D、多粘菌素E。
优选地，多粘菌素为多粘菌素B、多粘菌素E。
优选地，颗粒溶素与多粘菌素类抗生素的重量比为100：2-30。
优选地，颗粒溶素与多粘菌素类抗生素的重量比为100：13。
优选地，抗耐药菌药物的剂型为人或/和动物可以接受的药物剂型。
优选地，抗耐药菌药物的剂型包括：散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软膏剂、眼膏剂、凝胶剂、气雾剂、膜剂、口服液、滴眼剂、注射液或栓剂。
上述颗粒溶素可以从市场购得，也可以按照本领域常规方法制备得到。
本发明还提出了一种上述颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂的药物，其原料包括：颗粒溶素、多粘菌素类抗生素。
有益效果：
本发明创新性采用颗粒溶素GNLY与多粘菌素联用，对临床分离MDR-AB的体外与体内抑菌活性进行系统性评估；同时，对GNLY的抗生素增效剂作用和机制进行深入探讨。通过本发明可为在临床上降低多粘菌素的使用剂量从而减少对人体肾脏、神经系统的毒性，以及阻碍MDR-AB对多粘菌素产生诱导性耐药提供新途径，同时为应对包括MDR-AB在内的多重耐药菌感染开辟新的治疗方法奠定理论基础。
本发明首次提出了颗粒溶素作为抗生素增效剂，增强抗生素的抑菌活性，增强多粘菌素对耐药鲍曼不动杆菌抑菌活性，从而减少多粘菌素使用剂量；利用本发明提供的方法，使用颗粒溶素作为抗生素增效剂，可以将多粘菌素B与多粘菌素E对临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌的抑菌活性提高4-16倍。增效抑菌实验表明，颗粒溶素对多粘菌素B/E对临床分离35株耐药鲍曼不动杆菌的增效抑菌率分别为85.71％与94.29％。以小鼠为研究模型的急性毒理学实验结果表明，颗粒溶素未引起小鼠出现死亡、器官损伤等急性毒性反应。此外，基于小鼠表皮创伤感染模型的药效评价表明，当颗粒溶素的施药剂量为100μg/g，与1/2倍最小抗感染剂量多粘菌素B联用时，即可有效抑制耐药鲍曼不动杆菌在小鼠表皮创伤处的感染。本发明首次提出了颗粒溶素作为抗生素增效剂，增强抗菌素抑菌活性的策略。
附图说明
图1为GNLY增强多粘菌素B/E对MDR-AB菌体细胞膜的破坏作用图，其中，A为空白对照组，B为100μg/mL GNLY处理组，C为2μg/mL多粘菌素B处理组，D为2μg/mL多粘菌素B+100μg/mL GNLY处理组，E为2μg/mL多粘菌素E处理组，F为2μg/mL多粘菌素E+100μg/mL GNLY处理组。
图2为经静脉注射不同浓度GNLY对小鼠生长及组织器官影响结果图，其中，A为小鼠存活率，B为小鼠体重变化，C为小鼠血糖浓度，D为小鼠肺、心、肝、脾脏的HE染色组织切片。
图3为GNLY联合多粘菌B经腹腔注射对小鼠表皮创伤MDR-AB感染的治疗效果图。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例中所用的细菌、物料、仪器如下所示：
菌株：35株临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-AB)由安徽医科大学第一附属医院临床检验科提供。
培养基：MH肉汤培养基(即为Mueller-Hinton肉汤培养基)购于青岛海博生物技术有限公司。
实验动物：实验用Bab/c小白鼠购买于上海莱克斯实验动物有限公司，饲养于中国科学技术大学生命科学学院生物安全二级实验室。
