CN109820835B - 复合型胞内金黄色葡萄球菌抗菌制剂及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种复合型胞内金黄色葡萄球菌抗菌制剂及其制备和应用。所述抗菌制剂包括载体细菌承载噬菌体的复合物，所述载体细菌为金黄色葡萄球菌，所述噬菌体为金黄色葡萄球菌烈性噬菌体。优选所述载体细菌为金黄色葡萄球菌SH‑5，所述噬菌体为噬菌体SLPW。所述抗菌制剂的制备方法，包括如下步骤：S1、噬菌体的纯化；S2、用载体细菌吸附噬菌体后，得到载体细菌承载噬菌体的复合物。本发明的复合型胞内抗菌制剂能够进入皮肤角质细胞内部，高效杀死细胞内感染的MRSA菌株；经细菌‑噬菌体复合物处理后的感染的角质细胞状态恢复迅速，细胞的促炎性细胞因子和细胞毒性显著下降。

Description

复合型胞内金黄色葡萄球菌抗菌制剂及其制备和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，包括借助承载噬菌体的载体细菌，进入真核细胞内部杀灭耐药金黄色葡萄球菌的方法，具体地，涉及一种复合型胞内金黄色葡萄球菌抗菌制剂及其制备和应用。

背景技术

皮肤角质细胞是表皮中最主要的细胞，积极参与和协调皮肤的先天免疫反应。最近的研究表明，在金黄色葡萄球菌感染的早期，角质细胞能够发挥类似免疫细胞的功能抵抗金黄色葡萄球菌的感染。研究表明金黄色葡萄球菌能够入侵角质细胞并在其内持续存活，从而逃避免疫反应，导致皮肤的持续感染。然而，大多数抗菌药物对金黄色葡萄球菌在细胞内的持续感染束手无策。例如，抗生素很难自由的进入真核细胞，无法有效地杀灭细胞内的细菌；而小分子抗菌肽抗菌谱较广，从而导致皮肤中微生态平衡的破坏。此外，近年来，由于抗生素的过度使用，临床分离的金黄色葡萄球菌出现了严重的耐药情况(例如耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)的出现)，这对金黄色葡萄球菌引起的胞内感染的治疗提出了更严峻的挑战，因此寻求一类高效不耐药的杀灭细菌胞内感染的新型抗菌方法显得尤为重要。

噬菌体，作为一类可以感染并裂解细菌的病毒，是地球上最广泛存在的微生物。在过去的15年中，随着越来越多的葡萄球菌噬菌体被分离和鉴定，葡萄球菌，特别是金黄色葡萄球菌的噬菌体疗法取得了前所未有的进展。临床研究发现，金黄色葡萄球菌噬菌体能够靶向治疗疾病中的病原体，如金黄色葡萄球菌引起的菌血症，眼部感染及相关肺部感染。与传统的抗生素相比，噬菌体成本低，量产迅速，没有副作用，并且对耐药细菌有良好的杀菌效果。此外，通常认为噬菌体仅能识别细菌细胞壁上的受体，而与真核细胞不产生直接作用，因此单独使用噬菌体无法清除真核细胞内感染的细菌。

发明内容

本发明的目的在于克服现有抗菌制剂对解决胞内细菌感染的不足，提供一种能够进入真核细胞内部的噬菌体疗法。具体地，本发明的目的是提供一种复合型胞内金黄色葡萄球菌抗菌制剂及其制备和应用。

为了将噬菌体应用于治疗MRSA菌株的胞内感染，本发明将承载着金黄色葡萄球菌烈性噬菌体的载体细菌复合物(phage-loaded bacteria，PLB)加入角质细胞内，噬菌体能够随着载体细菌的入侵而进入角质细胞内部，从而高效杀死细胞内感染的MRSA菌株。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明提供一种复合型胞内抗菌制剂，所述抗菌制剂包括载体细菌承载噬菌体的复合物，所述载体细菌为金黄色葡萄球菌，所述噬菌体为金黄色葡萄球菌烈性噬菌体。

优选地，所述载体细菌为金黄色葡萄球菌SH-5，所述噬菌体为噬菌体SLPW。该噬菌体为本实验室分离(Wang,Z.,Zheng,P.,Ji,W.,etc.SLPW:A Virulent BacteriophageTargeting Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus In vitro and In vivo[J].Frontiers in microbiology,2016,7 934.)，在体内外能高效杀灭多种类型的金黄色葡萄球菌。

