CN115869306B - Iowh-032用于制备抗革兰氏阳性细菌感染药物中的应用 - Google Patents
Iowh-032用于制备抗革兰氏阳性细菌感染药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了IOWH‑032用于制备抗革兰氏阳性细菌感染药物中的应用，所述IOWH‑032，CAS编号为1191252‑49‑9。本发明的技术方案公开了IOWH‑032的医药新用途，IOWH‑032对革兰氏阳性细菌具有强效抑制作用，可以抑制如金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌等细菌的生长和生物被膜的形成，而且表现出一定的杀革兰氏阳性细菌中金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的活性。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及IOWH-032用于制备抗革兰氏阳性细菌感染药物中的应用。
背景技术
革兰氏阳性细菌是最常见的致病菌之一，引起的感染性疾病给人类带来了较大的威胁，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)(以下简写为金黄色葡萄球菌)是临床上最常见的致病性革兰氏阳性菌之一，可引起局部软组织化脓性感染、肺炎、心内膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎等一系列疾病，严重者可导致菌血症、脓毒性休克等全身感染甚至死亡。根据最新2021年全国细菌耐药监测网(CARSS)监测报告，革兰阳性菌分离率排名第一位的是金黄色葡萄球菌，占革兰阳性菌32.6％，其次是屎肠球菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌；甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)全国平均检出率为29.4％。2022年发布的2021年CHINET中国细菌耐药监测结果也指出，细菌对抗菌药物的耐药形势日趋严重和普遍，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcusaureus，MRSA)对抗菌药的耐药率普遍高于MSSA(Methicillin-susceptibleStaphylococcus aureus)。抗生素耐药已经成为感染治疗效果差或治疗失败的重要原因之一。此外，生物被膜(Bacterial biofilm，BF)和持留菌(Persister)的形成均是造成细菌耐药、影响临床治疗的难点问题。细菌生物被膜是指细菌在繁殖分化的过程中，黏附于接触表面，并分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等物质，将自身包绕其中形成的一种具有大量微生物群体聚集的膜状结构，可在内部形成低氧环境有利于形成大量持留菌，帮助细菌抵抗抗生素并逃避免疫清除，成熟后可释放浮游菌开始新的生物被膜周期，进而造成反复的慢性感染导致抗感染疗效欠佳。持留菌(Persisters)是在抗生素或其他胁迫下常常采用休眠策略以抵抗药物的杀灭作用，所占比例极低(一般不到0.1％)的一类特殊亚群，缺乏杀灭持留菌活性是多种强效抗菌药物抗感染治疗疗效欠佳的重要原因。细菌耐药、生物被膜和持留菌的形成不仅会导致感染时间持续延长，还会导致抗生素用量增加，甚至抗感染治疗失败，最终导致患者死亡风险升高。因此，寻找既能克服耐药、又能杀灭持留菌及抑制或清除生物被膜的新型抗菌药物，已成为当前临床的紧迫需求及研究热点。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了IOWH-032用于制备抗革兰氏阳性细菌感染药物中的应用，IOWH-032具有高效的抗革兰氏阳性细菌生长和抗生物被膜的活性，并且可能靶向某些关键蛋白发挥抗菌活性。
对此，本发明采用的技术方案为：
IOWH-032用于制备抗革兰氏阳性细菌感染药物中的应用，所述IOWH-032，CAS编号为1191252-49-9。
其中，所述IOWH-032的结构式如式(1)所示：
IOWH-032是一种有效的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)抑制剂。CFTR是一种存在于脊椎动物中的膜蛋白，由CTFR基因编码，可以指导氯化物和硫氰酸穿过上皮细胞膜。Pubmed数据库中，IOWH-032研究报道较少，2011年研究报道其作为抗分泌药物可以治疗感染性腹泻。另外，有报道表明IOWH-032可能潜在地作为开发治疗囊性纤维化的新药的先导化合物。2021年开展了一项2a期随机、单中心、双盲、安慰剂对照研究在可控的人感染模型中评价口服IOWH-032抗霍乱腹泻的安全性和初步疗效。2022年，最新发表的一篇文章表明IOWH-032抑制CFTR，进而导致新冠病毒复制减少。但是，至今未见在抗革兰氏阳性细菌效果方面的报道。
