CN107412772A - 聚‑n‑乙酰葡萄糖胺纳米纤维的抗菌应用 - Google Patents

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Abstract

本文描述了包含缩短的聚‑N‑乙酰葡萄糖胺和/或其衍生物纤维(“sNAG纳米纤维”)的组合物和所述组合物的抗菌应用。可将sNAG纳米纤维配制成用于预防和/或治疗细菌感染和与这类感染有关的疾病的组合物。还描述了使用这类组合物的方案。

Description

聚-N-乙酰葡萄糖胺纳米纤维的抗菌应用
本申请是申请日为2011年04月15日、申请号为201180029320.4、名称为“聚-N-乙酰葡萄糖胺纳米纤维的抗菌应用”的发明申请的分案。
本申请要求2010年4月15日提交的美国临时申请61/324,657的优先权，其通过引用整体结合到本文中。
1.领域
本文描述了包含缩短的聚-N-乙酰葡萄糖胺和/或其衍生物的纤维(“sNAG纳米纤维”)的组合物和所述组合物的抗菌应用。可将sNAG纳米纤维配制成用于预防和/或治疗细菌感染和与这类感染有关的疾病的组合物。还描述了应用这类组合物的方案。
2.背景
目前，抗生素是细菌感染的标准疗法。然而，一些个体对某些抗生素有变态反应，其他个体却遭受到与抗生素有关的副作用，而且连续使用抗生素常常导致其效力降低。另外，抗生素疗法常常导致细菌的抗生素抗性菌株的出现。因此，不断需要在不产生抗性或不随时间变化而降低效力的情况下对于对抗感染是有效的新的抗菌剂。例如在皮肤、消化道和呼吸道感染性疾病治疗中及在伤口治疗中，需要可用于临床情况下的非抗生素类抗菌剂。
伤口感染是细菌感染的一种类型。伤口感染是严重问题，尤其在患有慢性病(例如糖尿病)或免疫抑制期间的患者中。这类患者的适当炎症反应(包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞的迁移和募集)被破坏，这使患者易患更重的感染(Singer,A.J.和R.A.Clark，1999，NEngl J Med 341(10):738-46)。另外，细菌感染可导致伤口愈合减弱和脓毒症。鉴于许多现有抗生素治疗不起作用，以及抗生素抗性细菌例如MRSA(耐甲氧西林(Methycillin)金黄色葡萄球菌(S.aureus))盛行，因此十分需要新的临床治疗。
3.概述
一方面，本文描述了用于治疗和/或预防对象的细菌感染和/或与细菌感染有关的或由细菌感染引起的疾病的方法。
在某些实施方案中，本文描述了用于治疗对象的细菌感染的方法，所述方法包括将包含sNAG纳米纤维的组合物局部给予对象。在一些实施方案中，诊断患有细胞感染或者出现一种或多种细菌感染症状的对象。诊断细菌感染和细菌感染症状的方法是本领域技术人员已知的或本文中有描述。细菌感染可以是皮肤感染、胃肠感染、呼吸道感染、尿路感染、生殖道感染或本文所述对象体内任何其它器官或组织的感染。在一个实施方案中，感染为医院内感染、MRSA感染、假单胞菌(Pseudomonas)感染或艰难梭菌(C.dificule)感染。
在某些实施方案中，本文描述了用于治疗和/或预防与对象的细菌感染或细菌失衡有关的疾病的方法，所述方法包括将包含sNAG纳米纤维的组合物局部给予对象。在一个这样的实施方案中，所述方法包括治疗和/或预防与细菌感染有关的疾病。在另一个实施方案中，所述方法包括治疗和/或预防与细胞失衡有关的疾病，例如本文所述的细胞微生物丛(bacterial microbiota)失衡。在某些实施方案中，所述方法包括治疗现有的细菌感染。在这些实施方案的一些中，待接受治疗的对象被诊断患有与细菌感染有关的疾病或者出现这类疾病的一种或多种症状。在其它实施方案中，待接受治疗的对象被诊断患有与细胞失衡有关的疾病或者出现这类失衡的一种或多种症状。所述疾病可为皮肤疾病、胃肠道疾病、呼吸道疾病、尿路疾病、生殖道疾病或本文所述的对象体内任何其它器官或组织的疾病。在一些实施方案中，所述疾病为皮肤疾病或胃肠道疾病。在一个实施方案中，所述疾病与医院内感染、MRSA感染、假单胞菌感染或艰难梭菌感染有关。
在一些实施方案中，本文描述了用于预防细菌感染和/或细菌感染相关疾病的方法，所述方法包括将包含sNAG纳米纤维的组合物局部给予对象。在一些实施方案中，将包含sNAG纳米纤维的组合物给予存在细菌感染高风险的对象以预防细菌感染相关疾病。在具体实施方案中，将包含sNAG纳米纤维的组合物给予有伤口的对象或经历手术的对象。在一个实施方案中，将组合物给予无免疫应答的对象。在一些实施方案中，将包含sNAG纳米纤维的组合物施予伤口，其中所述伤口存在细菌感染的高风险。在某些实施方案中，伤口是开放性伤口。开放性伤口可为枪弹伤、刺伤、撕裂伤、擦伤、割伤、贯通伤、手术创伤或任何其它创伤。在某些实施方案中，伤口可为刺伤，例如血液透析术或导管插入术造成的刺伤。在这类实施方案中，待接受治疗的对象可被诊断患有血液透析相关感染或导管插入相关感染。在一个实施方案中，通过sNAG组合物预防的细菌感染和/或细菌感染相关疾病不在伤口(例如开放性伤口)部位或与伤口无关。在一个这样的实施方案中，细菌感染和/或细菌感染相关疾病不处于伤口部位(例如不处于开放性伤口部位)。
在一些实施方案中，本文描述了用于治疗对象的被细菌感染的伤口的方法，所述方法包括将包含sNAG纳米纤维的组合物局部给予对象的伤口部位。在一些实施方案中，待接受治疗的对象被诊断患有细菌感染或者出现一种或多种细菌感染的症状。在某些实施方案中，伤口是开放性伤口。开放性伤口可为枪弹伤、刺伤、撕裂伤、擦伤、割伤、贯通伤、手术创伤或任何其它创伤。在某些实施方案中，伤口可为刺伤，例如血液透析术或导管插入术造成的刺伤。在这类实施方案中，待接受治疗的对象可被诊断患有血液透析相关感染或导管插入相关感染。
待使用本文所述方法治疗或预防的细菌感染包括一种或多种下列属的细菌感染：鲍特氏菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)和Clamidophylia、棱菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、嗜血菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、李斯特氏菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、枝原体属(Mycoplasma)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibria)和耶尔森氏菌属(Yersinia)。在一些实施方案中，sNAG组合物可用于治疗和/或预防与被来自一种或多种所列细菌属的细菌感染的有关疾病或者其一种或多种症状。
待使用本文所述方法治疗或预防的细菌感染还包括被一种或多种下列菌种的细菌感染：炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、百日咳鲍特氏菌(Bordetella pertussis)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、狗布鲁氏菌(Brucella canis)、马耳他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucellasuis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热衣原体(Clamidophila psittaci)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficule)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、流感嗜血菌(Haemophilus influenae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、嗜肺军团菌(Legionella pneumphila)、肺炎性钩端螺旋体(Leptospira pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎枝原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、非解乳糖链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibria cholerae)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)。在一些实施方案中，sNAG组合物可用于治疗和/或预防与被来自一种或多种上列细菌菌种感染有关的疾病或者其一种或多种症状。
在某些实施方案中，待采用本文所述方法治疗或预防的细菌感染为MRSA感染、假单胞菌感染或艰难梭菌感染。在一些实施方案中，sNAG组合物可用于治疗和/或预防与MRSA感染、假单胞菌感染或艰难梭菌感染有关的疾病或者其一种或多种症状。
在某些实施方案中，待采用本文所述方法治疗或预防的细菌感染是由本领域普通技术人员已知的对标准抗菌疗法有抗性(例如抗一种或多种抗生素)的细菌引起的。在一个实施方案中，待采用本文所述方法治疗或预防的细菌感染是MRSA，例如医院内MRSA。在一些实施方案中，sNAG组合物可用于治疗和/或预防与由抗一种或多种抗生素的细菌引起的感染有关的疾病。在一个实施方案中，sNAG组合物可用于治疗和/或预防与MRSA(例如与医院内MRSA)有关的疾病。
待使用本文所述方法治疗的对象可为哺乳动物，优选人。对象还可为家畜动物(例如鸡、牛、猪、山羊)或宠物(例如狗或猫)或任何其它动物。
本文所述方法中考虑的sNAG纳米纤维可具有如下文第5.1部分所述的不同的长度、宽度和分子量。在某些实施方案中，大部分(在某些实施方案中，至少或超过60％、70％、80％、90％、95％或99％)的sNAG纳米纤维或100％的sNAG纳米纤维的长度介于约1至15μm之间。在一些实施方案中，大部分(在某些实施方案中，至少或超过60％、70％、80％、90％、95％或99％)的sNAG纳米纤维或100％的sNAG纳米纤维的长度介于约2至10μmp之间，或介于4至7μm之间。可按照例如下文中第5.2节中所述获得所需长度的sNAG纳米纤维。
在某些实施方案中，通过照射(例如γ照射)聚-N-乙酰葡萄糖胺或其衍生物来产生sNAG纳米纤维。在一些实施方案中，通过照射呈干燥纤维形式的聚-β-1→4-N-乙酰葡萄糖胺(例如以500-2,000kgy)，或照射呈湿纤维形式的聚-β-1→4-N-乙酰葡萄糖胺(例如以100-500kgy)，来产生sNAG纳米纤维。
在某些实施方案中，sNAG纳米纤维来源于微藻类。在另一个实施方案中，sNAG纳米纤维非来源于甲壳动物。在又一个实施方案中，sNAG纳米纤维可来源于微藻类、甲壳动物(例如虾)、真菌或任何其它来源。
在一个实施方案中，sNAG纳米纤维包含N-乙酰葡萄糖胺单糖和/或葡萄糖胺单糖，其中超过60％、70％、80％、90％、95％或99％的sNAG纳米纤维的单糖为N-乙酰葡萄糖胺单糖。在另一个实施方案中，sNAG纳米纤维包含N-乙酰葡萄糖胺单糖和/或葡萄糖胺单糖，其中超过70％的sNAG纳米纤维的单糖为N-乙酰葡萄糖胺单糖。
在某些实施方案中，用于本文所述方法的sNAG纳米纤维体外对金黄色葡萄球菌细菌培养物的细菌生长或存活不起作用，或体外对金黄色葡萄球菌细菌培养物的细菌生长或存活基本不起作用。在一些实施方案中，例如，当金黄色葡萄球菌细菌培养物体外用sNAG纳米纤维处理/与sNAG纳米纤维一起孵育时，sNAG纳米纤维降低体外细菌培养物的细菌生长或存活低于1log、0.75log、0.5log、0.25log、0.2log或0.1log。测定sNAG纳米纤维对细菌生长或存活的作用和对试验结果的评价描述于例如下文第5.1节、实施例2(例如第6.2.2.5节)和图11E。
在某些实施方案中，用于本文所述方法的sNAG纳米纤维在一个或多个生物相容性试验中不起反应。例如，当在洗脱试验、肌内植入试验、皮内试验或全身试验中测试时，用于本文所述方法的sNAG纳米纤维可不起反应。在一些实施方案中，当在洗脱试验、肌内植入试验、皮内试验或全身试验中测试时，本文所述组合物不起反应。在其它实施方案中，当在洗脱试验、肌内植入试验、皮内试验或全身试验中测试时，用于本文所述方法的sNAG纳米纤维为0级或1级。在又一个实施方案中，当在洗脱试验、肌内植入试验、皮内试验或全身试验中测试时，用于本文所述方法的sNAG纳米纤维至多起轻微反应。在一个实施方案中，按肌内植入试验的测定，sNAG纳米纤维或包含这类纳米纤维的组合物不起反应。在某些实施方案中，本文所述组合物在例如施用部位不引起变态反应或刺激。在其它实施方案中，本文所述组合物在例如施用部位至多引起轻微变态反应或轻微刺激。
本文所述组合物考虑的给药方式为局部，例如皮肤局部；伤口、手术、细菌感染或感染症状(例如肿胀)部位的局部和体表例如皮肤、黏膜(例如阴道、肛门、咽喉、眼、耳)或其它组织表面的局部。在某些实施方案中，将sNAG纳米纤维或包含这类纳米纤维的组合物配制成敷料、绷带、垫片(mat)、喷雾剂、液体制剂、混悬剂、膜、粉剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂、栓剂或凝胶剂。在一些实施方案中，将sNAG纳米纤维或包含这类纳米纤维的组合物配制成乳膏剂、凝胶剂、软膏剂、膜、粉剂、喷雾剂或栓剂。
另一方面，本文描述了用于本文所述方法的组合物。在一个具体实施方案中，所述组合物包含sNAG纳米纤维。在某些实施方案中，本文所述组合物包含sNAG纳米纤维和可用于预防和/或治疗细菌感染、细菌感染相关疾病或其症状的一种或多种其它的活性成分。在一些实施方案中，其它的活性成分是抗菌剂。这类其它的抗菌剂可以是抗生素。在另一个实施方案中，这类其它的抗菌剂是锌。在又一个实施方案中，本文所述组合物不含抗生素。在另外其它的实施方案中，本文所述组合物不含任何其它抗菌剂。在一个实施方案中，本文所述组合物包含sNAG纳米纤维为唯一的活性成分，且不含任何其它的活性成分。
在具体实施方案中，组合物包含sNAG纳米纤维和抗生素。可用于本发明组合物的抗生素的实例包括大环内酯类(microlides)(例如红霉素、阿奇霉素)、氨基糖苷类(例如阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素)、头孢菌素类(例如头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢噻肟、头孢吡肟)、氟喹诺酮类(例如环丙沙星、左氧氟沙星)、青霉素类(例如青霉素、氨苄西林、阿莫西林)、四环素类(例如四环素、多西环素)和/或碳青霉烯类(例如美罗培南、亚胺培南)。sNAG纳米纤维和本文所述药物可用于这类组合物中。在一些实施方案中，组合物包含sNAG纳米纤维和有效治疗或预防或者通常用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染、MRSA感染、假单胞菌感染或艰难梭菌感染的药物(例如有效对抗这类感染或常用来对抗这类感染的抗生素)。
在其它实施方案中，本文所述组合物与一种或多种其它抗菌剂或任何其它合适的疗法联合给予。在一些实施方案中，其它抗菌剂或疗法是抗生素(例如本领域已知的或本文描述的用于待治疗的细菌感染或细菌感染相关疾病的标准抗生素疗法)。在一些实施方案中，其它抗菌剂是有效治疗或预防或者通常用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染、MRSA感染、假单胞菌感染或艰难梭菌感染的药物(例如有效对抗这类感染或常用来对抗这类感染的抗生素)。在一些实施方案中，其它疗法在给予sNAG纳米纤维组合物之前、同时或之后给予。在又一个实施方案中，本文所述组合物不与任何其它疗法联合给予，例如不与抗生素联合给予。
3.1术语
本文所用术语“sNAG纳米纤维”、“sNAG”、“Taliderm”或“Talymed”(旧称“Taliderm”)可互换使用，是指缩短的聚-N-乙酰葡萄糖胺和/或其衍生物的纤维。
本文所用术语“约”意指给定值左右的范围，其中所得值与明确列举的值相同或基本相同(例如在10％、5％或1％以内)。在一个实施方案中，“约”意指在给定值或范围的10％以内。在另一个实施方案中，术语“约”意指在给定值或范围的5％以内。在另一个实施方案中，术语“约”意指在给定值或范围的1％以内。
本文所用术语“疾病”、“病症”或“病况”可互换使用，是指对象的医学病症。在一个具体实施方案中，疾病是与细菌感染有关的或由细菌感染引起的病理状态。
本文所用术语“细菌感染”意指细胞或对象中细菌的侵入、繁殖和/或存在。
本文所用数学术语“log”是指log10。
本文所用术语“疗法(therapies/therapy)”可以指可用于预防或治疗细菌感染或其相关症状或病况的任何方案、方法、组合物、制剂和/或物质。在某些实施方案中，术语“疗法”是指sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的药物组合物。在其它实施方案中，术语“疗法”是指sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的药物组合物以外的疗法。在具体实施方案中，“其它疗法”和“其它治疗”是指sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的药物组合物以外的疗法。在一个具体实施方案中，疗法包括使用sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的药物组合物作为辅助疗法；例如，sNAG纳米纤维组合物与药物疗法(例如抗生素)和/或可用于治疗和/或预防细菌感染或其相关症状或病况的其它疗法联用。
在将sNAG纳米纤维组合物给予对象的情况下，本文所用术语“有效量”是指引起有益作用或治疗作用的sNAG纳米纤维的量。在具体实施方案中，sNAG纳米纤维的“有效量”是指足以实现至少1、2、3、4或更多个下列作用的量：(i)清除细菌感染；(ii)根除与之相关的一种或多种症状，(iii)缩短清除细菌感染需要的时间；(iv)减轻或改善细菌感染和/或与之有关的一种或多种症状的严重程度；(v)缩短细菌感染和/或与之有关的一种或多种症状的持续时间；(vi)防止或延迟细菌的一个或多个抗性菌株的产生或减少所产生的细胞抗性菌株的数目；(vii)防止细菌感染和/或与之有关的一种或多种症状的复发；(viii)减少或排除细菌细胞群；(ix)减轻由细菌感染引起的或与细菌感染相关的病况的严重程度和/或持续时间；(x)减少对象的住院治疗；(xi)缩短住院期长度；(xii)延长对象的生存期；(xiii)提高或改善其它疗法的治疗效果；(xiv)降低死亡率；(xv)减少或消除细菌从一对象散布至另一对象，或者从一个器官或组织散布至另一器官或组织；(xvi)防止细菌数目的增加；(xvii)防止细菌感染或与之有关的一种或多种症状的发生或发作；(xviii)减少与细菌感染有关的症状的数目；(xix)缩短/减轻由细菌感染引起的或与细菌感染有关的病况的持续时间和/或严重程度；(xx)抑制或减少与细菌感染有关的一种或多种细菌毒素的产生；(xxi)稳定或减轻细菌感染相关炎症；(xxii)诱导一种或多种防卫素蛋白和/或防卫素样蛋白表达；(xxiii)诱导一种或多种Toll样受体表达；(xxiv)诱导有益于清除或减轻细菌感染或与之有关的一种或多种症状的一种或多种蛋白质表达；(xxvi)减轻与细菌感染有关的器官衰竭或与之相关的疾病；(xxvii)防止由细菌感染引起的或与细菌感染有关的病况的发作、发展或复发；和/或(xxviii)提高生命质量，通过本领域众所周知的方法(例如问卷法)来评价。在具体实施方案中，sNAG纳米纤维的“有效量”是指本文规定的sNAG纳米纤维组合物的量，例如第5.6节，见下文。
本文所用术语“老年人”是指65岁以上的人。
本文所用术语“成人”是指18岁以上的人。
本文所用术语“儿童”是指1岁-18岁的人。
本文所用术语“婴儿”是指新生儿-1岁的人。
本文所用术语“早产婴儿”是指孕龄小于37周(例如37周、36周、35周、34周、33周、32周、31周、30周、29周、28周之前或妊娠少于28周)便出生的新生儿至1岁的人。
本文所用术语“幼童”是指1岁-3岁的人。
本文所用术语“大多数”是指大于50％，包括例如50.5％、51％、55％等。
本文所用术语“对象”和“患者”可互换使用，是指动物(例如牛、马、绵羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠等)。在一个具体实施方案中，对象是哺乳动物例如非灵长类或灵长类，例如人。在具体实施方案中，对象是人。有关按照本文提供的方法治疗的患者的更多信息参见下文第5.5节。
在基因表达的情况下，本文所用术语“低表达”(例如基于由基因产生的蛋白质或肽的水平)是指表达低于基因的“正常”表达。在一个具体实施方案中，“低表达”是指基因表达低于“正常”基因表达的90％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％、低于50％、低于45％、低于40％、低于35％、低于30％、低于25％或低于20％。在另一个具体实施方案中，“低表达”是指基因表达是比“正常”基因表达低约20倍、约15倍、约10倍、约5倍、约4倍、约3倍、约2倍或约1.5倍。
4.附图简述
图1.纳米纤维刺激Ets1的上游调节子Akt 1活化。(A)磷酸-Akt在响应NAG和sNAG刺激的血清饥饿的EC时的蛋白质印迹分析。(B)被拼凑对照(scrambled control，“SCR”)或Akt1shRNA慢病毒感染的EC的RT-PCR分析和对Ets1和S26作为加载对照的表达进行评价。(C)将信号自sNAG纳米纤维转导至Akt1、Ets1和防卫素的信号转导途径示意图。
图2.通过Taliderm治疗部分拯救的Akt1失效动物的迟缓的伤口愈合。(A)在用或不用Taliderm治疗的情况下，受伤WT和AKT1失效小鼠的代表性图像。(B)自致伤第3天起代表性小鼠皮肤切片的H&E染色。
图3.sNAG纳米纤维刺激原代内皮细胞中的细胞因子和防卫素表达。(A)使用针对α-防卫素的抗体，用或不用sNAG处理的EC的免疫组织化学。(B)ELISA显示纳米纤维处理的EC引起α-防卫素1-3分泌(经血清饥饿，用5μg/ml或10μg/ml sNAG处理)。
图4.sNAG纳米纤维以Akt1依赖性方式刺激原代内皮细胞中的防卫素表达。(A)和(B)在有或没有PD98059(MAPK抑制剂，“PD”)、渥曼青霉素(PI3K抑制剂，“wtm”)存在时或者用拼凑对照(“SCR”)或Akt1(“AKT1”)shRNA慢病毒感染的、用或未用sNAG(“snag”)处理的血清饥饿的EC(“ss”)的定量RT-PCR分析，并对标示基因的表达进行评价。
图5.sNAG纳米纤维刺激小鼠角质形成细胞中的β-防卫素3表达。(A)在第3天，来自WT和Akt1失效动物的石蜡包埋小鼠皮肤伤口切片用β-防卫素3(右上图可见明亮染色；参见例如白色粗箭头)和内披蛋白(involucrin)抗体的免疫荧光染色。(B)应用NIHImageJ软件(TX＝Taliderm；Akt1＝Akt1失效)，量化β-防卫素3免疫荧光染色。(C)WT和Akt1失效治疗和未治疗的角质形成细胞用β-防卫素3(可见明亮染色；参见例如白色粗箭头)和TOPRO-3(核染色；参见例如白色细箭头)的免疫荧光染色。注意在WT和Akt1Taliderm治疗的伤口中β-防卫素3染色增加。
图6.Akt1依赖性转录因子结合位点。Akt1依赖性转录因子结合位点的示意图。应用Genomatix软件，针对DEF1、4和5的mRNA上的保守位点对转录起始位点上游500bp进行分析(ETS-黑色椭圆形；FKHD-条纹椭圆形；CREB-白色椭圆形；NFKB-方格椭圆形)。
图7.sNAG处理体外导致防卫素表达和分泌。(A)用sNAG(50μg/ml)处理血清饥饿(“SS”)原代内皮细胞达规定时间的RTPCR分析，并评价β-防卫素3和α-防卫素1的表达。(B)血清饥饿(未处理)或用sNAG纳米纤维处理(10μg/ml达5小时)的内皮细胞的免疫荧光标记。抗体是针对α-防卫素5(FITC，左上图)、β-防卫素3(德克萨斯红，右上图)。核用TOPRO-3染色(蓝色，左下图)。右下图表示三重叠加。(C)血清饥饿(未处理)或用sNAG纳米纤维处理的(10μg/ml达5小时)的角质形成细胞(HaCat)的免疫荧光标记。抗体针对α-防卫素5(FITC，左上图)、β-防卫素3(德克萨斯红，右上图)。核用TOPRO-3染色(蓝色，左下图)。
图8.sNAG诱导的防卫素表达有赖于Akt1。(A)在用或不用PD098059(“PD”)(50μM)、渥曼青霉素(“WTM”)(100nm)预处理的情况下，使用针对来源于自用或不用sNAG处理3小时的血清饥饿内皮细胞分离的总RNA的α-防卫素1的引物进行定量RT-PCR分析。定量测定以S26蛋白亚基为基础。(B)在有或没有PD98059(50μm)、渥曼青霉素(100nm)的情况下，定量测定来源于自用或不用sNAG处理3小时的血清饥饿内皮细胞分离的总RNA的β-防卫素3表达，并以S26为基础来表示。(C)用sNAG刺激规定时间的血清饥饿内皮细胞(SS)中磷酸-Akt的蛋白质印迹分析。线条表示其中的泳道已取出。(D)用拼凑对照(SCR)或Akt1shRNA慢病毒感染的、用或不用sNAG处理的血清饥饿的内皮细胞的定量RT-PCR分析，并对α-防卫素4表达进行评价。定量测定以S26为基础来表示。(E)来源于自用拼凑对照(SCR)或Akt1shRNA慢病毒感染的、用或不用sNAG处理的血清饥饿内皮细胞分离的总RNA的β-防卫素3表达的定量测定。定量测定以S26为基础来表示。全部实验以至少一式三份进行，且独立重复至少3次，显示了p值。