第二方面，本发明提供一种复合型胞内抗菌制剂的制备方法，包括如下步骤：

S1、噬菌体的纯化；

S2、用载体细菌吸附噬菌体后，得到载体细菌承载噬菌体的复合物。

优选地，步骤S1中，所述噬菌体的纯化步骤包括：在噬菌体悬液中加入DNaseⅠ和RNaseA，37℃水浴30min；再在噬菌体悬液中加入NaCl，置冰上1.5h后，低温离心，收集上清液，并加入50％PEG8000，冰浴2h后，低温离心，弃上清；将离心管内液体流干时，将噬菌体颗粒用PBS缓冲液重悬，室温静置2h；最后，在重悬液中加入等体积氯仿，室温离心，收集亲水相，于4℃保存备用。

优选地，步骤S2中，所述载体细菌的浓度为10⁴～10⁶CFU/ml；噬菌体的浓度为10⁴PFU/ml。

优选地，步骤S2中，所述吸附温度为37℃、吸附时间为10分钟。前期实验证明该噬菌体感染细菌的潜伏期为10分钟，如果低于这个时间，噬菌体和细菌互作不够充分，高于这个时间，子代噬菌体开始释放。因此低于或超过10分钟都会影响细菌携带噬菌体入胞效率。

第三方面，本发明提供一种复合型胞内抗菌制剂在制备细胞内金黄色葡萄球菌抗菌制剂中的用途。

优选地，所述细胞为皮肤角质细胞；所述金黄色葡萄球菌为MRSA菌株MS3。

本发明的内包括：

步骤一：噬菌体的纯化及体外杀菌效果的评估；

步骤二：噬菌体入胞承载菌株的筛选；

步骤三：细菌-噬菌体复合物在皮肤角质细胞内杀菌效果的评价。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明的复合型胞内抗菌制剂(承载着金黄色葡萄球菌烈性噬菌体的载体细菌复合物)能够进入皮肤角质细胞内部，高效杀死细胞内感染的MRSA菌株。

2、研究发现，影响细菌-噬菌体复合物工作效率的关键影响因素为二者前期的互作时间，即噬菌体和载体细菌于体外互作10min后立即进行治疗效果最佳。此外，分别比较细菌-噬菌体复合物和单一噬菌体对角质细胞内的杀菌效果发现：细菌-噬菌体复合物能够有效进入角质细胞内清除胞内细菌，而单一噬菌体无法进入角质细胞内。细菌-噬菌体复合物处理后的感染的角质细胞状态恢复迅速，细胞的促炎性细胞因子和细胞毒性显著下降。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为实施例2中噬菌体对不同类型候选承载菌株吸附能力的测定；

图2为实施例2中不同类型候选承载菌株对角质细胞的毒性和侵袭率；图中，图2A为不同类型候选承载菌株对角质细胞的毒性；图2B为不同类型候选承载菌株对角质细胞的侵袭率；

图3为实施例2中不同候选承载菌株与噬菌体形成的复合物胞内杀菌能力测定；

图4为实施例3中噬菌体-细菌复合物在不同时间点作用后对胞内金黄色葡萄球菌杀菌能力的测定；

图5为实施例4中噬菌体-细菌复合物处理后，角质细胞内噬菌体的含量；

图6为实施例4中噬菌体-细菌复合物及抗生素处理后，角质细胞内金黄色葡萄球菌数的存活能力；

图7为实施例5中细菌-噬菌体复合物处理后不同时间，角质细胞LDH的释放水平；

图8为实施例5中细菌-噬菌体复合物处理后细胞的促炎性细胞因子IL-6、TNF-α的转录水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明所涉及的全部金黄色葡萄球菌为本实验室分离保存(Wang Z,Zheng P,JiW,Fu Q,Wang H,Yan Y,Sun J.2016.SLPW:A Virulent Bacteriophage TargetingMethicillin-Resistant Staphylococcus aureus In vitro and In vivo.FrontMicrobiol 7:934.)，拥有自主知识产权。

下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1金黄色葡萄球菌烈性噬菌体SLPW的纯化和体外裂菌谱的测定

噬菌体SLPW分离自猪场粪便中，噬菌体在MRSA菌株MS3中扩增培养后，进行噬菌体的纯化，便于后期细胞治疗的应用，具体操作如下：

在噬菌体悬液中加入DNaseⅠ和RNaseA至终浓度为1μg/mL，37℃水浴30min。在噬菌体悬液中加入NaCl至终浓度1mol/L，置冰上1.5h后4℃12000rpm离心15min，收集上清液，并加入50％PEG8000至终浓度10％(w/v)，冰浴2h后4℃12000rpm离心15min，弃上清。将离心管在室温下倾斜倒置一定时间，在管内液体充分流干时，将噬菌体颗粒用PBS缓冲液重悬，室温静置2h。在重悬液中加入等体积氯仿，来回轻轻颠倒8～10次，室温5000rpm离心15min后，收集亲水相(重悬于PBS缓冲液的噬菌体)，于4℃保存备用。

