CN108883134A - 活化干细胞和用于感染伤口的全身治疗方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含输液现用的活化的同种异体间充质干细胞群以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。也提供了治疗哺乳动物感染伤口的方法，其通过将有效量的活化间充质干细胞给药给哺乳动物。

Description

活化干细胞和用于感染伤口的全身治疗方法

相关申请

本申请要求2015年12月7日提交的美国申请第62/264,077号的优先权，将其内容通过引用全部并入本文。

发明领域

本发明通常涉及活化间充质干细胞用于治疗感染伤口的用途。

发明背景

伤口愈合是一个复杂的、动态的且精心协调的过程，每当皮肤组织发生破损时它都会被激活。在伤口愈合过程期间会发生各种各样的事件。伤口感染是最常见的，还有组织损伤的严重并发症，诸如外伤性和手术伤口、慢性伤口和溃疡以及烧伤。

但是，由于抗生素抗性的全球性增长，本领域中对于治疗伤口感染的另外的非常规疗法仍存在至关重要的未满足需求。

发明概述

本文提供了包含已通过暴露于一种或多种激活剂而被活化的输液现用(infusionready)的同种异体(allogeneic)间充质干细胞群和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物，所述激活剂选自Toll样受体3(TLR3)激动剂、Toll样受体9(TLR9)激动剂、Toll样受体4(TLR4)激动剂、核寡二聚体化结构域(NOD)受体激动剂、RIG-I受体(RLR)激动剂、胞浆DNA感应蛋白(CDS)激动剂和/或STING受体激动剂。例如，可将组合物配制成用于静脉内给药。

间充质干细胞能够从本领域已知的任何来源获得或得到，例如骨髓、脂肪组织、脐带血、组织活检(例如皮肤活检或牙活检)或者诱导的多能干细胞(iPSC)。

在一些实施方案中，同种异体间充质干细胞群是通过体外(in vitro)和/或离体(ex vivo)使用一种或多种激活剂孵育至少2小时而被活化的。

合适的TLR3激动剂的非限制性例子包括聚腺苷-聚尿苷酸(poly(A:U)、聚肌苷-聚胞苷酸(pIC)和/或UV灭活的病毒颗粒(例如痘病毒颗粒)。

合适的TLR9激动剂的非限制性例子包括CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)、抑制性寡聚脱氧核苷酸(ODN)、纯化的DNA和/或纯化或合成的质粒DNA。

TLR4激动剂的非限制性例子包括细菌脂多糖(LPS)、单磷酰脂质A(MPLA)和/或热灭活的革兰氏阴性菌。

NOD受体激动剂的非限制性例子包括NOD1激动剂(例如二肽IE-DAP(iE-DAP(γ-D-Glu-mDAP))、NOD2激动剂(例如胞壁酰二肽(MDP)和/或其合成衍生物，诸如mirabutide)和/或NOD1/2混合激动剂(例如革兰氏阳性菌和/或合成的分子MurNAc-L-Ala-gamma-D-Glu-mDAP(PGN样分子)。

在一些实施方案中，RLR受体激动剂是双链RNA、合成的pAT RNA和/或合成的pICRNA；CDS激动剂是分离自细菌的双链DNA；和/或STING受体激动剂是环二核苷酸，包括但不限于3,3-环-gAMP、2,3-环-gAMP、2,2-环-gAMP以及环二-GMP和/或环二-UMP。

在一个实施方案中，激活剂是10μg/ml的聚肌苷:聚胞苷酸(pIC)

本文所描述的任何组合还可以包括有效量的一种或多种抗微生物剂，诸如杀菌抗生素和/或抑菌抗生素。合适的杀菌抗生素的非限制性例子可以包括青霉素衍生物(penams)、头孢菌素类(cephams)、单环β-内酰胺类(monobactams)、碳青霉烯类、万古霉素、达托霉素、氟喹诺酮类、甲硝唑、呋喃妥因、复方新诺明、泰利霉素和/或氨基糖苷类抗生素。抑菌抗生素的非限制性例子可以包括四环素类抗生素、氯霉素(choloramphenicol)、红霉素、克林霉素和/或利奈唑胺。

此外，在一些实施方案中，活化间充质干细胞能够在给药前预载一种或多种抗生素。

合适的同种异体间充质干细胞是哺乳动物间充质干细胞，包括人间充质干细胞。

本文所描述的组合物增强了哺乳动物中带有MDR细菌的慢性感染伤口的愈合。

也提供了治疗哺乳动物慢性感染伤口的方法，其通过将有效量(例如每kg哺乳动物体重2×10⁶个细胞)的活化间充质干细胞给药给哺乳动物。例如，能通过静脉内导管给细胞给药15分钟时间。

本领域技术人员会认识到，本文所描述的有效量的任何组合物也能用于哺乳动物慢性感染伤口的治疗方法中。在这些方法中，活化间充质干细胞或组合物诱导细菌清除，降低细菌负荷，或者在感染伤口中诱导细菌清除并降低细菌负荷。

优选地，将活化间充质干细胞全身(例如静脉内)给药给哺乳动物。

在本文所描述的任何方法中，间充质干细胞是通过与一种或多种激活剂体外或离体孵育而被活化的，激活剂选自Toll样受体3(TLR3)激动剂、Toll样受体9(TLR9)激动剂、Toll样受体4(TLR4)激动剂、核寡二聚体化结构域(NOD)受体激动剂、RIG-I受体(RLR)激动剂、胞浆DNA感应蛋白(CDS)激动剂和/或STING受体激动剂。

合适的TLR3激动剂的非限制性例子包括聚腺苷-聚尿苷酸(poly(A:U)、聚肌苷-聚胞苷酸(pIC)和/或UV灭活的病毒颗粒(例如痘病毒颗粒)。

合适的TLR9激动剂的非限制性例子包括CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)、抑制性寡聚脱氧核苷酸(ODN)、纯化的DNA和/或纯化或合成的质粒DNA。

TLR4激动剂的非限制性例子包括细菌脂多糖(LPS)、单磷酰脂质A(MPLA)和/或热灭活的革兰氏阴性菌。

NOD受体激动剂的非限制性例子包括NOD1激动剂(例如二肽IE-DAP(iE-DAP(γ-D-Glu-mDAP))、NOD2激动剂(例如胞壁酰二肽(MDP)和/或其合成衍生物，诸如mirabutide)和/或NOD1/2混合激动剂(例如革兰氏阳性菌和/或合成的分子MurNAc-L-Ala-gamma-D-Glu-mDAP(PGN样分子))。

在一些实施方案中，RLR受体激动剂是双链RNA、合成的pAT RNA和/或合成的pICRNA；CDS激动剂是分离自细菌的双链DNA；和/或STING受体激动剂是环二核苷酸，包括但不限于3,3-环-gAMP、2,3-环-gAMP、2,2-环-gAMP以及环二-GMP和/或环二-UMP。

在一个实施方案中，间充质干细胞是在给药前用聚肌苷:聚胞苷酸(pIC)活化的。例如，间充质干细胞是通过与10μg/ml的聚肌苷:聚胞苷酸(pIC)体外孵育至少2小时而被活化的。

本文所描述的任何方法还可以涉及给药有效量的一种或多种抗微生物剂，诸如杀菌抗生素(例如青霉素衍生物(penams)、头孢菌素类(cephams)、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类、万古霉素、达托霉素、氟喹诺酮类、甲硝唑、呋喃妥因、复方新诺明、泰利霉素和/或氨基糖苷类抗生素)和/或抑菌抗生素(例如四环素类抗生素、氯霉素、红霉素、克林霉素和/或利奈唑胺)。

间充质干细胞是哺乳动物间充质干细胞(例如同种异体间充质干细胞和/或人间充质干细胞)。

在本文所描述的任何方法中，活化间充质干细胞或其组合物增强了哺乳动物感染伤口的愈合。通过非限制性举例的方式，感染伤口选自擦伤(abrasions)、撕裂伤(lacerations)、挫伤(contusions)、震荡、刺伤、皮肤割伤、手术伤口、枪伤、烧伤、晒伤、冻伤、化学性创伤、咬伤、叮伤和电伤。

在各种实施方案中，伤口可以是感染了高耐药性细菌的慢性伤口，或者是被一种以上(即2、3、4、5或更多种)细菌株或种所感染的伤口。

此外，本文所描述的任何方法也能用于治疗I型或II型糖尿病患者的伤口。已知这些患者具有免疫缺陷，使得其慢性和/或感染伤口很难治疗。

在本文所描述的方法和用途中所采用的活化间充质干细胞具有比未活化的间充质干细胞更高的抗微生物活性。

在一个优选实施方案中，活化MSC是经静脉内给药的，并同时用抗生素疗法给药，包括杀菌或抑菌抗生素。

在本文所描述的任何方法或用途中，活化间充质干细胞能在伤口发生时或之后给药。

另一方面，本发明提供了用于治疗哺乳动物慢性感染伤口的活化间充质干细胞。活化间充质干细胞用于以治疗有效量给药。

又一方面，本发明提供了用于治疗哺乳动物慢性感染伤口的本发明的组合物。例如，组合物用于以治疗有效量给药。

治疗方法的任何特征(例如本文所描述的间充质干细胞和/或组合物的特征)同样适用于本发明的治疗方法和医药用途两个方面。

本文所描述的任何方面和实施方案都能够与“发明概述”、“附图”和/或“发明详述”部分所公开的其他方面或实施方案进行组合，包括本发明下面的非限制性具体实施例/实施方案。

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有如本申请所属领域普通技术人员所通常理解的同样含义。在说明书中，单数形式也包括复数，除非上下文另有清楚指明。

与本文所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料都能用于本申请的实施和测试，但还是在下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用而并入。

本文引用的参考文献并不被承认为所要求保护的申请的现有技术。在冲突的情况下，本说明书包括定义将优先。此外，材料、方法和实施例都仅仅是说明性的，而不是旨在限制。

从结合实施例的以下详细说明来看，本申请的其他特征和优点将变得清楚。

附图说明

图1是显示抗菌干细胞在伴有生物膜形成的小鼠慢性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)伤口感染模型中的治疗效果的系列照片。(参见Walton等人,Comp Med.64(1):25-33(2014)，通过引用将其并入本文)。

