CN114259485A - 苯溴马隆用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种苯溴马隆用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染的用途，用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染。本发明的技术方案公开了苯溴马隆的一种新用途，对金黄色葡萄球菌及其生物被摸具有抑菌和杀菌能力；亚抑菌浓度下的苯溴马隆可显著抑制金黄色葡萄球菌的生长和生物被膜形成；大于等于2倍最低抑菌浓度可清除金黄色葡萄球菌形成的生物被膜，并有效杀灭生物被膜中的金黄色葡萄球菌，亚抑菌浓度抑制金黄色葡萄球菌对红细胞的溶血活性。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及苯溴马隆用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染的用途。
背景技术
金黄色葡萄球菌，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-ResistantStaphylococcus aureus,MRSA)已经成为全球医院和社区获得性感染的主要致病菌，可引发如心内膜炎、骨髓炎、坏死性肺炎和败血症等严重致死性感染。由于MRSA对多种抗菌药物耐药，临床上常使用万古霉素和利奈唑胺作为治疗MRSA严重感染的有效药物，尽管近年来也有对MRSA有效的达托霉素和达巴万星应用于临床，但是随着MRSA不断突变以及获得新的耐药基因，些药物在临床应用后不久就出现耐药株。随着这些抗菌药物使用的越来越多，不久的将来耐药株会不断增多。
此外，金黄色葡萄球菌还可形成生物被膜(是细菌粘附于接触表面，分泌多种胞外基质等，将其自身包绕其中而形成的细菌群体)辅助细菌抵御抗生素，生物被膜形成会导致感染持续时间延长，是感染治疗失败的重要因素之一，然而当前临床使用的一线抗菌药物对生物被膜效果均不理想，导致该类感染相关的患者死亡风险升高。金黄色葡萄球菌的耐药和生物被膜形成给临床治疗造成极大的困难，因此寻找能够快速杀菌并清除生物被膜的新型抗金黄色葡萄球菌药物已经成为研究的热点方向。
苯溴马隆又名溴苯酰苯呋喃、苯溴酮或苯溴香豆素。是一种苯并呋喃衍生物，其能加快机体尿酸的排泄，具有抑制肾小管对尿酸的重吸收，从而降低机体尿酸水平，进而有效治疗痛风。它不仅缓解疼痛，减轻红肿，还能使痛风结节消散。主要用于慢性痛风的治疗。也可用于各种原因引起的继发性高尿酸血症，原发性高尿酸血症，但从未被使用于抗菌。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了苯溴马隆用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染的用途，可以用于治疗金黄色葡萄球菌浮游菌和金黄色葡萄球菌形成生物被膜以及分泌溶血素感染，该用途为苯溴马隆的一种新用途。
对此，本发明采用的技术方案为：
苯溴马隆用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染的用途，用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染。
目前，苯溴马隆是作为抑制肾小管对尿酸的重吸收，从而降低机体尿酸的药物，一般用于治疗高尿酸或痛风药物用。经过研究发现，苯溴马隆还具有治疗金黄色葡萄球菌感染和金黄色葡萄球菌形成生物被膜感染的用途，将苯溴马隆可以用于治疗金黄色葡萄球菌感染和金黄色葡萄球菌形成生物被膜感染的药物中，对金黄色葡萄球菌具有抑菌和杀菌作用；在亚抑菌浓度下，苯溴马隆可显著抑制金黄色葡萄球菌的生长和生物被膜形成；大于等于4倍最低抑菌浓度可清除金黄色葡萄球菌形成的生物被膜，并有效杀灭生物被膜中的金黄色葡萄球菌，亚抑菌浓度抑制金黄色葡萄球菌对红细胞的溶血活性。
作为本发明的进一步改进，所述苯溴马隆的浓度为不小于2μg/mL。该浓度为亚抑菌浓度抑制金黄色葡萄球菌生长的有效浓度。
作为本发明的进一步改进，所述苯溴马隆的浓度为不小于16μg/mL。该浓度为对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)的有效浓度范围，在此浓度要求下，可以起到抑制金黄色葡萄球菌的生长。