主要试剂：抗生素：氨苄西林、青霉素G、阿莫西林、甲氧西林、头孢哌酮、头孢西丁、头孢唑啉钠、氨曲南、亚胺培南、卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素、链霉素、红霉素、罗红霉素、四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、诺氟沙星、环丙沙星、多粘菌素B、多粘菌素E购买于上海生物工程有限公司；Triton X-100，购买于美国陶氏化学公司。
主要设备仪器：紫外分光光度分析仪(Shmadzu，日本)，酶标仪(Bio Tek,美国)，流式细胞仪(Accuri，美国)，10mm动物实验用皮肤环钻取样器购买于北京天诺天诚生物科技有限公司。
实施例1
GNLY与不同抗生素联用对多重耐药菌的协同抑菌作用的检测
具体操作如下：
步骤1：用MH肉汤培养基将临床分离的四株MDR-AB菌液浓度均稀释至为105CFU/mL，分别置于96孔板内，采用棋盘法加入不同梯度浓度的抗生素溶液，置于37℃条件下培养过夜，经酶标仪在595nm波长条件下测定OD值，并设定三次重复实验，其中，临床分离的四株MDR-AB为MDR-AB 95804、MDR-AB 018007、MDR-AB 96434、MDR-AB 01977。以《美国临床和实验室标准协会(NCCLS)推荐手册》为依据评判测试菌株对不同抗菌素的耐药性；结果如表1。
表1不同抗生素对临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度
Figure BDA0002070129390000061
Figure BDA0002070129390000071
由表1所示，这四株MDR-AB对氨苄西林、头孢哌酮与亚胺培南等β-内酰胺类抗生素，庆大霉素、阿米卡星等氨基糖苷类抗生素，金霉素、强力霉素等四环素类抗生素以及大环内脂类抗生素如：红霉素、罗红霉素，氟喹诺酮类抗生素如：环丙沙星、诺氟沙星等均具有很强的耐药性；但这四株MDR-AB对多粘菌素B、多粘菌素E具有敏感与接近中介耐药性，MIC均在2-4μg/mL。
步骤2：以表1检测结果为依据，随机选择MDR-AB 95804与MDR-AB 01977为指示菌，分别检测GNLY增效不同抗生素对MDR-AB的抑菌作用，具体操作方法同步骤1，将抗生素溶液替换成抗生素+GNLY溶液，其中，GNLY分子量为9kDa；结果如表2、表3、表4。
表2 GNLY(9kDa)与不同抗生素对于多重耐药鲍曼不动杆菌的协同抑菌作用
Figure BDA0002070129390000072
Figure BDA0002070129390000081
由表2可见，GNLY可增效多粘菌素B、多粘菌素E对MDR-AB的抑菌作用，而对于其他抗生素则未检测出有效增效抑菌作用。
表3 GNLY(9kDa)与多粘菌素B对于多重耐药鲍曼不动杆菌的协同抑菌作用
Figure BDA0002070129390000082
注：上表中FIC指数为≤0.5、0.5-1、1-2、>2时，分别表示存在协同、相加、无关、拮抗抑菌作用。
由表3可见，100μg/mL GNLY可分别将多粘菌B对临床分离MDR-AB 95804与01977的抑菌作用增强8或16倍。
表4 GNLY(9kDa)与多粘菌素E对于多重耐药鲍曼不动杆菌的协同抑菌作用
Figure BDA0002070129390000083
注：上表中FIC指数为≤0.5、0.5-1、1-2、>2时，分别表示存在协同、相加、无关、拮抗抑菌作用。
由表4可见，100μg/mL GNLY可分别将多粘菌E对临床分离MDR-AB 95804与01977的抑菌作用增强4、8倍。
实施例2
流式细胞术检测
