KR100717724B1 - 중간엽 줄기세포의 분화조절 조성물 및 이를 이용한분화촉진방법 - Google Patents

중간엽 줄기세포의 분화조절 조성물 및 이를 이용한분화촉진방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포(MSC)의 분화조절 조성물에 대한 것이다. 본 발명에 따르면, 중간엽 줄기세포(MSC)의 골분화유도시 Toll like receptor의 리간드인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN), poly I:C, CpG motif(ODN2006, ODN2216)의 처리와 항산화화합물인 케르세틴(quercetin)의 분화 전처리는 중간엽 줄기세포에서 골, 지방 및 혈관내피 세포분화 유도효과를 조절함을 알 수 있다. 따라서 이들 조성물에 의하여 중간엽 줄기세포의 분화가 조절되는 것을 바탕으로 분화촉진에 관련하는 조성물을 제조하여 분화유도제를 이용한 세포재생기술개발에 이용할 수 있다.
중간엽 줄기세포, 케르세틴(quercetin), TLR, LPS, PGN, poly I:C, 분화조절, 분화촉진

Description

중간엽 줄기세포의 분화조절 조성물 및 이를 이용한 분화촉진방법{COMPOSITION FOR THE DIFFERENTIATION OF MESENCHYMAL STEM CELLS AND DIFFERENTIATION METHOD OF MESENCHYMAL STEM CELLS USING IT}
도 1은 중간엽 줄기세포에서 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN)의 분화유도시 처리와 항산화 화합물인 케르세틴(quercetin)의 분화 전처리에 의하여 골분화정도를 측정한 결과이다.
도 2는 중간엽 줄기세포에서 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN)의 분화유도시 처리와 케르세틴(quercetin)의 분화 전처리에 의하여 지방분화억제정도를 측정한 결과이다.
도 3은 중간엽 줄기세포에서 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 poly I:C의 공동처리에 의한 골분화상승작용을 측정한 결과이다.
도 4는 중간엽 줄기세포에서 케르세틴(quercetin)의 전처리와 CpG motif(ODN2006)의 처리에 의한 혈관내피세포로의 분화정도를 측정한 결과이다.
도 5는 중간엽 줄기세포에서 케르세틴(quercetin)의 전처리와 CpG motif(ODN2006)의 처리에 의한 혈관내피세포로의 분화정도를 내피세포표지인자인 vWF로 면역조직 화학염색으로 확인한 결과이다.
도 6은 중간엽 줄기세포에서 케르세틴(quercetin)의 전처리에 의한 세포증식에 대한 작용을 측정한 결과이다.
도 7은 케르세틴(quercetin)을 전처리한 세포에서 생체 두개골 재생능력의 증가를 나타낸 결과이다.
본 발명은 중간엽 줄기세포(MSC)의 분화유도 조절에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 Toll like receptor(TLR)의 리간드(Ligand)인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS, TLR4 ligand)와 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN, TLR2 ligand), 폴리 I:C(polyinosinic:polycytidylic acid, poly I:C, TLR3 ligand), CpG motif(ODN2006, ODN2216, TLR9 ligand)와 항산화화합물인 케르세틴(quercetin)을 함유하는 분화조절용 조성물에 관한 것이다.