图2是证实在小鼠金黄色葡萄球菌伤口感染模型中用活化MSC和抗生素治疗后伤口组织中的细菌负荷随时间而降低的图表。

图3是证实用活化MSC加上抗生素的治疗降低了伤口组织中的细菌计数的图表。

图4是显示静脉内相对于直接伤口注射活化MSC用于治疗慢性伤口感染的对比的图表。

图5是显示小鼠慢性感染模型中活化MSC给药加上抗生素对显微创伤愈合组织学的效果的系列显微照片。

图6是显示活化MSC在静脉内给药后有效迁移到了伤口感染部位的系列照片。

图7是显示通过活化MSC的全身治疗促进了伤口愈合的系列照片。

图8是显示DiR标记的活化MSC在静脉内给药后迁移到了感染伤口部位的系列照片。

图9是证实MSC的体外杀菌的图表，其中***代表p<0.001，按非参数t检验进行评估。

图10是证实在与抗生素疗法联合时MSC表现出了协同杀菌作用和高水平抗生素抗性的逆转的图表。

图11是证实由活化MSC产生的趋化因子刺激了体外单核细胞迁移的图表。

图12是显示活化MSC的全身给药触发了伤口感染部位的单核细胞募集的系列照片。

图13是显示活化MSC疗法刺激了伤口部位伤口愈合巨噬细胞的分化和活化MSC的治疗将巨噬细胞极化表型从M1型改变成了M2型的系列照片。

图14是证实MSC产生抗微生物肽cathelicidin LL-37的系列照片。

图15是证实MSC的杀菌是部分依赖于cathelicidin LL-37的产生的图表。

图16证实了活化MSC产生的因子触发了经中性粒细胞而增强的细菌吞噬作用。

图17是证实活化MSC的静脉内给药触发了患有感染外伤性脚伤的狗的感染脚伤中多株耐药细菌的清除的图表。

图18是显示活化MSC的全身给药刺激了患有感染外伤性脚伤的狗的伤口愈合的系列照片。

图19显示了活化的犬同种异体脂肪源MSC对狗的未愈合感染爪伤的效果。

图20是显示感染MRSA的狗的慢性术后关节感染通过活化MSC治疗得到解决的系列照片。

图21是证实患有带有MDR肠球菌(Enterococcus)的皮肤感染的狗的伤口愈合的系列照片。

图22显示了用活化MSC和抗生素疗法治疗狗的骨髓炎和骨板感染。

图23是证实系列治疗之后的猫大块慢性感染伤口的愈合是用静脉内给药活化的猫MSC联合抗生素进行治疗的系列照片。

图24是来自患有糖尿病和慢性感染性术后伤口感染的狗的治疗前后的系列照片和培养结果，是用单次静脉内给药活化的犬MSC联合抗生素进行治疗的。

图25是显示源自诱导性多能干细胞(iPSC)的MSC也产生抗微生物活性的图表。

图26是显示MSC的活化增加了其迁移的图表。

图27是显示活化MSC破坏了金黄色葡萄球菌生物膜的图表。

发明详述

慢性伤口感染一直是发病率和死亡率的主要来源，部分是由日趋普遍的耐药细菌和糖尿病之类的疾病的更高发生率所推动的，这些疾病容易产生慢性伤口和伤口感染。(参见Owens等人,J.Hosp.Infect 70(Suppl.2):3-10(2008)；Vinh等人,J.Long TermEff.Med.Implants 15(5):467-88(2005)；Tuttle等人,Adv.Wound Care(New Rochelle)4(1):1-11(2015)；以及Edmiston等人,Adv.Exp.Med.Biol.830:47-67(2015))。最常发生在导管之类的植入物或骨科设备表面上的、以细菌生物膜发生为特征的感染特别难于仅用抗生素疗法进行管理，经常需要数周至数月的连续治疗。虽有侵袭性抗生素疗法，但在许多情况下，感染生物膜的设备或植入物必须去除以完全解决这些慢性感染。

本文提供的间充质干细胞(MSC)已通过使用特异性免疫激活化合物在体外或离体活化，以增强其抗微生物活性和伤口愈合活性。这样的活化MSC能够通过使用特定静脉内(i.v.)输液技术全身给药，要么单独给药，要么与一种或多种另外的抗生素疗法(即一种或多种杀菌和/或抑菌抗生素)联合给药，以到达并治疗常规直接注射可能无法企及部位的慢性伤口感染(例如骨科植入物感染)。

这些活化MSC(及其任何组合物)能够用于治疗慢性的、外伤性的和/或术后伤口感染，它们经常涉及到形成生物膜的多药耐药性细菌，使治疗特别困难。在实施方案中，活化MSC及其组合物将适用于治疗高抗生素耐药性感染和/或由多株相同或不同抗生素引起的感染。

而且，活化MSC能够用于治疗这样的患者(例如糖尿病患者)的伤口，其宿主免疫状态经常是单独抗生素疗法不能完全有效的成因，且其固有免疫和适应性免疫的缺陷均是公认的。

在本文所描述的任何方法或用途中，伤口感染性细菌对其有耐药性的抗生素仍能与活化MSC共给药以实现有效的细菌清除，部分是由于MSC增强抗生素效力的能力。实际上，在本文所描述的任何方法或用途中，很有必要将抗生素(甚至是感染性细菌对其有抗性的抗生素)与活化MSC共给药。

在全身给药活化MSC时，它们与抗生素和宿主固有免疫系统相互作用以降低细菌负荷并刺激伤口愈合。因此，全身性活化MSC给药是一种新的增强用于慢性深层(deep-seated)伤口感染的常规抗微生物疗法疗效的非抗生素方法。

MSC和抗生素疗法之间相互作用的最终结果是明显的细菌清除，甚至是来自于重度感染的人工植入材料的细菌，所述材料诸如包被有金黄色葡萄球菌或大肠杆菌(E coli)或假单胞菌(Pseudomonas)或肠球菌或者体内形成生物膜的任何数量的细菌的网状物(mesh)。而且，MSC给药还产生了其他益处，包括刺激伤口愈合并减少伤口相关的炎症和纤维化。

多种互补作用机制有可能解释活化MSC有助于控制伤口感染的能力。因此，MSC给药对细菌负荷的净效应有可能反映了直接和间接作用机制的总和。一种已证实的抗菌作用直接机制是由MSC分泌的cathelicidin之类的抗微生物肽。经由MSC的细菌清除的间接机制涉及到活化MSC与宿主固有免疫应答的相互作用。

定义

在本公开中，“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等等能够具有美国专利法所赋予的含义，并能够意指“包括”(“includes,”“including”等等)；术语“基本上由......组成”(“consisting essentially of”或“consists essentially”)同样具有美国专利法所赋予的含义，并且这些术语是开放式的，允许存在所记载物之外的更多存在，只要所记载物的基本特征或新特征并未被所记载物之外的更多存在所改变，但是要排除现有技术实施方案。

除非具体说明或者从上下文可显而易见看出，否则本文所使用的术语“a”、“an”和“the”要被理解为单数或复数。

除非具体说明或者从上下文可显而易见看出，否则本文所使用的术语“或”要被理解为包括在内的。

除非另有说明，否则本文所使用的术语“约”是指量、剂量、温度、时间、百分比等记载值±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％。

术语“伤口”是指由可能涉及膜(例如皮肤)撕裂并可能导致皮下组织破损的切割、打击或其他冲击所引起的活体组织损伤。伤口包括开放性和封闭性伤口。“伤口”的例子可包括但不限于非贯通伤(例如擦伤、撕裂伤、挫伤、震荡)；贯通伤(例如刺伤、皮肤割伤、枪伤、来自汽车事故或其他外伤的外伤性伤口和骨折)；热创伤(例如烧伤、晒伤、冻伤)；化学创伤(例如酸或碱)；咬伤和叮伤(例如来自人、狗、蝙蝠、啮齿动物、蛇、蝎子、蜘蛛和/或蜱)；以及电创伤。其他重要的伤口类别包括术后伤口感染，其可以包括软组织手术部位(例如肿瘤切除、心脏手术、器官移植)的感染、骨科植入物感染(例如受感染的膝或髋关节假体)、植入设备的感染(例如受感染的起搏器)以及慢性导管感染(例如PIC管线或留置导尿管的感染)。

“感染伤口”是指已被细菌之类的微生物浸润并伴随明显宿主应答(中性粒细胞和巨噬细胞浸润、肉芽组织、纤维化)的任何伤口。

伤口可以是慢性或急性的。“慢性伤口”是未在可预测的时间(即初始伤口发生后的几周或数月之内)并按有序的一系列阶段就愈合的伤口。这些伤口通常还容纳了已形成细菌生物膜的细菌群，生物膜能够在人工植入材料表面上形成，但是也能在宿主组织上发生(例如糖尿病足溃疡)。细菌生物膜状态的发展使得细菌更难用抗生素或其他药剂进行治疗，特别是当伤口在局部治疗无法企及的部位。此外，由于较长的既往抗生素史，慢性伤口也更有可能容纳多药耐药性细菌。因此，慢性伤口几乎总是难治疗得多，这是由于细菌抗性机制和抗生素耐药性选择压力的协同进化。这些感染通常还涉及到一种或多种多药耐药性(MDR)细菌株。这些细菌包括革兰氏阴性病原体(例如大肠杆菌、不动杆菌(Acinetobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、肠杆菌(Enterobacter)、假单胞菌)和革兰氏阳性病原体(例如葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、肠球菌)。还应注意的是，事实上所有革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌株都能体内形成生物膜。慢性伤口可能是高耐药性细菌感染的结果和/或相同或不同细菌的多株或多菌种感染的结果。

通过非限制性举例的方式，慢性感染伤口可包括压力性溃疡、褥疮性溃疡、动脉溃疡、静脉溃疡、静脉瘀滞性溃疡、糖尿病足溃疡、外伤性溃疡和/或烧伤溃疡、以及植入物感染(膝、踝、髋关节假体)、医疗设备感染(留置静脉通路或导尿管、起搏器、除颤器、用于静脉或动脉狭窄的支架)、网状植入物(例如阴道和腹腔吊带、血管滤器)以及骨科修复感染(例如骨板、螺钉、销和其他固定装置)。慢性伤口也可能在糖尿病患者中发生，已知糖尿病患者具有免疫缺陷，这使伤口很难治疗。

相反，“急性伤口”是迅速发生(即<1周)并用可预测的抗生素治疗方案在可预测的时间内无任何并发症地愈合的损伤。

本文所使用的“疾病”("disorder")是指会从开始、加速、促进或增强伤口愈合(包括急性伤口、开裂性伤口以及缓慢愈合、延迟愈合和慢性伤口)的药剂中获益的任何失调(disorder)、疾病(disease)或病症(condition)。这些伤口将包括糖尿病患者(例如足溃疡或其他皮肤感染)或者由于外周血管疾病而供血减少的患者(例如褥疮性溃疡、皮肤感染、肢体感染)的伤口。因此，药剂将被期望于减少炎症、减少或减轻结疤、改善疤痕质量、减少纤维化和/或减少粘附。例如，疾病、失调和病症包括急性伤口、开裂性伤口以及缓慢愈合、延迟愈合和慢性伤口。