将选择的MD-RAB菌株分别接种于MH肉汤培养基内，37℃、180rpm条件下培养6-8h，OD600为0.6。将菌液置离于无菌离心管内，5000g离心5min，弃去上清，无菌PBS缓冲液(0.01M，pH 0.72)洗涤后5000g离心5min，将菌体收集后溶解PBS缓冲液，OD值调整至0.5；加入抗菌素设定100μg/mL GNLY处理组，2μg/mL多粘菌素B/E处理组，100μg/mL GNLY+2μg/mL多粘菌素B/E处理组，以及空白对照组。经反应120min后取样1mL，离心收集菌体并经PBS缓冲液洗涤后，加入PBS缓冲液复溶，并加入预先配制好的碘化丙啶溶液(PI)至终浓度为10mg/mL，置于暗处反应30min，离心并经PBS缓冲液洗涤后，加入PBS缓冲液复溶，使用流式细胞仪进行检测；检测结果如图1。
图1为GNLY增强多粘菌素B/E对MDR-AB菌体细胞膜的破坏作用图，其中，A为空白对照组，B为100μg/mL GNLY处理组，C为2μg/mL多粘菌素B处理组，D为2μg/mL多粘菌素B+100μg/mL GNLY处理组，E为2μg/mL多粘菌素E处理组，F为2μg/mL多粘菌素E+100μg/mL GNLY处理组。
由图1可见，MDR-AB菌体细胞经多粘菌素B(2μg/mL)、多粘菌素E(2μg/mL)作用120min，菌体细胞壁膜的损伤率分别达到59.26％与40.91％；经GNLY(100μg/mL)作用，仅有8.66％菌体细胞壁膜出现损伤。当GNLY与多粘菌素B、多粘菌素E联合作用于MDR-AB120min，可显著增强菌体细胞壁膜的损伤程度；经流式细胞仪测定，碘化丙啶对MDR-AB菌体细胞壁膜的通透率相比较于多粘菌素B、多粘菌素E单独作用时分别增加了26％与45％左右。结果表明，GNLY可显著增效多粘菌素B/E对MDR-AB菌体细胞壁膜的损伤作用。
实施例3
GNLY增效多粘菌素B/E对临床分离MDR-AB的抑菌测定
由安徽省医科大学第一附属医院提供35株临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌，按照实施例1中步骤1描述的方法检测GNLY增效多粘菌素B与多粘菌素E对临床分离MDR-AB的抑菌作用，以提高抗生素对指示菌的MIC倍数≥4时认为具有增效抑菌作用。结果如表5、表6、表7：
表5多粘菌素B/E对35株临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度
Figure BDA0002070129390000101
Figure BDA0002070129390000111
由表5所示，0088对多粘菌素B/E表现出耐药性、0039、0092以及96434对多粘菌素B/E具有中介耐药，0105对多粘菌素E中介耐药，018007与01977对多粘菌素B中介耐药；其他大部分菌株均为敏感株，多粘菌素B/E对这些菌株的MIC为1-2μg/mL。
以上述35株临床分离MDR-AB为指示菌，将100μg/mL GNLY分别与多粘菌素B/E联用，检测增效抑菌作用。结果如表6：
表6 GNLY增效多粘菌素B/E对35株临床分离MDR-AB的协同抑菌率
Figure BDA0002070129390000121
注：H表示抗生素增效倍数≥64；M表示抗生素增效倍数为16-32；L表示抗生素增效倍数为4-8。
由表6可见，GNLY对多粘菌素B/E对临床分离35株MDR-AB的增效抑菌率分别为85.71％与94.29％。其中，GNLY对多粘菌素B/E增效抑菌倍数为16-32的比例均为5.71％，增效抑菌倍数主要为4-8。
表7对35株临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌的药敏测试结果
Figure BDA0002070129390000122
Figure BDA0002070129390000131
注：敏感试验结果由安徽医科大学第一附属医院提供；N表示无法确定。