Toll은 선천성 면역반응(innate immunity)에 관여하는 것으로 1991년에 처음으로 초파리(Drosophila melanogaster)안에서 발견되었으며(Gay NJ, Keith FJ. Drosophila Toll and IL-1 receptor. Nature. 1991 May 30;351(6325):355-6.), 1997년에 초파리 Toll과 유사한 사람의 Toll이 발견되었다(Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway CA Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature. 1997 Jul 24;388(6640):394- 7.). 그래서 이러한 mammalian Toll을 Toll-like receptor(TLR)라 명명하게 되었다. 인간에게서는 지금까지 11개의 Toll like receptor(TLR)가 확인되었으며, 이들 TLRs는 미생물들이 가지고 있는, 각각의 독특한 생물학적인 구조(PAMP, pathogen-associated molecular pattern)를 인식하는 중요한 역할을 한다(Akira, S., Takeda, K., Kaisho, T., 2001. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. Nat. Immunol. 2,675-680. ;Netea, M.G., van der Graaf, C., Van der Meer, J.W., Kullberg, B.J., 2004. Toll-like receptors and the host defense against microbial pathogens:bringing specificity to the innate-immune system. J. Leukoc. Biol. 75,749-755.;Zhang, D., Zhang, G., Hayden, M.S., Greenblatt, M.B., Bussey, C.,Flavell, R.A., Ghosh, S., 2004. A toll-like receptor that prevents infection by uropathogenic bacteria. Science 303, 1522-1526.). 예를 들어, TLR2, 6는 박테리아의 lipoprotein 즉, 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN)과 lipoteichoic acid를 인식하고, TLR3은 바이러스의 dsRNA와 DNA analog인 poly I:C를 인식하고, TLR4는 박테리아의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccahrides, LPS)를 인식하고, TLR5는 박테리아의 플라젤린(flagellin)을 인식하고, TLR7, 8은 Imiquimod, Loxoribine와 Single-Stranded RNAs을 인식하고, TLR9는 박테리아 DNA안의 CpG를 포함한 시퀀스(sequence) 또는 synthetic oligonucleotides(ODNs)를 인식하고, TLR11은 profilin-like protein을 인식한다(He H, Genovese KJ, Nisbet DJ, Kogut MH. Profile of Toll-like receptor expressions and induction of nitric oxide synthesis by Toll-like receptor agonists in chicken monocytes. Mol Immunol. 2005 Aug 9).
PAMPs가 TLRs을 자극하면 MyD88과 IRAK과 같은 수많은 단백질을 포함하는 signal cascades가 시작되고, 이 signal cascade는 pro-inflammatory cytokines인 인터루킨-1β(interleukin-1β, IL-1β), 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6), 인터루킨-12(interleukin-12, IL-12)의 분비와 nutrophil, immature DC, NK cell에 대한 chemotactic effect를 주는 인터루킨-8(interleukin-8, IL-8), RANTES, MIP-1a, MIP-1β의 분비와 T-cell stimulation하는 CD40, CD80, CD86 분비, antiviral effect인 인터페론 a(interferon a, IFNa), 인터페론β(interferonβ, IFNβ) 분비를 유도한다(Liew FY, Xu D, Brint EK, O'Neill LA. Negative regulation of toll-like receptor-mediated immune responses. Nat Rev Immunol. 2005 Jun;5(6):446-58. Review. ; Nature 388, 394 (1997); Nat. Immunol. 4, 105 (2003, Takeda K. Toll-like receptor. Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi. 2005 Oct;28(5):309-17 ).
케르세틴(quercetin)은 과일, 야채, 차 등과 같은 천연식물이나 곡물의 대부분을 차지하는 polyphenolic flavonoid를 함유하는 물질로 1936년 헝가리 Albert Szent-Gyorgyi에 의해 발견되었다. 이는 전형적인 항산화제로 유독한 중금속 침착제로 작용하며 효소, 호르몬, DNA 등의 생리적 중합제와 반응작용이 강해 전자전달 이나 유리기(free radical)의 소거작용이 있다(Saija A, Scalese M, Lanza M, et al. Flavonoids as antioxidant agents: importance of their interaction with biomembranes. Free Radic Biol Med 1995;19:481-486. ;Miller AL. Antioxidant flavonoids: structure, function and clinical usage. Alt Med Rev 1996;1:103-111.). 또한 케르세틴(quercetin)은 잠재적인 항암제로 세포주기를 조절하거나 티로신(tyrosine)을 저해하여 각종 암세포의 성장을 막는다고 알려진 바 있다(Yoshida M, Yamamoto M, Nikaido T. quercetin arrests human leukemic T-cells in late G1 phase of the cell cycle. Cancer Res 1992;52:6676-6681. ;Boutin JA. Tyrosine protein kinase inhibition and cancer. Int J Biochem 1994;26:1203-1226. ;Piantelli M, Maggiano N, Ricci R, et al. Tamoxifen and quercetin interact with type II estrogen binding sites and inhibit the growth of human melanoma cells. J Invest Dermatol 1995;105:248-253). 케르세틴(quercetin)은 항히스타민(histamine) 작용을 하여 각종 앨러지반응에 유용하게 사용되며, 천식 등에도 널리 사용되어지고 있다(Fox CC, Wolf EJ, Kagey-Sobotka A, Lichtenstein LM. Comparison of human lung and intestinal mast cells. J Allergy Clin Immunol 1988;81:89-94.). 최근의 보고에 의하면 이러한 케르세틴(quercetin)이 beta-catenin/Tcf의 저해제로 작용한다는 보고가 발표된 바가 있다(Park CH, Chang JY, Hahm ER, Park S, Kim HK, Yang CH. quercetin, a potent inhibitor against beta-catenin/Tcf signaling in SW480 colon cancer cells.Biochem Biophys Res Commun. 2005 Mar 4;328(1):227-34.).