重要的是，治疗将被期望于显著缩短诱导感染解决所必需的治疗时间，并且还要减少治疗次数和所需的抗生素剂量。

还包括以过量产生纤维化材料为特征的疾病、失调和病症，包括在胞外基质中过量产生纤维化材料；以正常组织元件被异常的、无功能的和/或基质相关组分的过量累积所取代为特征的疾病、失调和病症；以粘附形成为特征的疾病、失调和病症；和/或将从会促进伤口愈合和/或减少肿胀、发炎和/或疤痕形成(包括异常和过量结疤，包括疤痕疙瘩、增生性疤痕、普遍性(延展性)疤痕和萎缩性(凹陷性)疤痕)的药剂中受益的任何失调、疾病或病症。例如，包括由手术或外伤产生的伤口，无法以期望速度愈合的伤口(诸如延迟愈合的伤口，不完全愈合的伤口，慢性伤口以及裂开的伤口)，与神经性、缺血性、微血管性病理学、骨区域上方的压力(尾骨(骶骨)、髋部(转子)、臀部(坐骨)或者脚踵或足尖)、再灌注损伤、瓣膜回流病因学和病症有关的异常相关联的伤口。还包括将从本文所描述的增强细胞迁移、减少细胞粘附、结疤和发炎中受益的疾病、失调和病症。

本文所使用的术语“患者”或“受试者”在本文中是可以互换使用的，是指任何哺乳动物，包括人，家养和农场动物，狗、马、猫之类的动物园动物、运动用动物和宠物，以及农业动物包括牛、绵羊、猪和山羊。一种优选的哺乳动物是人，包括成人、儿童和老人。更优选的人是带有慢性未愈合感染伤口的I型或II型糖尿病人。受试者也可以是宠物，包括狗、猫和马。优选的农业动物将是牛和山羊。

除非另有说明，本文所使用的术语“治疗”(“treat”,"treating","treatment"等)是指逆转、减轻、抑制该术语所适用的疾病、失调或病症过程，或者预防这些疾病、失调或病症、或其一种或多种症状，包括给药本文所描述的任何组合物、药物组合物或剂型以预防症状或并发症的发作，或者减轻症状或并发症，或者消除这些疾病、病症或失调。优选地，治疗是治愈性的或改善性的。

本文所使用的“预防”意指整体或部分防止、或改善、或控制、或减少、或停止欲防止的事情或事件的产生或发生，例如疾病、失调或病症。

本文所使用的短语“治疗有效量”和“有效量”等，表示为达到改善或另外治愈效果之类的疗效而给患者或者患者的细胞、组织或器官给药的必需量。有效量是足以引起细胞、组织、系统、动物或人体的生物学或医学反应的，这也是研究人员、兽医、医生或临床医师所寻找的。确定合适的有效量或治疗有效量是在本领域技术人员日常水平之内的。

本文所使用的术语“给药”(“administering”,“administer”,“administration”等等)是指将治疗剂转移、递送、引入或转运给需要用此剂治疗的受试者的任何方式。这些方式包括但不限于口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮内、鼻内和皮下给药。

本文所使用的术语“杀菌”、“杀菌抗生素”等是指杀灭细菌的抗生素，与“抑菌抗生素”相对，后者是减慢细菌生长或繁殖的抗生素。杀菌抗生素是通过抑制细胞壁合成和/或通过抑制细菌酶或蛋白质翻译而杀灭细菌的。杀菌抗生素的例子包括但不限于β-内酰胺类抗生素(例如青霉素衍生物(青霉素和半合成青霉素，带有或不带克拉维酸之类的β-内酰胺酶抑制剂)、头孢菌素类(cephams)、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类)以及万古霉素、达托霉素、氟喹诺酮类、甲硝唑、呋喃妥因、复方新诺明、泰利霉素和氨基糖苷类抗生素。但是，还应当注意的是，活化MSC治疗也可通过抑菌抗生素改善细菌清除，抑菌抗生素包括氯霉素和四环素类。多种类型的抗生素(即一种或多种杀菌抗生素单独或者与一种或多种抑菌抗生素联合)也是可以使用的。

“Toll样受体(TLR)”是指在固有免疫系统中起关键作用的一类蛋白质。这些蛋白质一般是在巨噬细胞和树突状细胞之类的免疫系统哨兵细胞中表达的。它们识别源自微生物的结构上保守的分子。TLR的例子包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13。最优选的将是已知由MSC表达的TLR，包括TLR2、TLR3、TLR4、TLR7/8和/或TLR9。

“核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)受体”在调节固有免疫应答方面也起到关键作用。它们被发现在淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和非免疫细胞(即上皮细胞和MSC)中，并能与TLR配合或单独起作用来调节炎症反应。

包括RIG-1或STING或CDA受体在内的固有免疫受体的其他类型也在胞内引入刺激性配体特别是病毒和细菌核酸之后激活固有免疫应答方面起到关键作用。它们被发现在淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和非免疫细胞(即上皮细胞和MSC)中，并能与TLR配合或单独起作用来调节炎症反应。

本文所使用的术语“激动剂”是指与受体结合使用时会引起生理反应的物质。相反，“拮抗剂”是干扰或抑制另一生理作用的物质。

伤口愈合

伤口愈合是身体组织(即皮肤)在外伤或损伤之后修复自身的过程，它通常被分成几个阶段：止血(血液凝固)、炎症、增生(组织生长)和成熟(组织重构)。

皮肤组织损伤和血管破坏之后是纤维蛋白凝块的形成，其功能是减缓或阻止更多流血并提供细胞迁移进伤口的基质。这就是伤口愈合的止血阶段。

接下来，在炎症阶段，被各种分子吸引的中性粒细胞吞噬异物和细菌，分化成巨噬细胞的单核细胞迅速加入其中。巨噬细胞进而吞噬微生物、胞外基质片段、纤维蛋白、中性粒细胞、红细胞和其他碎片，也分泌被认为对有效伤口修复至关重要的各种分子。在慢性伤口中，该阶段的一种或多种组分可能调控异常，从而导致延迟的伤口愈合。M2表型的巨噬细胞被认为是促进伤口愈合最有效的。

在增生阶段，发生血管生成、胶原沉积、纤维增生和肉芽组织形成、上皮化和伤口收缩。最后，在成熟和重构阶段，胶原被重排，伤口的抗拉强度增强了，任何非必需细胞都通过凋亡被去除。

伤口愈合的这些阶段通常是以可预测的方式进展的，然而当它们不是这样时，就可能产生慢性伤口或病原性结疤。伤口愈合进程的速率、速度和/或有效性可能受到局部和/或全身性因素影响。例如，局部因素可以包括水分、机械因素、水肿、缺血和坏死、异物存在、低氧张力和/或灌注。全身性因素可以包括炎症、糖尿病、营养状态、代谢疾病、免疫抑制、结缔组织失调、抽烟、年龄和/或饮酒。

伤口愈合的并发症可以包括慢性感染的发生、疤痕形成缺陷或过量、冗长肉芽和/或有缺陷的伤口收缩。在这些并发症中，最严重的是慢性感染的发生，特别是与生物膜形成有关的感染，包括皮肤和骨组织的感染、骨科或手术植入物的感染、或者用于手术修复的材料的感染，包括金属骨科材料(板、螺钉、销)、网状物(血管滤器、重建网)以及医学植入物(起搏器、分流器)和血管通路端口及导管。这些感染通常也涉及到细菌的多药耐药性(MDR)菌株。这些细菌包括革兰氏阴性病原体(例如大肠杆菌、不动杆菌、克雷伯氏菌、肠杆菌、假单胞菌)和革兰氏阳性病原体(例如葡萄球菌、链球菌、肠球菌)。还应当注意的是，事实上所有革兰氏阴性和革兰氏阳性菌株都能够体内形成生物膜。

间充质干细胞

间充质干细胞(MSC)是能够分化成成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞的多能干细胞。在组织培养条件下，MSC显示出塑料粘附性，最常分类为CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD11b⁺、CD14^-、CD19^-、CD34^-、CD45^-、CD79a^-和HLA-DR^-细胞，尽管如此，应当注意的是分离自不同组织源的MSC都将显示不同的表面表型。MSC的抗微生物性可以随不同组织源而不同，因此在一定程度上对其对抗细菌感染的有效性被认为是不可预测的。

间充质干细胞(MSC)是神经嵴起源的细胞亚群，在体内大多数组织中以较低数量存在。来自各种来源的间充质干细胞都已在动物模型脓毒症、伤口愈合和感染中显示出抗微生物活性。(参见Krasnodembskaya等人,Stem Cells 28(12):2229-38(2010)；Krasnodembskaya等人,Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 302(10):L1003-13(2012)；Al-Anazi等人,“Chapter 9:Mesenchymal Stem Cells Their AntimicrobialEffects and Their Promising Future Role as Novel Therapies of InfectiousComplications in High Risk Patients”,dx.doi.org/10.5772/60640(2015)；Maxson等人,Stem Cells Trans Med 1(2):142-49(2012)；和Mei等人,Am J Respir Crit Care Med182(8):1047-57(2010)。MSC上Toll样受体(TLR)的存在和TLR配体对MSC活性的影响也已得到研究。(参见Lieneke I.Bouwman,论文标题为“Microbial ligands alter the fate ofstem cells TLR activation influences survival,proliferation,differentiation,and function of stem cells”,Universiteit Utrecht,Faculty of VeterinaryMedicine,department Infectious Diseases&Immunology,2009年7月13日)。这些研究结果已经有大量关于MSC对最终产生的性质的影响方面的经常相互矛盾的信息。例如，研究人员已表明，用TLR3配体的MSC的活化事实上增强了MSC的免疫抑制功能，这种作用对于伤口治疗来说通常会是禁忌性的。(参见Zhou等人,Nat Commun 5:3619(2014)；Cassatella等人,Stem Cells 29(6):1001-11(2011)；和Zhao等人,Stem Cells 32(2):p.521-33(2014)。因此，通过其TLR而由预活化MSC所产生的净效果(积极或硝基)是很难预测的，特别是当涉及到慢性感染伤口的治疗时，这种伤口显示出细菌和细菌生物膜之间的复杂相互作用，以及随时间推移而产生的免疫应答。