图9.sNAG诱导的体内防卫素表达需要Akt1。(A)在致伤后第3天自WT(n＝3)和Akt1小鼠收获的皮肤伤口的石蜡包埋切片。伤口不用或用sNAG膜治疗。使用针对β-防卫素3(绿色，右上图可见明亮染色；参见例如白色粗箭头)、内披蛋白(红色)和Topro(蓝色，核染色；参见例如白色细箭头)的抗体进行免疫荧光。(B)在第3天收获的用sNAG治疗的WT的石蜡包埋切片。使用针对β-防卫素3(绿色，可见明亮染色；参见例如白色粗箭头)、内披蛋白(红色)和Topro(蓝色，核染色；参见例如白色细箭头)的抗体进行免疫荧光。包括了这种较低的放大率(20x)以更好地说明表达β-防卫素3的表皮层。比例尺＝50μm。(C)应用NIH ImageJ软件对自石蜡包埋切片表达的β-防卫素3进行定量测定。实验独立地重复3次，并给出p值。
图10.sNAG治疗增加野生型小鼠的伤口闭合。来源于未用或用sNAG膜治疗的C57Bl6野生型动物的伤口组织切片的H&E染色。各图左边表示致伤后天数。黑色实线沿着表明伤口闭合的角质形成细胞的细胞层划线。黑色箭头表示伤口床的边缘。
图11.sNAG治疗以Akt1依赖性方式减轻细菌感染。(A)WT小鼠的金黄色葡萄球菌感染伤口的组织革兰氏染色。使用4mm活检钻使WT小鼠致伤。在致伤后立即用1x 109cfu/ml给小鼠接种。感染后30分钟，治疗组的小鼠用Taliderm治疗。治疗后5天采集皮肤样品，切片用于分析。进行组织革兰氏染色。暗紫色染色表示革兰氏阳性细菌和吞噬细菌的嗜中性粒细胞。显示了在20x和40x放大倍数下的切片。(B)来自WT和Akt1失效小鼠(n＝3)的石蜡包埋的金黄色葡萄球菌感染伤口的组织革兰氏染色。在第3天和第5天收获不用或用sNAG膜治疗的感染伤口和伤口床用于分析。暗紫色染色表示伤口床中存在革兰氏阳性细菌。黑色箭头表示革兰氏阳性细菌染色的实例。注意在用sNAG治疗的WT动物中，在未治疗的WT中缺乏阳性染色蓄积。比例尺＝50μm。(C)使用治疗和未治疗的WT(n＝3)和Akt1小鼠(n＝3)两者，从金黄色葡萄球菌感染伤口，定量测定致伤后第5天得到的CFU。与Akt1失效动物相比，接受sNAG治疗的野生型小鼠伤口床中，细菌负荷显著降低(p<.01)。全部实验独立地重复3次，并给出p值。(D)按(C)中所述类似方法，在致伤后第3天定量测定感染伤口的CFU。在第3天，sNAG治疗的感染伤口显示WT和Akt1失效动物两者的CFU显著降低，但与Akt1动物中的2倍差异相比，WT动物显示约10倍差异。(E)未用或用不同量的sNAG纳米纤维治疗的金黄色葡萄球菌培养物中CFU的定量测定。每个实验独立地进行3次，并给出p值。(F)在第3天，自用或未用β-防卫素3肽(1.0uM)治疗的WT小鼠(n＝3)的伤口收获的金黄色葡萄球菌感染伤口的组织革兰氏染色。注意用β-防卫素3肽治疗的感染伤口的革兰氏阳性细菌染色减少。(G)用或未用β-防卫素3肽治疗的金黄色葡萄球菌感染的WT小鼠(n＝3)的CFU的定量测定。用肽治疗的感染伤口显示CFU显著降低(p<.05)。比例尺＝50μm。每个实验独立地进行3次，并给出p值。
图12.通过sNAG治疗金黄色葡萄球菌感染伤口快速诱导防卫素表达。(A)使用针对来自sNAG治疗的WT(n＝3)和未治疗的WT小鼠(n＝3)两者的β-防卫素3(绿色，右上图和中下图可见明亮染色；参见例如白色粗箭头)、标记角质形成细胞层的内披蛋白(红色)和Topro(蓝色，核染色；参见例如白色细箭头)的抗体，对第3天自金黄色葡萄球菌感染伤口收获的石蜡包埋组织切片进行免疫荧光。无仅用第二抗体染色的初始对照(primary control)表明角蛋白的非特异性染色。比例尺＝50μm。(B)应用NIH ImageJ软件，来自石蜡包埋切片的β-防卫素表达3的定量测定。用sNAG治疗的金黄色葡萄球菌感染伤口显示β-防卫素3染色显著增加(p<.05)。实验独立地重复3次，并给出p值。
图13.抗β-防卫素3的抗体妨碍sNAG治疗的抗菌效果。(A)在第3天收获的WT小鼠(n＝3)的石蜡包埋的经sNAG治疗的金黄色葡萄球菌感染伤口的组织革兰氏染色。在sNAG治疗前，sNAG治疗伤口用β-防卫素3抗体或同种型对照山羊IgG抗体处理。代表性图像显示用针对β-防卫素3的抗体处理的小鼠伤口床中革兰氏阳性细菌染色(黑色箭头)蓄积增加。比例尺＝20μm。(B)在sNAG治疗治疗前来自用β-防卫素3抗体(n＝3)或对照IgG抗体(n＝3)处理的金黄色葡萄球菌感染WT小鼠的CFU的定量测定。β-防卫素3施用显著提高(p<.05)CFU。
图14.sNAG治疗降低铜绿假单胞菌的细菌感染。使用4mm活检钻使小鼠致伤，接种1.5x 109cfu/ml铜绿假单胞菌，感染后30分钟，感染伤口不治疗(n＝6)或用sNAG膜(n＝6)治疗(n＝6)，在第3天收获伤口床用于分析，培养30分钟，铺板，并定量测定未治疗和治疗的感染伤口的CFU。与未治疗动物相比，sNAG治疗的小鼠显示伤口床中的细菌负荷显著降低(p<.05)。
图15.照射对pGlcNAc纤维的化学和物理结构的作用。(A)pGlcNAc的分子量与照射水平/照射配比(formulation for irradiation)之间的相关性。(B)未照射的pGlcNAc浆(上线)、以100kGy照射的pGlcNAc浆(底线)和以200kGy照射的pGlcNAc浆(中线)的红外线(IR)光谱。(C)pGlcNAc的扫描电子显微镜(SEM)分析。(D)sNAG的扫描电子显微镜(SEM)分析。
图16.pGlcNAc不影响代谢率。对于每个期间(即在24小时和48小时时)，4个条形柱每个(自左到右)的身份如下：血清饥饿(SS)、VEGF及50和100μg/ml的pGlcNAc(NAG)。
图17.pGlcNAc保护人脐静脉内皮细胞(EC)免于血清剥夺诱导的细胞死亡。对于每个期间(即在24、48和72小时时)，5个条形柱(自左到右)每个的身份如下：血清饥饿(SS)、VEGF及50、100和250μg/ml的pGlcNAc(NAG)。
图18.sNAG诱导显著提高的代谢率。5个条形柱(自左到右)每条的身份如下：血清饥饿(SS)、VEGF及50、100和200μg/ml的sNAG。
图19.sNAG不保护EC免受血清剥夺诱导的细胞死亡。对于每个期间(即在24小时和48小时时)，5个条形柱(自左到右)每条的身份如下：血清饥饿(SS)、VEGF及50、100和200μg/ml的sNAG。
5.详述
本发明人发现，sNAG纳米纤维减少被金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌感染的皮肤伤口的细菌感染。虽然不受任何特定作用机制的束缚，但第6.2节提供的数据表明sNAG的抗菌作用并非是sNAG与细菌的直接作用所致，却是由下游影响(例如由Akt1活化而调节防卫素)所致。具体地讲，数据显示，体外用sNAG纳米纤维处理细菌培养物不影响细菌计数，这就表明了sNAG纳米纤维不直接抑制细菌生长。在第6.2.2.5节所述和图11E所示的具体实施例中，sNAG纳米纤维不直接影响金黄色葡萄球菌的生长或存活。下文第6.2.2.5节所述试验，可用来测试sNAG纳米纤维对细菌生长或存活缺乏直接作用。在该实施例中，溶液中金黄色葡萄球菌培养物用不同浓度的sNAG纳米纤维处理3小时，将培养物铺板在37℃下过夜，并测定细菌CFU/ml。如图11E所示，观察到对细菌生长或存活无作用。
本发明的发明人发现，sNAG纳米纤维可刺激防卫素表达，其可提高固有的抗菌反应。普遍认可的是，防卫素是先天免疫的重要参与者，并在抗菌活性中起作用。如下文第6.1节和第6.2节提供的实施例所证实的一样，本发明的发明人发现，sNAG纳米纤维可增加内皮细胞中α型和β型防卫素两者的表达，体外增加角质形成细胞中β型防卫素的表达，体内增加伤口愈合模型的β型防卫素的表达。
此外，如下文第6.1节和第6.2节提供的实施例所证实的一样，但不受任何特定作用机制的束缚，在体外和体内、在伤口愈合模型中Akt1似乎对sNAG依赖性防卫素表达很重要。sNAG治疗在野生型对照动物中始终减少被金黄色葡萄球菌感染的皮肤伤口的细菌感染，但在同样治疗的Akt1失效动物中并非如此。
本发明的发明人还发现，通过sNAG治疗人内皮细胞，可增量调节许多Toll样受体。Toll样受体(“TLRs”或“TLR”)是高度保守的受体，其识别导致先天免疫活化的细菌组分的特定分子模式。最新的研究将人防卫素表达与TLR活化联系起来。具体地讲，刺激TLR可导致防卫素合成增加。因此，虽不受任何作用机制的束缚，但sNAG纳米纤维可起通过Akt1活化引起先天免疫和细菌清除的刺激物的作用。
因此，本文描述了使用sNAG纳米纤维作为用于预防和/或治疗细菌感染和与之相关的疾病的新方法。在某些实施方案中，用sNAG纳米纤维治疗细菌感染减少患者的细菌负荷。在具体实施方案中，sNAG纳米纤维的使用加强伤口闭合，同时根除、减少或防止伤口的细菌感染。
5.1 sNAG纳米纤维
本文描述了sNAG纳米纤维组合物。sNAG纳米纤维包含聚-N-乙酰葡萄糖胺和/或其衍生物的纤维，通过本领域技术人员已知的任何方法例如通过扫描电子显微镜(“SEM”)测量，其大多数的长度小于30微米，且长度为至少1微米。例如，可按本文所述获得这种sNAG纳米纤维。
在某些实施方案中，通过本领域技术人员已知的任何方法(例如通过SEM)测量，大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％，或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)sNAG纳米纤维的长度小于约30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4或3微米，且长度为至少1微米。在具体实施方案中，通过本领域技术人员已知的任何方法(例如通过SEM)测量，大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％，或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)sNAG纳米纤维的长度小于约15微米或小于约12微米，且长度为至少1微米。在具体实施方案中，通过本领域技术人员已知的任何方法(例如通过SEM)测量，全部(100％)sNAG纳米纤维的长度小于约15微米，且长度为至少1微米。在某些实施方案中，通过本领域技术人员已知的任何方法(例如通过SEM)测量，大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％，或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)sNAG纳米纤维的长度等于或小于14、13、12、11、10、9、8或7微米，且长度为至少1微米。在一些实施方案中，通过本领域技术人员已知的任何方法(例如通过SEM)测量，大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％，或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)sNAG纳米纤维的长度介于1-15、2-15、2-14、1-12、2-12、1-10、2-10、3-12、3-10、1-9、2-9、3-9、1-8、2-8、3-8、4-8、1-7、2-7、3-7、4-7、1-6、1-5、1-4或1-3微米之间。
在一个具体实施方案中，通过本领域技术人员已知的任何方法(例如通过SEM)测量，大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％，或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)sNAG纳米纤维的长度为约8、7、6、5、4、3或2微米。在另一个具体实施方案中，通过本领域技术人员已知的任何方法(例如通过SEM)测量，大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％，或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)sNAG纳米纤维的长度介于约2-约10微米、约3-约8微米或约4-约7微米之间。在另一个具体实施方案中，通过本领域技术人员已知的任何方法(例如通过SEM)测量，全部(100％)sNAG纳米纤维的长度介于约2-约10微米、约3-约8微米或约4-约7微米之间。
在某些实施方案中，按电子显微镜的测定，sNAG纳米纤维纤维的厚度和/或直径介于0.005-5微米的范围。在具体实施方案中，sNAG纳米纤维的平均厚度和/或直径为约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3或4微米，或之间的任何范围(例如0.02-2微米、0.02-1微米、0.02-0.75微米、0.02-0.5微米、0.02-0.5微米、0.05-1微米、0.05-0.75微米、0.05-0.5微米、0.1-1微米、0.1-0.75微米、0.1-0.5微米等)。在具体实施方案中，大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％，或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)sNAG纳米纤维具有约0.02-1微米的厚度或直径。在其它实施方案中，大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％，或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)sNAG纳米纤维具有约0.05-0.5微米的厚度或直径。在具体实施方案中，全部(100％)sNAG纳米纤维具有约0.02-1微米或约0.05-0.5微米的厚度或直径。在某些实施方案中，大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％，或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)sNAG纳米纤维具有约0.02-2微米、0.02-1微米、0.02-0.75微米、0.02-0.5微米、0.02-0.5微米、0.05-1微米、0.05-0.75微米、0.05-0.5微米、0.1-1微米、0.1-0.75微米或0.1-0.5微米的厚度或直径。
在某些实施方案中，大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％，或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)sNAG纳米纤维的长度介于1和15微米之间，且具有约0.02-1微米的厚度或直径。
在某些实施方案中，sNAG纳米纤维的分子量小于100kDa、90kDa、80kDa、75kDa、70kDa、65kDa、60kDa、55kDa、50kDa、45kDa、40kDa、35kDa、30kDa或25kDa。在某些实施方案中，大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％，或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)sNAG纳米纤维具有小于100kDa、90kDa、80kDa、75kDa、70kDa、65kDa、60kDa、55kDa、50kDa、45kDa、40kDa、35kDa、30kDa或25kDa的分子量。在其它实施方案中，大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％，或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)sNAG纳米纤维具有介于约5kDa-100kDa、约10kDa-100kDa、约20kDa-100kDa、约10kDa-80kDa、约20kDa-80kDa、20kDa-75kDa、约25kDa-约75kDa、约30kDa-约80kDa、约30kDa-约75kDa、约40kda-约80kDa、约40kDa-约75kDa、约40kDa-约70kDa、约50kDa-约70kDa或约55kDa-约65kDa之间的分子量。在一个实施方案中，大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％，或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)sNAG纳米纤维具有约60kDa的分子量。
在某些实施方案中，1％-5％、5％-10％、5％-15％、20％-30％或25％-30％的sNAG纳米纤维脱去乙酰基。在一些实施方案中，1％、5％、10％、15％、20％、25％或30％的sNAG纳米纤维脱去乙酰基。在其它实施方案中，小于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的sNAG纳米纤维脱去乙酰基。在一些实施方案中，等于或大于1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或者全部(100％)的sNAG纳米纤维脱去乙酰基。在其它实施方案中，小于1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的sNAG纳米纤维脱去乙酰基。
在某些实施方案中，70％-80％、75％-80％、75％-85％、85％-95％、90％-95％、90％-99％或95％-100％的sNAG纳米纤维乙酰化。在一些实施方案中，70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的sNAG纳米纤维乙酰化。在其它实施方案中，超过70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％的sNAG纳米纤维乙酰化。在一些实施方案中，等于或大于1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或者全部(100％)的sNAG纳米纤维乙酰化。在其它实施方案中，小于1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的sNAG纳米纤维乙酰化。
在一些实施方案中，sNAG纳米纤维包含至少一种葡萄糖胺单糖，且还包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的N-乙酰葡萄糖胺单糖。在其它实施方案中，sNAG纳米纤维包含至少一种N-乙酰葡萄糖胺单糖，且还包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的葡萄糖胺单糖。
一方面，在MTT测定法中，sNAG纳米纤维提高血清饥饿人脐带静脉内皮细胞(“EC”)的代谢率。MTT测定法是用于细胞增殖(细胞生长)的实施室试验和标准比色测定(一种测量颜色改变的测定法)。简单地说，黄色的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑，一种四唑)在活细胞的线粒体中还原为紫色的甲臜(formazan)。这种还原只有当线粒体还原酶有活性时才发生，因此该转变可与有活力的(活的)细胞数正相关。细胞的代谢率可通过技术人员普遍已知的其它技术测定。
另一方面，在锥虫蓝排斥试验中，sNAG纳米纤维不拯救血清饥饿EC的细胞凋亡。锥虫蓝排斥试验是一种用于测定细胞悬液中存在的活细胞数的染料排斥试验。它基于这样的原理，即活细胞具有排除某些染料(例如锥虫蓝、伊红或丙啶)的完整细胞膜，而死细胞则没有。细胞的存活力可通过技术人员普遍已知的其它技术测定。
在某些实施方案中，描述了包含sNAG纳米纤维的组合物，其中sNAG纳米纤维在MTT测定法中提高血清饥饿人脐带静脉内皮细胞的代谢率和/或在锥虫蓝排斥试验中不拯救血清饥饿人脐带静脉内皮细胞的细胞凋亡。在一些实施方案中，sNAG纳米纤维在MTT测定法中提高血清饥饿人脐带静脉内皮细胞的代谢率，在锥虫蓝排斥试验中不拯救血清饥饿人脐带静脉内皮细胞的细胞凋亡。
在一个具体实施方案中，sNAG纳米纤维是生物相容性的。生物相容性可通过各种技术测定，包括但不限于如洗脱试验、给动物对象肌内植入或者皮内注射或全身注射等这类方法。这类试验描述于美国专利号6,686,342(参见例如实施例10)，其通过引用以其整体结合到本文中。
在某些实施方案中，用于本文所述方法的sNAG纳米纤维在一个或多个生物相容性试验中不起反应。例如，当在洗脱试验、肌内植入试验、皮内试验和/或全身试验中测试时，用于本文所述方法的sNAG纳米纤维可不起反应。在其它实施方案中，用于本文所述方法的sNAG纳米纤维当在洗脱试验、肌内植入试验、皮内试验或全身试验中测试时，试验分数为0级或1级。在又一个实施方案中，当在洗脱试验、肌内植入试验、皮内试验或全身试验中测试时，用于本文所述方法的sNAG纳米纤维至多起轻微反应。在某些实施方案中，本文所述组合物不引起变态反应或刺激。在其它实施方案中，本文所述组合物在例如施用部位引起至多轻微变态反应或轻微刺激。相关试验和试验结果的评价描述于例如美国专利号6,686,342，其通过引用以其整体结合到本文中，并描述于下文第6.8节。
在一个具体实施方案中，当在肌内植入试验时，sNAG纳米纤维不起反应。一方面，肌内植入试验是肌内植入试验—ISO 4周植入，见下文第6.8.3节。在某些实施方案中，通过洗脱试验测定，sNAG纳米纤维不具有生物反应性(洗脱试验等级＝0)。在一些实施方案中，sNAG纳米纤维的试验分数于“0”和/或通过皮内注射试验测定，有至多可忽略的刺激性。在一些实施方案中，sNAG纳米纤维在Kligman试验中不引起真皮内反应(即I级反应)和/或通过Kligman试验测定具有弱的变态反应潜力。
在某些方面，sNAG纳米纤维是免疫中性的(即它们不引起免疫应答)。
在一些实施方案中，sNAG纳米纤维是生物可降解的。sNAG纳米纤维优选在给予或植入患者后的以下时间内降解：约1天、2天、3天、5天、7天(1周)、8天、10天、12天、14天(2周)、17天、21天(3周)、25天、28天(4周)、30天、1个月、35天、40天、45天、50天、55天、60天、2个月、65天、70天、75天、80天、85天、90天、3个月、95天、100天或4个月。
在某些实施方案中，sNAG纳米纤维不引起可检测的异物反应。可能发生在伤口愈合期间的异物反应，包括渗出物在损伤部位蓄积、炎性细胞浸润以对该部位清创(debride)以及肉牙组织形成。异物的持续存在可抑制充分愈合。与其说是发生在伤口愈合中的吸收和再造，不如说异物反应的特征在于异物巨细胞的形成、外物囊化和慢性炎症。囊化是指密实的、通常无血管的胶原壳沉积在异物周围，使之与宿主组织有效隔离开来。在一个实施方案中，用sNAG纳米纤维治疗的部位(例如伤口或伤口的细菌感染部位)在治疗后1天、3天、5天、7天、10天或14天不引起可检测的异物反应。在一个这样的实施方案中，用sNAG纳米纤维治疗的部位(例如伤口)在治疗后1天、3天、5天、7天、10天或14天不引起异物囊化。
在一些实施方案中，sNAG纳米纤维(i)包含纤维，其中大多数纤维的长度介于约1和15微米之间，和(ii)(a)在MTT测定法中提高血清饥饿EC的代谢率和/或在锥虫蓝排斥试验中不拯救血清饥饿EC的细胞凋亡，和(b)当在肌内植入试验时不起反应。在某些实施方案中，sNAG纳米纤维(i)包含纤维，其中大多数纤维的长度介于约1和12微米之间，和(ii)(a)在MTT测定法中提高血清饥饿EC的代谢率和/或在锥虫蓝排斥试验中不拯救血清饥饿EC的细胞凋亡，和(b)当在肌内植入试验时不起反应。在某些实施方案中，sNAG纳米纤维(i)包含纤维，其中大多数纤维的长度介于约4和7微米之间，和(ii)(a)在MTT测定法中提高血清饥饿EC的代谢率和/或在锥虫蓝排斥试验中不拯救血清饥饿EC的细胞凋亡，和(b)当在肌内植入试验时不起反应。
在某些实施方案中，按本领域技术人员的测定，sNAG纳米纤维不直接影响细菌(例如金黄色葡萄球菌)的生长或存活。在其它实施方案中，按下文第6.2.2.5节给出的方法测定，sNAG纳米纤维不直接影响细菌(例如金黄色葡萄球菌)的生长或存活。在一些实施方案中，sNAG纳米纤维体外对细菌生长或存活没有直接作用。在一个实施方案中，sNAG纳米纤维对革兰氏阴性细菌的生长或存活没有直接作用(例如体外)。在另一个实施方案中，sNAG纳米纤维对革兰氏阳性细菌的生长或存活没有直接作用(例如体外)。在又一个实施方案中，sNAG纳米纤维革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的生长或存活没有直接作用(例如体外)。在一些实施方案中，sNAG纳米纤维或sNAG纳米纤维组合物不结合细菌(例如革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或两种类型的细胞)。在一些实施方案中，体外将细菌培养物与sNAG纳米纤维(例如50-500μg的sNAG纳米纤维)一起孵育，在以下时间内不减少细菌负荷：10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时或96小时(其中细菌培养物可为革兰氏阳性和/或革兰氏阴性)。在一些实施方案中，体外将金黄色葡萄球菌培养物与sNAG纳米纤维(例如约80μg-300μg或约100-200μg的sNAG纳米纤维)一起孵育，在以下时间内不减少细菌负荷：2小时、3小时、6小时或24小时。在另外其它的实施方案中，例如，当体外将金黄色葡萄球菌细菌培养物用sNAG纳米纤维处理/与sNAG纳米纤维一起孵育时，sNAG纳米纤维体外降低细菌生长或存活达小于1log、0.9log、0.8log、0.75log、0.7log、0.6log、0.5log、0.4log、0.3log、0.25log、0.2log、0.1log、0.05log或0.025log。在一些实施方案中，例如，体外将金黄色葡萄球菌细菌培养物用sNAG纳米纤维处理/与sNAG纳米纤维一起孵育时，sNAG纳米纤维体外降低细菌生长或存活达小于1x 104、2x 104、3x 104、4x 104、5x104、6x 104、7x 104、8x 104、9x 104或10x 104cfu/ml。sNAG纳米纤维对细菌生长或存活的作用的试验和对试验结果的评价描述于例如实施例2(例如第6.2.2.5节)和图11E，见下文。