经过大量的实验研究，证实IOWH-032具有强效抑制革兰氏阳性细菌生长的效果，特别是针对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌等革兰氏阳性细菌。而且对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的生物被膜具有明显的抑制作用。进一步的，对IOWH-032的作用靶位进行了初步探究，使用三株金黄色葡萄球菌YuSA145(MRSA)、CHS101(MSSA)、SA113(MSSA)分别用IOWH-032处理16h，进行蛋白质组分析，发现在三株菌的前二十多个具有显著性差异且表达水平改变倍数较高的蛋白中，均发现了4个候选的上调蛋白基因(SceD)和下调蛋白基因(hld、lip2、sbi)，揭示了IOWH-032的部分作用机制，IOWH-032具有高效的抗菌和抗生物被膜活性，并且可能靶向某些关键蛋白发挥抗菌活性。
作为本发明的进一步改进，所述革兰氏阳性细菌为金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、表皮葡萄球菌或肺炎链球菌中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，所述IOWH-032在处理体系中的浓度为不小于1.7μg/ml。进一步的，所述IOWH-032在处理体系中的浓度为1.7-13.6μg/ml。进一步的，针对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，所述IOWH-032在处理体系中的浓度为1.7-6.8μg/ml。针对粪肠球菌，所述IOWH-032在处理体系中的浓度为1.7-13.6μg/ml。
本发明还公开了一种治疗或预防革兰氏阳性细菌感染的药物，其包含IOWH-032。
作为本发明的进一步改进，所述药物为药物组合物或制剂。进一步的，所述药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、颗粒剂、喷剂或乳剂。
本发明还公开了一种抗菌剂，包含IOWH-032，所述IOWH-032的CAS编号为1191252-49-9，结构式如式(1)所示。采用此技术方案，该抗菌剂可以对革兰氏阳性细菌具有良好的抑菌或杀菌作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的技术方案公开了IOWH-032的医药新用途，IOWH-032对革兰氏阳性细菌具有强效抑制作用，可以抑制如金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌等细菌的生长和生物被膜的形成，而且表现出一定的杀革兰氏阳性细菌中金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的活性。其中对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitconcentration,MIC)范围为6.25-12.5μM(3.4-6.8μg/ml)，粪肠球菌为6.25-25μM；而且，IOWH-032能够在3.125及6.25μM浓度下显著性地抑制金黄色葡萄球菌、粪肠球菌生物被膜的形成，甚至对于个别菌株1.56μM浓度可以显著抑制部分金黄色葡萄球菌和粪肠球菌生物被膜的形成；此外，4倍MIC或8倍MIC的IOWH-032能够显著性地杀灭半数甚至是近3/4的细菌。IOWH-032能克服耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药问题，并能杀灭持留菌及抑制或清除生物被膜，有望成为高效、广谱的新型抗菌剂。
附图说明
图1是本发明实施例IOWH-032对金黄色葡萄球菌的生长抑制作用结果图；其中A-C、E-I分别为CHS101、CHS736、SA113、YuSA126、YuSA139、YuSA145、YuSA75、USA300金黄色葡萄球菌的生长曲线。N＝3。数据以Mean±SEM表示。
图2是本发明实施例IOWH-032对粪肠球菌的生长抑制作用结果图；其中A-C、E、F分别为EF16C47、EF16C51、EF16C166、OG1RF、EF16C152粪肠球菌的生长曲线。数据以Mean±SEM表示。
图3是本发明实施例的IOWH-032抑制粪金黄色葡萄球菌生物被膜形成的实验结果图；其中，A为37℃静置培养24h后测定的不同浓度IOWH-032处理后8株MRSA的OD600值，B为不同浓度IOWH-032处理后8株MSSA的OD600值，C为吸去甲醇稍微干燥后加入100μl 1％结晶紫染色15min，洗去结晶紫，烘干后检测的不同浓度IOWH-032处理后8株MRSA形成的生物被膜OD570值，D为吸去甲醇稍微干燥后加入100μl 1％结晶紫染色15min，洗去结晶紫，烘干后检测的8株MSSA的OD570值。N＝3，数据以Mean±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，#P<0.0001。
图4是本发明实施例的IOWH-032抑制粪肠球菌生物被膜形成的实验结果图；其中，A为37℃静置培养24h后测定的不同浓度IOWH-032处理后粪肠球菌的OD600值，B为不同浓度IOWH-032处理后粪肠球菌的1％结晶紫染色后的OD570值。。N＝3，数据以Mean±SEM表示。#P<0.0001。
图5是本发明实施例的不同浓度的IOWH-032对金黄色葡萄球菌的杀菌效果结果图；其中A为YUSA145菌落计数结果，B为CHS101菌落计数结果。