以不同来源的40株金黄色葡萄球菌为指示菌，测定噬菌体SLPW对不同菌株的体外裂解活性。具体操作如下：

取100μL培养至对数早期的待测菌株与100μL纯化后的SLPW噬菌体混均后加入45℃左右的上层琼脂培养基中，混匀后倒入预先制备好的BHI固体琼脂平板上，待平板凝固且表面干燥后置37℃培养过夜，记录噬菌体空斑数。如表1，噬菌体SLPW对不同类型及来源的金黄色葡萄球菌都具有良好的裂解效果。

表1噬菌体SLPW对不同来源金黄色葡萄球菌裂解效果

^a MLST分型：多位点序列分型；^b EOP成斑率(efficiency of plating)＝SLPW噬菌体对待测菌株PFU/SLPW噬菌体对ATCC25923菌株PFU；^c菌株来源：I,医院临床分离株；II,奶牛乳腺炎临床分离株；III,购买自美国ATCC参考菌株；IV,实验室保存菌株。

实施例2噬菌体携带菌株的筛选

本发明基于细菌承载噬菌体的复合物，进入角质细胞内进行治疗。承载菌株的选择需要达到以下三个标准：I承载菌株能够吸附噬菌体SLPW；II承载菌株能够高效进入角质细胞内；III承载菌株对角质细胞具有较低的毒性。因此，本研究对实验室菌株按以上标准进行筛选，最终确定金黄色葡萄球菌SH-5为最佳噬菌体携带菌株。具体方法如下：

步骤一：承载菌株对噬菌体的吸附实验

取500μL培养至对数期(OD600＝0.8～1.0)的待测菌株与100μL纯化后的噬菌体，混合后于37℃培养箱，孵育5min。一式两份，一份直接进行BHI琼脂双层平板实验，测定噬菌体(原噬菌体)的PFU；一份经13000rpm,3min离心，收集噬菌体上清液，该上清液即为未吸附的噬菌体，随后用BHI琼脂双层平板实验，测定未吸附的噬菌体的PFU。噬菌体吸附率＝100％－(未吸附的噬菌体PFU/原噬菌体PFU)。

步骤二：承载菌株对角质细胞入侵能力的测定

角质细胞(10⁵个细胞/孔)平铺于12孔板中，生长条件为1％胎牛血清的RPMI 1640细胞培养基。培养条件为含有5％CO₂的37℃培养箱。次日，将金黄色葡萄球菌(10⁶CFU)加入角质细胞中。平板在5％CO₂的37℃培养箱中温育1h。角质细胞用PBS清洗5次，随后加入含有50μg/ml庆大霉素和1％胎牛血清的细胞培养基，用来杀死细胞外金黄色葡萄球菌，孵育1h后，细胞用PBS洗涤3次，然后加入含有0.02％Triton X-100的PBS用以裂解角质细胞并释放细胞内的细菌。孵育15分钟，裂解液经倍比稀释后涂布于BHI琼脂培养基，37℃培养16h后进行细菌计数，该数目即为入侵于细胞内的细菌数。细菌入侵率＝入侵细菌数/初始细菌数。

步骤三：承载菌株对角质细胞毒性的测定

如上所述，将细菌加入到角质细胞后于37℃温育60分钟。之后，加入含有50μg/ml庆大霉素和1％胎牛血清的细胞培养基维持12h。之后测定细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放来衡定细菌对细胞的毒性。细胞处理方法如Promega产品说明书所示。细胞使用终浓度为1％(vol/vol)的Triton X-100裂解细胞定义为最大LDH释放量。使用酶标仪(OD_492nm)测定LDH的释放量。未处理细胞释放的LDH被指定为自发释放。如下计算细胞毒性：％细胞毒性＝(测试LDH释放量-自发释放量)/(最大释放量-自发释放量)。