由表7可以看出，上述35株临床分离鲍曼不动杆菌均为多重耐药菌株。
实施例4
GNLY的急性毒性学试验
所有实验动物均按照中国科学技术大学生命科学学院实验动物中心动物饲养及使用委员会的规定进行饲养和使用；本课题相关动物实验批准号为：47USTCACUC1701021。所有饲养于生命科学学院生物安全二级实验室，小鼠饲养与密封通风笼盒里，室温25℃，湿度控制在40-70％，12小时(8am-8pm)光照交替，所有小鼠均不限制饮食，自由摄入标准固体颗粒维持饲料和无菌水(饲料与水均由实验动物中心提供)。
选择8-10周Bab/c雄性小白鼠，体重20-25g，按照每组5只进行编号分组，经尾端静脉注射不同浓度GNLY(0.2mg/kg、1mg/kg、5mg/kg和25mg/kg体重)与生理盐水(空白对照组)，24h后对小鼠的死亡率、体重、血糖浓度进行记录与检测。并处死小鼠，取实质性器官组织包括：肺、心、肝、脾制成组织切片，经苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining，HE)染色后，通过显微镜观察。结果如图2。
图2为经静脉注射不同浓度GNLY对小鼠生长及组织器官影响结果图，其中，A为小鼠存活率，B为小鼠体重变化，C为小鼠血糖浓度，D为小鼠肺、心、肝、脾脏的HE染色组织切片。
由图2A所示，小鼠经尾端静脉注射25mg/kg GNLY后连续观察11天，小鼠未出现死亡、病态等其他不良现象，且由图2B所示，小鼠体重未出现显著变化；由图2C所示，小鼠经尾端静脉注射不同浓度GNLY 24h后，小鼠静脉血血糖均未见显著变化；由图2D所示，组织切片显示，在高剂量组(≥5mg/kg)可引起肺、心、肝、脾局部出现轻微炎症反应，但随着GNLY浓度增加至25mg/kg时，未观察到炎症反应进一步加剧。由于小鼠自身不合成GNLY，这些器官出现轻度炎症反应可能是由于小鼠自身将GNLY视为外源抗原，产生相应的免疫反应导致，这些炎性细胞的出现是有益的免疫调节作用亦或是有害的炎性反应有待进一步探讨。
实施例5
GNLY增效多粘菌素B治疗小鼠表皮MDR-AB感染的探讨
选择8-10周Bab/c雄性小白鼠，体重20-25g，使用电动剃须刀刮去小鼠背毛，通过皮肤环钻取样器在小鼠背部取下局部皮肤，在创伤面涂抹50μL OD值为0.4的MDR-AB菌液构建小鼠表皮创伤MDR-AB感染模型，按照每组5只进行编号分组，经腹腔注射施药，设定100μg/g·Day GNLY处理组，13μg/g·Day多粘菌素B处理组，100μg/mL GNLY+13μg/g·Day多粘菌B处理组，以及阳性30μg/g·Day多粘菌素B治疗组、未治疗感染组与未感染阴性对照组。连续施药10天，每天2次，并拍照记录小鼠伤口感染变化情况。结果见图3。
图3为GNLY联合多粘菌B经腹腔注射对小鼠表皮创伤MDR-AB感染的治疗效果图。
由图3可见，通过构建小鼠表皮创伤MDR-AB感染模型，经腹腔注射施药途径进行抗感染治疗。其中，未感染组，0-10天，创面未见有炎症症状。未施药感染组、100μg/g.d GNLY与13μg/g.d多粘菌素B三个处理组，2-10天小鼠创面均出现显著的化脓感染现象。30μg/g.d多粘菌素B与13μg/g.d多粘菌素B+100μg/g.d GNLY两个施药组，在0-2天创面均未见感染症状；4-6天，两组均可见有轻度感染，且程度相近。但6-10天，30μg/g.d多粘菌素B施药组，感染症状消失，伤口趋于愈合。联合用药组，第6天，仍可见轻度感染。随之，8-10天，创面感染症状消失。由此可见，13μg/g.d多粘菌素B与100μg/g.d GNLY两个施药组，2-10天小鼠创面处均可见显著的感染化脓现象；而13μg/g.d多粘菌素B+100μg/g.d GNLY与之相比能够在一定程度上有效抑制感染化脓，且药效作用与30μg/g.d多粘菌素B施药组相近，显示出多粘菌素B与GNLY联用对鲍曼不动杆菌引起的皮肤创面感染具有协同抑制作用。