图6是本发明实施例的IOWH-032处理三株金黄色葡萄球菌后的差异蛋白分析结果图；其中A为IOWH-032处理后的CHS101中的蛋白表达水平；B为IOWH-032处理后的YuSA145中的蛋白表达水平；C为IOWH-032处理后的SA113中的蛋白表达水平。
图7是本发明实施例的IOWH-032药物安全性实验结果图；其中A为溶血状况图，B为溶血率。
具体实施方式
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1
采用常规方法研究IOWH-032对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌的最低抑制浓度MIC，结果如表1所示。
表1IOWH-032对多种细菌的MIC
表1中，A为IOWH-032抗金黄色葡萄球菌MIC；B为IOWH-032表皮葡萄球菌；C为IOWH-032粪肠球菌；D为IOWH-032对各菌株MIC情况统计表。
从上述表1的结果可见，IOWH-032对多种革兰氏阳性细菌具有比较好的抑制活性，证实IOWH-032具有强效抑制金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌生长的效果，对12株MRSA、12株MSSA以及表皮葡萄球菌的最小抑菌浓度MIC范围为6.25-12.5μM(3.4-6.8μg/ml)；对粪肠球菌为6.25-25μM；对表葡和敲除株为3.125-12.5μM。
对比例1
IOWH-032主要包含了恶二唑及苯氧基苯基结构，本对比例采用几个包含苯氧基苯基的药物Tirabrutinib、L-Thyroxine、Permethrin以及包含恶二唑结构的药物IACS-010759、Avagacestat、Ozanimod、Oxolamine citrate，按照实施例1的方法进行抗菌活性对比实验，结果如表2所示，通过表1和表2的对比可见，对比例的含有苯氧基苯基和恶二唑结构的药物几乎都不具有抑制金黄色葡萄球菌、粪肠球菌生长的效果，只有一个药物Ozanimod对金葡菌和粪肠球菌的最小抑制浓度为25-50μM，虽然具有一定的抑制效果，但抑制效果较差。而实施例1的IOWH-032的对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌生长的具有更好的强效抑制效果。
表2
实施例2
IOWH-032对金黄色葡萄球菌的生长影响实验。
为了验证IOWH-032是否能够抑制金黄色葡萄球菌生长，我们使用不同浓度的IOWH-032处理金黄色葡萄球菌，在不同时间点检测其OD值。具体步骤为：将过夜培养的金黄色葡萄球菌CHS101、CHS736、SA113、YuSA126、YuSA139、YuSA145、YuSA75、USA300过夜培养，将过夜培养的菌液按1:200或1:500稀释加入到特制蜂窝状100孔板中，再将IOWH-032药物分别稀释至一定浓度，等体积加入到孔板中，将孔板放入生长曲线分析仪，连续测定OD600吸光度24h，根据测量值绘制各菌株的生长曲线。N＝3。数据以Mean±SEM表示。结果如图1所示，IOWH-032能够在12.5μM完全抑制金黄色葡萄球菌生长(USA300未设置12.5μM浓度)，在6.25μM浓度下，早期显示了一部分抑制效果。可见，IOWH-032可以高效抑制金黄色葡萄球菌的生长。
实施例3
IOWH-032对粪肠球菌的生长影响实验。
为了验证IOWH-032是否能够抑制粪肠球菌生长，我们使用不同浓度的IOWH-032处理金黄色葡萄球菌，在不同时间点检测其OD值。具体步骤包括：将粪肠球菌EF16C47、EF16C51、EF16C166、OG1RF、EF16C152过夜培养，将过夜培养的菌液按1:500稀释加入到特制蜂窝状100孔板中，再将IOWH-032药物按照已测定的MIC值分别稀释至一定浓度，等体积加入到孔板中，将孔板放入生长曲线分析仪，连续测定OD600吸光度24h，根据测量值绘制各菌株的生长曲线。N＝3。数据以Mean±SEM表示。结果如图2所示，对于OG1RF、EF16C152菌株，IOWH-032能够在12.5μM完全抑制金黄色葡萄球菌生长；对于EF16C166菌株，12.5μM具有显著抑制细菌生长的作用；在6.25μM亚抑菌浓度下，IOWH-032显著抑制了EF16C47以及EF16C51的生长。可见，IOWH-032可以高效抑制粪肠球菌的生长。
实施例4
IOWH-032对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响实验。
生物被膜形成是抗感染治疗的一个难点，因此，评估药物的有效性必须要监测其抑制生物被膜的能力。我们使用不同浓度的IOWH-032处理金黄色葡萄球菌24h后，测定OD600，检测细菌生长状态，固定后，使用结晶紫染色，干燥后测定OD570，检测生物被膜生成。具体步骤包括：将过夜培养的8株MRSA和8株MSSA菌株用TSBG1:100稀释后加入96孔板中，再加入稀释一定倍数的IOWH-032 100μl，设置空白对照组；37℃静置培养24h后分别测定不同浓度IOWH-032处理后8株MRSA的OD600值和8株MSSA的OD600值；吸去上清，100μl无菌水洗三次，洗去浮游菌；干燥，再用100μl甲醇固定15min；吸去甲醇稍微干燥后加入100μl1％结晶紫染色15min，洗去结晶紫，烘干后检测分别检测不同浓度IOWH-032处理后8株MRSA形成的生物被膜OD570值和8株MSSA的OD570值。N＝3，数据以Mean±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，#P<0.0001。结果如图3所示，IOWH-032能够在3.125及6.25μM浓度下显著性地抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成，甚至对于个别菌株1.56μM浓度可以显著抑制部分金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。可见，IOWH-032可以高效抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。