중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)는 체외에서 쉽게 증식할 수 있으며, 여러 가지 세포형태(지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포)로 분화가 가능한 세포이다(Caplan, A.I. 1991. Mesenchymal stem cells. J. Orthop . Res. 9, 641-650 ; Beresford, J. N., Bennett, J. H., Devlin, C., Leboy, P. S., and Owen, M.E. (1992). Evidence for an inverse relationship between the differentiation of adipocytic and osteogenic cells in rat marrow stromal cell cultures. J. Cell Sci. 102, 341-351 ; Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., Jaiswal, R. K., Douglas, R., Mosca, J. D., Moorman, M. A., Simonetti, D. W., Craig, S., and Marshak, D. R. (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147 ; Patricia, A. Z., Min, Z., Hiroshi, M., Jerry H., William, F. J., Adam, J. K., Prosper, B., Peter L. H., and Hedrick M. H. 2001. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue engineering. 7, 211-227). 따라서 중간엽 줄기세포는 유전자 치료와 세포치료에 있어서 유용한 타깃(target)으로 이용될 수 있으며 중간엽 줄기세포의 분화기전에 대한 이해는 다양한 세포의 초기분화를 이해하는데 중요한 역할을 한다(Banfi, A., Muraglia, A., Dozin, B., Mastrogiacomo, M., Cancedda, R., and Quarto, R. 2000. Proliferation kinetics and differentiation potential of ex vivo expanded human bone marrow stromal cells: Implications for their use in cell therapy. Exp . Hematology. 28, 707- 715). 지금까지 중간엽 줄기세포에서 이들 Toll like receptor(TLR)의 리간드들(Ligand)과 케르세틴(quercetin)이 분화과정에 있어서 아직 그 기능이 밝혀진 바가 없다.
본 발명에서는 중간엽 줄기세포에서 Toll like receptor(TLR)의 리간드들(Ligand)과 케르세틴(quercetin)이 중간엽 줄기세포의 분화과정을 조절할 수 있음을, 특히 케르세틴(quercetin)이 분화유도전 전처치만으로도 그 효과를 나타냄을 증명하였다. 따라서 본 발명은 Toll like receptor(TLR)의 리간드(Ligand)와 항산화화합물인 케르세틴(quercetin)의 분화조절작용에 대한 것이며, 이를 이용한 중간엽 줄기세포의 분화조절과 세포재생치료제 개발기술에 대한 기반을 제공한다.
본 발명의 주된 목적은 Toll like receptor(TLR)의 리간드(Ligand)와 항산화 화합물인 케르세틴(quercetin)를 함유하는 중간엽 줄기세포(MSC)의 세포 분화 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 조성물을 함유하는 분화유도 관련 새포재생 치료제 개발에 이용하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 조성물을 이용하여 중간엽 줄기세포의 골분화 증가방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 조성물을 이용하여 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포분화 증가방법을 제공하는 데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 Toll like receptor(TLR)의 리간드(Ligand)와 케르세틴(quercetin)을 유효성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포(MSC)의 분화조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, Toll like receptor(TLR)의 리간드(Ligand)인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides, LPS)는 Escherichia coli 055:B5로부터 분리한 것으로 1-10㎍/ml 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 분화조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, Toll like receptor(TLR)의 리간드(Ligand)인 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN)은 Staphylococcus Aureus로부터 분리한 것으로 1-10㎍/ml 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 분화조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, Toll like receptor(TLR)의 리간드(Ligand)인 폴리 I:C(Polyinosinic · Plycytidylic acid, poly I:C)는 1-10㎍/ml 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 분화조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, Toll like receptor(TLR)의 리간드(Ligand)인 시퀀스(sequence) 5'-tcg tcg ttt tgt cgt ttt gtc gtt-3'인 CpG motif(ODN2006, 서열번호1)와 5‘-ggG GGA CGA TCG TCg ggg gg-3'인 CpG motif(ODN2216, 서열번호2)는 0.5-1㎍/ml 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 분화조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 하기 화학식 1의 케르세틴(quercetin; 3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone)은 2-20μM 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 분화조절용 조성물을 제공한다.