作为本发明的进一步改进，所述苯溴马隆的浓度为不小于64μg/mL。该浓度为最低杀菌浓度浓度有效浓度范围，在此浓度要求下，可以起到对金黄色葡萄球菌的杀菌作用。
进一步的，所述苯溴马隆的浓度为32-256μg/mL，在该有效浓度范围，可以清除金黄色葡萄球菌已形成生物被膜。
进一步的，所述苯溴马隆的浓度为0.5-16μg/mL，在该有效浓度范围，可以抑制金黄色葡萄球菌形成生物被膜。
进一步的，所述苯溴马隆的浓度为4-16μg/mL，在该有效浓度范围，可以抑制金黄色葡萄球菌对红细胞的溶血活性。
本发明还公开了苯溴马隆用于制备抗金黄色葡萄球菌活性药物中的应用，所述苯溴马隆的浓度为不小于2μg/mL。具体而言，所述抗金黄色葡萄球菌活性包括治疗金黄色葡萄球菌浮游菌和金黄色葡萄球菌形成生物被膜以及分泌溶血素感染。采用此技术方案，在不同浓度范围，苯溴马隆可以用作治疗金黄色葡萄球菌浮游菌和金黄色葡萄球菌形成生物被膜以及分泌溶血素感染药物。进一步的，该药物的形式可以是颗粒、片剂或针剂。
作为本发明的进一步改进，所述苯溴马隆的浓度为不小于16μg/mL。
作为本发明的进一步改进，所述苯溴马隆的浓度为不小于64μg/mL。
作为本发明的进一步改进，所述苯溴马隆的浓度为32-256μg/mL。此浓度范围可以清除金黄色葡萄球菌已形成生物被膜。
作为本发明的进一步改进，所述苯溴马隆的浓度为0.5-16μg/mL。此浓度范围可以抑制金黄色葡萄球菌形成生物被膜。
作为本发明的进一步改进，所述苯溴马隆的浓度为4-16μg/mL。此浓度范围可以抑制金黄色葡萄球菌对红细胞的溶血活性。
本发明还公开了一种抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染的药物组合物，所述药物组合物包括苯溴马隆。
本发明还公开了一种治疗金黄色葡萄球菌分泌溶血素感染的药物组合物，所述药物组合物包括苯溴马隆。
经过实验发现，苯溴马隆对金黄色葡萄球菌具有抑菌和杀菌能力(最低抑菌浓度和最低杀菌浓度)；亚抑菌浓度下的苯溴马隆可显著抑制金黄色葡萄球菌的生长和生物被膜形成；大于等于2倍最低抑菌浓度可清除金黄色葡萄球菌形成的生物被膜，并有效杀灭生物被膜中的金黄色葡萄球菌，亚抑菌浓度抑制金黄色葡萄球菌对红细胞的溶血活性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的技术方案公开了苯溴马隆的一种新用途，对金黄色葡萄球菌及其生物被摸具有抑菌和杀菌能力(最低抑菌浓度和最低杀菌浓度)；亚抑菌浓度下的苯溴马隆可显著抑制金黄色葡萄球菌的生长和生物被膜形成；大于等于2倍最低抑菌浓度可清除金黄色葡萄球菌形成的生物被膜，并有效杀灭生物被膜中的金黄色葡萄球菌，亚抑菌浓度抑制金黄色葡萄球菌对红细胞的溶血活性。苯溴马隆可以用于治疗金黄色葡萄球菌感染和金黄色葡萄球菌形成生物被膜以及分泌溶血素感染的药物。
附图说明
图1是本发明实施例的亚抑菌浓度的苯溴马隆抑制4株MSSA形成生物被膜的结果分析图。与对照组比较：*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001(Student’s t test)。
图2是本发明实施例的亚抑菌浓度的苯溴马隆抑制另外4株MRSA形成生物被膜。与对照组比较：*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001(Student’s t test)。
图3是本发明实施例的不同浓度的苯溴马隆清除4株MSSA已形成的生物被膜的结果分析图。与0×MIC组比较：*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001(Student’s t test)。
图4是本发明实施例的不同浓度的苯溴马隆清除另外4株MRSA已形成的生物被膜的结果分析图。与0×MIC组比较：*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001(Student’s t test)。
图5是本发明实施例的苯溴马隆杀灭1株MSSA和1株MRSA生物被膜中的活菌的结果分析图。与对照组比较：**,P<0.01；***,P<0.001(Student’s t test)。
图6是本发明实施例的苯溴马隆抑制3株MRSA和7株MSSA对红细胞的溶血活性的结果分析图。与对照组比较：**,P<0.01；***,P<0.001(Student’s t test)。