在一些实施方案中，sNAG纳米纤维(i)包含纤维，其中大多数纤维的长度介于约1和15微米、1和12微米或4和7微米之间，(ii)体外对金黄色葡萄球菌细菌培养物的细菌生长或存活不起作用，和(iii)当在生物相容性试验(例如肌内植入试验)测试时不起反应。
在某些实施方案中，在用sNAG纳米纤维组合物处理或暴露在sNAG纳米纤维组合物中的细胞、组织或器官中，sNAG纳米纤维诱导某些模式的基因表达(通过例如RT-PCR、微阵列或ELISA测定的RNA或蛋白质表达)。准确地讲，在一些实施方案中，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导一种或多种防卫素蛋白、一种或多种防卫素样蛋白和/或一种或多种Toll样受体的表达。在另外其它的实施方案中，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导已知具有抗菌作用的一种或多种蛋白质的表达。
在某些实施方案中，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导一种或多种α-防卫素(例如DEFA1(即α-防卫素1)、DEFA1B、DEFA3、DEFA4、DEFA5、DEFA6)、一种或多种β-防卫素(例如DEFB1(即β-防卫素1)、DEFB2、DEFB4、DEFB103A、DEFB104A、DEFB105B、DEFB107B、DEFB108B、DEFB110、DEFB112、DEFB114、DEFB118、DEFB119、DEFB123、DEFB124、DEFB125、DEFB126、DEFB127、DEFB128、DEFB129、DEFB131、DEFB136)和/或一种或多种θ-防卫素(例如DEFT1P)表达。在一些实施方案中，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导DEFA1、DEFA3、DEFA4、DEFA5、DEFB1、DEFB3、DEFB103A、DEFB104A、DEFB108B、DEFB112、DEFB114、DEFB118、DEFB119、DEFB123、DEFB124、DEFB125、DEFB126、DEFB128、DEFB129和DEFB131的一种或多种的表达。在某些实施方案中，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导一种或多种Toll受体(例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11和/或TLR12)表达。在其它实施方案中，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导IL-1、CEACAM3、SPAG11、SIGIRR(IL1样受体)、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TBK1、TRAF6和IKKi的一种或多种的表达。在一些实施方案中，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导IRAK2、SIGIRR、TLR1、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、TLR10和TRAF6的一种或多种的表达。在一个实施方案中，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导至少一种上列基因产物的表达。
在一些实施方案中，与用sNAG纳米纤维治疗前对象的细胞、组织或器官中一种或多种上列基因的表达水平(例如一种或多种上列基因表达的已知平均水平)相比，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导的一种或多种上列基因表达的量等于或大于约0.25倍、0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍或20倍。在一些实施方案中，与用sNAG纳米纤维治疗前对象的细胞、组织或器官中一种或多种上列基因的表达水平(例如一种或多种上列基因表达的已知平均水平)相比，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导的一种或多种上列基因表达的量等于或大于约10％、25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、900％或1000％。
在一些实施方案中，按本领域技术人员已知方法或本文所述测定，sNAG纳米纤维而非长的聚-N-乙酰葡萄糖胺、壳多糖和/或脱乙酰壳多糖诱导上述一种或多种基因表达。在这些实施方案的一些中，按本领域技术人员已知方法或本文所述测定，与sNAG纳米纤维诱导的上述一种或多种基因的表达水平相比，长的聚-N-乙酰葡萄糖胺、壳多糖和/或脱乙酰壳多糖不诱导上述一种或多种基因的表达或诱导较低水平(例如低1.25倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或1/10倍)的上述一种或多种基因的表达。
在某些实施方案中，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导与下文表I、表II、表III、表V、表VIII和表IX、第6.2-6.5节说明的一种或多种基因表达谱一致、类似、大致相同或相当的基因表达谱。在一些实施方案中，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导在下文表I、表II、表III、表V、表VIII和表IX、第6.2-6.5节中表现为通过sNAG治疗而增量调节的一种或多种的基因表达。在一些实施方案中，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导在下文表I、表II、表III、表V、表VIII和表IX、第6.2-6.5节中表现为通过sNAG治疗而增量调节的大多数或全部基因的表达。在这些实施方案的一些中，通过本领域技术人员已知方法或本文所述，在用sNAG纳米纤维组合物治疗细胞、组织或器官后1小时、2小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、24小时、48小时、3天或5天测量基因表达水平。
在某些实施方案中，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导基因表达谱，其不同于由长的聚-N-乙酰葡萄糖胺聚合物或纤维诱导的表达谱。在具体实施方案中，由sNAG纳米纤维诱导的基因表达谱与下文表I、表II、表III、表V、表VIII和表IX、第6.2-6.5节中所示的一致、类似、大致相同或相当，而由长的聚-N-乙酰葡萄糖胺聚合物或纤维诱导的基因表达谱与下文表VIII和/或表IX、第6.5节所示表达谱一致、类似、大致相同或相当。在其它实施方案中，sNAG纳米纤维或包含sNAG纳米纤维的组合物诱导基因表达谱，其不同于由壳多糖或脱乙酰壳多糖诱导的基因表达谱。
在一个具体实施方案中，通过照射聚-N-乙酰葡萄糖胺和/或其衍生物获得sNAG纳米纤维。有关聚-N-乙酰葡萄糖胺及其衍生物参见下文第5.1.1节，有关采用照射产生sNAG纳米纤维的方法参见下文第5.2节。可采用照射缩减聚-N-乙酰葡萄糖胺纤维和/或聚-N-乙酰葡萄糖胺衍生物纤维的长度形成缩短的聚-β-1→4-N-乙酰葡萄糖胺纤维和/或缩短的聚-N-乙酰葡萄糖胺衍生物纤维，即sNAG纳米纤维。准确地讲，可采用照射缩减/减小聚-N-乙酰葡萄糖胺或其衍生物的长度和分子量而不干扰其微结构。sNAG纳米纤维的红外线谱(IR)与未照射的聚-β-1→4-N-乙酰葡萄糖胺或其衍生物的红外线谱类似、大致相同或相当。
在一个实施方案中，sNAG纳米纤维非来源于壳多糖或脱乙酰壳多糖。而在另一个实施方案中，本文所述组合物可来源于壳多糖或脱乙酰壳多糖，或者sNAG纳米纤维可来源于壳多糖或脱乙酰壳多糖。
5.1.1聚-N-乙酰葡萄糖胺及其衍生物
美国专利号5,622,834、5,623,064、5,624,679、5,686,115、5,858,350、6,599,720、6,686,342、7,115,588和美国专利公布号2009/0117175(其每一个通过引用结合到本文中)描述了聚-N-乙酰葡萄糖胺及其衍生物以及产生它们的方法。在一些实施方案中，聚-N-乙酰葡萄糖胺具有β-1→4构型。在其它实施方案中，聚-N-乙酰葡萄糖胺具有α-1→4构型。聚-N-乙酰葡萄糖胺及其衍生物可呈聚合物的形式或呈纤维的形式。
聚-N-乙酰葡萄糖胺可通过例如微藻类、优选硅藻产生，并且可从微藻类、优选硅藻纯化。可用作产生聚-N-乙酰葡萄糖胺的起始来源的硅藻包括但不限于圆筛藻属(Coscinodiscus)、小环藻属(Cyclotella)和海链藻属(Thalassiosira)的成员。可通过许多不同的方法，包括本领域已知的机械力方法和化学/生物学方法，从硅藻培养物中获得聚-N-乙酰葡萄糖胺(参见例如美国专利号5,622,834、5,623,064、5,624,679、5,686,115、5,858,350、6,599,720、6,686,342和7,115,588，其每一个通过引用以其整体结合到本文中)。在某些实施方案中，聚-N-乙酰葡萄糖胺并非来源于以下的一种或多种：有壳类水生动物、甲壳动物、昆虫、真菌或酵母。
在一个实施方案中，聚-β-1→4-N-乙酰葡萄糖胺来源于包括以下的处理方法：a)包含胞体和聚-β-1→4-N-乙酰葡萄糖胺聚合物纤维的微藻类用能够将N-乙酰葡萄糖胺聚合物纤维从胞体中分离的生物制剂(例如氢氟酸)处理足够时间，使得聚-β-1→4-N-乙酰葡萄糖胺聚合物纤维从胞体中释放出来；b)从胞体中分离聚-β-1→4-N-乙酰葡萄糖胺聚合物纤维；和c)从分离的聚-β-1→4-N-乙酰葡萄糖胺聚合物纤维中除去污染物，从而分离并纯化出聚-β-1→4-N-乙酰葡萄糖胺聚合物。
在其它实施方案中，聚-β-1→4-N-乙酰葡萄糖胺可来源于以下的一种或多种：有壳类水生动物、甲壳动物、昆虫、真菌或酵母。在某些实施方案中，本文所述组合物不含壳多糖或脱乙酰壳多糖。
可使聚-N-乙酰葡萄糖胺的一个或多个单糖单元脱酰基。在某些实施方案中，1％-5％、5％-10％、5％-15％、20％-30％或25％-30％的聚-N-乙酰葡萄糖胺脱去乙酰基。在一些实施方案中，1％、5％、10％、15％、20％、25％或30％的聚-N-乙酰葡萄糖胺脱去乙酰基。在其它实施方案中，低于30％，25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的聚-N-乙酰葡萄糖胺脱去乙酰基。在一些实施方案中，等于或大于1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或全部(100％)的聚-N-乙酰葡萄糖胺脱去乙酰基。在其它实施方案中，低于1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的聚-N-乙酰葡萄糖胺脱去乙酰基。
在某些实施方案中，聚-N-乙酰葡萄糖胺组合物包含70％-80％、75％-80％、75％-85％、85％-95％、90％-95％、90％-99％或95％-100％的乙酰化葡萄糖胺(即N-乙酰葡萄糖胺)单糖。在一些实施方案中，聚-N-乙酰葡萄糖胺组合物包含70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的乙酰化葡萄糖胺(即N-乙酰葡萄糖胺)单糖。在其它实施方案中，聚-N-乙酰葡萄糖胺组合物包含超过70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％的乙酰化葡萄糖胺。在一些实施方案中，聚-N-乙酰葡萄糖胺组合物包含等于或大于1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或全部(100％)的乙酰化葡萄糖胺。在其它实施方案中，聚-N-乙酰葡萄糖胺组合物包含小于1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的乙酰化葡萄糖胺。
在一些实施方案中，聚-N-乙酰葡萄糖胺组合物包含至少一种葡萄糖胺单糖，且还包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的N-乙酰葡萄糖胺单糖。在其它实施方案中，聚-N-乙酰葡萄糖胺组合物包含至少一种N-乙酰葡萄糖胺单糖，且还包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的葡萄糖胺单糖。
聚-N-乙酰葡萄糖胺的衍生物也可用于本文所述的组合物。聚-N-乙酰葡萄糖胺的衍生物和制备该种衍生物的方法描述于美国专利号5,623,064(参见例如第5.4节)，其通过引用以其整体结合到本文中。聚-N-乙酰葡萄糖胺的衍生物可包括但不限于部分或完全脱乙酰化聚-N-乙酰葡萄糖胺或其脱乙酰化衍生物。此外，聚-N-乙酰葡萄糖胺可通过硫酸化、磷酸化和/或硝化而衍生化。聚-N-乙酰葡萄糖胺衍生物包括例如硫酸化聚-N-乙酰葡萄糖胺衍生物、磷酸化聚-N-乙酰葡萄糖胺衍生物或硝化聚-N-乙酰葡萄糖胺衍生物。此外，聚-N-乙酰葡萄糖胺的一个或多个单糖单元可含有一个或多个磺酰基、一个或多个O-酰基。另外，脱乙酰化聚-N-乙酰葡萄糖胺的一个或多个单糖可含有N-酰基。聚-N-乙酰葡萄糖胺或其脱乙酰化衍生物的一个或多个单糖可含有O-烷基。聚-N-乙酰葡萄糖胺的一个或多个单糖单元可为碱衍生物。聚-N-乙酰葡萄糖胺的脱乙酰化衍生物的一个或多个单糖单元可含有N-烷基。聚-N-乙酰葡萄糖胺的脱乙酰化衍生物的一个或多个单糖单元可含有至少一个脱氧卤(deoxyhalogen)衍生物。聚-N-乙酰葡萄糖胺的脱乙酰化衍生物的一个或多个单糖单元可形成盐。聚-N-乙酰葡萄糖胺的脱乙酰化衍生物的一个或多个单糖单元可形成金属螯合物。在一个具体实施方案中，金属为锌。聚-N-乙酰葡萄糖胺的脱乙酰化衍生物的一个或多个单糖单元可含有N-亚烷基或N-亚芳基。在一个实施方案中，衍生物是乙酸酯衍生物。在另一个实施方案中，衍生物不是乙酸酯衍生物。在一个实施方案中，聚-N-乙酰葡萄糖胺或脱乙酰化聚-N-乙酰葡萄糖胺用乳酸衍生化。其中，在另一个实施方案中，衍生物不用乳酸衍生化。
5.2制备sNAG纳米纤维的方法
聚-N-乙酰葡萄糖胺聚合物或纤维和上述聚-N-乙酰葡萄糖胺聚合物或纤维的任何衍生物可作为干的聚合物或纤维或者聚合物或纤维膜来照射。或者，聚-N-乙酰葡萄糖胺聚合物或纤维和上述聚-N-乙酰葡萄糖胺聚合物或纤维的任何衍生物可在潮湿时照射。通过照射制备sNAG纳米纤维的方法和如此产生的sNAG纳米纤维描述于美国专利公布号2009/0117175，其通过引用以其整体结合到本文中。
在某些实施方案中，将聚-N-乙酰葡萄糖胺聚合物或纤维制成悬浮液/浆液或湿饼用于照射。可在将聚合物或纤维制成其最终制剂(例如敷料)之前、同时或之后进行照射。一般而言，悬浮液/浆液的聚合物或纤维含量可变化，例如约0.5mg-约50mg的聚合物或纤维/1ml蒸馏水用于浆液，约50mg-约1000mg的聚合物或纤维/1ml蒸馏水用于湿饼制剂。可先将聚合物或纤维在液氮中冻干、冰冻并粉碎，使之更易于形成悬浮液/浆液或湿饼。同样，可将悬浮液/浆液过滤除去水分，从而形成湿饼。在某些方面，照射作为包含约0.5mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、12mg、15mg、18mg、20mg、25mg或50mg的聚合物或纤维/ml蒸馏水或前述实施方案之间的任何范围(例如1-10mg/ml、5-15mg/ml、2-8mg/ml、20-50mg/ml等)的悬浮液的聚合物或纤维。在其它方面，照射作为包含约50-1,000mg聚合物或纤维/1ml蒸馏水的湿饼的聚合物或纤维。在具体实施方案中，湿饼包含约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000mg聚合物或纤维/1ml蒸馏水或之间的任何范围(例如100-500mg/ml、300-600mg/ml、50-1000mg/ml等)。
照射优选呈γ辐射、电子束辐射或X射线的形式。优选两种照射来源：放射性核素和电。在具体实施方案中，放射性核素为钴-60和铯-137。这两种核素发射γ射线，其是无质量的光子。γ射线具有0.66-1.3MeV的能量。使用电，产生电子，并加速至高达10MeV或更高的能量。当照射聚合物或纤维以减小其大小时，要考虑的是通过10MeV电子穿透密度类似于水的材料的深度在一侧暴露时限于约3.7cm，或两侧暴露时限于约8.6cm。在较低的电子能量下，穿透深度减小。可通过将金属(通常为钨或钽)靶标置于电子光路中，来将电子能量转换成X射线。X射线的转换限于能量至多5MeV的电子。X射线是无质量的光子，与γ射线类似，可穿透聚合物或纤维。在电子能量转换为x射线能量时，仅有约8％效率。在x射线产生设备中需要高能电子束机器，是低转换效率的原因。
在一个具体实施方案中，照射为γ辐射。
辐射的吸收剂量是每单位产品重量吸收的能量，以戈瑞(gy)或千戈瑞(kgy)测量。对于干的聚合物或纤维，优选的吸收剂量为约500-2,000kgy辐射，最优选约750-1,250kgy或约900-1,100kgy辐射。对于湿的聚合物或纤维，优选的吸收剂量为约100-500kgy辐射，最优选约150-250kgy或约200-250kgy辐射。
辐射剂量可根据其对聚合物或纤维的长度的作用来描述。在具体实施方案中，所用辐射剂量优选分别减短聚合物或纤维的长度介于聚合物或纤维的起始长度约10％至90％之间。在具体实施方案中，平均长度减短达约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或约90％或之间的任何范围(例如20-40％、30-70％，等等)。或者，所用辐射剂量优选减短聚合物或纤维的长度大约1微米至100微米之间。在具体实施方案中，根据起始纤维长度，聚合物或纤维的平均长度减短至小于约15微米、小于约14微米、小于约13微米、小于约12微米、小于约11微米、小于约10微米、小于约8微米、小于约7微米、小于约5微米、小于约4微米、小于约3微米、小于2微米或小于1微米。在某些实施方案中，大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)聚合物或纤维的长度减短至仅仅约20微米、仅仅约15微米、仅仅约12微米、仅仅约10微米、仅仅约8微米、仅仅约7微米或仅仅约5微米。在某些实施方案中，照射聚合物或纤维减短大多数(在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间)纤维的长度至介于约1-20微米之间、介于约1-15微米之间、介于约2-15微米之间、介于约1-12微米之间、约2-12微米之间、约1-10微米之间、约2-10微米之间、介于约1-8微米之间、介于约2-8微米之间、介于约1-7微米之间、介于约2-7微米之间、介于约3-8微米之间、介于约4-7微米之间、介于约1-5微米之间、介于约2-5微米之间、介于约3-5微米之间、介于约4-10微米之间，或已包括在内的前述长度的任何范围。
还可根据其对聚合物或纤维的分子量的作用来描述辐射剂量。在具体实施方案中，所用辐射剂量优选降低聚合物或纤维的分子量至聚合物或纤维初重的约10％-90％之间。在具体实施方案中，平均分子量降低达约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或约90％或之间的任何范围(例如20-40％、30-70％，等等)。或者，所用辐射剂量优选降低聚合物或纤维的分子量至1,0000-1,000,000道尔顿之间。在具体实施方案中，根据起始分子量，平均聚合物或纤维的分子量降低至小于1,000,000道尔顿、小于750,000道尔顿、小于500,000道尔顿、小于300,000道尔顿、小于200,000道尔顿、小于100,000道尔顿、小于90、000道尔顿、小于80,000道尔顿、小于70,000道尔顿、小于60,000道尔顿、小于50,000道尔顿、小于25,000道尔顿、小于10,000道尔顿或小于5,000道尔顿。在某些实施方案中，平均分子量降低至不少于500道尔顿、不少于1,000道尔顿、不少于2,000道尔顿、不少于3,500道尔顿、不少于5,000道尔顿、不少于7,500道尔顿、不少于10,000道尔顿、不少于25,000道尔顿、不少于50,000道尔顿、不少于60,000道尔顿或不少于100,000道尔顿。还包括前述平均分子量之间的任何范围；例如，在某些实施方案中，聚合物或纤维的照射降低平均分子量至介于约10,000至100,000道尔顿之间、介于1,000和25,000道尔顿之间、介于50,000和500,000道尔顿之间、介于25,000和100,000道尔顿之间、介于30,000和90,000道尔顿之间、介于约40,000和80,000道尔顿之间、介于约25,000和75,000道尔顿之间、介于约50,000和70,000道尔顿之间或介于约55,000和65,000道尔顿之间等等。在某些实施方案中，聚合物或纤维的照射降低大多数的分子量，而在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间的纤维降低至介于约20,000和100,000道尔顿、约25,000和75,000道尔顿、约30,000和90,000道尔顿、约40,000和80,000道尔顿、约50,000和70,000道尔顿或约55,000和65,000道尔顿之间。在某些实施方案中，聚合物或纤维的照射降低大多数的分子量，在某些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％或者介于55％-65％、55％-75％、65％-75％、75％-85％、75％-90％、80％-95％、90％-95％或95％-99％之间的纤维降低至约60,000道尔顿。
在照射后，可将浆液过滤并干燥，并可将湿饼干燥，形成可用于本发明实践的组合物(例如敷料和本文所述的其它组合物)。
5.3包含sNAG纳米纤维的组合物
可将sNAG纳米纤维配制成各种组合物用于本文所述局部给药。
可将包含sNAG纳米纤维的组合物配制成乳膏剂、膜、膜剂、液体溶液剂、混悬剂、粉剂、糊剂、软膏剂、栓剂、明胶组合物、气雾剂、凝胶剂或喷雾剂。在一个实施方案中，将包含sNAG纳米纤维的组合物配制成超薄膜。在一些实施方案中，将包含sNAG纳米纤维的组合物配制成敷料、垫片或绷带。还考虑了适于溶液中或悬浮液中的固体制剂、给药前的液体制剂。将这类组合物整合在可植入装置中或包覆在可植入装置上也是可行的，例如其中抗菌活性可能是有益的矫形植入物(用于髋、膝、肩；钉、螺丝钉等)、心血管植入物(支架、导管等)等。
包含sNAG纳米纤维的组合物可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。合适的赋形剂可包括水、盐水、盐溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等或其组合。合适的赋形剂还包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、油(包括石油、动物、植物或合成来源的油、例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、丙烯、二醇等。另外，包含sNAG纳米纤维的组合物可包括润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂和其它作用剂的一种或多种。还可将sNAG纳米纤维组合物掺入生理上可接受的载体中，例如掺入适于局部施用的生理上可接受的载体中。术语“药学上可接受的”意指经联邦或州政府管理机构核准或列于美国药典或其它普遍公认的药典以用于动物，更特别用于人。合适药用载体的实例描述于E.W.Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"。