Figure 112006003793293-pat00001
구체적으로, 본 발명에서는 지방조직에서 분리배양한 중간엽 줄기세포에서 Toll like receptor(TLR)의 리간드(Ligand)인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides, LPS), 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN)과 항산화화합물인 케르세틴(quercetin)은 골분화를 증가시켰고, 펩티도글리탄(peptidoglycan, PGN)과 케르세틴(quercetin)은 지방분화를 억제하였다. 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN), 그리고 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 poly I:C를 분화유도시에 공동처리하는 경우에는 중간엽 줄기세포의 골분화를 상승시켰다. 중간엽 줄기세포에 CpG motif(ODN2006, 서열번호1)와 항산화화합물인 케르세틴(quercetin)의 처리는 50ng/ml VEGF와 10ng/ml b-FGF를 포함한 Metri-gel에서 혈관구조를 형성함을 확인하였다.
케르세틴(quercetin)는 2μM이상의 농도에서 중간엽줄기세포의 증식을 억제하였다. 케르세틴(quercetin)을 전처리한 중간엽 줄기세포를 두개골 결손된 면역결핍 생쥐에 이식한 후 5주 경과 후에 생체내에서 골형성의 현저한 증가를 나타냄을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
(실시예 1) : 지방으로부터 중간엽 줄기세포의 분리
부산대학병원에서 지방제거수술을 시행한 환자에서 얻은 지방으로부터 기질 줄기세포를 분리하였다. 지방조직으로부터 기질줄기세포를 분리하기 위하여 성형외과에서 피하지방제거술을 시행한 환자에서 지방조직을 얻는다. 분리한 지방조직을 HBSS로 씻어준 후, 핀셋과 가위를 이용하여 지방조직을 얇게 자른 다음 0.075% collagenase를 37℃에서 30분간 처리한다. 원심분리 후 pellet에 58% low-glucose DMEM, 40% MCDB-201 or F-12, 1x insulin-transferrin-selenium, 1x linoleic acid-BSA, 10-8 M dexamethasone, 10-4 M ascorbic acid 2-phosphate, 100 U penicillin, 1,000 U streptomycin, 2% 소태아혈청 또는 5-10% 인체자가혈청, 10 ng/ml FGF (Sigma Chemical Co)로 이루어진 배지를 넣어줘서 resuspension 시킨 후, 100㎛ nylon mesh 에 통과시킨 후. 분리된 세포들을 dish에 plating해서 24시간 후 부착되지 않은 세포를 제거해준다.
(실시예 2) : 중간엽 줄기세포에서 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides, LPS)와 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN), poly I:C, CpG motif(ODN2006, ODN2216)의 분화유도시 처리와 케르세틴(quercetin) 분화 전처리에 의한 골분화 증가 및 지방분화 억제작용
리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN), poly I:C, CpG motif(ODN2006(서열번호1), ODN2216(서열번호2)), 케르세틴(quercetin)의 골분화에 대한 효과를 검정하기 위하여 지방기질세포에 케르세틴(quercetin)은 분화초기 3일 동안만 0.5에서 3mM농도로 처리하고 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN)은 1에서 10㎍/㎖ 농도로, poly I:C는 1에서 10㎍/㎖ 농도로, CpG motif(ODN2006, ODN2216)은 0.5에서 1㎍/㎖ 농도로 분화유도 과정동안 3일에 한번씩 처리한다. 골분화유도는 분화배지(10% 소태아혈청, 50 ㎍/㎖ ascorbic acid, 1.5 mg/ml β-glycerophosphate, 10-8M dexamethasone in α-MEM)를 이용하고 10일간 분화를 유도한다. 뼈세포로의 분화는 alizarin red S 염색을 통해 확인 한다. 도 1은 중간엽 줄기세포에서 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS), 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN), poly I:C, CpG motif(ODN2006, ODN2216), 케르세틴(quercetin)을 처리하여 골분화정도를 측정한 결과이다. 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS), 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN)의 분화유도시 처리와, 케르세틴(quercetin)의 3일 동안의 전처리에 의해 골분화정도가 증가함을 확인할 수 있었다. 케르세틴(quercetin)의 유사유도체인 chyrisin은 골분화에 효과를 나타내지 못하였다. 반면에 CpG motif(ODN2006, ODN2216)를 분화유도시에 처리하는 경우에는 지방기질세포의 골분화정도가 감소함을 확인할수 있었다.