讨论
1.当前，全球范围内的多重耐药致病菌为传统医疗带来了前所未有的挑战。尤其以被合称为“ESKAPE”(E，肠球菌属；S，金黄色葡萄球菌；K，克雷伯菌属；A，鲍曼不动杆菌；P，铜绿假单胞菌；E，肠杆菌属)的这些菌株在临床上备受瞩目。时至今日，在临床上检出对所有可用抗生素均具耐药性的全耐药革蓝氏阴性菌已成现实。正如美国传染病学会所言，细菌耐药性已成为人类健康的首要威胁。面对现有抗菌素资源日益枯竭以及开发新型抗菌素进展缓慢的现状，发掘新型抗菌素增效剂成为维持抗菌素有效性，保护抗生素现有资源，延缓细菌产生耐药性的高效可行策略。当前，抗菌素增效剂的开发主要集中于β-内酰胺酶抑制剂、外排泵阻碍剂以及外膜渗透促进剂以及宿主免疫调节剂等研究方向。其中，β-内酰胺酶抑制剂已广泛应用临床，如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦、阿维巴坦等。GNLY作为一类参与人体免疫防御的重要活性多肽，在体内具有免疫调节与介导Gzms间接杀死胞内寄生菌或病原虫等生物活性功能。我们通过本发明的研究发现，GNLY在体外由于抗菌活性较弱，无法单独应用抑制细菌增殖，但GNLY可有效增强多粘菌素B/E对MDR-AB的抑菌能力。由此可见，GNLY具备可作为一类新型抗菌素增效剂的发掘潜能。
2.耐药菌株主要是通过：增强细胞膜上的泵出机制，将抗菌肽排到胞外，降低全球范围其在菌体内的富集浓度；分泌蛋白酶降解抗菌肽或者对抗菌肽进行酶解修饰，阻碍抗菌肽对作用靶点的识别；菌体自身通过对易受攻击靶点进行结构重排，增强药物耐受力或降低抗菌肽对其的亲和力与识别能力等机制实现耐药性。如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)通过合成一种特殊的对β-内酰胺类抗生素具有极低亲和力的青霉素结合蛋白(PBPs)，从而对该类药物产生耐药性。耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)菌株通过大量合成肽聚糖以及抑制肽聚糖自溶酶活性达到延缓肽聚糖更新两个途径，从而使细胞壁厚度增加，对万古霉素产生耐药性。另有研究表明，有些MRSA菌株能够通过增加细胞壁合成，对万古霉素产生耐药性。其中，细胞壁厚度增加是这些菌株最为显著的形态变化，平均厚度增加达到24nm(增长百分比为105％)。Hu等通过研究表明，金黄色葡萄球菌walK突变株MRSA V8通过降低细胞壁代谢相关基因以及自溶能力，增加细胞壁的厚度，从而减少了对万古霉素的敏感度。抗生素对于菌体的作用靶点包括：细胞壁、蛋白质合成过程以及DNA复制和修复过程等。如，青霉素和万古霉素主要通过阻断细胞壁合成过程中的肽基转移、糖基转移以及肽链交联过程发挥抑菌作用。抗菌肽一直被认为是一类能够抑制耐药菌爆发的新型抗菌剂来源。相关报道表明，Joseph Menousek等从抗菌肽数据库中筛选到一种新型的对MRSA具有抑制作用的抗菌肽DASamP1，在体外表现出对MRSA具有杀灭能力，在小鼠体内实验展示出抑制MRSA早期生物膜的形成。Deborah L.Higgins等探讨了脂糖肽替拉万星(Telavancin)对MRSA的抑菌机制，结果表明，其主要通过破坏菌体细胞壁合成以及细胞膜结构，导致胞内容物外泄等实现抑菌。在本发明研究中，通过流式细胞术测试结果可见，当GNLY与多粘菌素B/E联用时，表现出促进MDR-AB细胞壁膜通透性增大，发挥增效抑菌作用。表明，GNLY与抗菌素联用时主要以菌体细胞壁膜为作用靶点，通过增强对耐药菌细胞壁膜的损伤作用达到杀菌目的。