但是，MSC(或其组合物)治疗慢性生物膜感染的用途在以前尚未被评估过。

MSC能够从各种组织中获得或得到，包括例如骨髓、脂肪组织、胎盘、羊水、脐带组织、脐带血、成人肌肉、角膜基质、皮肤组织和/或牙髓。

MSC的大多数实验性和临床性研究都使用源自骨髓的细胞(BM-MSC)或者源自脂肪组织的细胞(Ad-MSC)。但是，BM-MSC和Ad-MSC的使用确实存在潜在缺点，因为当自体MSC被使用时，供体年龄极大影响了MSC的免疫性和抗微生物性，这是由于来自年老患者或动物的细胞通常功能更差。而且，当使用来自无关供体的MSC(即同种异体MSC)时，存在供体之间的变异性问题以及确保MSC无病原体的问题。此外，MSC能够在它们衰老并丧失其有效性之前仅进行有限的体外扩增，从而极大限制了由单一供体所能够产生的MSC数量。

这个问题的一种解决方法是使用源自诱导性多能干细胞(iPSC)的MSC。iPSC能够从许多不同的成人组织中产生，并分化成MSC，在本文中被称为“iMSC”。与iMSC的使用相关联的几个优点包括它们能够无限增殖的事实，即使源自年老个体、它们也可以恢复年轻MSC的功能，以及它们能够被用作治疗多个患者的单一细胞源。

因此，iMSC细胞系是从小鼠和狗iPSC两者中产生的，并评估了它们体外显示杀菌活性的能力。但是，如前所述的MSC抗微生物活性的不可预测性使得不可能预测iMSC的抗微生物活性。而且，已发现iMSC表达非常不同于常规BM-MSC或Ad-MSC的表面表型。

但是，发现在其表现出的体外杀灭葡萄球菌的能力方面，小鼠活化IMSC等价于小鼠Ad-MSC。(参见图25)。在抗微生物活性方面，还用犬iMSC相比于Ad-MSC获得类似的结果。

因此，iMSC是能够用于治疗耐药性慢性细菌感染的MSC另一来源。而且，为了甚至更强的抗微生物活性，iMSC亚群可以在用于临床患者之前可能从iMSC细胞系中进一步体外选择，因此使iMSC甚至比常规BM-MSC或Ad-MSC更为有效。

MSC的活化

已表明MSC通过抗微生物肽的分泌来发挥抗微生物作用。(参见Krasnodembskaya等人,Stem Cells 28(12):2229-2238(2010)，通过引用将其并入本文)。也已表明MSC同时在培养基中分泌抗微生物因子。(参见图9)。例如，鼠、狗和人MSC都产生胞外Cramp，它是杀灭革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的重要抗微生物肽。(参见图14和15)。

已表明使用Toll样受体(TLR)配体的MSC活化增强了该抗微生物作用。(参见Johnson等人,The Journal of Immunology 190(1):Supplement 180.11(2013)，通过引用将其并入本文；也参见Zhao等人,Stem Cells 32(2):521-33(2014))。然而，在Johnson文献中，抗微生物活性仅是体外证实的，且仅针对金黄色葡萄球菌的完全抗生素易感株。而且，在Johnson等人的文献中，发现MSC的活化在体外实际上并不增强其抗菌活性，这是通过体外杀菌测定所评估的。因此，将不可能预测到活化MSC会有针对慢性伤口感染的体内活性，事实上Johnson等人的出版物将会给出活化MSC的体内应用的相反教导。而且，也不可能会预测到MSC针对除了非耐药性金黄色葡萄球菌之外细菌菌株的活性。也不可能会预测到针对高耐药性细菌株的体内活性。最后，也不可能会预测到MSC在包含多种不同高耐药性细菌株的混合感染(例如包含MDR大肠杆菌和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的感染)中的活性。

相比之下，如本文所证实的，活化MSC的体内静脉内给药降低了伤口组织中随时间推移的细菌负荷(参见下文实施例2)，减少了伤口部位的活细菌(参见下文实施例3)，并显示出体外杀菌(参见下文实施例9)。而且，也表明活化MSC的静脉内给药对于慢性伤口感染的治疗是体内有效的。(参见下文的实施例4-5、7、10和17-20；也参见图18-24)。同样，如下文表1显示，活化MSC在体内有效抵抗了高耐药性细菌株，也同时有效抵抗了多种不同的高耐药性细菌株。

此外，甚至更难预测到MSC抵抗例如糖尿病患者中的高耐药性感染的活性，已知糖尿病患者具有明显的免疫缺陷，限制了其控制慢性细菌感染的能力。不希望被特定理论所束缚，证据表明活化MSC是通过免疫介导的机制起作用的，该机制在糖尿病伤口之类的血管化降低的组织中会被预期为受限的。(参见图11-13、16)。然而，已证实了活化犬MSC在患有糖尿病和慢性(6个月)膝关节术后感染的狗中具有预料不到的强活性，而重复的多轮抗生素疗法都对它无效。在单剂静脉内给药MSC之后(参见图22)，伤口就已经部分愈合了，更重要的是，几个月来伤口培养物首次变成阴性。

此外，如本文所述，使用一种或多种TLR3、TLR9、TLR4和/或NOD受体激动剂活化的MSC增强了这些细胞的抗微生物作用。TLR激活剂的合适例子包括但不限于聚腺苷-聚尿苷酸(poly(A:U))、聚肌苷-聚胞苷酸(poly(I:C)或pIC)、CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)、抑制性寡聚脱氧核苷酸(ODN)、细菌DNA、质粒DNA、合成的双链DNA或单链RNA、细菌脂多糖(LPS)、单磷酰脂质A(MPLA)和/或TLR7/8配体(例如咪喹莫特)。此外，MSC活化也能使用NOD配体来实现，所述NOD配体包括肽聚糖、尿酸、高浓度钾、单链RNA和其他NOD配体。

能够通过将MSC与有效量的激活剂在体外或离体孵育来活化MSC。例如，能够将MSC与激活剂(即pIC)孵育1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多小时。尽管确定激活剂的合适浓度是本领域技术人员常规范围之内的，但考虑了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/ml或更高的浓度。在一个实施方案中，通过与10μg/ml pIC体外孵育两小时来活化MSC。

MSC的活化也增加了其迁移。例如，使用Boyden小室评估了MSC应答趋化因子梯度的迁移能力，其中底部小室中含有SDF-1(干细胞来源因子-1，用于MSC的趋化因子)，上部小室中含有MSC。发现用pIC活化的MSC的迁移明显强于未活化MSC的迁移。(参见图26)。活化MSC更多迁移到炎症部位，这对于它们在静脉内注射后能够找到感染伤口来说是重要的，因为感染伤口会产生高水平的SDF-1。

此外，在迁移到伤口部位和募集宿主免疫效应细胞(即中性粒细胞和单核细胞)方面，活化MSC具有最强的免疫学性质(参见图16)，与未被活化的间充质干细胞相比，活化间充质干细胞表现出增强的抗微生物活性。

在根除慢性感染伤口中的细菌方面，活化MSC和抗生素之间存在很强的协同相互作用。

给药

本文所描述的有效量的活化MSC或任何组合物都能经由口服、局部、静脉内(i.v.)、动脉内、眼内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内或皮下的给药途径而给药给受试者。

在一个实施方案中，活化MSC是静脉内给药的。如图4所示，静脉内给药的MSC在降低伤口细菌负荷方面比SC给药明显更有效。而且，静脉内给药的活化MSC最初在肺部被困住了，但它们能够离开肺部并迁移到整个身体的炎症部位。(参见图6和8)。

能够使用本领域已知的任何合适的给药方案来给药本文所描述的活化MSC或组合物。间充质干细胞和/或组合物能够作为单剂给药，或者能够以多剂(即2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多剂)进行给药。

通常来说，患者将接受多于一剂(即2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多剂)的本文所描述的任何组合物和/或活化MSC。当给药多于一剂时，能够规律性或不规律性间隔地给药。以非限制性举例的方式，能够每日、每周、双周、每月或双月给药剂量。例如，能够每1、2、3、4、5、6或7天给药剂量；每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周给药剂量；和/或其任何组合。

在一个非限制性例子中，在6周期间给药三次(即每两周一次)分开的剂量(即三次治疗)。

在一些实施方案中，每kg体重能每剂给药1×10⁴至1×10⁸个细胞。例如，可通过静脉输液管在15分钟时间内每kg体重缓慢给药约2×10⁶个细胞。

确定用于具体伤口类型治疗的合适剂量(每kg体重的活化间充质干细胞)、给药速度、给药剂数和/或给药频率是本领域技术人员常规水平之内的。

本文所描述的活化MSC和组合物可另外包含有效量的一种或多种抗菌剂，诸如杀菌抗生素(例如青霉素衍生物(penams)、头孢菌素类(cephams)、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类、万古霉素、达托霉素、氟喹诺酮类、甲硝唑、呋喃妥因、复方新诺明、泰利霉素和/或氨基糖苷类抗生素)。选择合适的杀菌抗生素及其有效剂量是本领域技术人员常规水平之内的。此外，在一些实施方案中，能够给药一种或多种抑菌抗生素(单独或者与一种或多种杀菌抗生素联合)。

当与抗生素疗法联合时，全身给药活化MSC能有效清除与慢性感染伤口相关联的细菌。而且，MSC的全身给药也与慢性感染模型中更多的伤口愈合细节相关联。

组合物

本文提供的是输液现用MSC群并结合一种或多种药学或兽医学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或溶媒，已将MSC活化以增强其抗微生物作用。这些组合物增强了哺乳动物感染性或深层伤口的愈合。

术语“药学可接受的”和“兽医学可接受的”是指药学或兽医学可接受的材料、组合物或溶媒，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包衣材料。从与药物制剂中的其他组分相容这种意义来说，每种组分都必须是“药学可接受的”或“兽医学可接受的”。还必须适用于与人体和动物组织或器官接触而没有过量毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性或者其他问题或并发症，要与合理的收益/风险比相称。(参见Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第21版；Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients,第5版；Rowe等人编辑,The PharmaceuticalPress and the American Pharmaceutical Association:2005；Handbook ofPharmaceutical Additives,第3版；Ash和Ash编辑,Gower Publishing Company:2007；Pharmaceutical Preformulation and Formulation,Gibson编辑,CRC Press LLC:BocaRaton,FL,2004))。