实施例5
IOWH-032对粪肠球菌生物被膜形成的影响实验。
为了检测IOWH-032是否能抑制粪肠球菌生物被膜的形成，我们使用粪肠球菌做了同样的生物被我抑制实验。具体步骤包括：将过夜培养的10株粪肠球菌用TSBG1:100稀释后加入96孔板中，再加入稀释一定倍数的IOWH-032 100μl，设置空白对照组；37℃静置培养24h后分别测定不同浓度IOWH-032处理后粪肠球菌的OD600值和1％结晶紫染色后的OD570值。N＝3，数据以Mean±SEM表示。#P<0.0001。结果如图4所示，IOWH-032依然能够在3.125及6.25μM浓度下显著性地抑制粪肠球菌的生物被膜，甚至对于个别菌株1.56μM浓度可以显著抑制部分金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。这提示，IOWH-032可能对其他革兰氏阳性细菌同样有效，具有成为广谱抗菌药物的潜力。可见，IOWH-032可以高效抑制粪肠球菌生物被膜的形成。
实施例6
IOWH-032对金黄色葡萄球菌的杀菌活性实验。
为了了解IOWH-032对金黄色葡萄球菌的杀菌活性，将过夜培养的菌液加入4xMIC和8×MIC浓度的IOWH-032。在37℃、220rpm摇床培养并且分别于3h、6h、12h、24h吸取1mL菌液，用无菌生理盐水梯度稀释并涂布于TSB平板进行YUSA145(A)以及CHS101(B)菌落计数。结果如图5所示，在4×MIC的浓度下，可以显著杀灭近半数细菌，在8倍MIC浓度下，针对MRSAYuSA145可杀灭近3/4的细菌，而对MSSA CH101和4×MIC的杀菌效果没有差别。可见，OWH-032对金黄色葡萄球菌具有杀菌活性。
实施例7
IOWH-032对金黄色葡萄球菌的蛋白质组学靶点分析实验。
为了初步筛选IOWH-032可能的靶点，使用IOWH-032同时处理三株金黄色葡萄球菌。6.25μM IOWH-032处理三株金黄色葡萄球菌16h小时后，收集菌体，裂解，提取蛋白，使用高分辨质谱仪分析蛋白表达水平。结果如图6所示，发现大约有两百个左右的显著差异的蛋白，而前二十个左右的具有高表达倍数的差异蛋白中，分别找出一个上调蛋白的基因SceD，以及三个下调蛋白的基因hld、sbi、lip2,结果揭示这些基因在调控IOWH-032的抗菌活性过程中占有重要作用，可能是相关信号通路中的关键蛋白基因和靶点。
实施例8
IOWH-032的安全性实验。
为了检测IOWH-032的药物毒性，我们使用溶血实验进行检测，具体为：使用不同浓度的IOWH-032加入到含有血细胞的PBS中，37℃孵育1h，离心，取上清，OD540nm处测吸光度。2％的Triton X-100作为阳性对照，PBS为阴性对照。计算溶血率：实验组-阴性对照组/阳性对照组-阴性对照组*100％。结果如图7所示，在50μM浓度下，IOWH-032不造成溶血，在100μM只有微弱的溶血，可见IOWH-032药物安全性较高。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1. IOWH-032用于制备抗革兰氏阳性细菌感染药物中的应用，其特征在于：所述IOWH-032，CAS编号为1191252-49-9，所述抗革兰氏阳性细菌感染为抑制金黄色葡萄球菌、抑制粪肠球菌、抑制表皮葡萄球菌、杀灭金黄色葡萄球菌、抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成、抑制粪肠球菌生物被膜形成中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的IOWH-032用于制备抗革兰氏阳性细菌感染药物中的应用，其特征在于：所述IOWH-032在处理体系中的浓度为不小于1.7μg/ml。
3.根据权利要求2所述的IOWH-032用于制备抗革兰氏阳性细菌感染药物中的应用，其特征在于：所述药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、颗粒剂、喷剂或乳剂。
4. IOWH-032用于制备抗革兰氏阳性菌抗菌剂的应用，其特征在于：所述IOWH-032的CAS编号为1191252-49-9，所述抗革兰氏阳性细菌为抑制金黄色葡萄球菌、抑制粪肠球菌、抑制表皮葡萄球菌、杀灭金黄色葡萄球菌、抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成、抑制粪肠球菌生物被膜形成中的一种或多种。
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