3.近些年来，一些用于验证具有伤口治愈效果的新型药物的试验用动物模型相继出现。通过建立这些带有创伤或感染的动物模型来模拟人体临床治疗过程。因此，在建立相应的动物模型的过程中，实验的动物的生理因素、对感染的反应以及感染自身的性质务必尽可能模拟真实的临床人体病理状态。在本课题研究中，选择Bab/c表皮与真皮层，取下1cm2皮肤组织，裸露皮下肌肉组织，确保伤口的面积与深度，使足够多的菌体细胞能够在创伤面上定殖。通常，对于鲍曼不动杆菌等革蓝氏阴性菌引起的局部皮肤轻度感染，可使用复方多粘菌素B软膏局部涂抹治疗。然而，一些鲍曼不动杆菌对这些药物以及其他常规的抗生素具有耐受能力，可导致伤口感染加重，延缓愈合。在本发明研究中发现，当GNLY与多粘菌素B/E联用时，体外与体内试验结果均表明，GNLY可增效多粘菌素B对MDR-AB的抑菌作用。出现这种情况，可能是由两方面原因导致；(1)多粘菌素B/E主要以菌体细胞壁膜为作用靶点，通过直接破坏致病菌细胞壁膜结构导致细菌死亡，作用过程直接快速。此外，多粘菌素B在小鼠体内代谢速度较慢，且MDR-AB在小鼠体表生长繁殖缓慢；因此，GNLY与多粘菌素B联用对MDR-AB更容易实现协同增效抑菌作用。(2)GNLY属于人源抗菌肽，在小鼠等啮齿类动物体内不表达，当GNLY进入小鼠体内，可能被免疫防御系统当作外源抗原蛋白，导致GNLY在小鼠体内的半衰期较短，不能长时间维持工作浓度，因此，以菌体细胞壁膜为共同作用靶点的GNLY与多粘菌素B在小鼠体内能够在相对较短的时间内杀伤病原菌。因此，GNLY可作为一种新型抗菌素增效剂用于临床上增强多粘菌菌素B对MDR-AB的抗感染抑菌作用具有极大的开发潜力。
结论
本发明研究初步确定了GNLY对抗菌素具有增效抑菌作用。研究结果表明，GNLY在体外可增效多粘菌素B/E对多重耐药鲍曼不动杆菌的抑菌活性，增强多粘菌素对MDR-AB菌体细胞壁膜的损伤程度，使菌体细胞壁膜通透性增大，导致菌体死亡。GNLY与多粘菌素B/E联用对35株临床分离MDR-AB的协同抑菌率分别达到85.71％与94.29％，表现出良好的抗生素抑菌增效功能。通过构建小鼠表皮感染模型，进一步对GNLY的体内增效抑菌功能进行探讨。结果表明，GNLY与多粘菌素B联用通过腹腔注射施药时，能够有效抑制MDR-AB在小鼠表皮创伤处引起的感染。GNLY可作为一种新型抗菌素增效剂用于临床上增强多粘菌菌素B对MDR-AB的抑菌作用，具有重要的开发价值与广阔的应用前景。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂的应用，其特征在于，颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂在制备抗耐药菌药物中的应用；所述颗粒溶素与多粘菌素类抗生素的重量比为100：2-30；所述耐药菌为临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌；所述多粘菌素类抗生素为多粘菌素B或多粘菌素E；所述应用为非治疗目的。
2.根据权利要求1所述颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂的应用，其特征在于，颗粒溶素与多粘菌素类抗生素的重量比为100：13。
3.根据权利要求1所述颗粒溶素作为多粘菌素类抗生素增效剂的应用，其特征在于，抗耐药菌药物的剂型为人或/和动物可以接受的药物剂型；抗耐药菌药物的剂型包括：散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软膏剂、凝胶剂、气雾剂、膜剂、口服液、滴眼剂、注射液或栓剂。
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