在各个实施方案中，活性MSC群可以是同种异体或自体的。

本文所描述的任何组合物可另外包含有效量的一种或多种抗微生物剂，诸如杀菌抗生素(单独或者与一种或多种抑菌抗生素联用)。示例性的杀菌抗生素包括但不限于青霉素衍生物(penams)、头孢菌素类(cephams)、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类、万古霉素、达托霉素、氟喹诺酮类、甲硝唑、呋喃妥因、复方新诺明、泰利霉素、氨基糖苷类抗生素及其任何组合。当抗生素与活性MSC联用时，观察到了强协同作用。(参见图10)。或者，可以考虑活性MSC加上氯霉素、红霉素、克林霉素或四环素类之类的抑菌抗生素的组合。

本公开的药物组合物要配制成与其原定给药途径(即肠胃外、静脉内、动脉内、皮内、皮下、口服、吸入、经皮、局部、经粘膜、腹膜内或胸膜内和/或直肠给药)相容。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液能够包括以下成分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，诸如乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，以及氯化钠或右旋糖之类的毒性调节剂。pH能够用酸或碱调节，诸如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂能够被封装在玻璃或塑料制成的安剖瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适用于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散体、以及用于细胞的无菌注射溶液或分散体的现用现配制剂的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有情况下，组合物都必须是无菌的，流动性应达到易于注射的程度。在生产和储存条件下必须是稳定的，务必防止细菌和真菌之类的微生物污染作用。载体能够是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多羟基化合物(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等等)及其合适的混合物。适当流动性的维持能够通过例如使用卵磷脂之类的包衣、通过维持分散体情形下的所需粒径以及通过使用表面活性剂。防止微生物活动能够通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等。在一些实施方案中，将希望在组合物中包括等渗剂，例如糖、甘露醇、山梨糖醇之类的多元醇、氯化钠。延长注射组合物的吸收能够通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来实现，例如单硬脂酸铝和明胶。

无菌注射液能够通过将所需量的活性化合物加入到根据需要含有上面列举的一种或组合组分的合适溶剂中、然后通过过滤灭菌而制备。一般而言，分散体是通过将活性化合物加入到无菌溶媒中来制备的，无菌溶媒中包含基本分散介质和所需的上面列举的其他组分。在用于无菌注射液制备的无菌粉末例子中，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其得到活性组分加上任何另外所希望的组分的粉末，所希望的组分来自于它的事先无菌过滤溶液。

在一些实施方案中，MSC也可在给药前预载抗生素，以增加直接递送到感染伤口部位的抗生素，其利用MSC作为递送机制。特别适用于该递送方法的抗生素包括在细胞中具有高溶解度的抗生素，包括但不限于氟喹诺酮类、氯霉素、四环素类和甲硝唑。MSC预载抗生素能够通过在将载有抗生素的MSC给药给宿主之前、培养带有一种或多种抗生素的MSC而实现，该抗生素是跨膜易溶的。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。能够将它们包装在明胶胶囊中或者压制成片剂。为了口服治疗给药的目的，活性化合物中能够加入赋形剂并以片剂、锭剂或胶囊形式使用。口服组合物也能使用载液来制备用作漱口剂，其中载液中的化合物经口服、漱口、咳出或吞下。药学相容的粘合剂和/或佐剂材料能够被包括作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等都能包含任何以下组分或类似性质的化合物：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖，崩解剂，诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或者调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精。

对于吸入给药，化合物是以来自加压容器或分配器或雾化器的气溶胶喷雾剂形式递送的，所述加压容器或分配器含有合适的推进剂，例如二氧化碳之类的气体。

全身给药也能通过经粘膜或经皮方式。对于经粘膜或经皮给药，在配方中使用了适合于欲穿透的屏障的渗透剂。这些渗透剂通常是本领域已知的，包括例如用于经粘膜给药的去污剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药能够通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂实现。对于经皮给药，如现有技术通常已知的将活性化合物配制成软膏剂、药膏、凝胶或乳膏。

化合物也能制备成用于直肠递送的栓剂(例如带有可可油和其他甘油酯之类的常规栓剂基质)或保留灌肠形式。

在一个实施方案中，活性化合物制备为带有防止化合物被迅速从体内清除的载体，诸如控释制剂，其包括植入物和微胶囊化的递送系统。生物可降解的、生物相容聚合物都能使用，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这些制剂的制备方法对于本领域技术人员来说将是显而易见的。材料也能从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals,Inc.商业获得。脂质体悬浮液(包括靶向感染细胞的带有抗病毒抗原单克隆抗体的脂质体)也能用作药学可接受的载体。这些能够根据本领域技术人员已知的方法制备，例如美国专利第4,522,811号中所描述的。

为了容易服用和剂量均匀度，特别有利的是配制剂量单位型的口服或肠胃外组合物。本文所使用的剂量单位型是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有活性化合物的预定量，其经计算与所需药物载体一起可产生所期望的疗效。本公开的剂量单位型的规格取决于并直接依赖于活性化合物的独特特征和想达到的疗效、以及合成用于个体治疗的这种化合物的领域中所固有的限制。

药盒、药物和制品

活化MSC单独或者与一种或多种其他治疗剂(例如一种或多种杀菌抗生素)联合可用于制备药物，例如用于治疗感染性或深层伤口的药物。

还提供了用于治疗慢性感染伤口的药盒，其含有本文所描述的任何组合物，可选带有使用说明书。

还提供了制品，其包括含有本文所描述的任何组合物的容器以及用于治疗受试者中感染性或深层伤口的说明书。

本文所描述的任何组合物都能被包括在容器、包装或分配器中，并带有用药说明书。

治疗方法

本文所描述的任何组合物都能用于治疗哺乳动物中含多药耐药性细菌的慢性感染伤口。同样地，有效量的活化MSC也能用于治疗慢性感染伤口。例如，MSC的组合物能够用于治疗高耐药性感染。

活化MSC用于慢性伤口感染治疗用途的具体适应症包括治疗对感染的免疫力降低的糖尿病患者(参见图24)。例如，这些患者中的具体慢性伤口包括感染性溃疡(腿、足、手臂)、受感染的植入物、受感染的导管、骨髓炎和其他深层组织慢性感染。活化MSC用于伤口感染治疗的其他适应症包括治疗含有多种或多株MDR细菌的感染，其包括革兰氏阴性和革兰氏阳性感染的混合感染、以及不同革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的混合感染(参见图17-19)。

还提供了方法将组合物或活化间充质干细胞与杀菌抗生素和/或抑菌抗生素之类的一种或多种抗菌剂联合给药(例如在组合物或活化间充质干细胞给药之前、同时或者给药之后)。本文描述的活化MSC或组合物与杀菌抗生素疗法的具体组合是深层组织细菌感染的有效清除所必需的，并且在抗生素和活化MSC联合体内治疗深层细菌感染时观察到了强协同作用。(参见图10)。

例如，活化MSC和口服抗生素的联用导致了细菌负荷的显著降低。(参见图2)。同样地，这种联用还显著减少了深层伤口感染部位的活细菌数量(参见图3)。

此外，活化MSC也能够破坏金黄色葡萄球菌生物膜。使用生物膜peg测定在体外评估了MSC破坏金黄色葡萄球菌生物膜的能力。与生物膜单独或者与非活化MSC孵育的生物膜相比，生物膜状态的细菌与活化MSC的孵育显示出了生物膜的破坏。(参见图27)。此外，注意到了绿脓杆菌细菌生物膜中甚至更大的生物膜破坏。因为与生物膜产生相关联的植入物感染极其难于用常规抗生素疗法进行根除，本文描述的联合治疗(即使用活化MSC和抗生素)就将是有用的。

本文描述的任何组合物或者活化间充质干细胞的给药诱导了细菌清除和/或降低了感染伤口中的细菌负荷，这相应地能够增强感染伤口的愈合。

合适的组合物和/或活化间充质干细胞(单独或者与一种或多种杀菌和/或抑菌抗生素联用)能够在伤口发生时或者之后给药。此外，MSC也可预载一种或多种抗生素。

将理解的是，根据本公开的治疗实体的给药将与合适的载体、赋形剂和其他药剂一起给药，它们被加入到制剂中以提供改善的转移、传输、耐受性等等。许多合适制剂都能够在所有药物化学家已知的处方集中找到：Remington’s Pharmaceutical Sciences(第15版,Mack Publishing Company,Easton,PA(1975))，特别是其中由Blaug、Seymour编写的第87章。这些制剂包括例如散剂、糊剂、软膏剂、胶浆剂、蜡剂、油剂、脂质剂、含脂(阳离子或阴离子)溶媒(诸如Lipofectin)、DNA缀合剂、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳化碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。任何前述混合物都可适用于根据本公开的治疗和疗法，只要制剂中的活性成分不会被制剂所失活，并且制剂是生理上相容和给药途径耐受的。也参见Baldrick P.“Pharmaceutical excipientdevelopment:the need for preclinical guidance.”Regul.Toxicol Pharmacol.32(2):210-8(2000),Wang W.“Lyophilization and development of solid proteinpharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2):1-60(2000),Charman WN“Lipids,lipophilicdrugs,and oral drug delivery-some emerging concepts.”J Pharm Sci.89(8):967-78(2000),Powell等人“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA JPharm Sci Technol.52:238-311(1998)以及其中的引文中有关药物化学家公知的制剂、赋形剂和载体的更多信息。

本发明已得到描述，下面的实施例是以说明性而非限制性的方式提供的。

实施例

实施例1：活化MSC抑制深层组织金黄色葡萄球菌感染小鼠模型中的细菌伤口感染。

将手术补片植入到CD-1小鼠(每组n＝5只)中，已使用表达荧光素酶的金黄色葡萄球菌菌株(Xen36)在手术补片上形成生物膜，使得能够使用生物发光成像追踪感染。(参见Walton等人,Comp Med.64(1):25-33(2014)，通过引用将其并入本文)。随后将补片皮下植入以模拟深层手术植入物感染。安置植入物之后的第2天，将小鼠随机分配到以下治疗组中：未治疗对照；仅用抗生素(阿莫西林-克拉维酸，在饮用水中持续治疗)治疗；通过静脉内给药未经处理MSC的治疗；通过静脉内给药活化MSC的治疗；通过给药未经处理MSC加上抗生素的治疗；以及使用活化MSC加上抗生素的治疗。

以每只小鼠5×10⁵个细胞的剂量静脉内给药活化MSC，以3天间隔进行4次治疗。MSC是使用合成TLR3配体活化的。

在补片植入后每2-3天通过IVIS成像技术对小鼠成像，以评估对细菌负荷的治疗效果。每个治疗组一只小鼠中伤口的代表性IVIS图像描绘于图1中。

成像证实了用抗生素和活化MSC治疗的小鼠中感染的消失，而其他组小鼠中的感染还继续存在。发现治疗效果取决于3个关键因素：(1)MSC的活化；(2)MSC与抗生素疗法同时联合给药；(3)MSC的静脉内给药。