组合物中sNAG纳米纤维的最终用量可变化。例如，组合物(例如经制备用于给予患者)中sNAG纳米纤维的量可大于或等于50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或约99％重量/体积。在一个实施方案中，组合物中sNAG纳米纤维的量为约95％、约98％、约99或约100％。同样，组合物(例如经制备用于给予患者)中sNAG纳米纤维的量可为约50％-100％、约60％-100％、约70％-100％、约75％-100％、约80％-100％、约90％-100％、约95％-100％、约70％-95％、约75％-95％、约80％-95％、约90％-95％、约70％-90％、约75％-90％或约80％-90％重量/体积。组合物可包含超过30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％sNAG纳米纤维溶液。
可将sNAG纳米纤维组合物配制成伤口敷料。在某些实施方案中，将sNAG纳米纤维组合物配制成为呈屏障、膜或膜剂形式的伤口敷料。或者，可将sNAG纳米纤维组合物加入敷料衬垫例如屏障、膜或软片中。可以标准尺寸提供屏障、膜或软片，可进一步剪切，使成待治疗面积的大小。衬垫可以是常用的敷料材料，例如在给患者施用时将聚合物或纤维加入或包覆在之上的绷带或纱布。或者，可将sNAG纳米纤维配制成为用线、微珠、微球或微纤维制造的屏障、膜或软片，或者可将组合物配制成为形成屏障的垫片。在某些实施方案中，至少75％、至少85％、至少90％或至少95％的敷料由sNAG纳米纤维组成。在某些方面，敷料不含常用的敷料材料，例如纱布或绷带。在这类实施方案中，将sNAG纳米纤维本身配制成伤口敷料。
包含sNAG纳米纤维的组合物还可包含任何合适的天然或合成的聚合物或纤维。合适的聚合物或纤维的实例包括纤维素聚合物、黄原胶、聚芳酰胺、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酰胺/酰亚胺、聚酰胺酰肼、聚酰肼、聚咪唑、聚苯并噁唑、聚酯/酰胺、聚酯/酰亚胺、聚碳酸酯/酰胺、聚碳酸酯/酰亚胺、聚砜/酰胺、聚砜酰亚胺等、其共聚物和混合物。聚合物或纤维的其它合适类别包括聚偏二氟乙烯(polyvinyledene fluoride)和聚丙烯腈。这些聚合物或纤维的实例包括描述于美国专利号RE 30,351、4,705,540，4,717,393、4,717,394、4,912,197、4,838,900、4,935,490、4,851,505、4,880,442、4,863,496、4,961,539和欧洲专利申请0 219 878的那些，其全部均通过引用予以结合。聚合物或纤维可包括纤维素聚合物、聚酰胺、聚芳酰胺、聚酰胺/酰亚胺或聚酰亚胺的至少一种。在某些实施方案中，聚合物或纤维包括聚芳酰胺、聚酯、氨基甲酸乙酯和聚四氟乙烯。在一个实施方案中，本文所述组合物包含不止聚合物的一种类型(例如sNAG纳米纤维和纤维素)。
在某些方面，sNAG纳米纤维是组合物中的唯一活性成分。
在其它实施方案中，组合物包含一种或多种其它活性成分，以例如促进抗菌作用和/或愈合(例如伤口愈合)。在一些实施方案中，其它活性成分是一种或多种抗菌剂(例如抗生素、防卫素肽、防卫素样肽或Toll-受体样肽)或生长因子。在具体实施方案中，其它活性成分是生长因子，例如PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD、FGF-1、FGF-2、FGF-5、FGF-7、FGF-10、EGF、TGF-α(HB-EGF)、双调蛋白、上皮调节蛋白、β细胞调节素(betacellulin)、神经调节蛋白、epigen、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盘生长因子(PLGF)、促血管生成素-1、促血管生成素-2、IGF-I、IGF-II、肝细胞生长因子(HGF)和巨噬细胞刺激蛋白(MSP)的一种或多种。在其它实施方案中，其它活性成分是促进免疫系统的作用剂、止痛药或退热药。
在某些实施方案中，其它活性成分是下列抗生素类之一的抗生素：大环内酯类(例如红霉素、阿奇霉素)、氨基糖苷类(例如阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素)、头孢菌素类(例如头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢噻肟、头孢吡肟)、氟喹诺酮类(例如环丙沙星、左氧氟沙星)、青霉素类(例如青霉素、氨苄西林、阿莫西林)、四环素类(例如四环素、多西环素)和碳青霉烯类(例如美罗培南、亚胺培南)。在一些具体实施方案中，其它活性成分是以下的一种或多种：万古霉素、磺胺药(例如复方新诺明/甲氧苄啶-磺胺甲噁唑复方)、四环素(例如多西环素、米诺环素)、克林霉素、噁唑烷酮类(例如利奈唑胺)、达托霉素、替考拉宁、奎奴普丁/达福普汀(共杀素)、替吉环素、蒜素、杆菌肽、呋喃西林、过氧化物、新生霉素、奈替米星、甲基乙二醛(methylglyoxal)、蜜蜂防卫素-1、妥布霉素、二葡萄糖酸氯己定、葡萄糖酸氯己定、左氧氟沙星、锌和银。在一些实施方案中，组合物包含sNAG纳米纤维和有效治疗或预防或者通常用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染、MRSA感染、假单胞菌感染或艰难梭菌感染的其它活性成分(例如有效对抗这类感染或常用来对抗这类感染的抗生素)。
sNAG纳米纤维组合物可含有胶原，虽然在某些方面，sNAG纳米纤维组合物不含胶原。
在某些实施方案中，sNAG纳米纤维组合物不含任何其它疗法。在某些实施方案中，sNAG纳米纤维组合物不含任何其它抗菌剂、防卫素肽、防卫素样肽、Toll-受体样肽或生长因子。在一些实施方案中，sNAG纳米纤维组合物不含抗生素。在另外其它的实施方案中，sNAG纳米纤维组合物可包含其它疗法(例如抗生素)。在一个这样的实施方案中，其它疗法(例如抗生素)未包覆、固定或配制在sNAG纳米纤维中。
在其它方面，sNAG纳米纤维组合物不含大量的蛋白质材料。在具体实施方案中，sNAG纳米纤维组合物的蛋白质含量不大于0.1％、0.5％或1％重量。在其它实施方案中，通过考马斯染色无法检出组合物的蛋白质含量。
在一个实施方案中，sNAG纳米纤维组合物中还包括锌。除其抗微生物性质以外，锌还在伤口愈合中起作用(参见Andrews等，1999,Adv Wound Care 12:137-8)。优选以盐的形式加入锌，例如氧化锌、硫酸锌、乙酸锌或葡糖酸锌。
5.4 sNAG组合物的抗菌用途
可通过给予本文所述的sNAG纳米纤维组合物来治疗和/或预防多种细菌感染和与之相关的疾病(参见例如第5.4.1和5.4.2节，见下文)。在一个实施方案中，本文所述组合物是抑菌剂。在另一个实施方案中，本文所述组合物是杀菌剂。在一个实施方案中，本文所述组合物可用于治疗和/或预防革兰氏阳性细菌所致感染和/或任何与之相关的疾病。在另一个实施方案中，本文所述组合物可用于治疗和/或预防革兰氏阴性细菌所致感染和/或任何与之相关的疾病。在又一个实施方案中，本文所述组合物可用于治疗和/或预防革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌两者所致感染和/或任何与之相关的疾病。
可使用本文所述组合物治疗和/或预防的细菌感染包括以下细菌所致感染：水螺菌科(Aquaspirillum family)、固氮螺菌科(Azospirillum family)、固氮菌科(Azotobacteraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、巴尔通氏体属(Bartonella)菌种、蛭弧菌科(Bdellovibrio family)、弯曲杆菌属(Campylobacter)菌种、衣原体属菌种(例如肺炎衣原体)、棱菌属、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(例如柠檬酸杆菌(Citrobacter)菌种、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、欧文氏菌属(Erwinia)菌种、大肠杆菌、哈夫尼菌属(Hafnia)菌种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)菌种、摩根氏菌属(Morganella)菌种、普通变形菌(Proteus vulgaris)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)菌种、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)和弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri))、加德纳氏菌科(Gardinella family)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、螺杆菌科(Helicobacterfamily)、军团菌科(Legionallaceae)、李斯特氏菌属((Listeria))菌种、甲基球菌科(Methylococcaceae)、分枝杆菌(例如结核分枝杆菌)、奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)、海洋螺杆菌科(Oceanospirillum family)、巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)、肺炎球菌菌种、假单胞菌属(Pseudomonas菌种)菌种、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、螺菌科(Spirillumfamily)、螺状菌科(Spirosomaceae)、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和酿脓葡萄球菌(Staphylococcus pyrogenes))、链球菌属(Streptococcus)(例如肠炎链球菌(Streptococcus enteritidis)、Streptococcus fasciae和肺炎链球菌)、Vampirovibr、螺杆菌科(Helicobacter family)和/或吸血弧菌科(Vampirovibriofamily)的细菌。在一个具体实施方案中，由这类细菌所致感染引起的疾病或与由这类细菌所致感染有关的疾病也可使用本文所述组合物预防和/或治疗。
可使用本文所述组合物治疗和/或预防的细菌感染还包括由下列属的细菌引起的感染：鲍特氏菌属、疏螺旋体属、布鲁氏菌属、弯曲杆菌属、衣原体属和Clamidophylia、棱菌属、棒杆菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、弗朗西丝氏菌属、嗜血菌属、螺杆菌属、军团菌属、钩端螺旋体属、李斯特氏菌属、分枝杆菌属、枝原体属、奈瑟氏球菌属、假单胞菌属、立克次氏体属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属、密螺旋体属、弧菌属和/或耶尔森氏菌属。在一个具体实施方案中，由这类细菌所致感染引起的疾病或与由这类细菌所致感染有关的疾病也可使用本文所述组合物预防和/或治疗。
可使用本文所述组合物治疗和/或预防的细菌感染包括由下列菌种的细菌引起的感染：炭疽芽孢杆菌、百日咳鲍特氏菌、布氏疏螺旋体、流产布鲁氏菌、狗布鲁氏菌、马耳他布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、空肠弯曲杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、白喉棒杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌、流感嗜血菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、肺炎性钩端螺旋体、问号钩端螺旋体、单核细胞增生李斯特氏菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、肺炎枝原体、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、铜绿假单胞菌、奇异变形菌、立氏立克次氏体、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、非解乳糖链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、苍白密螺旋体、霍乱弧菌和/或鼠疫耶尔森氏菌。在一个具体实施方案中，由这类细菌所致感染引起的疾病或与由这类细菌所致感染有关的疾病也可使用本文所述组合物预防和/或治疗。
在一些实施方案中，本文所述组合物可用于治疗和/或预防需氧细菌所致感染和/或与之相关的疾病。在其它实施方案中，本文所述组合物可用于治疗和/或预防厌氧细菌所致感染和/或与之相关的疾病。
在某些实施方案中，使用本文所述组合物治疗和/或预防铜绿假单胞菌感染。假单胞菌是一种革兰氏阴性需氧细菌，存在于油、水、其它潮湿环境、植物和动物、产生蓝-绿色色素绿脓菌素和特有甜味的临床分离菌种中。已知铜绿假单胞菌引起尿路感染、肺炎、呼吸系统感染、皮炎、软组织感染、菌血症(bacterimia)、骨与关节感染、胃肠感染和各种全身性感染。已知它是引起感染的重要原因，特别在烧伤患者、囊性纤维化患者、发生免疫抑制的患者(例如AIDS和癌症患者)和住院超过1周的患者中。它是医院内感染例如但不限于肺炎、泌尿道感染和菌血症的常见原因。可通过本文所述组合物来预防和/或治疗这些感染的任一种或全部。
在一些实施方案中，使用本文所述组合物治疗和/或预防葡萄球菌感染，特别是金黄色葡萄球菌感染。在该实施方案和本文描述的其它实施方案中，sNAG纳米纤维组合物的使用可阻止产生抗性生物以及允许不依赖抗生素地清除细菌感染。
在某些实施方案中，本文所述组合物可用来对抗对一种或多种抗菌剂有抗性的细菌。例如，本文所述组合物可用来治疗对一种或多种抗生素有抗性的细菌，例如对常用抗生素有抗性的细菌例如MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)、VRSA(耐万古霉素金黄色葡萄球菌)、VRE(耐万古霉素肠球菌)、耐青霉素类肠球菌、PRSP(耐青霉素类肺炎链球菌)、耐异烟肼/利福平结核分枝杆菌和耐其它抗生素细菌的菌株(例如大肠杆菌、沙门氏菌属、弯曲杆菌属和链球菌的抗性菌株)。在一个实施方案中，本文公开的组合物可用来治疗多重耐药细菌。
在一些具体实施方案中，本文所述组合物可用于治疗和/或预防耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(“MRSA”；它亦可称为多重耐药金黄色葡萄球菌或耐苯唑西林金黄色葡萄球菌(“ORSA”))。MRSA是对β-内酰胺抗生素出现抗性的金黄色葡萄球菌的任何菌株，其包括但不限于青霉素类(青霉素类、甲氧西林、双氯西林、萘夫西林、苯唑西林等)和头孢菌素类。MRSA的一些已知菌株包括EMRSA15和EMRSA16(亦称MRSA252)，其对红霉素和环丙沙星有抗性；CC8(亦称ST8:USA300)；ST1:USA400；ST8:USA500；ST59:USA1000；ST93菌株；ST80菌株和ST59菌株。MRSA是造成人的多种感染的原因。MRSA是一个严重的健康隐忧，引起约50％的卫生保健相关的葡萄球菌感染。在美国，每年超过94,000人发生严重的MRSA感染，约19,000死于感染。尤其流行的MRSA是在医院中；其中MRSA感染的风险因素包括既往抗生素暴露(例如喹诺酮抗生素)、进入重症监护室、手术和暴露于MRSA定居的患者。有开放性伤口的患者、无免疫应答的患者(由于例如HIV/AIDS、癌症、移植手术、重度哮喘所引起)、低龄儿童(例如婴儿和幼童)和年长者(例如老年人)具有发生MRSA感染的高风险。还在毒品注射者、糖尿病人、皮肤病患者、带有侵入性装置(例如血管内导管)的患者和保健工作者和在有限空间(囚犯、士兵、长期医疗保健设施例如护理院中的患者)度过时光的其它人中观察到MRSA感染的较高风险率。金黄色葡萄球菌最常定居在鼻前孔(鼻孔)，虽然呼吸道的其余部位、开放性伤口、静脉内导管和泌尿道也是潜在的感染部位。大部分社区相关性MRSA感染位于皮肤和软组织上。MRSA的初期症状包括类似于丘疹、蜘蛛咬伤或疖的红肿，可伴有发热和皮疹；肿块最稍后发展成灌脓疖。社区相关性MRSA的普遍现象是皮肤感染，例如坏死性筋膜炎或脓性肌炎、坏死性肺炎、感染性心内膜炎、骨或关节感染。一些MRSA导致脓毒症和中毒性休克综合征，这可能是由于这类菌株(例如PVL、PSM)所带毒素所致。MRSA可引起蜂窝组织炎。上述任一种或本领域已知的MRSA菌株、诊断有MRSA、MRSA的症状的患者、有MRSA和/或MRSA相关疾病风险的患者群可用本文所述组合物治疗。在一些实施方案中，本文所述组合物防止一种或多种MRSA症状的发作或发展，或缩短/降低一种或多种这些症状(例如本文所述症状)的持续时间和/或严重程度。
本文所述组合物可用作杀死或毁坏有害细菌的杀菌剂。例如，本文所述组合物可用来治疗已建立的细菌感染，预防性防止细菌感染或局部给予对象易受感染的部位或可能是适于细菌生长的位置的部位(例如牙龈、开放性伤口、褥疮和阴道或腹肌沟部位)。
在某些实施方案中，本文所述组合物降低细菌生长和/或细菌存活率超过菌落形成单位(CFU)/mL的约0.1log、0.2log、0.25log、0.3log、0.4log、0.5log、0.6log、0.7log、0.75log、0.8log、0.9log、1log、1.25log、1.5log、1.75log、2log、2.25log、2.5log、2.75log、3log、3.25log、3.5log、3.75log、4log、4.5log、5log、5.5log、6log、6.5log、7log、7.5log、8log、8.5log、9log、9.5log、10log、10.5log、11log、11.5log、12log、12.5log、13log、13.5log、14log、14.5log或15log。在某些实施方案中，本文所述组合物降低细菌生长和/或细菌存活率达菌落形成单位(CFU)/mL的约0.2log-15log、0.2log-10log、0.2log-5log、0.5log-15log、0.5log-10log、0.5log-5log、0.5log-3log、1log-15log、1log-12log、1log-10log、1log-7log、1log-5log、1log-3log、1.5log-5log、2log-15log、2log-10log、2log-5log、3log-15log、3log-10log、3log-5log、4log-10log、2log-8log、3log-8log、4log-8log、2log-7log、3log-7log、2log-6log和这些值之间的任何值。在某些实施方案中，本文所述组合物降低细菌生长和/或细菌存活率达等于或大于1x 1010、0.5x 1011、1x 1011、1.5x 1011、2x 1011、2.5x 1011、3x 1011、4x 1011、5x 1011、7x 1011、1x 1012、1.5x 1012、2x1012、3x 1012、5x 1012、7x 1012、8x 1012、1x 1013、1.5x 1013或2x 1013(CFU)/mL或这些值之间的任何范围的值。在一些实施方案中，在细菌感染用单次施用/剂量或多次施用/剂量的sNAG纳米纤维组合物治疗后的以下时间内，实现细菌生长和/或存活率的这类降低：少于约30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、15小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、1周、2周、3周、4周、1月或2月。
在一个实施方案中，待用sNAG纳米纤维组合物治疗的感染不是病毒感染、真菌感染、寄生物感染或酵母感染。
可用本文所述的sNAG纳米纤维组合物治疗和/或预防各种与细菌感染相关的疾病或病况(参见例如第5.4.2节，见下文)。在一个实施方案中，考虑了用于治疗现有的细菌感染或细菌感染相关疾病的方法。
在一些实施方案中，本文所述组合物可用来治疗伤口(参见第5.4.1节，见下文)。在具体实施方案中，本文所述组合物用来治疗细菌感染的伤口。在其它实施方案中，本文所述组合物用来预防伤口的细菌感染。在一些实施方案中，本文所述组合物用来治疗已知与伤口感染有关的细菌，尤其用来治疗金黄色葡萄球菌/MRSA、酿脓链球菌、肠球菌和/或铜绿假单胞菌感染和与这类感染有关的疾病。
在其它实施方案中，本文所述组合物非用于治疗伤口。在一个实施方案中，本文所述组合物非用于治疗慢性伤口。在另一个实施方案中，本文所述组合物非用于治疗烧伤创面。在又一个实施方案中，本文所述组合物非用于治疗手术创伤。在一个实施方案中，本文所述组合物非用于治疗慢性伤口、烧伤创面和手术创伤。在另一个实施方案中，本文所述组合物非用于治疗伤口和/或灼伤。在又一个实施方案中，本文所述组合物非用于治疗未感染伤口。
在一些实施方案中，本文所述组合物非用于治疗细菌感染的伤口。在另一个实施方案中，本文所述组合物非用于治疗与伤口有关或因伤口引起的细菌感染。在一些实施方案中，本文所述组合物非用于治疗已知与伤口感染有关的细菌，例如金黄色葡萄球菌/MRSA、酿脓链球菌、肠球菌和/或铜绿假单胞菌。
在一些实施方案中，本文所述组合物可用于治疗或预防各种细菌感染和因细菌感染引起或与细菌感染相关疾病，其与伤口无关(参见第5.4.2节，见下文)。
在某些实施方案中，细菌感染相关疾病的治疗包括将本文所述组合物之一给予对象或对象群以治疗疾病或者获得有益效果或治疗效果。在具体实施方案中，该治疗在对象或对象群中实现以下1、2、3、4、5种或更多种作用：(i)降低或改善疾病或与之相关症状的严重程度；(ii)缩短疾病或与之相关症状的持续时间；(iii)防止疾病或与之相关症状的发展；(iv)使疾病或与之相关症状消退；(v)预防与之相关症状的发生或发作；(vi)预防与之相关症状的复发；(vii)防止或减少疾病从对象或对象群传播至另一对象或对象群；(viii)减少疾病相关器官衰竭；(ix)降低住院发生率；(x)缩短住院期长短；(xi)延长生存期；(xii)消除疾病；(xiii)提高或改进另一疗法的预防效果或治疗效果；(xiv)提高生命质量，通过本领域众所周知的方法(例如问卷法)来评价；(xv)减少疾病症状的数目；和/或(xvi)降低死亡率。在一些实施方案中，治疗包括使用本文所述组合物的任何疗法。
在一些实施方案中，治疗细菌感染包括将本文所述组合物之一给予对象或对象群以治疗细菌感染或细菌感染的症状。在具体实施方案中，该治疗在对象或对象群中实现以下1、2、3、4、5种或更多种作用：(i)清除细菌感染；(ii)根除一种或多种与细菌感染有关的症状，(iii)缩短清除细菌感染需要的时间；(iv)减轻或改善细菌感染和/或与之有关的一种或多种症状的严重程度；(v)缩短细菌感染和/或与之有关的一种或多种症状的持续时间；(vi)防止或延迟细菌的一个或多个抗性菌株的产生或减少所产生的细胞抗性菌株的数目；(vii)防止与之有关的一种或多种症状的复发；(viii)减少或排除细菌细胞群(例如患者物样品中细菌计数减少，按本领域已知的或本文描述的方法之一通过CFU/mL或log降低来测量)；(ix)减少对象的住院治疗；(x)缩短住院期长度；(xi)延长对象的生存期；(xii)提高或改善其它疗法的治疗效果；(xiii)降低死亡率；(xiv)减少或消除细菌从一对象散布至另一对象，或者从一个器官或组织散布至另一器官或组织；(xv)防止细菌数目的增加；(xvi)防止与之有关的一种或多种症状的发生或发作；(xvii)减少与细菌感染有关的症状的数目；(xviii)抑制或减少与细菌感染有关的一种或多种细菌毒素的产生；(xix)稳定或减轻与细菌感染相关的炎症；(xx)减轻与细菌感染有关的器官衰竭或与之相关的疾病；和/或(xxi)提高生命质量，通过本领域众所周知的方法(例如问卷法)来评价。
在某些实施方案中，将本文所述组合物给予对象导致以下的一种或多种：(i)诱导一种或多种防卫素蛋白和/或防卫素样蛋白表达；(ii)诱导一种或多种Toll样受体表达；和/或(iii)诱导有益于清除或减少细菌感染或与之有关的一种或多种症状的一种或多种蛋白质的表达。
在某些实施方案中，预防细菌感染包括将本文所述组合物之一给予对象或对象群以实现一种或多种下列作用：(i)抑制细菌感染或与之相关症状的发生或发作；和/或(ii)抑制细菌感染或与之相关症状的复发。
在其它实施方案中，预防细菌感染包括将本文所述组合物之一给予对象或对象群以预防细菌感染相关疾病。在具体实施方案中，这类预防在对象或对象群中实现一种或多种下列作用：(i)抑制细菌感染相关疾病或其症状的发生或发作；和/或(ii)抑制细菌感染相关疾病或与之相关症状的复发。
5.4.1伤口细菌感染的治疗或预防
在某些实施方案中，本文所述sNAG纳米纤维组合物可用于治疗累及机体任何组织的各种细菌感染的伤口或防止有被细菌感染风险的伤口被感染。