步骤四：候选承载菌株与噬菌体复合物的胞内杀菌能力测定

角质细胞(10⁴个细胞/孔)平铺于12孔板中，用MRSA菌株MS3(5×10⁵CFU/孔)感染1h。接着加入庆大霉素(50μg/ml)杀死细胞外细菌，1h后，将角质细胞用PBS洗涤3次放置37℃细胞培养箱备用。将备选的承载菌株(10⁴CFU/ml)于37℃吸附10 ⁴PFU/ml噬菌体SLPW(MOI＝1)10分钟，然后将吸附有噬菌体的承载菌株混合液(0.1ml)加入到角质细胞中。在处理后12h取细胞样。细胞用PBS洗涤3次后加入0.02％Triton X-100的PBS于37℃孵育15分钟以裂解角质细胞并释放细胞内细菌。将各稀释度的裂解产物平铺于BHI琼脂平板上并在37℃下温育过夜，之后对菌落进行计数以确定细胞内细菌的数量。

上述实验结果表明，在10株不同MLST型的非耐药金黄色葡萄球菌中，噬菌体SLPW对金黄色葡萄球菌SH-5的吸附能力最强，吸附率达到40％，明显高于其他菌株(图1)；此外菌株SH-5对于角质细胞的毒性相对较低，作为承载菌株更为安全(图2A)。同时，对于角质细胞的侵袭率达到20％，表明该菌株有较好的入胞能力(图2B)。特别是，不同候选承载菌株与噬菌体复合物杀菌能力结果表明，承载菌株SH-5携带噬菌体的胞内杀菌能力要明显强于其他菌株(图3)。综上所述，菌株SH-5被选择为噬菌体SLPW的承载菌株用于接下来的胞内治疗分析。

实施例3噬菌体与承载菌株互作时间对其胞内杀菌能力的影响

将实施例2筛选的承载菌株SH-5与噬菌体SLPW互作10、30和60min之后加入到感染的细胞内。检测12小时后胞内细菌的数量。具体操作如下：角质细胞(10⁴个细胞/孔)平铺于12孔板中，用MRSA菌株MS3(5×10⁵CFU/孔)感染1h。接着加入庆大霉素(50μg/ml)杀死细胞外细菌，1h后，将角质细胞用PBS洗涤3次放置37℃细胞培养箱备用。将承载菌株SH-5(10⁴CFU/ml)于37℃分别吸附10 ⁴PFU/ml噬菌体SLPW(MOI＝1)10，20和60分钟，然后将吸附有噬菌体的承载菌株混合液(0.1ml)加入到角质细胞中。同时，单独添加噬菌体和单独添加承载菌株至角质细胞作为两组对照。在处理后12h取细胞样。细胞用PBS洗涤3次后加入0.02％Triton X-100的PBS于37℃孵育15分钟以裂解角质细胞并释放细胞内细菌。将各稀释度的裂解产物平铺于BHI琼脂平板上并在37℃下温育过夜，之后对菌落进行计数以确定细胞内细菌的数量。

结果显示，混合10min的噬菌体-细菌复合物(PLB)处理后细胞内的细菌数显著下降(图4)，表明噬菌体与承载菌株最佳互作时间为10min。

实施例4细菌-噬菌体复合物胞内杀菌实验

将实施例2筛选的承载菌株SH-5与噬菌体SLPW互作后加入细胞内，连续检测24小时内胞内细菌的数量。具体操作如下：

角质细胞(10⁴个细胞/孔)平铺于12孔板中，用耐药金黄色葡萄球菌USA300(5×10⁵CFU/孔)感染1h。接着加入庆大霉素(50μg/ml)杀死细胞外细菌，1h后，将角质细胞用PBS洗涤3次，如下所示对各个孔施加不同的处理(组A-E)。

Group A：金黄色葡萄球菌SH-5(10⁵CFU/ml)于37℃吸附10⁴PFU/ml噬菌体SLPW(MOI＝10)10分钟，然后将吸附有噬菌体的SH-5细胞(0.1ml)加入到角质细胞中。

Group B：将0.1ml噬菌体SLPW(10⁴PFU/ml)加入到角质细胞中。

Group C：将0.1ml金黄色葡萄球菌SH-5细胞(10⁵CFU/ml)加入到角质细胞中。

Group D：万古霉素(5μg/ml，2×MIC)加入到角质细胞中。

Group E：氯霉素(80μg/ml，2×MIC)加入到角质细胞中

在处理后3h，6h，9h，12h和24h时间点取细胞样。细胞用PBS洗涤3次后加入0.02％Triton X-100的PBS于37℃孵育15分钟以裂解角质细胞并释放细胞内细菌。将各稀释度的裂解产物一式两份，一份平铺于BHI琼脂平板上并在37℃下温育过夜，之后对菌落进行计数以确定细胞内细菌的数量。另一份采用BHI琼脂双层平板实验，测定胞内噬菌体数量。