这些发现证实，将MSC局部直接注射到伤口中并未有效控制细菌感染，而联合抗生素的未活化MSC给药也未控制感染。(参见图3)。此外，当经皮下注射到感染伤口中时，单独给药的活化MSC也未改善细菌清除。因此，活化MSC和杀菌抗生素疗法的具体组合对于深层组织中细菌感染的有效去除是必需的。

实施例2：在小鼠金黄色葡萄球菌伤口感染模型中用活化MSC和抗生素治疗后，伤口组织中细菌负荷随时间的降低。

如上文实施例1所描述的，用活化MSC或抗生素或两者联合治疗已用浸滞了金黄色葡萄球菌的补片进行感染的CD-1小鼠(每组n＝5只)。使用IVIS成像定量伤口部位的金黄色葡萄球菌数量(图像强度与活细菌数直接成正比)，将萤光素酶的通量强度平均值(+/-SEM)对治疗时间作图。

与未治疗对照小鼠或用抗生素治疗的小鼠(Abx)或活化MSC单独治疗的小鼠(ActMSC)相比，用活化MSC+口服抗生素治疗的小鼠在治疗第13天时显著降低了细菌负荷。(参见图2)。

实施例3：在活化MSC联合抗生素治疗的递送之后，伤口感染部位活细菌的减少。

CD-1小鼠(每组n＝5只)具有慢性深层金黄色葡萄球菌感染，是使用如上文实施例1所描述的植入性感染补片产生的。然后通过用同种异体脂肪源的小鼠MSC以3天间隔重复3次静脉内注射来治疗小鼠。治疗组包括未治疗的对照动物(Ctrl)、仅用口服阿莫西林-克拉维酸(Abx)、单独MSC(MSC)、单独活化MSC(Act MSC)、未活化MSC加上抗生素(MSC+Abx)、或者活化MSC加上抗生素(Act MSC+Abx)治疗2周的动物。在2周治疗完成时候，将动物处死，收集感染部位的伤口组织，并经处理以使用定量铺板技术在LB琼脂四板上定量伤口组织中的活细菌菌数(集落形成单位或CFU)。

与其他治疗组的动物相比，用活化MSC加上抗生素治疗的小鼠显著降低了其在伤口部位的活细菌负荷。(参见图3)。图3也证实，当与抗生素一起给药时，未活化MSC并未有效控制感染。同样地，只有某些类型的抗生素显示出了触发MSC抗菌作用的活性。

总之，这些发现表明，当与杀菌抗生素联用时，活化MSC显著降低了深层伤口感染部位的活细菌数量。

实施例4：用于慢性伤口感染治疗的静脉内给药与直接伤口注射的对比。

用口服抗生素加上活化MSC治疗患有如上文实施例1所描述的金黄色葡萄球菌伤口感染的小鼠，通过在感染周围组织(SC)中直接注射或者经由静脉内途径给药。以3天间隔重复另外2次治疗。在第14天，收集伤口组织，通过铺板和集落计数确定组织中的细菌负荷。

图4所示结果证实，发现静脉内给药MSC比SC给药更为显著有效地降低了伤口细菌负荷。

实施例5：活化MSC给药加上抗生素对小鼠慢性感染模型中显微伤口愈合特征的影响。

如上文实施例1所述治疗带有金黄色葡萄球菌感染补片植入物的小鼠。在研究完成时(第21天)，将小鼠处死，解剖伤口组织以显露植入部位。图5描绘了未治疗伤口(上图)和用活化MSC加上抗生素治疗的伤口(下图)的代表性显微照片(H&E染色的组织切片，20X)。在治疗过的伤口中，显著降低了炎性细胞浸润，并且用成纤维细胞愈合组织替代了炎症。(参见图5)。

实施例6：活性MSC在静脉内给药后有效迁移到伤口感染部位。

通过免疫荧光成像评估了来自感染对照动物和来自静脉内注射了活化GFP转基因MSC(每只小鼠每次注射1×10⁶个MSC)的感染性动物的伤口组织，以检测伤口组织中的MSC。如图6所示，在右侧图像中在伤口部位明显累积了大量的GFP+MSC，这表明MSC在静脉内给药后有效迁移到了伤口中。

这些结果表明，即使大多数静脉内注射的活化MSC最初都困在了肺部，但细胞在之后都能有效离开肺部并在数天之后迁移到全身的炎症部位。这一发现突出了静脉内给药方法的主要优点之一，也就是使MSC能够进入身体任何感染部位，而不只是能够局部应用或者经由针注射它们时所在的皮肤部位。

实施例7：通过活化MSC的全身治疗促进伤口愈合。

如上文实施例1所述治疗带有金黄色葡萄球菌感染补片植入物的小鼠。在研究完成时(第21天)，将小鼠处死，解剖皮肤以显露植入部位。图7描绘了未治疗伤口(对照)和用活化MSC加上抗生素治疗的伤口的代表性照片，与未治疗的对照伤口(左图)相比，MSC治疗的伤口(右图)显然基本上愈合了。未治疗的伤口(左图)被含有脓液的反应性组织的厚囊所包围，而MSC+抗生素治疗的伤口(右图)则显示出非常少的炎症和没有脓液累积。最初植入的手术补片材料也能在治疗过的伤口植入物中看到，而在未治疗伤口中它就被脓液完全包围了。

仅仅在用活化MSC和抗生素治疗的小鼠组中观察到了伤口愈合效果。而且，图7所示结果表明，它们除了根除慢性深层细菌感染的能力之外，活化MSC给药也显著促进了伤口愈合、炎症和反应性疤痕组织形成的减少。

实施例8：DiR标记的MSC在静脉内给药之后迁移到感染伤口部位。

在金黄色葡萄球菌感染的小鼠的伤口中(详见上文实施例1)，用红外染料DiR(DiIC18(7)(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物))标记活化或未活化的MSC，并经静脉内注射到活小鼠中，然后在生物发光成像仪(IVIS)中成像以检测所注射MSC的迁移。注射48小时后，DiR+细胞在感染伤口区域就看得见了(中图和右图，方框区域)。

图8所示结果表明，注射了活化MSC的小鼠伤口区域(右图)比注射了未活化MSC的小鼠伤口区域(中图)存在实质上更多的DiR+细胞。在未注射MSC的对照小鼠(左图)中，未检测到红外信号。每只动物中的金黄色葡萄球菌伤口感染区域成像为蓝绿色区域(每幅图的左图)。每只小鼠中的大片阴影区域是肺部，而伤口浸润细胞的轮廓是方框区域。

静脉内注射的MSC被有效输送到感染伤口处，有可能是应答炎症组织所产生的趋化因子而被募集的，活化MSC的迁移比未活化细胞更有效。静脉内注射的MSC逐渐累积到感染伤口边缘的事实也表明，重复给药MSC对于诱导完全的细菌去除效果来说是重要的。

实施例9：MSC的体外杀菌。

通过将细菌直接与MSC体外共培养来评估MSC杀灭金黄色葡萄球菌的能力。将MSC(1×10⁵个细胞/孔)与细菌(10个细菌/孔)在96孔板中以三个平行孔方式进行共培养4h，然后从上清液中收集细菌，经手动计数确定CFU。结果显示于图9中。当从MSC中收集条件培养基并与细菌孵育时，也观察到了类似结果。

这些发现表明，MSC在培养基中自发分泌抗菌因子。

实施例10：当与抗生素疗法联合时，MSC显示出协同杀菌作用和高水平抗生素抗性的逆转。

使用如上文实施例9所描述的类似实验设计，将高抗生素抗性细菌株与单独的活化MSC、单独的抗生素(头孢唑林(cefa))、或者抗生素+活化MSC以三份平行培养方式孵育，在4h后评估杀菌。当细菌与极高剂量的抗生素孵育时，几乎未观察到杀菌。同样地，单独用活化MSC也未观察到明显杀菌。

但是，抗生素与活化MSC联合给药证实了与单独的活化MSC或单独的抗生素相比的协同杀菌作用。(参见图10)。而且，使用其他抗生素和使用其他细菌菌株也观察到了类似结果。此外，来自狗和人二者的MSC也都证实了这种协同作用。

这些发现支持了MSC疗法和持续抗生素疗法联合治疗慢性感染的基本原理，甚至可以使用据认为细菌对其有抗性的抗生素，这是因为它们证实了MSC所分泌因子和头孢菌素类、青霉素类和氨基糖苷类之类的常规杀菌抗生素之间存在独特的、此前未知的抗菌相互作用。此外，这种相互作用部分解释了抗生素和活化MSC体内联合治疗深层细菌感染时所观察到的强协同作用。

实施例11：活化MSC所产生的趋化因子刺激了体外单核细胞迁移。

使用迁移试验(Boyden小室)和狗血评估了来自MSC培养物的条件培养基(CM)刺激单核细胞迁移的能力。如图11所示，与来自MSC的CM孵育后，刺激了增强的单核细胞迁移，而与来自活化MSC(用pIC体外活化2h)的CM孵育后则刺激了更为显著的单核细胞迁移。

这些结果表明，用pIC活化MSC能够刺激单核细胞更多迁移到受伤部位(参见下文实施例12)。

实施例12：活化MSC的全身给药触发了单核细胞在伤口感染部位的募集。

已进行了研究来调查活化MSC对宿主免疫应答的影响，包括单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞应答。通过使用其所有炎性单核细胞都表达GFP的报告小鼠来确定迁移到伤口组织中的单核细胞的数量。将感染金黄色葡萄球菌的小鼠伤口进行免疫染色，以检测炎性单核细胞。

当通过静脉内给药活化MSC来治疗带有慢性金黄色葡萄球菌感染伤口的小鼠时(参见上文实施例1)，如图12所示，与未治疗的对照动物(左图)相比，浸润伤口的单核细胞数显著减增加了(右图)。来自未治疗的动物(左图)或单独用抗生素治疗的动物(未显示)的伤口含有相当稀少的单核细胞群，而来自用活化MSC治疗的动物(右图)伤口中含有非常密集的从血流中募集的单核细胞群。此外，在用活化MSC治疗的动物中，迁移到伤口组织中的单核细胞数明显比用未活化MSC治疗的多。

这些发现证实，在静脉内给药之后MSC就将宿主免疫细胞(单核细胞)募集到了组织中，也证实MSC的活化显著增强了这种单核细胞募集效果。活化MSC治疗的单核细胞募集效果很重要，因为单核细胞在组织中分化成巨噬细胞，而巨噬细胞是刺激伤口愈合的关键白细胞。