有两种伤口类型，开发性和闭合性伤口。按照引起伤口的物体，对开放性伤口分类。例如由边缘光滑的锋利物体例如刀、剃刀或玻璃碎片造成的切口或切伤(包括手术创伤)。撕裂伤是因位于硬组织上的软组织受钝击所造成的不规则伤口(例如覆盖颅骨的皮肤的撕裂伤)或由例如分娩造成的皮肤和其它组织撕裂。擦伤或擦破是其中皮肤的最上层(表皮)被擦伤的浅表伤口。刺伤由刺穿皮肤的物体(例如钉或针)造成。贯通伤由插入身体的物体(例如刀)造成。枪弹伤由射入身体(例如射入伤)和/或射穿身体(例如射出伤)的子弹或类似射弹造成。在医学情况下，所有的戳伤和枪弹伤都为开放性伤口。开放性伤口还包括由热、化学或电击伤引起的烧伤创面。闭合性伤口包括挫伤(更常称为瘀伤，由损伤皮下组织的钝物外伤造成)、血肿(亦称blood tumor，由血管损伤造成，进而造成皮下血液聚集)和挤压伤(由在长时间内施以极大力或过分使力造成)。
在某些实施方案中，本文所述组合物用来治疗细菌感染的开放性伤口或预防开放性伤口的细菌感染。在某些实施方案中，本文所述组合物可用于治疗或预防枪弹伤、刺伤和/或贯通伤的细菌感染。在某些实施方案中，本文所述组合物可用于治疗或预防术后细菌感染、手术部位细菌感染、导管相关性细菌感染或血液透析相关性细菌感染。在又一个实施方案中，本文所述组合物非用于治疗或防止开放性伤口的细菌感染、枪弹伤、刺伤和/或贯通伤。在某些实施方案中，本文所述组合物非用于治疗或预防术后细菌感染、手术部位细菌感染、导管相关性细菌感染或血液透析相关性细菌感染。
在一些实施方案中，伤口是慢性伤口。慢性伤口可以是未能适当愈合的任何伤口，包括手术创伤(例如植皮供区)、皮肤溃疡(例如糖尿病性溃疡、静脉淤滞性溃疡、小腿溃疡、动脉供血不足溃疡(arterial insufficiency ulcer)或褥疮)或烧伤创面。在一个实施方案中，本文所述组合物用于治疗或预防慢性伤口感染(例如与糖尿病性溃疡、静脉淤滞性溃疡、小腿溃疡、动脉供血不足溃疡、褥疮、手术创伤或灼伤相关的感染)。在又一个实施方案中，本文所述组合物非用于治疗或预防慢性伤口细菌感染(例如非用于预防与糖尿病性溃疡、静脉淤滞性溃疡、小腿溃疡、动脉供血不足溃疡、褥疮、手术创伤或灼伤相关的细菌感染)。
在某些实施方案中，本文所述组合物用于治疗或预防医院内细菌感染。医院内细菌感染中，手术创伤细菌感染占支配地位；统计数据显示高达所有手术患者的8％。这类感染类型的直接成本每年约为45亿美元。许多医院传染性细菌发展成抗生素抗性，因此需要非抗生素型治疗。在医院情况下使用本文所述sNAG组合物可扣减大部分成本，并显著减少抗生素抗性菌种的产生。在又一个实施方案中，本文所述组合物非用于治疗或预防医院内细菌感染，例如手术细菌感染。
在一个实施方案中，本文所述组合物可用于治疗或预防出血伤口(例如出血表面伤口)的细菌感染。在一个实施方案中，本文所述组合物可用来治疗枪弹伤、刺伤、贯通伤或手术创伤从而治疗或预防这类伤口的细菌感染。在又一个实施方案中，本文所述组合物非用于治疗或预防出血伤口(例如出血表面伤口)的细菌感染。
本文所述组合物可用于治疗或预防皮肤伤口(例如累及皮肤表皮层和真皮层的伤口以及角膜和衬有上皮的器官的损伤)的细菌感染，从而治疗或预防这类伤口的细菌感染。伤口可由各种物理创伤包括切伤、擦伤、烧伤、化学暴露、手术操作(例如手术切开术、植皮术)造成。在一个实施方案中，本文所述组合物可用于治疗角膜和巩膜创伤，包括累及眼的上皮层、基质层和内皮层的创伤，从而治疗或预防这类伤口的细菌感染。在又一个实施方案中，本文所述组合物非用于治疗或预防皮肤伤口的细菌感染。
在一些实施方案中，本文所述组合物可用来治疗被诊断患有细菌感染的患者的伤口。在某些实施方案中，在使用本文所述组合物治疗细菌感染的伤口时，通过试验或测定法，测定受细菌感染的伤口中细菌抗原的存在情况。在一个实施方案中，进行伤口物培养以检测患者伤口的细菌感染。在另外其它的实施方案中，由一种或多种细菌感染症状的存在情况，确定伤口被感染。
在其它实施方案中，当患者表现出一种或多种以下细菌感染症状时，可使用本文所述组合物治疗患者的伤口，例如：伤口愈合缓慢；伤口部位发热、发红和/或肿胀；伤口部位触痛；伤口部位液体或脓流出；和/或发热。伤口细菌感染的症状包括但不限于局限性红斑、局限性疼痛、局限性发热、蜂窝组织炎、水肿、脓肿、可为粘性、变色和脓性的分泌物、伤口愈合迟缓、创缘内和/或创缘两者上的组织变色、变脆、出血性肉牙组织、伤口部位发出异味、换药部位突如其来的疼痛和/或触痛、淋巴管炎(即源于伤口的红线、并导致肿胀触痛的淋巴腺在受累区域排除)和与伤口基部的伤口凹陷/突起(pocketing/bridging)有关的伤口破裂(即伤口在与跨越整个伤口床的不均匀散布的肉牙组织相对的基部发生肉牙组织条带)。在一些实施方案中，本文所述组合物防止一种或多种上列症状的发作或发展，或缩短/降低这些症状的一种或多种的持续时间和/或严重程度。
在一个实施方案中，本文所述组合物可用于伤口愈合和伤口细菌感染治疗，或用于伤口愈合和防止伤口细菌感染。在一个实施方案中，本文所述组合物用来加快伤口愈合，同时治疗或预防伤口细菌感染。sNAG纳米纤维组合物对伤口愈合的作用和伤口愈合应用中sNAG纳米纤维的一些用途描述于美国专利公布号2009/0117175，其通过引用以其整体结合到本文中(参见例如实施例2)。
5.4.2其它细菌感染的治疗或预防
在某些实施方案中，本文所述sNAG纳米纤维组合物可用于治疗和/或预防皮肤、胃肠道、呼吸道、泌尿道、生殖道、血液、咽喉、耳、眼、鼻窦或机体的任何其它器官或组织的细菌感染。在另一个实施方案中，本文所述sNAG纳米纤维组合物可用于治疗和/或预防皮肤病况、胃肠病况、呼吸道病况和/或与细菌感染有关的任何其它器官或组织的病况。在一些实施方案中，将本文所述sNAG纳米纤维组合物局部施用于患者的皮肤、口、耳、眼、肛门或腹股沟区以治疗或预防细菌感染。在一些实施方案中，使用本文所述组合物治疗和/或预防非处于伤口部位的机体器官或组织的细菌感染，和/或与伤口无关的或非由伤口造成的细菌感染。
在某些实施方案中，本文所述sNAG纳米纤维组合物用来治疗现有的细菌感染。例如，这类组合物可用来治疗通过试验或测定(例如本文描述或本领域已知的试验之一)被诊断患有细菌感染的对象。或者，这类组合物可用来治疗出现细菌感染或细菌感染相关疾病的一种或多种症状，例如技术人员已知的(例如由治疗医生/医师确定为细菌感染的症状)和/或本文描述的细菌感染的一种或多种症状的对象。
在某些实施方案中，本文所述组合物用来治疗与细胞微生物丛失衡有关的病况或与细胞微生物丛异常或细胞微生物丛变化有关的病况。例如，这类组合物可用来治疗其皮肤细胞微生物丛不同于对照对象(例如无皮肤病况的症状的对象)的皮肤细胞微生物丛的患者的皮肤病况。在其它实例中，这类组合物可用来治疗其肠细胞微生物丛(或其它组织或器官的微生物丛)不同于对照对象(例如无肠病况的症状的对象)的肠细胞微生物丛的患者的肠病况(或任何其它组织或器官的病况)。
在其它实施方案中，本文所述组合物可用于治疗已知与细菌感染有关或被细菌感染加重的任何疾病(例如痤疮)。在一个实施方案中，本文所述组合物可用来治疗被铜绿假单胞菌感染的囊性纤维化患者。
在一些实施方案中，本文所述组合物有效对抗由细菌分泌或排出的毒素。在一个实施方案中，本文所述组合物可抑制/减少细菌毒素(和/或由细菌毒素引起的病况或症状)，例如由炭疽芽孢杆菌、艰难梭菌、白喉棒杆菌、铜绿假单胞菌产生的毒素；内毒素和/或细胞溶素。一些防卫素能够抑制细菌毒素，包括由炭疽芽孢杆菌、艰难梭菌、白喉棒杆菌、铜绿假单胞菌产生的细菌毒素，以及细胞溶素(由革兰氏阳性细菌产生的溶解红细胞的内毒素)。鉴于防卫素的这些功能，导致防卫素表达和分泌途径的活化可供抗生素依赖性地清除细菌感染，因此避免细菌抗性的产生。
在某些实施方案中，本文所述组合物可用于治疗和/或预防皮肤的一种或多种细菌感染，或与细菌感染有关的皮肤疾病。在一些实施方案中，本文所述组合物用来治疗局限性皮肤感染和/或弥散性皮肤感染。在一些实施方案中，本文所述组合物用于治疗或预防皮肤感染或者与累及皮肤的表皮、真皮和/或皮下(下皮)组织的细菌感染有关的皮肤疾病。在这些实施方案的一些中，皮肤受累层包括表皮的一层或多层(即基底层、棘层、粒层、透明层(stratum licidum)和角质层)、真皮组织的一种或多种类型(即胶原、弹性组织和网状纤维)、真皮的一层或多层(即上层、乳头层和下网状层)；和/或下皮组织的一种或多种类型(即脂肪、弹性蛋白和结缔组织)。在一个实施方案中，本文所述组合物用于治疗或预防皮肤表面的细菌感染。在另一个实施方案中，本文所述组合物用于治疗或预防皮肤的葡萄球菌(“Staph”)感染和/或皮肤的链球菌(“Strep”)感染。在又一个实施方案中，本文所述组合物用来治疗皮肤的白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)和/或金黄色葡萄球菌感染。在一些实施方案中，本文所述组合物用于治疗或预防蜂窝组织炎、脓疱病、毛囊炎、红癣、痈、疖、脓肿、丹毒和/或皮肤炭疽。在另一个实施方案中，本文所述组合物用于治疗或预防蜂窝组织炎。蜂窝组织炎影响较深层的真皮和皮下组织，通常影响脸、臂和腿，并几乎总是因为导致细菌感染的皮肤破坏而发生。蜂窝组织炎的症状包括以下一种或多种：皮肤破坏的周围皮肤肿胀、疼痛、触痛、外部起泡体征、淋巴结间的红线、发热和发冷。在另一个实施方案中，本文所述组合物用于治疗或预防毛囊处皮肤细菌感染(例如毛囊炎)。毛囊炎的症状包括肿胀、毛发周围脓疱、硬结和疼痛。在另一个实施方案中，本文所述组合物可用于治疗或预防痤疮。痤疮的出现通常是细菌感染的症状。在一个实施方案中，本文所述组合物用于治疗或预防与细菌感染有关或由细菌感染造成的皮炎。在一些实施方案中，本文所述组合物防止一种或多种上列症状的发作或发展，或缩短/降低这些症状的一种或多种的持续时间和/或严重程度。
在某些实施方案中，本文所述组合物可用于治疗和/或预防一种或多种肠/消化道细菌感染或与细菌感染有关的胃肠疾病。普通形式的肠细菌感染包括沙门氏菌属、志贺氏菌属、大肠杆菌、棱菌属、葡萄球菌属、李斯特氏菌属和耶尔森氏菌属。这些细菌引起腹泻和胃肠炎症，亦称胃肠炎(gastroeneteritus)。肠细菌感染的症状包括但不限于腹部痉挛和疼痛、血便、食欲不振、不时伴发呕吐、发热和腹泻的恶心。在一些实施方案中，本文所述组合物用来治疗出现常与细菌感染有关的食物中毒的一种或多种症状的患者。
在某些实施方案中，本文所述组合物可用来治疗与葡萄球菌感染(例如金黄色葡萄球菌感染)有关的疾病。在这些实施方案的一些中，所述疾病为皮肤、鼻、口和/或性区的葡萄球菌感染。在一些实施方案中，疾病为肺炎、脑膜炎、心内膜炎、中毒性休克综合征和/或败血症。在一个实施方案中，本文所述组合物可用来治疗对一种或多种抗生素有抗性的葡萄球菌细菌，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(“MRSA”)。在某些实施方案中，将本文所述组合物给予被诊断患有葡萄球菌感染的对象，或给予出现一种或多种葡萄球菌感染症状的对象(例如存在以下症状的一种或多种：小红肿块、脆红肿块、灌脓肿块或脓肿、疖、眼睑腺炎、水疱和/或红色结痂皮肤，例如鼻和口周围的红色结痂皮肤或中毒性休克综合征的一种或多种症状)。在一些实施方案中，本文所述组合物防止一种或多种上列症状的发作或发展，或缩短/降低这些症状的一种或多种的持续时间和/或严重程度。
在某些实施方案中，本文所述组合物可用于治疗或预防与细菌感染有关的感冒。例如，本文所述组合物可用于治疗或预防尽管使用标准止痛药却仍持续的感冒。在一个实施方案中，本文所述组合物用于治疗或预防鼻窦、耳或咽喉的细菌感染。这类细菌感染的症状包括局限性疼痛和肿胀。鼻窦细菌感染可导致流鼻涕和脸或额部剧烈疼痛。在一个实施方案中，本文所述组合物用来治疗脓毒性咽喉炎(酿脓链球菌)。在一些实施方案中，本文所述组合物防止一种或多种上列症状的发作或发展，或缩短/降低这些症状的一种或多种的持续时间和/或严重程度。
在一些实施方案中，本文所述组合物可用于治疗或预防生殖器、泌尿道或肛门细菌感染或与细菌感染有关的泌尿道或生殖道疾病。在这些实施方案的一些中，本文所述组合物可用来治疗与细菌感染有关的性传播疾病。这类感染的症状包括但不限于尿痛、浑浊分泌物和/或性交疼痛。在这些实施方案的一些中，本文所述组合物用于治疗或预防梅毒、淋病、衣原体病(clamydia)和滴虫病的一种或多种。在一个实施方案中，本文所述组合物用来治疗衣原体病(Chlamidya)。在另一个实施方案中，本文描述组合物用来治疗淋病。淋病的症状包括局限性骨盆疼痛、搔痒和刺激、尿痛、稠的黄色或绿色分泌物、月经期间出血。在一个实施方案中，本文所述组合物用于治疗或预防细菌性阴道病感染。细菌性阴道病的症状包括阴道分泌物、气味、阴道搔痒和腹部疼痛。在一些实施方案中，本文所述组合物防止一种或多种上列症状的发作或发展，或缩短/降低这些症状的一种或多种的持续时间和/或严重程度。
在其它实施方案中，本文所述组合物可用于治疗或预防呼吸道感染(例如肺部细菌感染)或与细菌感染有关的呼吸道疾病。在一些实施方案中，这类组合物用于治疗或预防上呼吸道感染。在一个实施方案中，这类组合物用于治疗或预防结核病。结核病由结核分枝杆菌(mucobacterium tuberculosis)引起，且是通过喷嚏或唾液从人传播给人的高度传染性疾病。因此，本文所述组合物不仅可用来治疗被诊断患有结核病或表现结核病症状的对象，而且还可用来治疗与这类对象接触的个体(例如家庭成员、护理人或医务人员)。结核病症状包括咳血、过度体重减轻、疲倦、食欲不振和持续发热。在一些实施方案中，本文所述组合物防止一种或多种上列症状的发作或发展，或缩短/降低这些症状的一种或多种的持续时间和/或严重程度。在一个实施方案中，本文所述组合物用来治疗肺炎和/或肺炎链球菌感染。在另一个实施方案中，这类组合物用来治疗支气管炎。在一个实施方案中，本文所述组合物用来治疗黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎链球菌和/或流感嗜血菌(Haemophilus influenza)。
在一些实施方案中，本文所述组合物用于治疗或预防黏膜表面(例如口腔黏膜)细菌感染或与细菌感染有关的黏膜表面的疾病/病况。在一个实施方案中，本文所述组合物用于治疗或预防口腔细菌感染。例如，这类组合物可用于治疗或预防与口的细菌感染有关的病况例如龈炎、龋齿和/或蛀牙。在一个实施方案中，本文所述组合物可用于口腔卫生产品。
在一个实施方案中，本文所述组合物用来治疗耳的细菌感染，例如中耳感染或与这类感染有关的疾病。在一个实施方案中，本文所述组合物用来治疗由细菌感染造成的中耳炎。
在一些实施方案中，本文所述组合物用于治疗或预防植入假体(例如心脏瓣膜和导管)的细菌感染。在一些实施方案中，本文所述组合物用来治疗动物咬伤(例如猫狗咬伤)以防止细菌感染。
本文所述组合物可用于治疗或预防各种细菌感染相关疾病包括但不限于麻风(Hansen病)、霍乱、炭疽(例如皮肤炭疽、肺炭疽、胃肠炭疽)、百日咳、腹股沟肉芽肿、细菌性阴道病、淋病、新生儿眼炎、脓毒性关节炎、梅毒、先天性梅毒、顿咳、鸟分枝杆菌综合征(mycobacterium avium complex)、类鼻疽(meliodosis)、钩端螺旋体病、破伤风、猩红热、链球菌感染、侵袭性A组链球菌病、链球菌中毒性休克综合征、脑膜炎球菌病、菌血症、脓毒性咽喉炎、伤寒发热型沙门氏菌病、痢疾、结肠炎、伴发胃肠炎和小肠结肠炎的沙门氏菌病、细菌性痢疾、阿米巴痢疾、志贺菌病、白喉、皮肤白喉、呼吸道白喉、军团病、结核病、潜伏性结核、乙型流感嗜血菌、伤寒、副溶血性弧菌、创伤弧菌(vibrio vulnificus)、弧菌、耶尔森氏鼠疫杆菌肠道病、惠普尔病(Whipple’s disease)、急性阑尾炎、脑膜炎、脑炎、脓疱病、蜂窝组织炎、痈、疖、痤疮、脓毒症、败血症、肺炎、支原体肺炎、脑膜炎球菌病、脑膜炎、沃-弗综合征(Waterhouse-Friderichsen syndrome)、尸碱食物中毒、葡萄球菌食物中毒、中毒性休克综合征、坏死性肺炎、败血症、急性感染性心内膜炎、汗腺感染(例如化脓性汗腺炎)、由蜱传播的细菌疾病(例如落矶山斑疹热、莱姆病)、肉毒中毒、鼠疫(例如黑死病、肺鼠疫)、土拉菌病、布鲁氏菌病、急性肠炎、非淋病性尿道炎、性病性淋巴肉芽肿、沙眼、新生儿包涵体性结膜炎、鹦鹉热、假膜性结肠炎、气性坏疽、急性食物中毒、腹泻、旅行者腹泻、婴儿腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征、支气管炎、李斯特菌病、厌氧菌性蜂窝组织炎、消化性溃疡、庞蒂亚克热、膀胱炎、子宫内膜炎、中耳炎、鼻窦炎、链球菌性咽炎、风湿热、丹毒、产褥热、坏死性筋膜炎、医院内感染、假单胞菌感染和/或猫抓病。
5.5患者群
在某些实施方案中，可将本文所述sNAG纳米纤维组合物给予未感染对象(subject)，即未患细菌感染的对象。在一个实施方案中，将本文所述组合物给予有受细菌感染风险的未感染对象。
在一个实施方案中，可将本文所述sNAG纳米纤维组合物给予被诊断患有细菌感染的患者。在另一个实施方案中，可将本文所述组合物给予出现一种或多种细菌感染的症状的患者。
在某些实施方案中，将本文所述组合物给予被诊断患有细菌感染的患者。在某些实施方案中，在给予本文所述组合物之前，患者被诊断患有细菌感染。例如，当在取自患者的生物样品中检出细菌抗原时，可将本文所述组合物给予患者。在一个实施方案中，生物样品获自将通过本文所述组合物治疗的部位或区域或将给予本文所述组合物的区域。在一个实施方案中，使用拭子从疑似感染的部位采集细胞或脓以检测细菌感染。在另一个实施方案中，从疑似感染部位(例如伤口)吸取液体以检测细菌感染。在又一个实施方案中，进行活组织检查以检测细菌感染。在一个实施方案中，当疑似感染部位是伤口时，可进行伤口物培养以检测细菌感染。在另一个实施方案中，生物样品获自患者的血液、尿液、痰或粪便。在一些实施方案中，可进行血液或尿液检验以检测细菌感染(例如当怀疑细菌感染传播到血液或其它组织/器官中时)。在一些实施方案中，采用DNA检测方法例如PCR，测试所采样品(例如细胞、组织或液体)的一种或多种细菌类型的情况。在其它实施方案中，免疫荧光分析、血清学、培养(例如血液琼脂培养)或本领域已知的和/或实践的可用于细菌感染实验室诊断的任何其它试验。
在其它具体实施方案中，可将本文所述组合物给予被诊断患有或出现细菌感染相关疾病的一种或多种症状的患者。在某些实施方案中，在给予本文所述组合物之前，患者被诊断患有与细菌感染有关的疾病或者出现细菌感染相关疾病的一种或多种症状。细菌感染相关疾病可通过技术人员已知的任何方法诊断，包括评价患者的症状和/或检测患者生物样品中的细菌抗原(例如如上所述)。在一个实例中，治疗医师或其它医学专业人士可将本文所述组合物给予被诊断患有细菌感染相关疾病的患者。在另一个实例中，在检出细菌感染相关疾病的一种或多种症状时，患者可使用本文所述组合物。
在某些实施方案中，将本文所述组合物给予被诊断患有以下感染的患者：例如炭疽芽孢杆菌、百日咳鲍特氏菌、布氏疏螺旋体、流产布鲁氏菌、狗布鲁氏菌、马耳他布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、空肠弯曲杆菌、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、白喉棒杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌、流感嗜血菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、肺炎性钩端螺旋体、问号钩端螺旋体、单核细胞增生李斯特氏菌、黏膜炎莫拉氏菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、肺炎枝原体、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、铜绿假单胞菌、奇异变形菌、卡氏肺孢菌(Pneumocystis jiroveci)、立氏立克次氏体、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、非解乳糖链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、苍白密螺旋体、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森氏菌的细菌感染和/或本文所述或本领域已知的任何其它细菌感染。在一个实施方案中，将本文所述组合物给予被诊断患有由MRSA或铜绿假单胞菌所致细菌感染的患者。
在某些实施方案中，将本文所述组合物给予被诊断患有与细菌感染有关的以下疾病的患者：例如麻风(Hansen病)、霍乱、炭疽(例如皮肤炭疽、肺炭疽、胃肠炭疽)、百日咳、腹股沟肉芽肿、细菌性阴道病、淋病、新生儿眼炎、脓毒性关节炎、梅毒、先天性梅毒、顿咳、鸟分枝杆菌综合征、类鼻疽、钩端螺旋体病、破伤风、猩红热、链球菌感染、侵袭性A组链球菌病、链球菌中毒性休克综合征、脑膜炎球菌病、菌血症、脓毒性咽喉炎、伤寒发热型沙门氏菌病、痢疾、结肠炎、伴发胃肠炎和小肠结肠炎的沙门氏菌病、细菌性痢疾、阿米巴痢疾、志贺菌病、白喉、皮肤白喉、呼吸道白喉、军团病、结核病、潜伏性结核、乙型流感嗜血菌、伤寒、副溶血性弧菌、创伤弧菌、弧菌、耶尔森氏鼠疫杆菌肠道病、惠普尔病、急性阑尾炎、脑膜炎、脑炎、脓疱病、蜂窝组织炎、痈、疖、痤疮、脓毒症、败血症、肺炎、支原体肺炎、脑膜炎球菌病、脑膜炎、沃-弗综合征、尸碱食物中毒、葡萄球菌食物中毒、中毒性休克综合征、坏死性肺炎、败血症、急性感染性心内膜炎、汗腺感染(例如化脓性汗腺炎)、由蜱传播的细菌疾病(例如落矶山斑疹热、莱姆病)、肉毒中毒、鼠疫(例如黑死病、肺鼠疫)、土拉菌病、布鲁氏菌病、急性肠炎、非淋病性尿道炎、性病性淋巴肉芽肿、沙眼、新生儿包涵体性结膜炎、鹦鹉热、假膜性结肠炎、气性坏疽、急性食物中毒、腹泻、旅行者腹泻、婴儿腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征、支气管炎、李斯特菌病、厌氧菌性蜂窝组织炎、消化性溃疡、庞蒂亚克热、膀胱炎、子宫内膜炎、中耳炎、鼻窦炎、链球菌性咽炎、风湿热、丹毒、产褥热、坏死性筋膜炎、医院内感染、假单胞菌感染和/或猫抓病。
在一些实施方案中，在感染症状出现之前或在感染症状变严重之前(例如在患者需要治疗或住院之前)，将本文所述组合物给予患有细菌感染的患者。在一些实施方案中，在感染症状出现之后或在疾病症状变严重之后(例如患者需要治疗或住院之后)，将本文所述组合物给予患病患者。
在一些实施方案中，待给予本文所述组合物的对象是动物。在某些实施方案中，动物是鸟。在某些实施方案中，动物是犬。在某些实施方案中，动物是猫。在某些实施方案中，动物是马。在某些实施方案中，动物是牛。在某些实施方案中，动物是哺乳动物，例如马、猪、小鼠或灵长类，优选人。在一些实施方案中，动物是宠物或农场动物。
在某些实施方案中，待给予本文所述组合物的对象是成人。在某些实施方案中，待给予本文所述组合物的对象是50岁以上的成人。在某些实施方案中，待给予本文所述组合物的对象是老年对象。
在某些实施方案中，待给予本文所述组合物的对象是早产婴儿。在某些实施方案中，待给予本文所述组合物的对象是幼童。在某些实施方案中，待给予本文所述组合物的对象是儿童。在某些实施方案中，待给予本文所述组合物的对象是婴儿。在某些实施方案中，向其给予本文所述组合物的对象不是6月龄以下婴儿。在一个具体实施方案中，本文所述待给药的对象2岁或更小。
在另外其它的实施方案中，可将本文所述组合物给予有发生细菌感染风险(例如有高风险)的患者。有发生细菌感染高风险的患者包括但不限于年长者(例如老年人)和无免疫应答的人。在一些实施方案中，将本文所述组合物给予有发生细菌感染风险的患者，例如但不限于无免疫应答(例如因癌症治疗或移植术所致)的患者、儿童、早产婴儿、老年人、糖尿病人、被诊断患有癌症的人、已用传统抗生素疗程治疗的患者、已进行手术的患者和/或有伤口的患者。在一些实施方案中，可将本文所述组合物预防性给予有发生细菌感染风险的患者，例如因例如年龄、营养不良、疾病、化学治疗所致免疫系统缺乏免疫力的患者；用传统抗生素疗程治疗的患者；或带有伤口(例如开放性伤口)的患者。在其它实施方案中，有发生细菌感染风险的患者是HIV/AIDS患者、癌症患者、进行移植手术的患者、哮喘(例如重度哮喘)患者、吸毒者、皮肤病患者、带有侵入性装置(例如血管内导管)的患者、保健工作者或在空间受限设施中度过时光的患者(例如监狱囚犯、士兵、长期医疗保健设施例如护理院等中的患者)。待给予本文所述组合物的患者还可以是患有慢性阻塞性肺病(COPD)、气肿、鼻炎、支气管炎、喉炎、扁桃体炎和/或囊性纤维化的患者。
在某些实施方案中，将本文所述组合物给予未诊断出病毒感染(例如HIV/AIDS)、真菌感染或酵母感染的患者。在某些实施方案中，将本文所述组合物给予不属于一个或多个以下患者组：无免疫应答患者、癌症患者、HIV/AIDS患者、哮喘患者、进行移植手术的患者、已进行手术的患者和/或有伤口的患者。在一个实施方案中，待给予本文所述组合物的患者没有伤口(例如慢性伤口或因例如手术或战地创伤所致开放性伤口)。