도 2는 동일한 방법으로 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN), poly I:C, CpG motif(ODN2006, ODN2216), 케르세틴(quercetin)의 처리가 지방으로의 분화정도를 확인하기 위해서 지방분화유도배지(10% 소태아혈청, 1μM dexamethasone, 0.5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 10μM insulin, and 200μM indomethacin in α-MEM)에서 6일간 분화를 유도하여 2% Oil Red O로 실온에서 1시간 염색한 후 현미경에서 분화정도를 관찰한 결과이다. 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN)의 분화유도시 처리와 케르세틴(quercetin)의 전처리가 지방분화정도가 억제됨을 확인할 수 있었다.
(실시예 3) : 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 poly I:C의 공동처리에 의한 골분화상승작용
리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN), poly I:C의 공동처리에 의한 골분화에 대한 효과를 검정하기 위하여 지방기질세포에 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS) 10㎍/㎖와 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN) 5㎍/㎖ 농도로, 그리고 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS) 10㎍/㎖와 poly I:C 10㎍/㎖ 농도로 분화유도시에 공동처리하고 3일에 한번씩 첨가해준다. 골분화유도는 분화배지(10% 소태아혈청, 50 ㎍/㎖ ascorbic acid, 1.5 mg/ml β-glycerophosphate, 10-8M dexamethasone in α-MEM)를 이용하고 10일간 분화를 유도한다. 뼈세포로의 분화는 alizarin S 염색을 통해 확인한다. 도 3은 중간엽 줄기세포에서 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN), 그리고 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 poly I:C로 처리하여 골분화정도를 측정한 결과이다. 공동으로 처리시 단독으로 처리하였을 때 보다 상호작용으로 인한 골분화 증가효과가 상승되었다.
(실시예 4) : 중간엽 줄기세포에서 케르세틴(quercetin)의 전처리와 CpG motif(ODN2006)처리에 의한 혈관내피세포로의 분화 증가작용
CpG motif(ODN2006, ODN2216), 케르세틴(quercetin)의 혈관내피세포로의 분화에 대한 효과를 검정하기 위하여 지방기질세포에 케르세틴(quercetin)은 분화전 24시간 동안 10에서 20μM 농도로 처리하고, CpG motif(ODN2006, ODN2216)은 0.5에서 1㎍/㎖ 농도로 분화유도시 한번 이틀 동안 처리한 다음, 50ng/ml VEGF와 10ng/ml b-FGF를 포함한 Metri-gel에서 2-3일 배양하여 혈관구조를 형성함을 확인하였다(도 4). Metri-gel에서의 배양 5-7일 후, 혈관구조를 형성한 지방조직기질세포를 dispase II를 사용하여 단일세포로 분리한 후, 내피세포표지인자인 vWF로 면역조직 화학염색을 실시한 결과, 케르세틴(quercetin)과 CpG motif(ODN2006)를 처리한 세포가 혈관내피세포로의 분화가 증가되었음을 확인할 수 있었다(도 5). 면역결핍생쥐의 대퇴동맥을 결찰하고, 결찰 후 1일에 근육으로 106개의 지방조직기질세포를 이식한 후, 2주후 Laser Doppler로 혈류양을 측정한 결과 PBS만을 주입한 군에 비하여 지방조직기질세포를 주입한 군에서 혈류량이 유의하게 증가하였으며, 10-20μM의 케르세틴으로 전처치한 지방조직기질세포에서 그 효과가 의미있게 증가하였다(n=6, p<0.05).
Figure 112006003793293-pat00002
Laser Doppler로 혈류양을 측정한 결과
(실시예 5) : 케르세틴(quercetin)전처리에 의한 세포증식에 대한 작용
케르세틴(quercetin) 전처리가 지방기질세포의 증식능에 영향을 미치는 지를 측정하였다. 10000개의 지방기질세포에 케르세틴(quercetin) 2, 5, 10μM을 처리한 후, 1-4일 동안 각각 trypsin/EDTA를 처리하여 단일세포로 분리한 후 현미경에서 haematometer를 이용하여 세포의 수를 측정하였다. 케르세틴(quercetin) 전처리는 농도 의존적으로 세포의 증식능을 유의하게 억제함을 확인하였다. 도 6은 지방기질세포의 증식에 케르세틴(quercetin)이 미치는 영향을 확인한 결과이다.