实施例13：活化MSC的治疗刺激了伤口部位伤口愈合巨噬细胞的分化。

如图13所示，从未治疗小鼠(左图)、用未活化MSC治疗的小鼠(中图)、用活化MSC治疗的小鼠(右图)中收集患有慢性金黄色葡萄球菌伤口感染的小鼠伤口组织，在第2周时收集感染伤口的组织并处理以检测诱导型表达一氧化氮的M1巨噬细胞(iNOS表达)和检测M2巨噬细胞(精氨酸酶表达)。用活性MSC治疗的(而不是用未活化MSC治疗的)小鼠伤口中含有的M2巨噬细胞明显比M1巨噬细胞更多，而在未治疗动物或用未活化MSC治疗的动物中观察到了正好相反的结果。

M2巨噬细胞是伤口愈合所必需的，因此M2巨噬细胞数的增加可能有助于解释为什么在用活化MSC治疗的动物中伤口愈合加速了。(参见上文实施例12)。

实施例14：MSC产生cathelicidin抗微生物肽LL-37。

如图14所示，将小鼠MSC免疫染色以检测抗微生物肽LL-37的胞内产生(左图)或用无关同种型对照抗体的免疫染色(右图)。在MSC中观察到了LL-37的丰富表达(左图)，而几乎没有观察到对照抗体的染色。

这些结果表明，鼠、狗和人MSC都产生胞内LL-37，它是杀灭革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的重要抗微生物肽。

当用MSC联合头孢唑林时所观察到的已证实协同杀菌作用很可能是由于MSC所释放的LL-37，它随后与抗生素协同作用以产生增强的杀菌作用。

实施例15：MSC的杀菌是部分依赖于cathelicidin LL-37产生的。

如图15所示，将MSC与细菌共培养，并评估了LL-37的中和效应。在对照MSC中、在还用中和LL-37的抗体进行处理的MSC中、在用无关抗体处理的MSC中评估了MSC的杀菌活性。抗Cramp抗体的加入显著降低了MSC的杀菌活性，这表明MSC杀菌是部分由抗菌肽LL-37的分泌所介导的。

实施例16：活化MSC所产生的因子触发了经由中性粒细胞的细菌吞噬增强。

已进行了研究来调查活化MSC对宿主免疫应答的影响，包括单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞应答。将中性粒细胞与来自MSC的条件培养基(CM)孵育2h，然后洗涤，再与金黄色葡萄球菌细菌孵育2h。经抗生素处理去除胞外细菌，通过用抗金黄色葡萄球菌抗体免疫染色来定位细菌。通过针对CD11b表达的免疫染色来定位中性粒细胞。与MSCCM的孵育明显增强了细菌吸收，如图16下图所示。与来自活化MSC的上清液进行孵育的中性粒细胞(右下图和左图)比对照中性粒细胞(右上图)或与来自未活化MSC的因子孵育的中性粒细胞(右中图)具有明显更强的吞噬性。

这些结果表明了一种机制，MSC可通过该机制与宿主免疫系统相互作用以加强细菌清除。而且，活化MSC对宿主先天免疫系统施加了较强影响，这能够有助于深层细菌感染的控制。

实施例17：活化MSC的静脉内给药触发了患有感染性外伤性足损伤的狗感染性足伤口中多株耐药性细菌的清除。

已在患有自然发生伤口和伤口感染的宠物狗中进行了临床研究，以评估活化MSC和抗生素疗法的有效性。在评估活化MSC治疗对伤口感染控制的有效性研究中加入了受严重外伤和带有感染足伤口的狗(参见图18和19)。该特定动物中的足伤口感染了两种高抗生素耐药性细菌分离株(大肠杆菌和绿脓杆菌)，并在加入到本研究之前已进行两周无效治疗。

用活化的同种异体犬MSC经3次静脉内输液(每kg体重2×10⁶个活化的同种异体MSC，输液15分钟时间，间隔两周一次)治疗爪伤口，通过治疗期间按时间顺序取得的连续定量培养物来确定感染伤口中的细菌计数(参见图17)。也给狗维持细菌对其有抗性的原有日用抗生素治疗，以避免混淆本研究的解释。

在MSC治疗之前(但同时仍进行抗生素治疗)，保持了很高的细菌计数。在第2周时(首次MSC治疗后)，MDR大肠杆菌和MDR假单胞菌两者的数量都实质上降低了，到第3次MSC输液完成时(第8周)，数量继续降低到了检测不到的水平。

也照相监测了所述感染爪伤口的伤口愈合，结果示于图18和19中。在活性MSC初次注射时(图18，Inj#1，上图)，爪伤口严重发炎和疼痛且未愈合。在第三次MSC注射时(图18，下图)，爪伤口已明显愈合，对狗来说不再疼痛。类似地，图19显示，与治疗前的伤口参数相比，2次MSC治疗后的4周时，伤口基本愈合了。

对于通过静脉内给药活化MSC联合抗生素来控制耐药性细菌感染方面，在用活化MSC和抗生素治疗的另外4只患有慢性伤口感染的狗中获得了类似结果。这些狗包括患有数月的长期膝关节术后感染的两只狗(参见图20)、一只带有慢性的受感染起搏器导线的狗和一只带有慢性的受感染骨板的狗(参见图21)。在所有4个病例中，在开始静脉内给药活化的同种异体犬MSC之后，细菌计数就明显降低或清除了，伤口基本愈合了。

从用活化MSC治疗的患有MDR感染的狗中获得的汇总数据提供于下面的表1中。临床数据来自7只患有各种不同部位MDR伤口感染的狗，它们很难用常规抗生素治疗，将它们加入并在评估活化的犬MSC的抗微生物治疗有效性的临床试验中进行治疗。评估了所有狗在6周时愈合的细菌学和微生物学证据。

表1

总而言之，所有这些发现都表明，活化MSC产品能够从无关供体动物(即同种异体细胞)获得且仍有活性。而且，活化MSC的人临床应用真实剂量就能够有效根除真实伤口感染模型中高耐药性微生物的复杂混合物。

这些结果也证实，当活化MSC全身给药给患有高耐药性细菌感染的动物中时，它们具有很强的愈合活性。此外，这些结果是在人细菌感染的自发性真实动物模型中获得的，因此这些发现能够很容易应用到人或动物感染的治疗中。

实施例18：用活化MSC加上抗生素治疗术后感染狗中的慢性关节感染。

将患有未缓解术后膝关节感染的一只狗加入到评估活化的犬MSC抗微生物性的研究中，狗在1年期间已继续进行了另外2次手术和多个抗生素疗程。在研究期间，狗保持原来的(无效的)抗生素治疗方案，同时接受3次间隔2周的活化同种异体犬脂肪源MSC输液。通过关节液细胞学的连续评估来监测治疗反应，关节液是通过关节穿刺获得的。(参见图20)。

最初的关节液含有大量炎性细胞，在治疗期间开始迅速消失，直到研究的第8周，关节液就正常了。此外，狗在临床方面得到了显著改善，到第8周时就可能开始再次正常使用四肢了。狗在1年之后保持了临床正常。

因此，这些发现表明，在与人术后感染非常相似的自发疾病模型中，活化MSC治疗联合抗生素能够有效防止甚至在膝关节之类部位的深层感染。

实施例19：患有MDR肠球菌皮肤感染的狗的伤口愈合。

一只狗在外伤性皮肤伤口修复之后发生了MDR肠球菌某个种(Enterococcus sp)感染，该感染对抗生素治疗无效。因此，将这只狗加入到了评估活化的犬MSC解决伤口感染并刺激伤口愈合的能力的临床试验中。在研究期间，这只狗接受了活化的犬同种异体脂肪源MSC在8周时间内的3次静脉内系列输液。在研究完成时，与治疗前相比，伤口基本上愈合了(参见图21，左图)，肠球菌不再能够从伤口中培养出来(参见图21，右图)。

实施例20：用活化的MSC和抗生素疗法对狗骨髓炎和骨板感染的治疗。

一只狗在用骨板修复骨折之后发生了慢性和抗生素抗性感染。(参见图22，左图)。然后用活化的同种异体犬MSC以2周间隔输液3次治疗这只狗，同时保持原来的抗生素治疗。在治疗之前和活化MSC首次静脉内输液之后2周时，从带有已感染多种不同MDR细菌种的骨板的狗中进行定量培养。一次MSC注射之后，在治疗第4周时从感染伤口分离到的细菌数量就明显降低了。(参见图22，右图)。

这些发现表明，活化MSC的全身给药也能有效防止骨板之类的植入物感染，众所周知很难单独用抗生素治疗植入物感染。尽管有这种已知困难，活化MSC和抗生素疗法的组合还是在MSC给药仅仅2周内就产生了细菌计数的显著下降。

实施例21：用活化的猫间充质干细胞全身治疗之后，猫慢性MDR伤口感染的愈合和清除。

一只猫自发发生血管炎及随后颈部和背部上大片皮肤的丧失。使用频繁更换绷带来管理伤口，但随后变成感染了几种不同细菌分离株。对这只猫进行抗生素治疗(恩诺沙星)，但伤口继续感染并严重坏死，这只猫变成全身都生病了。

在加入抗微生物干细胞研究时，伤口培养物产生了高耐药性中间葡萄球菌(Staphylococcus intermedius)。这只猫随后接受了活化的猫同种异体MSC的系列静脉内输液，每kg体重给药2×10⁶个细胞的剂量，每两周给药进行3次治疗。在治疗试验期间，这只猫继续只用葡萄球菌分离株对其有抗性的恩诺沙星治疗。

结果示于图23中。在接受首次干细胞治疗之后24h之内，这只猫在临床上就显著改善了。在3周时复检，尽管从伤口液中分离出了葡萄球菌(Staphylococcus)，但伤口明显更小，观察到更少的流出物。在第5周时，伤口还更小了，伤口组织看起来健康得多，伤口培养物都是阴性。在7周时，伤口几乎完全愈合，伤口培养物都是阴性。这只猫不再接受更多治疗，伤口被认为解决了。

实施例22：患有糖尿病的狗中带有多株MDR细菌的慢性伤口感染的治疗。

图24显示了患有糖尿病和慢性感染性术后伤口的狗中的伤口愈合和感染解决。一只长期存在糖尿病的狗发生了膝关节术后伤口感染，在用几种抗生素治疗后的3个月时间都一直很难进行常规抗生素治疗。

在进入干细胞试验时，伤口是红色并且发炎的并渗出化脓物质。用2×10⁶个细胞/kg的活化同种异体犬MSC的系列静脉内输液对这只狗进行治疗，以2周间隔进行给药。治疗前的定量伤口培养物显示了2种不同的高MRD表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)分离株。