在某些实施方案中，待给予本文所述组合物的对象是其一种或多种防卫素肽无表达或表达水平低或者具有编码一种或多种防卫素肽的一种或多种基因的突变/缺失的对象。在一些实施方案中，待给予本文所述组合物的对象是其中一种或多种α-防卫素(例如DEFA1、DEFA1B、DEFA3、DEFA4、DEFA5、DEFA6)、一种或多种β-防卫素(例如DEFB1、DEFB2、DEFB4、DEFB103A、DEFB104A、DEFB105B、DEFB107B、DEFB108B、DEFB110、DEFB112、DEFB114、DEFB118、DEFB119、DEFB123、DEFB124、DEFB125、DEFB126、DEFB127、DEFB128、DEFB129、DEFB131、DEFB136)和/或一种或多种θ-防卫素(例如DEFT1P)无表达或表达水平低或表达水平改变的对象。在一些实施方案中，待给予本文所述组合物的对象是其中DEFA1、DEFA3、DEFA4、DEFA5、DEFB1、DEFB3、DEFB103A、DEFB104A、DEFB108B、DEFB112、DEFB114、DEFB118、DEFB119、DEFB123、DEFB124、DEFB125、DEFB126、DEFB128、DEFB129和DEFB131中的一种或多种无表达或表达水平低或表达水平改变的对象。在某些实施方案中，待给予本文所述组合物的对象是其中一种或多种Toll受体(例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11和/或TLR12)无表达或表达水平低或表达水平改变的对象。在另外其它的实施方案中，待给予本文所述组合物的对象是其中IL-1、CEACAM3、SPAG11、SIGIRR(IL1样受体)、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TBK1、TRAF6和IKKi中的一种或多种无表达或表达水平低或表达水平改变的对象。在一些实施方案中，待给予本文所述组合物的对象是其中IRAK2、SIGIRR、TLR1、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、TLR10和TRAF6的一种或多种无表达或表达水平低或表达水平改变的对象。基因的低表达水平是比正常表达水平低的水平(例如低1.25倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍)，其中正常表达水平是技术人员认为在对象所属物种中是正常的表达水平和/或是同一物种中大多数对象的表达水平。基因表达水平改变是不同于正常表达水平的水平(例如超过20％、25％、30％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％)，其中正常表达水平是技术人员认为在对象所属物种中是正常的表达水平和/或是同一物种中大多数对象的表达水平。其中“正常”表达的一种或多种防卫素基因是：(i)已知存在于未出现症状的对象或未诊断出待治疗的疾病或感染的对象的平均表达水平；(ii)在3、5、10、20、25、50名或更多名未出现症状的对象或未诊断出待治疗的疾病或感染的对象中检测的平均表达水平；和/或(iii)在疾病或感染发作之前在待给予本文所述组合物的患者中检测的表达水平。
5.6 sNAG纳米纤维组合物的给药方式
在某些实施方案中，本文描述了用于治疗或预防细菌感染或细菌感染相关疾病的方法，其中将包含sNAG纳米纤维的组合物局部给予需要这类治疗的患者。在一些实施方案中，将sNAG纳米纤维组合物局部应用于细菌感染或疾病风险加大的组织或器官。
在一些实施方案中，将有效量的sNAG纳米纤维和/或sNAG纳米纤维组合物给予对象。
在一些实施方案中，将包含sNAG纳米纤维的组合物局部给予患者的细菌感染部位或细菌感染相关疾病累及的部位。在另外其它的实施方案中，将包含sNAG纳米纤维的组合物局部给予患者的细菌感染部位和患者的细菌感染部位周围或细菌感染相关疾病累及的部位。在另外其它的实施方案中，将包含sNAG纳米纤维的组合物施用在患者的细菌感染部位附近或细菌感染相关疾病累及的部位附近。在又一个实施方案中，将包含sNAG纳米纤维的组合物局部给予有细菌感染高风险的部位。
可通过本领域技术人员熟知的局部给药的许多合适方法的任一种给予本文所述sNAG纳米纤维组合物，包括但不限于局部给予皮肤、局部给予机体的任何其它表面(例如黏膜表面)、通过吸入、鼻内、阴道、直肠、口腔或舌下给予。局部给药方式可随待治疗或预防的疾病而变化。可配制sNAG纳米纤维组合物用于局部给药的各种类型。
在一个实施方案中，可将包含sNAG纳米纤维的组合物施用于患者的皮肤。例如，可将这类组合物局部施用于患者的皮肤用于治疗和/或预防皮肤细菌感染或与细菌感染有关的皮肤疾病。
在另一个实施方案中，可将本文所述组合物局部施用于患者的黏膜表面。例如，可将这类组合物局部施用于口腔黏膜用于治疗和/或预防口或牙龈的细菌感染或与细菌感染有关的口或牙龈疾病。
在一些实施方案中，可将包含sNAG纳米纤维的组合物施用于患者的伤口。例如，可将这类组合物直接局部施用于伤口部位或患者的伤口部位附近用于治疗和/或预防伤口的细菌感染或与伤口细菌感染有关的疾病。在一个这样的实施方案中，伤口是细菌感染的伤口，例如按照本文所述方法之一诊断。伤口可以是本文所述伤口类型的任一种。在另外其它的实施方案中，未将包含sNAG纳米纤维的组合物施用于患者的伤口，或未施用于患者的细菌感染的伤口。
在一些实施方案中，可将本文所述组合物局部施用于患者的生殖器、尿路或肛门表面/区域。例如，可将这类组合物局部施用于生殖器、尿路或肛门表面/区域用于治疗和/或预防生殖器、尿路或肛门细菌感染或与细菌感染有关的这类组织的疾病。
用于局部给药的上列方法可包括以乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、液体溶液剂、膜、软片、喷雾剂、糊剂、粉剂或本文所述或本领域已知的任何其它制剂的形式给予sNAG纳米纤维。例如，还可将sNAG纳米纤维施用于敷料或绷带，以治疗患者的皮肤上的局限性感染/病况。
在一些实施方案中，可将本文所述组合物作为喷雾剂施用于患者的口腔和/或呼吸系统。例如，可作为喷雾剂施用这类组合物用于治疗和/或预防口、鼻、牙龈、咽喉或肺的细菌感染或与细菌感染有关的口、鼻、牙龈、咽喉或肺的疾病/病况。在一个这样的实施方案中，可配制组合物以作为吸入器给予。
在一些实施方案中，可将本文所述组合物作为栓剂施用于患者的直肠、阴道或尿道。例如，可作为栓剂施用这类组合物用于治疗和/或预防消化道、泌尿道或生殖道的细菌感染或与细菌感染有关的这类组织的疾病。
在另一个实施方案中，本文所述组合物可施用于手术操作部位。例如，可将这类组合物喷雾、作为乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、膜或粉剂施用或涂覆在待进行手术操作的或已进行手术操作的表面上。在一个实施方案中，将本文所述组合物施用于手术切开部位、切除组织的部位或手术缝线或缝合部位。本文所述组合物的这种给予可预防术后感染。例如，可在已知有细菌感染高风险的手术操作期间或之后，使用本文所述组合物。已知有细菌感染高风险的手术操作包括肠切除术、胃肠手术操作、肾手术等。可将本文所述组合物施用于任何上列手术操作或其它手术操作的部位。
在另外其它的实施方案中，可将本文所述组合物涂覆在装置(例如口腔卫生或待用于患者或插入患者中的其它产品)上，以防止患者的细菌感染。
在一些实施方案中，本文考虑的方法包括检测/诊断患者的细菌感染的步骤。在一些实施方案中，检测/诊断包括患者生物样品中一种或多种细菌或细菌抗原的试验或测定。在其它实施方案中，诊断包括评价患者是否患有细菌感染或细菌感染相关疾病的一种或多种的症状。
本文所述组合物可具有缓释性质和/或可以导致这类组合物缓释的制剂给予。在一些实施方案中，如上文第5.1节中所述sNAG纳米纤维随时间进行生物降解，sNAG纳米纤维的这些性质可导致或引起本文所述组合物的缓释。在另外其它的实施方案中，采本领域已知的任何方法，将本文所述组合物配制成具有缓释能力。本文所述组合物可在将组合物给予患者后相当于或久于以下时间的一段时间内缓释：约6小时、12小时、18小时、24小时(1天)、2天、3天、5天、7天(1周)、10天、14天(2周)、3周或4周。
所考虑的治疗方案包括sNAG纳米纤维组合物(例如乳膏剂、膜或敷料)的单剂量或单次施用或者sNAG纳米纤维组合物的多剂量或多次施用方案。可每小时一次、每日一次、每周一次或每月一次给予剂量或施用。例如，可一天一次、一天两次、一天3次、一天4次、一天5次、每3小时一次、每6小时一次、每12小时一次、每24小时一次、每48小时一次、每72小时一次、一周一次、一周2次、一周3次、每隔一天一次、2周一次、3周一次、4周一次或一月一次给予sNAG纳米纤维组合物的剂量。
可给予sNAG纳米纤维组合物持续以下时间：等于或大于1周、2周、3周、1月、2月、3月、4月、5月、6月、9月、1年、1.5年、2年、2.5年、3年、4年、5年、7年、10年或更多年。在一个这样的实施方案中，sNAG纳米纤维组合物在治疗期间不引起任何副作用或只引起轻微副作用。在一个这样的实施方案中，sNAG纳米纤维组合物在响应治疗时不失去其疗效或不引起细菌抗性菌株的产生。在另一个实施方案中，sNAG纳米纤维组合物不引起刺激(例如中度或重度刺激)或变态反应(例如中度或重度变态反应)。
组合物中sNAG纳米纤维的浓度可改变。一般而论，使用有效量的sNAG纳米纤维。有效量可为足以实现一种或多种本文所述作用的量，例如有效减轻或根除细菌感染，或者减轻或根除细菌感染的一种或多种的症状的量。例如，组合物可包含约0.2-20mg/cm2sNAG纳米纤维/剂量(施用)组合物，其呈适于局部递送至患者的形式。在某些实施方案中，本文所述组合物包含约0.25、20mg/cm2、约0.5-20mg/cm2、约1-20mg/cm2、约1-15mg/cm2、约1-12mg/cm2、约1-10mg/cm2、约1-8mg/cm2、约1-5mg/cm2、约2-8mg/cm2或约2-6mg/cm2sNAG纳米纤维/剂量(施用)组合物，呈适于局部递送至患者的形式。
5.7联合疗法
sNAG纳米纤维组合物可与其它疗法联合给予，例如加强免疫系统的物质、抗菌剂(例如抗生素)、防卫素肽、防卫素样肽、止痛疗法(例如镇痛剂)、解热疗法和/或已知有效对抗或常用于治疗和/或预防细菌感染或细菌感染相关疾病的其它药剂或药物。
在一些实施方案中，本文所述组合物与其它抗菌剂联合给予，例如抗生素。在一个这样的实施方案中，本文所述组合物可与常用于治疗所述细菌感染或所述疾病的标准疗法联用来治疗细菌感染或细菌感染相关疾病。在一个实施方案中，可将本文所述组合物与已知有效对抗所述细菌感染或所述疾病的标准抗菌剂(例如抗生素)联合给予被诊断患有或出现细菌感染或细菌感染相关疾病的症状的患者。
在某些实施方案中，与下列抗生素类之一的抗生素联合给予本文所述组合物：大环内酯类(例如红霉素、阿奇霉素)、氨基糖苷类(例如阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素)、头孢菌素类(例如头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢噻肟、头孢吡肟)、氟喹诺酮类(例如环丙沙星、左氧氟沙星)、青霉素类(例如青霉素、氨苄西林、阿莫西林)、四环素类(例如四环素、多西环素)和碳青霉烯类(例如美罗培南、亚胺培南)。在一些实施方案中，与有效治疗或预防或通常用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染、MRSA感染、假单胞菌感染或艰难梭菌感染的药剂(例如抗生素)联合给予本文所述组合物。
在一个具体实施方案中，与以下一种或多种药物联合给予本文所述组合物：万古霉素、磺胺药(例如复方新诺明/甲氧苄啶-磺胺甲噁唑复方)、四环素(例如多西环素、米诺环素)、克林霉素、噁唑烷酮类(例如利奈唑胺)、达托霉素、替考拉宁、奎奴普丁/达福普汀(共杀素)、替吉环素、蒜素、杆菌肽、呋喃西林、过氧化物、新生霉素、奈替米星、甲基乙二醛和蜜蜂防卫素-1。还可与包含以下一种或多种药物的敷料联合给予本文所述组合物：过氧化物、妥布霉素、二葡萄糖酸氯己定、葡萄糖酸氯己定、左氧氟沙星和银。在一个实施方案中，与一种或多种所列药剂一起给予本文所述组合物以治疗或预防金黄色葡萄球菌感染，特别是MRSA感染。
在一些实施方案中，在给予其它疗法之前(例如1分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、24小时或更多个小时或者介于之间的任何时间)、同时或之后(例如1分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、24小时或更多小小时或者在介于之间的任何时间后)给予本文所述组合物。例如，可在给予抗菌剂(例如抗生素)之前、同时或之后给予这类组合物。
在这些实施方案的一些中，可在患者已用其它抗菌剂(例如抗生素)进行治疗细菌感染的疗程后，将本文所述组合物给予患者以治疗或预防细菌感染或细菌感染相关疾病。在一些实施方案中，可将本文所述组合物给予已对一种或多种抗菌剂(例如抗生素)产生抗性的患者。在一个实施方案中，可将本文所述组合物给予已用抗生素(例如按标准用于治疗所述细菌感染的抗生素)进行治疗的疗程且已对所述抗生素产生抗性的患者。
然而，在某些实施方案中，仅给予sNAG纳米纤维组合物。在一个这样的实施方案中，sNAG纳米纤维组合物不与任何其它疗法一起给予，例如，它不与免疫调节剂、抗菌剂(例如抗生素)、防卫素肽、防卫素样肽、止痛疗法(例如镇痛剂)或解热疗法一起给予。在一个实施方案中，sNAG纳米纤维组合物不与抗生素联合给予。在某些实施方案中，sNAG纳米纤维组合物不与抗病毒剂、抗真菌剂或抗酵母剂一起联合给予。
5.8试剂盒
还考虑了包含任何上述sNAG组合物的药包或试剂盒。药包或试剂盒可包括一个或多个容器，容器中装有一种或多种包含本文所述组合物的成分。优选在没有污染的情况下，将组合物装在有利于取出组合物的密封防水无菌包装内。可制造容器的材料包括铝箔、塑料或容易灭菌的其它常用材料。试剂盒可装有用于单次给予或多次给予组合物的材料，优选其中用单独的防水无菌包装提供用于单次给予的材料。
在另一个实施方案中，提供具有双室的容器。第一室装有任何上述sNAG组合物，而第二室装有另一种活性剂例如另一种抗菌剂。在作战或临床上，第一室中的组合物易与第二室中的活性剂混合以便随后给予患者。
此外，为紧急用途或军事用途设计的试剂盒还可装有一次性预灭菌的仪器，例如剪刀、手术刀、夹子、止血带、弹性或无弹性绷带等。
任选与所述试剂盒或药包相关的可以是监管医药品或生物制品制造、使用或销售的政府机构规定形式的通告，该通告反映了已经制造、使用或销售机构核准用于给予人。例如，试剂盒可包括有关FDA批准的通告和/或使用说明书。
本文所包括的试剂盒可用于上述应用和方法。
6.实施例
6.1实施例1：来自海洋硅藻的sNAG纳米纤维通过Akt1/Ets1依赖性途径促进伤口 愈合和防卫素表达
该实施例表明，sNAG纳米纤维促进皮肤伤口愈合和防卫素表达，且Akt1→Ets1途径在通过sNAG纳米纤维调节皮肤伤口愈合中起重要作用。
6.1.1材料与方法
sNAG/Taliderm纳米纤维由Marine Polymer Technologies生产和供应，被制成用于伤口治疗的合适药贴。将野生型C57Black和Akt1失效小鼠关养在南卡罗来纳医科大学(Medical University of South Carolina)动物设施中。8-12周龄的野生型和Akt1失效小鼠用50％纯氧和50％异氟烷气麻醉。恰在致伤前，将Nair Hair Removal Lotion用于其背部，去脱去任何不需要的毛。使用切割活检钻，取出背部4mm的圆形皮肤区。在第0天将Taliderm置于各伤口上，或留下伤口不治疗。在1、3、5和7天，对伤口拍照，测量，并用8mm活检钻切取，以确保完整取出伤口和周围皮肤。将用或不用Taliderm治疗的野生型和Akt1失效伤口包埋在石蜡中，以备用于H&E和免疫荧光染色。
将石蜡包埋件切片，置于显微镜载玻片上染色。载玻片用二甲苯洗涤，脱去石蜡，并通过一系列分级乙醇(graded alcohols)再水化。然后将切片在0.1％Triton x100中孵育以透化。将切片在煮沸的抗原修复溶液(Antigen Retrival solution)中孵育。在第一山羊抗体、β-防卫素3 1:400稀释液中孵育前，使用1％动物血清封闭。然后将切片在第一抗体中在潮湿箱中于4°孵育过夜。使用免疫荧光第二驴α-山羊488抗体1:200稀释液，接着用TOPRO-3核染色。采用共焦显微术拍摄照片。
使用苏木精和伊红染色观察基本结构例如表皮、真皮、肌肉和血管，并测定伤口中的取向和大致位置。还采用H&E染色以开始鉴定哪些细胞类型被Taliderm以Akt1依赖性方式刺激。
其它材料与方法描述于附图说明和下面的结果部分中，并按照本领域已知方法进行。
6.1.2结果
sNAG纳米纤维刺激Ets1的上游调节子Akt 1活化。图1A显示在响应血清饥饿EC的NAG和sNAG刺激时磷酸-Akt的蛋白质印迹分析。图1B显示以拼凑对照或Akt1shRNA慢病毒感染的EC的RT-PCR分析和对ts1和S26作为加载对照的表达进行评价。图1C表示将信号自sNAG纳米纤维传导至Akt1、Ets1和防卫素的信号转导途径。
通过Taliderm(sNAG)治疗部分挽救Akt1失效动物中伤口愈合的延迟。图2A显示在用或不用Taliderm治疗的情况下致伤WT和AKT1失效小鼠的代表性图像。图2B显示第3天伤口的代表性小鼠皮肤切片的H&E染色。野生型和Akt1伤口切取物的H&E染色表明角质形成细胞增殖和迁移的Taliderm依赖性增加。短划线表示横跨创缘的角质形成细胞增殖的区域。在野生型和Akt1治疗的伤口两者中，与野生型和Akt1对照相比，横跨创缘的上皮再生明显增加。这就表明Taliderm增加不依赖于Akt1途径的角质形成细胞募集。虽然Taliderm诱导表皮横跨创缘的完全上皮再生，但是与野生型相比，在下层组织中实质上仍缺乏血管重建。这在Akt1动物中由于大量出血和红细胞浸润而显而易见。
sNAG纳米纤维刺激原代内皮细胞中的细胞因子和防卫素表达。图3A显示使用针对α-防卫素的抗体，用或不用sNAG处理的EC的免疫组织化学。图3B表示显示纳米纤维处理的EC导致α-防卫素1-3分泌的ELISA。
sNAG纳米纤维以Akt1依赖性方式刺激原代内皮细胞中的防卫素表达。图4A和图4B显示在有或没有PD98059(MAPK抑制剂)、渥曼青霉素(PI3K抑制剂)的情况下或者用拼凑对照或Akt1shRNA慢病毒感染的、用或不用sNAG处理的血清饥饿EC的定量RT-PCR分析，并对标示基因的表达进行评价。
sNAG纳米纤维刺激小鼠角质形成细胞中的β-防卫素3表达。图5A显示在第3天得自WT和Akt1失效动物的石蜡包埋小鼠皮肤伤口切片用β-防卫素3和内披蛋白抗体染色的免疫荧光染色。在WT和Akt1失效小鼠两者中开发出皮肤伤口愈合模型以评价体内Taliderm的作用。这些研究结果表明，在Taliderm治疗的动物中，β-防卫素3的表达以Akt1依赖性方式增加。Taliderm在愈合伤口中增加防卫素表达的能力对治疗和控制伤口感染具有重大影响。图5B显示应用NIHImageJ软件对β-防卫素3免疫荧光染色的定量测定。图5C显示WT和Akt1失效治疗和未治疗的角质形成细胞用β-防卫素3和TOPRO-3的免疫荧光染色。注意在WT和Akt1Taliderm治疗的伤口中，绿色β-防卫素3染色增加。伤口切片的免疫荧光标记表明，Taliderm治疗的伤口显示β-防卫素3表达以Akt1依赖性方式增加。虽然Akt1治疗的伤口显示β-防卫素3适度增加，但是野生型治疗的伤口表现出更明显的增加。这就表明β-防卫素3表达不仅仅由施用纳米纤维而增加，而且至少部分依赖于Akt1途径。β-防卫素3表达似乎限于角质形成细胞，这表明了该表达是角质形成细胞特异性的。
Akt1依赖性转录因子结合位点。图6显示Akt1依赖性转录因子结合位点的示意图。应用Genomatix软件，针对DEF1、4和5的mRNA上的保守位点，对转录起始位点上游500bp进行分析。
6.1.3结论
所提供的数据表明，Ets1的sNAG纳米纤维刺激由Akt1被这些纳米纤维激活而引起。纳米纤维治疗导致参与细胞募集的基因表达显著增加，所述基因例如IL-1(已知的Ets1靶标)、VEGF和几种防卫素(β3、α1、α4和α5)、近来表明起化学引诱物作用的抗微生物小肽。PI3K/Akt1途径的药理抑制和使用shRNA敲减Akt1两者导致这些趋化因子的表达降低。Akt1失效小鼠显示被Taliderm纳米纤维部分挽救的伤口愈合表型迟缓。Taliderm治疗的伤口还显示作为Akt1依赖性的防卫素表达增加。
在Taliderm治疗的伤口中β-防卫素3表达和角质形成细胞增殖的增加表明Taliderm作为有效的伤口愈合产品的有益应用。Taliderm在角质形成细胞中以Akt1依赖性方式起增加抗微生物肽表达的作用，这表明了Akt1在sNAG纳米纤维功能中的必不可少的作用。将其与来自抑制PI3K/Akt1途径和使用shRNA敲减Akt1导致这些趋化因子表达降低的实验室的其它研究(Buff，Muise-Helmericks，未发表)相互关联。
虽然β-防卫素3表达的增加是Akt1依赖性的，但是8mm伤口切取物的H&E染色(图2B)表明，Taliderm在伤口再上皮化中不依赖于Akt1起作用。即使新的角质形成细胞横跨整个创缘，下层组织也未表明血管生长被同样刺激。这就说明缺乏Akt1是造成真皮中血管渗漏和大量浮动红细胞的原因。这表明对于血管形成的增加，Taliderm依赖于Akt1途径。
总的来说，(i)sNAG纳米纤维(Taliderm)部分通过刺激血管生成而增加伤口愈合；(ii)对内皮细胞进行sNAG纳米纤维治疗激活Akt1/Ets1依赖性途径，导致细胞移动和细胞因子分泌改变；(iii)Taliderm治疗的伤口显示β-防卫素3的表达以Akt1依赖性方式增加；(iv)用Taliderm治疗Akt1失效动物部分挽救该表型，导致角质形成细胞增殖/迁移显著增加；和(v)生物信息学分析表明，ETS1可能参与导致伤口愈合和细胞因子分泌增加的sNAG活化途径。
总之，这些研究结果表明Akt1→Ets1途径在通过sNAG纳米纤维调节皮肤伤口愈合中的重要作用，并支持使用这些纳米纤维作为促进伤口愈合的新的有效方法。
6.2实施例2：sNAG纳米纤维增加防卫素表达，提高伤口闭合的动力学并具有间接 的防卫素依赖性抗菌作用。
该实施例表明，sNAG纳米纤维具有体内对抗金黄色葡萄球菌的有效抗菌作用，该作用是间接的和防卫素依赖性的。该实施例还表明sNAG纳米纤维以Akt-1依赖性方式诱导角质形成细胞和内皮细胞中防卫素的体外表达和皮肤伤口中防卫素的体内表达，并提高伤口闭合的动力学。
6.2.1材料与方法
组织培养，药理抑制，ELISA：在37°与5％CO2下，将人脐带静脉EC(Lonza)维持在内皮基础培养基2(Lonza)中。内皮基础培养基2(EBM2)补充了如Lonza方法描述的EC生长培养基2SingleQuots和1％青霉素类/链霉素(Invitrogen)。在补充0.1％胎牛血清(ValleyBiomedical)的EBM2中达80-90％汇合时进行血清饥饿达24小时，接着用无菌水中的高度纯化的pGlcNAc(50μg/ml)纳米纤维(sNAG)(由Marine Polymer Technologies,Inc.,Danvers,Mass.,USA提供)刺激。用于本研究的pGlcNAc硅藻衍生的纳米纤维是来源于较长形式(NAG)的短的生物可降解纤维，平均长度为4-7μm，聚合物分子量约为60,000Da。对于使用PD098059(50μM)或渥曼青霉素(100nM)的抑制，将细胞预处理45分钟后，用sNAG(50μg/ml)刺激3小时。
统计分析：至少一式三份且至少独立3次地进行各定量实验。应用MicrosoftExcell进行全部统计分析以计算平均值、标准差和斯图豋t检验。
慢病毒感染：针对Akt1的使命(Mission)shRNA慢病毒构建体购自Sigma/Aldrich。合成的pLKO.1shRNA载体购自Addgene。使慢病毒在293T细胞中繁殖，将293T细胞保持在上述已补充的DMEM中。采用来自Addgene的用于产生慢病毒颗粒的方案，使用购自Addgene的psPAX2和pMD2.G包装载体，进行慢病毒的生产。对于靶细胞的感染，将7.5X 105个细胞铺板于100mm2板中，使之孵育过夜。次日，使用终浓度为1μg/ml的1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)和拼凑对照或Akt1 shRNA慢病毒转导细胞。转导后，使内皮细胞血清饥饿过夜，用sNAG(50g/ml)刺激3小时。通过RT-PCR，监测全部感染的适当降低。
RT-PCR：对于半定量RT-PCR，按照生产商的说明书，用RNAsol(Teltest，Inc.)提取RNA。按照生产商的说明书，使用Oligo(dT)，用Superscript First Strand Synthesis Kit(Invitrogen)自2μg总RNA合成cDNA。PCR反应物含有等量的cDNA和1.25μM的合适引物对(Sigma-Proligo,St.Louis,MO,USA)。用于这些分析的全部引物序列如下:
循环条件为：94℃5分钟；94℃1分钟30-35个循环，55-65℃(根据引物Tm)1分钟，72℃1分钟；72℃7分钟，并冷却至4℃。对于每个所用引物对，凭经验确定循环数在该测定的线性范围内。核糖体蛋白亚基S26引物作为内部对照，进行全部的半定量RT-PCR。在BioRad分子成像系统(BioRad Molecular Imaging System)(Hercules，CA，USA)中观察产物。使用均购自Stratagene的Brilliant CYBR绿色QPCR试剂盒联合Mx3000P Real-Time PCR系统，进行实时PCR。使用检测核糖体亚基S26的引物作为内部对照。
切割伤口愈合模型：在所有实验中使用野生型C57Bl/6和Akt1-/-[43]。在阻断完整蛋白质表达的翻译起始位点上采用插入诱变策略，产生Akt1失效动物。对介于8-12周龄间的经麻醉的成年雄性小鼠进行致伤。使用4mm活检钻(Miltex)产生2个全厚皮肤伤口，在各胁产生两个相同的伤口。使用O2/异氟烷汽化麻醉机(VetEquip，Inc.)，使小鼠麻醉。使用4％异氟烷用于诱导；2％用于手术。手术前，通过脱毛术脱毛，使用70％乙醇将该区域清洗并灭菌。伤口用以蒸馏水湿润的sNAG膜治疗或不予治疗。在第3和5天，使动物安乐死，使用8mm活检钻(Miltex)收获包括皮肤周围在内的整个伤口。将伤口固定在4％低聚甲醛中在4°下过夜，在石蜡中包埋，切片用于分析。