结果显示，与单独添加噬菌体(Group B)相比，加入PLB后，角质细胞内的噬菌体数量显著增加，角质细胞内的细菌数量显著(P<0.05)下降(图5和图6)，而Group B几乎不能杀死隐藏在角质细胞中的MRSA菌株。此外，结果显示(图6)PLB的胞内杀菌能力强于万古霉素(Group D)，略低于氯霉素(Group E，胞内抗菌药)。研究表明PLB能够有效进入角质细胞，清除细胞内的MRSA菌株。

实施例5细菌-噬菌体复合物胞内杀菌效果评估

收集实施例3处理的不同时间点细胞，分别检测细胞促炎性细胞因子和细胞毒性的释放水平，评估细菌-噬菌体复合物处理后细胞状态的变化。具体操作如下：

步骤一：细胞毒性检测

分别收集细菌-噬菌体复合物处理后、噬菌体单独处理及抗生素处理的角质细胞上清，如说明书所示，使用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega)检测细胞乳酸脱氢酶的释放。样品最终在酶标仪下(OD₄₉₂)测定吸光度。空白处理的细胞释放的LDH被定为自发释放；用终浓度为1％的Triton X-100裂解细胞释放的LDH定义为最大释放。细胞毒性计算如下：％细胞毒性＝(待测LDH释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)。

步骤二：细胞因子检测

分别收集细菌-噬菌体复合物处理后、噬菌体单独处理及抗生素处理的角质细胞上清，使用RNA提取试剂盒(Qiagen)从上清液中提取纯化RNA。根据说明书，使用RNA反转录试剂盒(TaKaRa)进行cDNA合成。合成的cDNA用两步法qRT-PCR检测样品的mRNA水平。将β-肌动蛋白作为内参基因。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素-6(IL-6)和β-肌动蛋白的引物序列于表2中。使用比较周期阈值(2^-ΔΔCT)方法分析mRNA水平。

结果显示，与噬菌体单独处理组(Group B)及万古霉素(Group D)处理组相比，PLB处理(Group A)后3h和6h的细胞LDH的释放显著下降(图7)；与噬菌体单独处理组(Group B)及万古霉素(Group D)处理组相比，PLB处理(Group A)后12h，细胞的促炎性细胞因子IL-6，TNF-α的转录水平下降明显(图8)。这表明细菌-噬菌体复合可以减轻细胞内MRSA菌株引起的炎性反应同时减少细胞的毒性。

表2荧光定量PCR引物序列

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> 复合型胞内金黄色葡萄球菌抗菌制剂及其制备和应用

<130> DAG34354

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 1

agcctcaatg acgaccta 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 2

atctttgttg gagggtga 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 3

agccgcatcg ccgtctccta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 4

cagcgctgag tcggtcaccc 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

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<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 5

ccacgaaact accttcaact cc 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 6

gtgatctcct tctgcatcct gt 22

Claims (8)

1.一种复合型胞内抗菌制剂，其特征在于，所述抗菌制剂包括载体细菌承载噬菌体的复合物，所述载体细菌为金黄色葡萄球菌SH-5，所述噬菌体为噬菌体SLPW；所述载体细菌吸附噬菌体即得所述复合型胞内抗菌制剂，所述吸附的时间为10分钟。

2.一种根据权利要求1所述的复合型胞内抗菌制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、噬菌体的纯化；

S2、用载体细菌吸附噬菌体后，得到载体细菌承载噬菌体的复合物；所述吸附的时间为10分钟。

3.根据权利要求2所述的复合型胞内抗菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述噬菌体的纯化步骤包括：在噬菌体悬液中加入DNaseⅠ和RNaseA，37℃水浴30min；再在噬菌体悬液中加入NaCl，置冰上1.5h后，低温离心，收集上清液，并加入50％PEG8000，冰浴2h后，低温离心，弃上清；将离心管内液体流干时，将噬菌体颗粒用PBS缓冲液重悬，室温静置2h；最后，在重悬液中加入等体积氯仿，室温离心，收集亲水相，于4℃保存备用。

4.根据权利要求2所述的复合型胞内抗菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述载体细菌的浓度为10⁴～10⁶CFU/ml；所述噬菌体的浓度为10⁴PFU/ml。

5.根据权利要求2所述的复合型胞内抗菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述吸附的温度为30℃～40℃。

6.根据权利要求2所述的复合型胞内抗菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述吸附的温度为37℃。

7.一种根据权利要求1所述的复合型胞内抗菌制剂在制备细胞内抗MRSA菌株制剂中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述细胞为皮肤角质细胞；所述抗菌制剂所抑制的菌株为MRSA菌株MS3。

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