具体实施方式
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
苯溴马隆用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染的用途，其用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染。下面分别从各个实验进行验证。
实施例1
最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)检测：
最低抑菌浓度(MIC)采用微量肉汤稀释法进行，以ATCC29213为质控株，按照CLSI-M100-S27版进行操作。同时以万古霉素、利奈唑胺、氨苄西林和苯溴马隆作为对比例，结果如下表1所示，可见苯溴马隆对25株临床分离金黄色葡萄球菌株(包含甲氧西林敏感株MSSA和耐甲氧西林株MRSA)具有抑菌和杀菌作用，其MIC为16mg/L。
表1苯溴马隆对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度
实施例2
本实施例为检测亚抑菌浓度的苯溴马隆对抑制金黄色葡萄球菌形成生物被膜的实验，具体方法包括：
金黄色葡萄球甲氧西林敏感菌株(MSSA)CHS100、CHS151、CHS160和CHS46以及甲氧西林耐药菌株(MRSA)CHS823、CHS733、CHS736和CHS727菌株在TSB培养基中37℃，220rpm/min摇菌过夜培养10-12h。用TSBG培养基(TSB培养基+0.5％葡萄糖)将菌液1:200稀释(含或不含治疗菌药物)，每孔200ul加入96孔板(Costar3599)，每株菌设3复孔，37℃静置培养24h。弃去上清，PBS洗脱3次(200ul/孔/次)，室温下干燥后加入甲醇固定15min(200ul/孔)，弃去甲醇室温下干燥后每孔加入0.5％结晶紫染液100ul，室温下染色10min，清水下轻柔洗脱结晶紫染液直至流水无色，室温下干燥后在酶标仪上读取OD570值。上述实验操作独立重复3次，数据表示为均数±标准差(mean±SD)。
实验结果如图1和图2所示，可见，苯溴马隆在1/32×MIC(0.5mg/L)浓度下可显著抑制4株MSSA(CHS100、CHS151、CHS160和CHS46)和4株MRSA(CHS823、CHS733、CHS736和CHS727)金黄色葡萄球菌形成生物被膜。
实施例3
本实施例验证苯溴马隆有效清除金黄色葡萄球菌已形成的生物被膜的实验。
金黄色葡萄球菌甲氧西林敏感菌株(MSSA)CHS100、CHS151、CHS160和CHS46以及甲氧西林耐药菌株(MRSA)CHS823、CHS733、CHS736和CHS727在TSB培养基中37℃，220rpm/min摇菌过夜培养10-12h。用TSBG培养基(TSB培养基+0.5％葡萄糖)将菌液1:200稀释，每孔200ul加入96孔板(Costar 3599)，每株菌设3复孔，37℃静置培养24h形成成熟的生物被膜。弃去上清，无菌生理盐水洗脱3次(200ul/孔/次)，随后加入新鲜的TSBG培养基(含不同浓度的苯溴马隆)，静置培养48h(每24h更换1次新的培养基)后，弃去上清，PBS洗脱3次(200ul/孔/次)，室温下干燥后加入甲醇固定15min(200ul/孔)，弃去甲醇室温下干燥后每孔加入0.5％结晶紫染液100ul，室温下染色10min，清水下轻柔洗脱结晶紫染液直至流水无色，室温下干燥后在酶标仪上读取OD570值。上述实验操作独立重复3次，数据表示为均数±标准差(mean±SD)。
实验结果如图3和图4所示，苯溴马隆的浓度在2×MIC(32mg/L)、4×MIC(64mg/L)、8×MIC(128mg/L)和16×MIC(256mg/L)，可显著清4株MSSA(CHS100、CHS151、CHS160和CHS46)和4株MRSA(CHS823、CHS733、CHS736和CHS727)生物被膜的清除作用，并发现在2-16×MIC(32-256mg/L)浓度下可对这8株金黄色葡萄球菌的生物被膜具有清除作用。
实施例4
本实施例为检测苯溴马隆杀灭生物被膜中的金黄色葡萄球菌的实验。