苏木精和伊红染色(H&E)：全部H&E染色在Histology Core Facility at theMedical University of South Carolina,Department of Regenerative Medicine andCell Biology中进行。简单地说，使切片在二甲苯中透明，通过一系列分级乙醇再水化，依次放入苏木精和酸醇中。然后将样品放入氨水中，在乙醇中漂洗，暴露于伊红中后，通过分级乙醇脱水，并在二甲苯中透明。使用Cytoseal-XYL(Richard-Allan Scientific)将切片封片。切片使用Olympus BX40显微镜(4x物镜，0.13)观察H&E，并使用Olympus Camera(DP25型)和DP2-BSW数据采集软件拍摄。
细菌接种，组织革兰氏染色，菌落形成单位定量测定：如上所述使8-12周之间的雄性小鼠致伤。挑选金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)的一个菌落，在37°下培养过夜，并调节吸光度为OD600＝0.53。将1mL的金黄色葡萄球菌在10,000rpm离心，重新悬浮于无菌PBS中，使用15μl接种各伤口。接种后将sNAG膜施用于治疗组30分钟。在致伤后第3和5天，使小鼠安乐死，使用8mm活检钻收获伤口。将每只动物一个伤口在4％低聚甲醛中于4℃固定过夜，将另一伤口培养和铺板在没有抗生素的LB培养基中用于细菌定量测定(见下文)。将用于组织革兰氏染色的伤口在石蜡中包埋并切片。使切片在二甲苯中透明，通过一系列酒精再消化，并按照生产商所述方法使用组织革兰氏染色剂(Sigma-Aldrich)染色。
对于培养，将伤口切片放入0.5ml细菌培养基，在振荡的同时，在37℃下孵育30分钟。使用置于37℃过夜的稀释系列，定量测定菌落形成单位(CFU)。统计菌落数/板/稀释液，计算CFU/ml。
为了测定sNAG处理的细菌培养物的CFU/ml，溶液中的金黄色葡萄球菌培养物用不同浓度的sNAG(10μl和20μl 10.8mg/ml sNAG)处理3小时。然后将培养物铺板在37°下过夜，计算CFU/ml。
β-防卫素3肽应用：针对其在上述感染伤口愈合模型中对细菌生长的作用，对有生物活性的人β-防卫素3肽(Peptide Institute,Inc.)的3个试验浓度(1.0μM、2.5μM、5.0μM)进行测试。各个浓度均负面影响细菌生长，因此选择最低浓度用于分析。在每个伤口用金黄色葡萄球菌感染后，施用10ul肽。3天后，收获伤口，包埋用于切片和革兰氏染色，或按如上所述定量测定培养CFU/ml。
β-防卫素3抗体阻断：按上文的描述，给野生型雄性小鼠致伤，用15ul金黄色葡萄球菌感染。接种后，一个伤口用0.2ug/mLβ-防卫素3抗体(Santa Cruz)治疗，而另一个用0.2ug/mL正常山羊IgG对照抗体(Santz Cruz)治疗。在抗体治疗后第0天，将sNAG膜施用于全部小鼠。每24小时施用抗体。在第3天使小鼠安乐死，使用8mm活检钻收获伤口。在4℃下将伤口在4％低聚甲醛中固定过夜，在石蜡中包埋，切片，并使用组织革兰氏染色剂进行分析。如上所述，对第3天收获的伤口进行CFU/ml定量测定。
免疫荧光，显微镜术：将石蜡包埋的组织切片通过二甲苯和系列分级乙醇再水化。切片用0.01％Triton-X100处理，在高压锅中使用抗原解屏蔽溶液(antigen unmaskingsolution)(Vector Laboratories)进行抗原修复5分钟，使之冷却。皮肤切片用β-防卫素3山羊多克隆抗体(Santa Cruz)、内披蛋白兔多克隆抗体(Santa Cruz)和TO-PRO 3-碘化物(Molecular Probes)标记。将切片在第一抗体中于4°孵育过夜，并在合适的第二免疫荧光抗体(Invitrogen)中在室温下孵育1小时。在没有第一抗体的情况下，对各抗体的对照切片进行染色。采用Olympus FluroView激光扫描共焦显微镜(Model IX70)观察组织切片，使用Olympus Camera(Model FV5-ZM)和Fluoview 5.0数据采集软件在环境温度下拍摄。使用60x油浸镜头(Olympus浸镜油)对全部组织切片拍照。
HUVEC或是血清饥饿的，或在培养中用sNAG处理5小时，用抗α-防卫素5(FITC)、β-防卫素3(德克萨斯红)或TOPRO 3(蓝色)的抗体染色。使用免疫荧光显微镜术拍摄图像。采用Zeiss Axiovert 100M共焦显微镜观察细胞培养防卫素表达，并使用水作为介质，使用LSM 510照相机(Zeiss Fluor 63xW/1.2A物镜)在环境温度下拍摄。
蛋白质印迹分析：在用sNAG(50μl/ml)刺激规定时程之前，使内皮细胞经血清饥饿。然后将细胞裂解，进行蛋白质印迹分析。用于蛋白质印迹分析的抗体如下：PI3K的抗p85亚基和磷酸特异性Akt抗体(Cell Signaling Technologies)。
6.2.2结果
6.2.2.1当用sNAG刺激时角质形成细胞和内皮细胞表达和分泌防卫素
该实施例表明，sNAG治疗调节抗微生物小肽防卫素的表达，防卫素是先天免疫应答的组成部分。
为了研究sNAG处理对体外防卫素表达的影响，使用培养物中的原代人脐静脉内皮细胞。当用sNAG刺激时，内皮细胞表达α型防卫素和β型防卫素两者。如图7A所示用sNAG处理的内皮细胞显示在刺激1小时内β-防卫素3和α-防卫素1mRNA表达增量调节。还观察到由sNAG处理所致α-防卫素4和5的类似的增量调节(数据未显示)。使用含有超过25种不同防卫素基因的定制基因阵列以证实原代内皮细胞中α型防卫素的表达和角质形成细胞中β型防卫素的表达。sNAG刺激的内皮细胞显示α-防卫素1、4和5和β-防卫素3的特异性表达增加。此外，sNAG刺激的人角质形成细胞增加β-防卫素样基因的表达，其中几种列于表1中。这些研究结果表明，在响应sNAG刺激时，在原代内皮细胞中表达至少3种α-防卫素基因和β-防卫素3，在原代角质形成细胞中表达多种β-防卫素基因。
表I：基因阵列分析显示通过sNAG增量调节多种防卫素基因
为了测试sNAG依赖性防卫素表达是否也发生在蛋白质水平上，使用抗α和β防卫素两者的抗体，对sNAG刺激的内皮细胞进行免疫荧光。如图7B所示，在该细胞类型中，β-防卫素3和α-防卫素5两者在sNAG刺激时均增量调节。然而，用sNAG刺激的原代人角质形成细胞(HaCat)不引起α-防卫素表达增加，但却引起β-防卫素3表达增加(图7C)。总之，这些实验表明，在原代角质形成细胞和原代内皮细胞两者中，sNAG刺激导致防卫素肽增量调节。
6.2.2.2 sNAG依赖性防卫素表达需要Akt1
之前公布的数据表明，sNAG刺激的原代内皮细胞导致整联蛋白活化、Ets1表达和MAP激酶活化增加(Vournakis，J.N.等，2008,J Vasc Res.45(3):222-32)。研究结果将Akt1定位于内皮细胞和果蝇(Drosophila)的Ets1的上游(Lavenburg，K.R.等，2003，FASEB J.17(15)：2278-80)。为了开始测定负责防卫素表达的信号转导途径，使内皮细胞经血清饥饿，并在sNAG刺激前，用针对PI3K(渥曼青霉素)或MAP激酶(PD098059)的药理抑制剂预处理。定量实时PCR分析表明，在抑制PI3K/Akt途径或MAP激酶途径后，α-防卫素1mRNA水平大大降低(图8A)。β-防卫素3的RT-PCR分析也表明，通过抑制这些途径水平也降低(图8B)。短时程sNAG处理内皮细胞导致Akt1磷酸化，一种Akt1活化的标准指示物(图8C)。为了证实防卫素表达的确需要Akt1，使用慢病毒递送的针对Akt1的shRNA。用合成的(SCR)对照或Akt1shRNA感染，接着用sNAG处理的血清饥饿内皮细胞的定量RT-PCR证实，对于sNAG依赖性α-防卫素表达需要Akt1表达(图8D)。由于已知β-防卫素在上皮细胞中表达，因此在人角质形成细胞(HaCat)中使用针对Akt1的shRNA的慢病毒递送。sNAG处理用合成的(SCR)对照感染的血清饥饿角质形成细胞，导致通过Akt1敲减破坏的β-防卫素3表达显著增加(图8E)。这些结果说明，sNAG处理在内皮细胞中激活Akt1，并很大程度上表明在内皮细胞和角质形成细胞两者中，sNAG依赖性防卫素表达需要Akt1。
6.2.2.3皮肤伤口的sNAG治疗体内增加防卫素表达
为了证实体内防卫素表达对Akt1的依赖性，将野生型和Akt1失效动物用于切割伤口愈合模型中。虽然大部分哺乳动物白细胞表达α-防卫素(人、兔、大鼠和仓鼠)，但小鼠白细胞不表达α-防卫素。因此，集中研究这些小鼠模型的β-防卫素表达。用干燥形式的sNAG(一种生物可降解薄膜)治疗3天的皮肤伤口导致野生型动物角质形成细胞中β-防卫素3表达统计显著性地增加(图9A)。内披蛋白(Watt，F.M.，1983,J Invest Dermatol.81(增刊1):100s-3s)染色(红色)用来标记角质形成细胞细胞层，表明β-防卫素3的表达限于表皮层。为了评价sNAG依赖性防卫素表达是否有赖于Akt1，使用Akt1失效动物模型进行类似测定。用sNAG膜治疗的Akt1失效小鼠的伤口显示对β-防卫素3表达的诱导显著降低(图9A)。为了更好地观察表达β-防卫素3的表皮层，图9B显示在第3天收获的sNAG治疗的野生型伤口的代表性图像。sNAG治疗的皮肤伤口主要在皮肤基底上层中诱导β-防卫素3表达(图9B)。图9C所示定量分析显示，sNAG治疗的野生型动物中β-防卫素3表达增加约5倍，而且对于这种增加需要Akt1。
6.2.2.4 WT动物中sNAG治疗增加伤口闭合的动力学
之前的结果已表明，在响应sNAG治疗的糖尿病小鼠模型中，伤口闭合的动力学提高。在野生型动物中测到sNAG的类似影响。在野生型动物中产生切割伤口，用膜形式的sNAG治疗或不予治疗。在致伤后1、3和5天取组织切片，进行H&E染色。如图10所示，在致伤后第3天，野生型伤口的sNAG治疗导致完全闭合，用实线表示。这比对照伤口早2天发生。Akt1失效动物显示伤口闭合延迟；这些动物直到致伤后7天才完全闭合伤口。在Akt1失效动物中，伤口闭合延迟不被sNAG治疗拯救(数据未显示)。这些研究结果表明，在野生型小鼠中，sNAG不仅仅诱导防卫素表达，而且还提高伤口愈合动力学，并且可能是新的有效治疗药。
6.2.2.5 sNAG是对抗金黄色葡萄球菌的有效抗微生物药
已知防卫素肽具有抗微生物性质，其针对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌具有活性。由于用sNAG治疗的内皮细胞增加防卫素表达(α型和β型两种)，且用sNAG治疗的皮肤伤口体内显著增加β-防卫素3表达，因此对sNAG治疗在细菌感染伤口中的抗微生物药效力进行了评价。
为了确定sNAG是否减少皮肤伤口的细菌负荷，使野生型和Akt1失效动物经历皮肤伤口愈合，接着用金黄色葡萄球菌感染。感染后，感染伤口用sNAG治疗或不予治疗持续3和5天。如图11A和11B中的组织革兰氏染色所示，与未治疗伤口相比，用sNAG治疗的野生型动物显示致伤后第5天革兰氏阳性细菌染色显著减弱。相比之下，在致伤后5天来源于Akt1失效动物未治疗伤口的革兰氏染色组织显示，革兰氏阳性染色的嗜中性粒细胞蓄积(图11B)，说明了不被sNAG治疗拯救的这些动物中可能没有细菌清除。这些研究结果表明，Akt1失效动物在免疫清除机制方面有缺陷，其不被sNAG治疗拯救。
为了以菌落形成单位(CFU)量化sNAG特异性细菌改变，收获来自sNAG治疗或未治疗的野生型和Akt1失效小鼠两者的感染伤口，并培养。如图11C所示，在致伤后5天，用sNAG治疗的野生型动物中细菌数显著减少(10倍)。然而，虽然与野生型相比，在Akt1失效动物中检出的细菌数减少，但在Akt1失效动物中，sNAG治疗对绝对细菌数几乎没有作用。感染后3天(图11D)，与未治疗对照相比，sNAG治疗的野生型小鼠中CFU有类似的10倍减少。与未治疗的Akt1失效动物相比，sNAG治疗的Akt1失效动物显示CFU 2倍降低。一般而论，Akt1失效动物每伤口具有较低的细菌负荷，这可反映出除防卫素表达以外，对其它过程的Akt1依赖性作用。这些研究结果表明，在野生型小鼠而非在Akt1失效小鼠中，sNAG治疗导致受感染的皮肤伤口中细菌负荷显著降低，表明了防卫素介导抗菌反应的可能性。
为了表明sNAG治疗的抗菌作用非由纳米纤维对细菌生长或对其存活的直接作用所致，在具有不同量的sNAG的溶液中处理金黄色葡萄球菌细菌培养物3小时，并测定菌落形成单位。如图11E所示，sNAG处理对金黄色葡萄球菌的生长无直接作用，这就表明sNAG不直接抑制细菌生长，因此可能通过防卫素增量调节起作用。
6.2.2.6模拟sNAG抗菌作用的防卫素肽的应用
为了确定加入防卫素肽是否可阻断类似于sNAG治疗所示的细菌感染，如上所述使野生型小鼠致伤，并接种金黄色葡萄球菌，然后用有生物活性的人β-防卫素3肽(1.0μm)治疗3天。组织活检样品使用组织革兰氏染色剂染色，定量测定CFU。图11F-G显示这些实验的结果。用β-防卫素3肽治疗的受感染小鼠的细菌负荷减少，减少约活细菌的7.5倍(图11G)，与用sNAG治疗的野生型小鼠的相似。
诱导防卫素表达的机制之一是通过由细菌LPS引起的刺激，可能通过Toll样受体的活化(Selsted，M.E.和A.J.Ouellette，2005，Nat Immunol.6(6):551-7)。为了测试仅细菌感染是否能够在测试时间内诱导β-防卫素表达，在致伤后3天，对野生型动物感染伤口的β-防卫素表达进行了评价。如图12A所示，在感染3天内，仅细菌感染不诱导β-防卫素表达，如用sNAG治疗所示。然而，在野生型动物中，在相同时间内，感染伤口的sNAG治疗引起β-防卫素表达增加约3-5倍(图12B)。这些研究结果表明，sNAG治疗快速诱导金黄色葡萄球菌感染伤口中导致明显细菌清除的防卫素表达。
6.2.2.7抗β-防卫素3抗体阻断sNAG的抗菌作用
由于防卫素是分泌性蛋白质，本发明人假设，抗β-防卫素3抗体可能会阻断抗菌活性。为了验证该设想，如上所述，产生伤口，用金黄色葡萄球菌感染，并用sNAG治疗。伤口用β-防卫素3抗体或同种型对照处理；每天施用一次达3天。获取伤口切片，并对革兰氏阳性细菌染色。如图13A所示，来源于用β-防卫素抗体处理的伤口切片比用同种型对照抗体处理的伤口有更多的革兰氏阳性细菌。所显示的每个切片来源于痂正下方的伤口区。这些伤口中CFU的定量测定显示，在金黄色葡萄球菌感染伤口中在sNAG治疗前β-防卫素3的中和导致细菌显著增加。用IgG同种型对照处理的动物显示活细菌约5倍减少(图13B)。总之，这些结果表明，sNAG治疗不仅导致伤口愈合动力学提高，而且还促进内源抗菌反应，并且支持这种纳米纤维作为加快伤口愈合同时减少伤口感染的新疗法的应用。
6.2.3结论
本文给出的研究结果表明，海洋硅藻来源的纳米纤维sNAG，可用作加快伤口愈合同时减少伤口感染的新的有效方法。数据表明，目前用于止血的这种FDA批准的材料，刺激原代内皮细胞α型和β型防卫素的表达和原代角质形成细胞β型防卫素的增量调节。
防卫素是先天免疫系统必不可少的组分。这些肽具有抗微生物性质，对革兰氏阳性和阴性细菌、真菌和许多病毒具有活性。防卫素是存在于哺乳动物、昆虫和植物中的富含半胱氨酸的阳离子小肽(3-4kDa)，根据其二硫键的形式而被归类为不同的家族(α、β和θ)。α-防卫素被认为对嗜中性粒细胞有特异性，以极高浓度存在(占细胞总蛋白的约5-7％)(Ganz,T.和R.I.Lehrer,1994,Curr Opin Immunol.6(4):584-9)，并在抗微生物反应期间分泌(Ganz,T.,1987,Infect Immun.55(3):568-71)。另已表明，兔肺泡巨噬细胞具有α-防卫素，水平与兔嗜中性粒细胞的相当(Ganz,T.等,1989,J Immunol.143(4):1358-65)。β-防卫素存在于上皮细胞类型，例如角质形成细胞、黏膜上皮细胞(Harder,J.等,1997,Nature387(6636):861；以及Harder,J.等,2001,J Biol Chem.276(8):5707-13)、口腔组织和唾液分泌物(Mathews,M.等,1999,Infect Immun.67(6):2740-5)和在响应感染性或炎性刺激时其可被增量调节的肾(Ganz,T.和R.I.Lehrer,1994,Curr Opin Immunol.6(4):584-9)中。人β-防卫素1(hDEFB1)是上皮组织中最重要的抗微生物肽之一。防卫素表达和分泌可能对于产生伤口治疗剂极其重要。防卫素的抗微生物作用被视为先天免疫的组成部分，且是非特异性和广谱的。因此获得性细菌抗性(如见于过度使用抗生素)并不是问题。
本文给出的数据还表明，防卫素表达体外和体内都需要Akt1。sNAG治疗降低野生型对照动物皮肤伤口的金黄色葡萄球菌感染，但在同样治疗的Akt1失效动物中则不然。另外重要的是注意，sNAG刺激的野生型皮肤伤口导致伤口闭合的动力学提高。β-防卫素的抗体阻断导致sNAG-抗菌活性减弱。总之，这些研究结果表明Akt1在调节负责清除细菌感染的防卫素表达的重要作用，且sNAG治疗在野生型动物中激活这些途径。
数据表明，感染伤口的sNAG治疗可至少部分通过诱导防卫素表达，而大大减少患者的细菌负荷。金黄色葡萄球菌是常见于定居皮肤和鼻中的细菌。它仍是医院内感染的普遍原因，常引起术后伤口感染。多年来，医院的金黄色葡萄球菌感染一直困扰着医疗保健工作人员，用于治疗的抗生素的广泛使用导致抗生素抗性菌株。本文给出的数据表明，用sNAG治疗葡萄球菌感染伤口显著减少细菌负荷。例如在图11A和11B中，接受治疗的WT小鼠中暗紫色革兰氏染色的缺乏表明，金黄色葡萄球菌感染已被从这些伤口中清除。体外和体内数据两者提供了在治疗伤口时使用Taliderm/sNAG降低细菌感染并因此加快伤口愈合的有力证据。
对照实验表明，sNAG的抗菌作用非由该材料与细菌的直接相互作用所致，而是由下游影响所致，例如由于Akt1活化而调节防卫素。普遍认可的是，防卫素是先天免疫的重要参与者，在抗微生物活性中起作用。其功能的大多证据是通过与防卫素肽的体外混合实验来直接杀死细菌(Selsted,M.E.和A.J.Ouellette,2005,Nat Immunol.6(6):551-7)或在如图11所示的类似实验中直接施用纯化的活性肽。本文数据表明，使用局部施用的sNAG在野生型动物对防卫素表达的诱导导致抗菌反应。最近表明，表达人防卫素5基因的转基因小鼠模型是低抗鼠伤寒沙门氏菌(一种导致野生型动物死亡的感染)的(Salzman,N.H.等,2003,Nature 422(6931):522-6)，再次表明了防卫素在调节抗微生物反应中的重要性。
已被公认的是，防卫素的α-亚型在嗜中性粒细胞中特异性表达，而β型防卫素的来源是上皮。在培养和在皮肤伤口愈合模型两者中，检出人角质形成细胞在响应sNAG时诱导的β型防卫素表达。体内数据说明，在用sNAG治疗后，β-防卫素3主要在基底上层表达。这与之前将人β-防卫素2定位于皮肤棘层和颗粒层的数据一致(Oren,A.等,2003,Exp MolPathol.74(2):180-2)。皮肤与损伤和感染不断接触，不仅仅起作为机械屏障起作用，而且还保持发动针对感染的积极防御的能力。皮肤外层中β-防卫素的表达支持其在皮肤先天免疫中的作用。然而，数据显示，sNAG特异性刺激内皮细胞中3种不同α-防卫素(1、4和5)的表达。这已得到RT-PCR、基因阵列分析、免疫荧光和ELISA(数据未显示)的证实。组织修复中内皮细胞和白细胞之间的相互作用在伤口愈合中是最初和最重要的步骤之一。白细胞自血管系统外渗的过程是由趋化因子介导的，因此，有趣的是，α-防卫素被sNAG诱导，且可促使必要的嗜中性粒细胞/内皮细胞相互作用。最近，防卫素具有抑制微生物细胞以外的生物活性已为众人所知，包括其通过对树突细胞(Hubert,P.等,2007,FASEB J.21(11):2765-75)和T细胞、单核细胞和巨噬细胞(Garcia,J.R.等,2001,Cell Tissue Res.306(2):257-64)和角质形成细胞(Niyonsaba,F.等,2007,J Invest Dermatol.127(3):594-604)具有趋化活性而有助于获得性免疫应答。之前的研究表明，人β防卫素1和2具有通过CC-趋化因子受体6(CCR6)而化学引诱未成熟树突细胞和T细胞的能力(Yang,D.等,1999,Science 286(5439):525-8)，而且人β防卫素2可通过CCR6受体化学引诱TNFα处理的嗜中性粒细胞(Niyonsaba,F.,H.Ogawa和I.Nagaoka,2004,Immunology 111(3):273-81)。业已表明，人β-防卫素2和3通过与在巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞上表达的受体CCR2相互作用而诱导趋化性(Rohrl,J.等,2010,J Immunol,2010)。有趣的是，数据显示，sNAG治疗诱导α防卫素和β防卫素两者在内皮细胞中表达。总之，近来的数据表明，防卫素不仅仅可通过其抗微生物性质，而且还通过对适当愈合是必需的其它细胞类型的趋化性，来介导伤口愈合。然而，仅施用β-防卫素3不导致伤口闭合增加(数据未显示)，这意味着局部施用单一防卫素无法维持化学引诱、细胞募集和伤口闭合增加所需的细胞相互作用。
使用野生型和Akt1敲除动物两者的体内数据证实，在sNAG诱导的β-防卫素3表达中需要Akt1。由于小鼠白细胞像大多数其它哺乳动物白细胞一样不表达α-防卫素(Ganz,T.,2004,C R Biol.327(6):539-49)，因此体内浸润性免疫细胞的α-防卫素染色是不可能的。体外用α防卫素1-3处理的气道上皮细胞引起需要PI3K和MAPK途径活化的细胞迁移剂量和时间依赖性地增加(Aarbiou,J.等,2004,Am J Respir Cell Mol Biol.30(2):193-201)。已表明，内皮细胞的sNAG刺激导致MAPK活化(Vournakis，J.N.等，2008,J VascRes.45(3):222-32)，且在本文所给出的数据中，药理抑制MEK也抑制防卫素的体外表达。这些研究结果表明，两个途径通过sNAG对防卫素表达的调节起作用，然而，Akt1消融导致其体外和体内表达两者显著下降。在髓样细胞中，部分通过Ets家族成员PU.1在转录水平上控制β-防卫素1表达(Yaneva,M.等,2006,J Immunol.176(11):6906-17；以及Ma,Y.,Q.Su和P.Tempst,1998,J Biol Chem.273(15):8727-40)。PU.1是B细胞谱系中的Akt1的下游靶标(Rieske,P.和J.M.Pongubala,2001,J Biol Chem.276(11):8460-8)。在原代内皮细胞中已表明，在果蝇气管发育期间，Akt1体外和体内均是Ets1的上游。(Lavenburg,K.R.等,2003,FASEB J.17(15):2278-80)。sNAG刺激内皮细胞导致Ets1的表达增加(可能通过Akt1)，Ets1是内皮细胞迁移所必需的(Vournakis,J.N.等,2008,J Vasc Res.45(3):222-32)。
迄今，sNAG治疗已引起一系列下游活性；止血、细胞迁移、细胞增殖、伤口闭合加快，以及如本文所述，刺激导致抗菌功能的先天免疫应答。
假如在出现慢性伤口和因伤口感染所致并发症的人群内糖尿病患者急剧增加，则十分需要新的临床治疗。在本文中，描述了海洋来源的pGlcNAc纳米纤维，其不仅仅提高伤口愈合的动力学，而且还起刺激先天免疫作用从而提供抗菌活性。这些观察资料明的显重要性是医院内感染的应用。医院内感染中，手术创伤感染占支配地位；统计数据显示高达所有手术患者的8％。这类感染类型的直接成本每年约为45亿美元。假如防卫素是先天免疫系统的组成部分，则激活这些途径将阻止抗性生物的产生以及允许不依赖抗生素地清除细菌感染。在医院情况下，使用sNAG可扣减大部分成本，并显著减少抗生素抗性菌种的产生。总之，这些研究结果表明，这些海洋来源的pGlcNAc纳米纤维在临床领域将是十分有益的。
6.3实施例3：sNAG是对抗铜绿假单胞菌的有效抗微生物药
该实施例表明，sNAG纳米纤维体内具有对抗铜绿假单胞菌的抗菌作用。
材料与方法：使用4mm活检钻(Miltex)，使8-12周龄的野生型C57Bl/6雄性小鼠致伤，在各胁形成两个相同的伤口。使用O2/异氟烷汽化麻醉机(VetEquip，Inc.)使小鼠麻醉。使用4％异氟烷用于诱导；2％用于手术。手术前，脱毛，挑取铜绿假单胞菌，在37°下培养过夜，并调节吸光度为OD600＝0.53。各伤口接种1.5x109cfu/伤口铜绿假单胞菌。接种后30分钟以后，伤口用蒸馏水湿润的sNAG膜治疗(试验组，n＝6)或不予治疗(对照组，n＝6)。在第3天使动物安乐死，使用8mm活检钻(Miltex)收获包括皮肤周围在内的整个伤口。将每只动物的一个伤口固定在4％低聚甲醛中于4℃过夜，在石蜡中包埋，切片用于分析，而将另一伤口培养和铺板在没有抗生素的LB培养基中用于细菌定量测定。对于培养，将伤口切片放入0.5ml细菌培养基中，在振荡的同时，在37℃下孵育30分钟。使用置于37℃过夜的稀释系列，定量测定菌落形成单位(CFU)。统计菌落数/板/稀释液，计算CFU/ml。