(실시예 6) : 케르세틴(quercetin)전처리에 의한 생체(in vivo) 골분화능의 증가
케르세틴(quercetin)이 지방기질세포의 골재생능에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 면역결핍생쥐의 두개골에 지름 4mm 정도의 결손을 주고 케르세틴(quercetin) 5μM을 3일 동안 전처리한 지방조직 기질세포 1x106 개를 직경 4mm, 두께 0.7mm의 크기로 자른 Collagen sponge에 심어 이식하였다. 이식 5주 후 생쥐를 희생하여 두개골을 분리하고 분리한 두개골을 Alizarin red로 염색하여 골의 생성을 확인하였고 더욱 더 자세한 확인을 위해 두개골을 탈칼슘화하여 paraffin에 embeding하였다. 이것을 10㎛두께로 자른 후 hematoxylin and eosin 염색을 실시하여 골재생 여부를 확인하였다. 도 7은 케르세틴(quercetin)으로 처리한 지방기질세포가 생체에서 골재생을 촉진하는 것을 보여주는 것으로, Alizarin red S의 염색과 골형성의 형태학적 검사를 통해 케르세틴(quercetin)을 전처리한 지방기질세포가 생체내에서 골형성의 현저한 증가를 나타냄을 확인하였다. 즉, 지방기질세포만 이식한 경우보다 케르세틴(quercetin)으로 처리한 지방기질세포가 면역결핍생쥐의 두개골 결손에 있어서 골재생을 촉진하는 것을 알 수 있다.
본 발명에 따르면 인체 중간엽 줄기세포 (MSC 포함)에서 Toll like receptor의 리간드인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN), poly I:C의 분화유도시 처리와 케르세틴(quercetin)의 전처리는 골세포로의 분화를 현저히 촉진하는 효과를 보임을 알 수 있다. 따라서 이 들 약물에 의해 골세포로의 분화가 촉진되는 기전을 바탕으로 분화유도제를 제조하여 골질환 치료제 개발에 이용할 수 있다. 또한 Toll like receptor의 리간드인 CpG motif(ODN2006, ODN2216)와 케르세틴(quercetin)이 혈관내피세포로의 분화를 촉진함을 알 수 있어, 이들 약물에 의한 기전을 바탕으로 혈관질환치료제 개발에 이용할 수 있다.
즉, 본 발명은 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS), 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN), poly I:C 등 Toll-like receptor(TLR) 작용물질과 케르세틴(quercetin) 계통약물을 골재생 및 골관련 질환의 치료용도로 제공할 수 있다. 또한 CpG motif(ODN2006)와 케르세틴(quercetin) 유도약물을 혈관재생 및 혈관관련 질환의 치료용도로 제공할 수 있다.

Claims (6)

  1. Toll like receptor(TLR)의 리간드인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides, LPS), 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN), 폴리 I:C(polyinosinic:polycytidylic acid, poly I:C) 및 항산화화합물인 케르세틴(quercetin)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 분화조절 조성물.
  2. Toll like receptor(TLR)의 리간드인 CpG motif(ODN2006, 서열번호1), CpG motif(ODN2216, 서열번호2) 및 항산화화합물인 케르세틴(quercetin)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 분화조절 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides, LPS), 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN), 폴리 I:C(polyinosinic:polycytidylic acid, poly I:C)의 농도는 각각 1-10㎍/㎖, 케르세틴(quercetin)의 농도는 2-20μM인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 분화조절 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    CpG motif(ODN2006, 서열번호1), CpG motif(ODN2216, 서열번호2)의 농도는 각각 0.5-1㎍/㎖, 케르세틴(quercetin)의 농도는 2-20μM인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 분화조절 조성물.
  5. 중간엽 줄기세포에 케르세틴(quercetin)을 전처리한 후, 분화유도시에 Toll like receptor(TLR)의 리간드인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides, LPS), 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN) 및 폴리 I:C(polyinosinic:polycytidylic acid, poly I:C)를 처리함으로써 골세포로의 분화를 촉진시키는 방법.
  6. 중간엽 줄기세포에 케르세틴(quercetin)을 전처리한 후, 분화유도시에 Toll like receptor(TLR)의 리간드인 CpG motif(ODN2006, 서열번호1), CpG motif(ODN2216, 서열번호2)를 처리함으로써 혈관내피세포로의 분화를 촉진시키는 방법.
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