金黄色葡萄球甲氧西林敏感菌株(MSSA)CHS160以及甲氧西林耐药菌株(MRSA)CHS823菌株在TSB培养基中37℃，220rpm/min摇菌过夜培养10-12h。用TSBG培养基(TSB培养基+0.5％葡萄糖)将菌液1:200稀释，每孔2ml加入24孔板(Costar 3524)，每株菌设3复孔，37℃静置培养24h形成成熟的生物被膜。弃去上清，无菌生理盐水洗脱3次(200ul/孔/次)，随后加入新鲜的TSBG培养基(含4、8、16xMIC浓度的苯溴马隆/溴苯酰苯呋喃/苯溴酮/苯溴香豆素或者不含药物)，静置培养48h(每24h更换1次新的培养基)。弃去上清，无菌生理盐水洗脱3次，加入胰酶消化后将孔底的生物被膜重悬于1ml生理盐水中，随后10倍比稀释之后取100ul涂布在TSA平板上进行cfu计数。上述实验操作独立重复3次，数据表示为均数±标准差(mean±SD)。
结果如图5所示，可见苯溴马隆在4和16×MIC(mg/L)浓度下可杀灭2株MSSA(MSSA)CHS160和(MRSA)CHS823生物被膜中的活菌。
实施例5
本实施例为苯溴马隆检测抑制金黄色葡萄球菌培养基上对红细胞的溶血活性的实验。
金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药菌株(MRSA)USA300、YUSA145、YUSA218以及金黄色葡萄球甲氧西林敏感菌株(MSSA)ATCC29213、SA13、SA8、SA27、CHS350、YUSA135、YUSA134，以上菌株在TSB中37℃，220rpm/min过夜培养，然后1：200接种至新鲜的含有苯溴马隆(0、1/4、1/2×MIC)的TSB中37℃，220rpm/min摇菌过夜，12000rpm离心取上清，1％兔血红细胞一比一混合放置于37℃培养箱孵育30分钟，2000rpm离心10分钟，1％Tritten作为阳性对照，PBS作为阴性对照，离心后取上清铺于聚乙烯96孔板，使用酶标仪测量OD540，使用溶血率计算公式计算数值：
溶血率(％)＝(样本的OD540－阴性对照的OD540)/(阳性对照的OD540－阴性对照的OD540)。
结果如图6所示，可见亚抑菌浓度1/4、1/2×MIC的苯溴马隆可以显著抑制金黄色葡萄球菌对红细胞的溶血活性。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.苯溴马隆用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染的用途，其特征在于：用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染。
2.根据权利要求1所述的苯溴马隆用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染的用途，其特征在于：所述苯溴马隆的浓度为不小于2μg/mL。
3.根据权利要求2所述的苯溴马隆用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染的用途，其特征在于：所述苯溴马隆的浓度为不小于16μg/mL。
4.根据权利要求3所述的苯溴马隆用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染的用途，其特征在于：所述苯溴马隆的浓度为不小于64μg/mL。
5.苯溴马隆用于制备抗金黄色葡萄球菌活性药物中的应用，其特征在于：所述苯溴马隆的浓度为不小于2μg/mL。
6.根据权利要求5所述的苯溴马隆用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染药物中的应用，其特征在于：所述苯溴马隆的浓度为不小于16μg/mL。
7.根据权利要求6所述的苯溴马隆用于抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染药物中的应用，其特征在于：所述苯溴马隆的浓度为不小于64μg/mL。
8.一种抗金黄色葡萄球菌及其生物被膜感染的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括苯溴马隆。
9.一种治疗金黄色葡萄球菌分泌溶血素感染的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括述苯溴马隆。
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