首次MSC输液后两周，伤口外观已经改善了，其主人报告说狗没有那么跛了。此外，返回的伤口培养物没有生长。在第二次MSC输液之后，伤口外观已经显著改善了，伤口培养物再次阴性了。在第4周伤口上出现的浆液性渗出物(参见图24)是无菌的，此前也已在用活化MSC治疗期间的其他伤口中观察到，通常会自发解决。

实施例23：加载抗生素的MSC和抗生素疗法对慢性伤口感染的治疗。

在培养基中体外扩增MSC，然后与透细胞的抗生素(例如喹诺酮类、四环素类、甲硝唑)孵育1-2小时，同时、之前或随后用pIC活化。在如上所述静脉内输液之前洗涤和收集已活化并加载的MSC。间隔1-2周用加载抗生素的细胞重复治疗，直到伤口解决。

本方法的优选患者(与不加载抗生素的MSC对比)将包括患有特定耐药性感染(例如高耐药性感染)的受试者，患有口服或静脉内递送后的抗生素不能穿透组织的感染的患者；和不希望口服或肠胃外给药以避免破坏正常细菌群的患有感染的患者(例如艰难梭菌(C.difficile)易感患者)。

等同内容

在上面所附描述中阐述的是本发明的一个或多个实施方案的细节。与本文所描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料都能用于本发明的实施或测试中，然而现在还是描述了优选的方法和材料。

前述说明仅仅是为了说明的目的而进行介绍的，并不旨在将发明限制于所公开的精确形式，而是通过本文所附的权利要求进行限制。

Claims (61)

1.组合物，其包含输液现用的同种异体间充质干细胞群以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述间充质干细胞已通过暴露于一种或多种激活剂而被活化，所述激活剂选自Toll样受体3(TLR3)激动剂、Toll样受体9(TLR9)激动剂、Toll样受体4(TLR4)激动剂、核寡二聚体化结构域(NOD)受体激动剂、RIG-I受体(RLR)激动剂、胞浆DNA感应蛋白(CDS)激动剂和STING受体激动剂。

2.权利要求1所述的组合物，其中组合物被配制成用于静脉内给药。

3.权利要求2所述的组合物，其中同种异体间充质干细胞群是从骨髓、脂肪组织、脐带血、组织活检或者诱导的多能干细胞(iPSC)获得或得到的。

4.权利要求3所述的组合物，其中组织活检是皮肤活检或牙活检。

5.权利要求1所述的组合物，其中同种异体间充质干细胞群是通过使用一种或多种激活剂孵育至少2小时而被活化的。

6.权利要求5所述的组合物，其中孵育是在体外或离体进行的。

7.权利要求1所述的组合物，其中TLR3激动剂选自聚腺苷-聚尿苷酸(poly(A:U)、聚肌苷-聚胞苷酸(pIC)和UV灭活的病毒颗粒。

8.权利要求7所述的组合物，其中UV灭活的病毒颗粒是痘病毒颗粒。

9.权利要求1所述的组合物，其中TLR9激动剂选自CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)、抑制性寡聚脱氧核苷酸(ODN)、纯化的DNA以及纯化或合成的质粒DNA。

10.权利要求1所述的组合物，其中TLR4激动剂选自细菌脂多糖(LPS)和单磷酰脂质A(MPLA)或热灭活革兰氏阴性菌。

11.权利要求1所述的组合物，其中NOD受体激动剂选自NOD1、NOD2和NOD1/2混合激动剂。

12.权利要求11所述的组合物，其中NOD1受体激动剂是二肽IE-DAP(iE-DAP(γ-D-Glu-mDAP)。

13.权利要求11所述的组合物，其中NOD2受体激动剂选自胞壁酰二肽(MDP)及其合成衍生物。

14.权利要求13所述的组合物，其中合成衍生物是mirabutide。

15.权利要求11所述的组合物，其中混合NOD1/2激动剂选自革兰氏阳性菌和合成的分子MurNAc-L-Ala-gamma-D-Glu-mDAP(PGN样分子)。

16.权利要求1所述的组合物，其中RLR受体激动剂选自双链RNA、合成的pAT RNA和合成的pIC RNA。

17.权利要求1所述的组合物，其中CDS激动剂是分离自细菌的双链DNA。

18.权利要求1所述的组合物，其中STING受体激动剂选自环二核苷酸；3,3-环-gAMP；2,3-环-gAMP；2,2-环-gAMP；环二-GMP和环二-UMP。

19.权利要求2所述的组合物，其中激活剂是10μg/ml的聚肌苷-聚胞苷酸(pIC)。

20.权利要求1所述的组合物，其中该组合物还包含有效量的一种或多种抗微生物剂。

21.权利要求20所述的组合物，其中一种或多种抗微生物剂是杀菌抗生素。

22.权利要求21所述的组合物，其中杀菌抗生素选自青霉素衍生物(penams)、头孢菌素类(cephams)、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类、万古霉素、达托霉素、氟喹诺酮类、甲硝唑、呋喃妥因、复方新诺明、泰利霉素和氨基糖苷类抗生素。

23.权利要求20所述的组合物，其中一种或多种抗微生物剂是抑菌抗生素。

24.权利要求23所述的组合物，其中抑菌抗生素选自四环素类抗生素、氯霉素、红霉素、克林霉素和利奈唑胺。

25.权利要求24所述的组合物，其中四环素类抗生素选自四环素、多西环素和米诺环素。

26.权利要求20所述的组合物，其中同种异体间充质干细胞是哺乳动物间充质干细胞。

27.权利要求26所述的组合物，其中同种异体间充质干细胞是人间充质干细胞。

28.权利要求1所述的组合物，其中该组合物增强了哺乳动物中带有MDR细菌的慢性感染伤口的愈合。

29.治疗哺乳动物慢性感染伤口的方法，该方法包括将有效量的活化间充质干细胞给药给哺乳动物。

30.权利要求29所述的方法，其中活化间充质干细胞诱导细菌清除，降低细菌负荷，或者在感染伤口中诱导细菌清除并降低细菌负荷。

31.权利要求30所述的方法，其中活化间充质干细胞被静脉内给药给哺乳动物。

32.权利要求30所述的方法，其中间充质干细胞是从骨髓、脂肪组织、脐带血、组织活检、血液或者诱导的多能干细胞(iPSC)获得或来源的。

33.权利要求32所述的方法，其中iPSC来源于组织活检或血细胞。

34.权利要求33所述的方法，其中活检是皮肤活检或者牙活检。

35.权利要求31所述的方法，其中间充质干细胞是通过使用一种或多种激活剂孵育而被体外或离体活化的，所述激活剂选自Toll样受体3(TLR3)激动剂、Toll样受体9(TLR9)激动剂、Toll样受体4(TLR4)激动剂、核寡二聚体化结构域(NOD)受体激动剂、RIG-I受体(RLR)激动剂、胞浆DNA感应蛋白(CDS)激动剂和STING受体激动剂。

36.权利要求35所述的方法，其中TLR3激动剂选自聚腺苷-聚尿苷酸(poly(A:U)、聚肌苷-聚胞苷酸(pIC)和UV灭活的病毒颗粒。

37.权利要求36所述的方法，其中UV灭活的病毒颗粒是痘病毒颗粒。

38.权利要求35所述的方法，其中TLR9激动剂选自CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)、抑制性寡聚脱氧核苷酸(ODN)、纯化的DNA以及纯化或合成的质粒DNA。

39.权利要求35所述的方法，其中TLR4激动剂选自细菌脂多糖(LPS)和单磷酰脂质A(MPLA)或热灭活革兰氏阴性菌。

40.权利要求35所述的方法，其中NOD受体激动剂选自NOD1、NOD2和NOD1/2混合激动剂。

41.权利要求40所述的方法，其中NOD1受体激动剂是二肽IE-DAP(iE-DAP(γ-D-Glu-mDAP)。

42.权利要求40所述的方法，其中NOD2受体激动剂选自胞壁酰二肽(MDP)及其合成衍生物。

43.权利要求42所述的方法，其中合成衍生物是mirabutide。

44.权利要求40所述的方法，其中混合NOD1/2激动剂选自革兰氏阳性菌和合成的分子MurNAc-L-Ala-gamma-D-Glu-mDAP(PGN样分子)。

45.权利要求40所述的方法，其中RLR受体激动剂选自双链RNA、合成的pAT RNA和合成的pIC RNA。

46.权利要求40所述的方法，其中CDS激动剂是分离自细菌的双链DNA。

47.权利要求40所述的方法，其中STING受体激动剂选自环二核苷酸；3,3-环-gAMP；2,3-环-gAMP；2,2-环-gAMP；环二-GMP和环二-UMP。

48.权利要求35所述的方法，其中激活剂是聚肌苷:聚胞苷酸(pIC)。

49.权利要求48所述的方法，其中间充质干细胞石通过体外使用10μg/ml的聚肌苷:聚胞苷酸(pIC)孵育至少2小时而被活化的。

50.权利要求31所述的方法，其中间充质干细胞的有效量是每kg哺乳动物体重2×10⁶个细胞。

51.权利要求50所述的方法，其中通过静脉内输液管给细胞给药15分钟时间。

52.权利要求31所述的方法，其中该方法还包括给药有效量的一种或多种抗微生物剂。

53.权利要求52所述的方法，其中一种或多种抗微生物剂是杀菌抗生素。

54.权利要求53所述的方法，其中杀菌抗生素选自青霉素衍生物(penams)、头孢菌素类(cephams)、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类、万古霉素、达托霉素、氟喹诺酮类、甲硝唑、呋喃妥因、复方新诺明、泰利霉素和氨基糖苷类抗生素。

55.权利要求29所述的方法，其中间充质干细胞是哺乳动物间充质干细胞。

56.权利要求55所述的方法，其中哺乳动物间充质干细胞是同种异体间充质干细胞。

57.权利要求55所述的方法，其中哺乳动物间充质干细胞是人间充质干细胞。

58.权利要求52所述的方法，其中活化间充质干细胞增强了哺乳动物感染伤口的愈合。

59.权利要求58所述的方法，其中感染伤口选自擦伤、撕裂伤、挫伤、震荡、刺伤、皮肤割伤、手术伤口、枪伤、烧伤、晒伤、冻伤、化学性创伤、咬伤、叮伤和电伤。

60.权利要求35所述的方法，其中活化间充质干细胞具有比未活化的间充质干细胞更高的抗微生物活性。

61.权利要求31所述的方法，其中活化间充质干细胞在伤口产生时或之后给药。