结果：对sNAG治疗的革兰氏阴性细菌感染伤口的效力进行评价。如图14所示，与未治疗动物相比，sNAG治疗的动物中，感染后3天细菌数显著减少(超过2倍)。这些研究结果表明，sNAG治疗导致受感染皮肤伤口中革兰氏阴性细菌、特别是铜绿假单胞菌的细菌负荷显著降低(除实施例2所示革兰氏阳性细菌的细菌负荷降低以外)。
6.4实施例4：sNAG纳米纤维增量调节许多防卫素和Toll受体基因的表达。
该实施例表明，通过sNAG处理人内皮细胞增量调节许多防卫素和Toll样受体。
材料与方法：将Human Chip探针印在环氧树脂载玻片上。按第6.2节中的描述培养HUVEC细胞，并用sNAG纳米纤维(“sNAG”)处理5小时。按照生产商的说明书，用RNAsol(Teltest，Inc.)提取RNA，使用Amino Allyl MessageAMPTM II aRNA扩增试剂盒(AppliedBiosystems)扩增，并标记。通过在室温O/N下在浸于封闭溶液(Sigma Tris缓冲盐水pH8.0，在1000ml dH2O、1％BSAw/v、NaN3中至0.05％)中，制备载玻片用于与aRNA杂交，然后漂洗并干燥。使含有来自sNAG处理细胞的标记的靶aRNA的样品与载玻片杂交(65ul/载玻片；在95℃变性5分钟；在0.1％SDS和5X SSC和1％BSA中于37℃杂交48小时)，漂洗并干燥。对载玻片进行扫描，采用Perkin-Elmer Scan Array设备和更新的ScanArray Express软件V3.0，检测杂交。为了鉴定增量调节的基因，应用Agilent GeneSpring GX v.11生物信息数据分析(Agilent GeneSpring GX v.11Bioinformation Data Analysis)，对微阵列数据进行分析。
所分析的目标基因：IL-1、CEACAM3、SPAG11、防卫素(“DEFA”＝α-防卫素，“DEFB”＝β-防卫素)；Toll样受体(“TLR”)、SIGIRR(单一IG IL-1相关受体)和TRAF6(TNF受体相关因子6)。阳性对照：1433Z(酪氨酸-3-单氢化酶/色氨酸5单氢化酶激活蛋白(Tyrosine-3-monohydrogenase/tryptophan 5monohydrogenase actition protein))；GAPD(甘油醛-3-磷酸脱氧酶)；RPL13A(核糖体蛋白质L13a)；UBC(Ubiquitin C)；ACTB(Actin B)。
结果：微阵列基因芯片分析结果和Q-PCR验证的微阵列结果见下表II-VI。使用定制的基因芯片，确定许多防卫素和Toll样受体通过sNAG治疗人内皮细胞而被增量调节。
Toll样受体(TLR)是高度保守的受体，识别导致先天免疫活化的细菌组分的特定分子模式。有趣的是，果蝇缺乏获得性免疫系统，但仍对微生物感染有抗性(Imler,J.L.和J.A.Hoffmann,2000,Curr Opin Microbiol,3(1):16-22)。该宿主防御是先天免疫系统的结果，其通过合成由TLR诱导的抗微生物肽dToll和18-wheeler而提供保护(Lemaitre,B.等,1996,Cell86(6):973-83；以及Williams,M.J.等,1997,EMBO J.16(20):6120-30)。近期的研究还将人防卫素表达与TLR活化相联系。已表明，在气道上皮细胞中以TLR-2依赖性方式诱导人β-防卫素2(Hertz,C.J.等,2003,J Immunol.171(12):第6820-6页)。已经表明，在单核细胞中，在响应肺炎衣原体时，Toll样受体4介导人β-防卫素2诱导(RomanoCarratelli,C.等,2009,FEMS Immunol Med Microbiol.57(2):116-24)。重要的是，PI3K/Akt途径是TLR信号转导中的关键组分，控制细胞对病原体的反应(Weichhart,T.和M.D.Saemann,2008,Ann Rheum Dis.67Suppl 3:iii70-4)。因为已知刺激TLR可导致防卫素合成增加，该项研究表明sNAG通过激活Akt1而作为先天免疫和细菌清除的刺激物的潜力。
表II：在响应sNAG刺激时被增量调节的一些基因一览表
基因 功能
IL-1 参与免疫防御的促炎细胞因子
CEACAM3 指导若干细菌菌种的吞噬作用的细胞黏附分子
SPAG11 具有抗微生物性质的β-防卫素-3样分子
防卫素 具有抗微生物活性的一系列防卫素
TLR Toll样受体：刺激针对感染的细胞反应的重要性
基因 配体/功能 诱导倍数
TLR1 来自细菌和分枝杆菌的三酰基脂肽 7.6
TLR4 LPS，病毒蛋白，Hsp60(衣原体) 5.064
TLR7 合成化合物 3.271
TLR8 合成化合物 2.067
TRAF6 下游信号转导调节剂 6.167
SIGRR IL-1受体相关TLR调节剂 5.895
表III：防卫素微阵列基因表达
(sNAG 10ug/ml 5小时的HUVEC反应)
表IV：DEFCB3微阵列基因验证
(AB Prism 7000；sNAG(10ug/ml)，HUVEC 5小时)
TaqMan相对qPCR倍数改变计算(ABI方法)
表V：Toll样受体微阵列基因表达
6.5实施例5：sNAG和长纤维NAG在基因表达谱中不同。
该实施例表明，在其对基因表达的作用，具体地说在其对一些防卫素和Toll样受体的表达的作用方面，sNAG纳米纤维与长p-GlcNAc纤维不同。
材料与方法：采用标准技术，将Human Defensin Chip探针(浓度：20uM，量18-20，溶剂：基于SSC的点样缓冲液)印于环氧树脂载玻片上。按第6.2节所述，培养HUVEC和HaCat细胞，并用长纤维(“LNAG”)或sNAG纳米纤维(“sNAG”)处理2小时或20小时。按照生产商的说明书，用RNAsol(Teltest，Inc.)提取RNA，使用Amino Allyl MessageAMPTM II aRNA扩增试剂盒(Applied Biosystems)扩增。在RNA扩增期间，来自用LNAG处理的细胞的aRNA和来自用sNAG处理的细胞的aRNA用Cy3或Cy5荧光染料进行差别标记。在室温O/N下，通过浸入封闭溶液(Sigma Tris缓冲盐水pH8.0，在1000ml dH2O、1％BSAw/v中，NaN3至0.05％)中，制备用于与aRNA杂交的载玻片，然后漂洗并干燥。将含有来自LNAG和sNAG处理细胞的等量的差异标记的靶aRNA的样品混合，与载玻片杂交(65ul/载玻片；在95℃变性5分钟；在0.1％SDS和5XSSC和1％BSA中于37℃杂交48小时)，漂洗并干燥。表VII中的下列示图说明实验设置：
对载玻片进行扫描，使用Perkin-Elmer Scan Array设备和更新的ScanArrayExpress软件V3.0检测杂交。对于各载玻片，观测Cy5、Cy3和复合荧光。为了确定增量调节和减量调节的基因，应用Agilent GeneSpring GX v.11生物信息数据分析对微阵列数据进行分析。
所分析的目标基因：DEFA1、DEFA3、DEFA4、DEFA5、DEFA6、DEFB1、DEFB013A、DEFB104A、DEFB105B、DEFB108B、DEFB112、DEFB114、DEFB118、DEFB119、DEFB123、DEFB124、DEFB125、DEFB126、DEFB127、DEFB128、DEFB129、DEFB131和DEFB4(“DEFA”＝α-防卫素，“DEFB”＝β-防卫素)；TLR1、TLR10、TL2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR8(“TLR”＝Toll受体)；SIGIRR(单一IG IL-1相关受体)；IRAK2(IL-1受体相关激酶1)；TRAF6(TNF受体相关因子6)；D106A(β-防卫素106)、D107A(β-防卫素107)。阴性对照：3个随机序列(1、2、3)。阳性对照：1433Z(酪氨酸-3-单氢化酶/色氨酸5单氢化酶活化蛋白)；GAPD(甘油醛-3-磷酸脱氧酶)；RPL13A(核糖体蛋白质L13a)；UBC(泛素C)；ACTB(肌动蛋白B)。
结果：下表VIII和IX给出微阵列基因芯片分析的结果。表VIII显示在暴露在LNAG纤维或sNAG纳米纤维中2小时或24小时后，人脐静脉内皮细胞(“HUVEC”)中的基因表达。表IX显示在暴露在LNAG纤维或sNAG纳米纤维2小时或24小时后在人角质形成细胞细胞系(HaCat)中的基因表达。结果表明，被长的聚-N-乙酰葡萄糖胺纤维(“LNAG”)诱导的基因表达谱与被sNAG纳米纤维(“sNAG”)诱导的基因表达谱不同。具体地讲，LNAG和sNAG在其对防卫素基因和Toll受体基因表达的作用中不同。
表VIII：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中微阵列防卫素基因表达、倍数改变
表IX：人角质形成细胞细胞系(HaCat)中的微阵列防卫素基因表达，倍数改变
6.6实施例6：照射对sNAG膜的作用
sNAG膜的制备方法。sNAG膜来源于如前所述产生的微藻pGlcNAc纤维(参见Vournakis等美国专利号5,623,064和5,624,679，其每个的内容均通过引用以其整体结合到本文中)。简单地说，使用确定成分生长培养基，将微藻类培养在独特的生物反应器条件中。从高密度培养物中收获微藻类后，通过逐步分离和纯化方法分离纤维，产生成批悬浮于水中的纯纤维用于注射(wfi)。通过浓缩和烘炉干燥，将纤维配制成贴剂，包装，通过γ-辐射灭菌。纤维尺寸平均为250nm x 1-2nm x～100μm。利用化学和物理试验参数，对纤维批次分别进行品质控制，在发售时，每批都符合严格的纯度标准。要求最后批次基本不含蛋白质、金属离子和其它组分。然后通过照射缩短纤维以产生sNAG膜。简单地说，起始原料含有60g的pGlcNAc浆，浓度为1mg/mL。通过将5mL过滤至0.2um过滤器中，来证实pGlcNAc浆的浓度。将含有15g pGlcNAc的15L pGlcNAc浆过滤，直到湿饼形成。然后将湿饼(wake cake)转移至是γ辐射相容性容器的金属箔袋中，并进行200kGyγ辐射。针对其对pGlcNAc组合物的作用，测试了其它辐射条件，如图15A中所反映的一样。
照射对pGlcNAc膜的作用。虽然照射降低pGlcNAc的分子量，但是照射不干扰纤维的微结构。在不同条件下照射pGlcNAc：作为干的冻干材料；作为干的膜；作为浓浆料(30:70重量/体积)和作为稀浆料(5mg/ml)。对于干的聚合物，合适的分子量降低(至500,000-1,000,000道尔顿的分子量)在1,000kgy的照射剂量下实现，对于湿的聚合物在200kgy下实现(图15A)。
在整个照射过程中保持纤维的化学和物理结构，通过红外线(IR)光谱(图15B)、元素测定和扫描电子显微镜(SEM)分析予以证实。经照射纤维的显微镜观察显示粒子长度显著缩短(图15C和15D)。大多数纤维的长度小于约15μm，其平均长度为约4um。
6.7实施例7：sNAG纳米纤维和长形式p-GlcNAc纤维在其对脐带静脉内皮细胞的代 谢率和血清剥夺的作用中不同
材料与方法。按Cambrex方法所述，在37℃与5％CO2下，将合并的多供体人脐带静脉内皮细胞(EC)(Cambrex)在补充EC生长培养基2SingleQuots的内皮基础培养基2(Cambrex)中维持。在补充0.1％胎牛血清(Gibco BRL)的RPMI-1640中呈80-90％汇合时，进行血清饥饿24小时，接着用无菌水中的VEGF 165(20ng/ml，R&D Systems)或高度纯化的pGlcNAc纳米纤维或sNAG纳米纤维(由Marine Polymer Technologies,Inc.,Danvers,Mass.,USA提供)刺激，量如附图描述中的规定。对于细胞增殖/存活力评价，采用2种不同的测定法：使用血细胞计数器通过直接细胞计数的锥虫蓝排斥和生产商(Promega)所述方法中的MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2yl)-2,5-二苯基溴化四唑]测定法。
结果—pGlcNAc：
pGlcNAc不影响代谢率。如图16所示，按通过MTT测定法的测量，pGlcNAc不引起较高的代谢率，这就表明该聚合材料不引起细胞增殖显著增加。
pGlcNAc保护EC免受血清饥饿诱导的细胞死亡。为了测试pGlcNAc纤维是否对EC需要直接作用，将血清饥饿EC细胞用VEGF或不同浓度pGlcNAc纤维处理。如图17所示，在血清饥饿后48小时和72小时，与铺板细胞(对照)的总数相比，在48小时或72小时后，细胞数有约2倍的减少。在48小时时，细胞数的这种减少通过加入VEGF或通过加入50或100μg/ml的pGlcNAc纤维而被拯救。在72小时时，细胞数的这种减少通过加入VEGF而被拯救，或通过加入100μg/ml的pGlcNAc纤维在很大程度上被拯救。这些结果表明像VEGF一样，pGlcNAc纤维处理防止血清剥夺诱导的细胞死亡。
结果—sNAG：
sNAG诱导显著升高的代谢率。如通过MTT测定法的测量，与VEGF相比，50、100或200μg/ml的sNAG引起EC的较高代谢率(图18)。
sNAG不保护EC免受血清剥夺诱导的细胞死亡。为了测试sNAG纤维对EC是否具有直接作用，血清饥饿EC细胞用VEGF或用不同浓度的sNAG纤维处理。如图19所示，在血清饥饿后48小时，与铺板细胞(对照)总数相比，细胞数有约2倍的减少。细胞数的这种减少通过加入VEGF而非通过加入50、100或200μg/ml的sNAG纤维被拯救。这些结果表明，不像VEGF，sNAG纤维处理不阻止血清剥夺诱导的细胞死亡。
结论：上述结果表明，与长形式pGlcNAc不同，在MTT测定法中，sNAG提高血清饥饿EC的代谢率，并且在锥虫蓝排斥试验中，不拯救血清饥饿EC的细胞凋亡。
6.8实施例8.sNAG的临床前试验
6.8.1试验品
使用包含按在上文第6.2.1节中所述产生的sNAG的试验品。试验品由MarinePolymer Technologies，Inc.供应。
6.8.2生物相容性测试–L929MEM洗脱试验(Elusion Test)–ISO10993-5
在小鼠成纤维细胞L929哺乳动物细胞中测试了试验品的生物相容性。在暴露于试验品后48小时时，在L929细胞中未观察到生物反应性(0级)。所观察到的获自阳性对照品(4级)和阴性对照品(0级)的细胞反应证实了该试验系统的适合性。根据该方案的标准，试验品被视为无毒的，并符合洗脱试验国际标准化组织(ISO)10993-5准则的要求。参见下表X。
表X：
反应性级别
6.8.3肌内植入试验–ISO–4周植入
6.8.3.1材料与方法
为了评价试验品诱导局部毒性作用的潜力，采用肌内植入试验–ISO–4周植入(“肌内植入试验”)。简单地说，把试验品植入New Zealand白兔脊柱旁肌肉组织达4周时间。使用以下两种对照品分别对试验品进行评价：阳性对照氧化纤维素(Surgicel)(Johnson andJohnson,NJ)和阴性对照高密度聚乙烯(阴性对照塑料)。
试验品和对照品的制备。试验品经测量宽约1mm，长为10mm。制备两种对照品。阳性对照氧化纤维素(C1)，经测量宽约1mm，长为10mm，并接受灭菌。阴性对照塑料(C2)，经测量宽约1mm，长为10mm，通过浸入70％乙醇中来灭菌。
给药前操作。植入前给每只动物称重。试验当天，剪除动物背侧软毛，碎毛用真空脱除。使每只动物适当麻醉。植入前，将该部位用手术准备溶液擦洗。
给药剂量。将4个试验品条经手术植入每只兔每个脊柱旁肌肉，距中线约2.5cm，与脊柱平等，彼此相距约2.5cm。将试验品条植入脊柱一侧。以相同方式，将阳性对照品条(氧化纤维素)植入每只动物的对侧肌肉。将2个阴性对照条(阴性对照塑料)植入脊柱任一侧的试验品和C1对照植入部位的尾部(朝向尾)(共4条)。共需要至少8个试验品条和8个各对照品条用于评价。
给药后操作。使动物维持4周时间。在此期间每日一次观察动物以确保植入部位适当愈合，并观察毒性的临床征象。观察资料包括所有临床表现。在观察期结束时，给动物称重。通过注射巴比妥酸盐处死各动物。允许经过足够时间以便在不出血的情况下切割组织。
总体观察。从每只动物中完整切下其中植入试验品或对照品的脊柱旁肌肉。用手术刀小心地将植入部位周围切断并提起组织，取出肌肉组织。大体检查切离的植入组织，但无需使用可能破坏用于组织病理学评价的该组织完整性的过度侵入操作。将组织放入装有10％中性缓冲福尔马林的适当标记的容器中。
组织病理学。在福尔马林中固定后，从较大块的组织中切离各植入部位。宏观检查含有植入材料的植入部位。利用下列评分，检查各部位的炎症征兆、囊化、出血、坏死和变色：
0＝正常
1＝轻微
2＝中度
3＝明显
在宏观观察后，使植入材料留在原位，对含有植入部位的组织切片进行加工。通过Toxikon制备苏木精和伊红染色切片的组织载玻片。通过光学显微镜检查对载玻片进行评价和分级。
植入物的作用的病理学评价。通过各植入部位的显微镜观察，对以下类别的生物反应进行了评价：
1.炎症反应：
a.多形核白细胞
b.淋巴细胞
c.嗜酸性粒细胞
d.浆细胞
e.巨噬细胞
f.巨细胞
g.坏死
h.变性
2.愈合反应：
a.纤维变性
b.脂肪浸润
使用下列评分对各类反应分级：
0＝正常
0.5＝极轻微
1＝轻微
2＝中度
3＝明显
通过评价自植入物/组织界面的区域距具有正常组织和正常血管分布特征的未受影响区域的宽度，对受累区域的相对大小进行评分。使用下列分数对受累区域的相对大小进行评分：
0＝0mm，无部位(No site)
0.5＝至多0.5mm，极轻微
1＝0.6-1.0mm，轻微
2＝1.1-2.0mm，中度
3＝>2.0mm，明显
肌内植入试验根据下列参考文献进行：
1.ISO 10993-6，1994，Biological Evaluation of Medical Devices–Part 6:Tests for Local Effects After Implantation(医疗装置的生物学评价–第6部：植入后局部效应的测试)。
2.ISO 10993-12，2002，Biological Evaluation of Medical Devices–Part 12:Sample Preparation and Reference Materials(医疗装置的生物学评价–第12部：样品制备和参比材料)。
3.ASTM F981-04，2004，Standard Practice for Assessment of Compatibilityof Biomaterials for Surgical Implants with Respect to Effect of Materials onMuscle and Bone(根据材料对肌肉和骨的作用对手术植入物进行生物材料相容性评价的标准规程)。
4.ASTM F763-04，2004，Standard Practice for Short Term Screening ofImplant Materials(植入材料的短期筛选的标准规程)。
5.ISO/IEC 17025，2005，General Requirements for the Competence ofTesting and Calibration Laboratories(测试实验室和校准实验室能力的一般要求)。
根据下列标准评价肌内植入试验的结果：
1.计算评定值：对每一植入部位，求出总分。将每只动物试验部位的平均分值与该动物对照部位的平均分值进行比较。计算所有动物试验部分和对照部位的平均差异，如下设置初始生物反应性评定值：
0-1.5无反应*
>1.5-3.5轻微反应
>3.5-6.0中度反应
>6.0明显反应
*负数计算报告为零(0)。
2.评定值的修正：病理观察人员检查计算出的生物反应性水平。病理学观察人员可根据所有因素(例如相对大小、反应模式、炎症与消退)的观察结果，修正生物反应性评定值。在陈述式报告(一种由病理学观察人员提出的有关试验材料生物相容性的说明性陈述式报告)中提供评定值修正的理由。
6.8.3.2结果
结果表明，当与阳性对照氧化纤维素相比时，在植入4周时试验品无反应性(生物反应性评定值0.2)；当与阴性对照高密度聚乙烯(阴性对照塑料)比较时，无反应性(生物反应性评定值0.0)。
临床观察。下表XI显示试验品和对照植入部位的宏观评价结果，说明在4周时间内无显著炎症征兆、囊化、出血、坏死或变色。未对一些试验部位和大多数阳性对照氧化纤维素进行宏观观察，提供系列切片用于显微评价。
表XI：
宏观观察结果
4周植入
动物编号：60959
动物编号：60961
动物编号：60968
T＝试验部位(提交代表性切片用于显微评价)
C1＝氧化纤维素(由于该材料的性质所致，提交代表性切片用于显微评价)
C2＝阴性对照高密度聚乙烯(阴性对照塑料)
评分尺度
0＝无反应 2＝中等反应 NSF＝未发现部位
1＝轻微反应 3＝明显反应 N/A＝不适用
植入部位观察资料(显微)。下表XII显示试验品植入部位显微评价的结果，表明与各对照品部位相比无显著炎症征兆、纤维变性、出血、坏死或变性。4周期间的生物反应性评定值(平均3只动物)为0.2(C1–氧化纤维素)和0.0(C2–阴性对照塑料)，表明了与任一个对照植入部位相比都无反应。病理学家注意到，原位试验品周围有中度的多形和组织细胞(巨噬细胞)浸润，鉴于试验材料的性质这是未曾预料到的。
表XII：
显微观察结果
4周植入
动物编号：60959
T＝试验部位
C1＝氧化纤维素
C2＝阴性对照高密度聚乙烯(阴性对照塑料)
动物试验评分(平均值*)＝2.0
动物C1评分(平均值*)＝1.5
动物C2评分(平均值*)＝1.4
动物评分(平均试验评分-平均C1评分)＝0.5
动物评分(平均试验评分-平均C2评分)＝0.6
*用于生物反应性评定值的计算
**T4中不存在部位
表XII：
显微观察结果(续表)
4周植入
动物编号：60961
T＝试验部位
C1＝氧化纤维素
C2＝阴性对照高密度聚乙烯(阴性对照塑料)
动物试验评分(平均值*)＝1.8
动物C1评分(平均值*)＝2.2
动物C2评分(平均值*)＝2.5
动物评分(平均试验评分-平均C1评分)＝-0.4
动物评分(平均试验评分-平均C2评分)＝-0.7
*用于生物反应性评定值的计算
**T2、C1-2和C2-4中不存在部位。
表XII：
显微观察结果(续表)
4周植入
动物编号：60968
T＝试验部位
C1＝氧化纤维素
C2＝阴性对照高密度聚乙烯(阴性对照塑料)
动物试验评分(平均值*)＝2.3
动物C1评分(平均值*)＝1.8
动物C2评分(平均值*)＝2.4
动物评分(平均试验评分-平均C1评分)＝0.5
动物评分(平均试验评分-平均C2评分)＝-0.1
*用于生物反应性评定值的计算
**C1-4中不存在部位。
6.8.4皮内注射试验–ISO 10993-10
针对其在New Zealand白兔中皮下注射后产生刺激的潜力，对注射用USP 0.9％氯化钠(NaCl)和试验品的棉籽油(CSO)提取物进行了评价。与注射对照品的部位相比，试验品部位不显示显著较大的生物反应。根据该方案的标准，试验品被视为无足轻重的刺激物，并符合ISO 10993-10准则的要求。结果见下表XIII。
表XIII:
皮内试验皮肤反应评分
NaCl提取物
＝恰在注射后，未用于评价标准。
试验品的总平均分*＝0.0
对照品总平均分*＝0.0
试验品和对照品总平均分之间的差异＝0.0–0.0＝0.0
CSO提取物
＝恰在注射后，未用于评价标准。
试验品的总平均分*＝0.0
对照品的总平均分*＝0.0
试验品和对照品总平均分之间的差异＝0.0–0.0＝0.0
ER＝红斑；ED＝水肿；T＝试验部位；C＝对照部位
*总平均分＝红斑加水肿总分除以12
(2只动物x 3个得分时期x 2个得分类别)
Kligman最大化试验–ISO 10993-10
注射用UPS 0.9％氯化钠(NaCl)和试验品的棉籽油(CSO)提取物在激发(0％敏化)时、在诱导期后在Hartley豚鼠中不引起真皮内反应。因此，如Kligman得分系统的规定，这是I级反应，试验品被归类为具有弱的变态反应潜力。根据该方案的标准，I级敏化率不视为显著，试验品符合ISO10993-10准则的要求。结果见下表XIV。
表XIV:
皮肤检查数据
根据所观察到的敏化百分比解释试验结果。
7.通过引用予以结合
本说明书引用的全部出版物、专利和专利申请均通过引用结合到本文中，正如各个出版物或专利申请具体而单独指明通过引用予以结合一样。虽然为了清楚理解起见，通过实例和实施例以某些细节描述前面的发明，但是根据本发明的教导，本领域普通技术人员将易于明白的是，可对之进行某些改变和修改而又不偏离随附权利要求书的精神或范围。

Claims (29)

1.一种用于治疗对象的细菌感染的方法，所述方法包括：
将包含sNAG纳米纤维的组合物局部给予被诊断患有细菌感染或出现细菌感染的一种或多种症状的对象，
其中超过50％的sNAG纳米纤维的长度介于约1至15μm之间，
其中所述sNAG纳米纤维体外对金黄色葡萄球菌细菌培养物的细菌生长或存活不起作用，和
其中所述sNAG纳米纤维当在肌内植入试验中测试时不起反应。
2.权利要求1的方法，其中所述感染是皮肤感染、胃肠感染、呼吸道感染、尿路感染或生殖道感染。
3.一种用于治疗与对象的细菌感染或细菌失衡有关的疾病的方法，所述方法包括：
将包含sNAG纳米纤维的组合物局部给予被诊断患有与细菌感染或细胞失衡相关的疾病或出现与细菌感染或细胞失衡相关的疾病的一种或多种症状的对象，
其中超过50％的sNAG纳米纤维的长度介于约1至15μm之间，
其中所述sNAG纳米纤维体外对金黄色葡萄球菌细菌培养物的细菌生长或存活不起作用，和
其中所述sNAG纳米纤维当在肌内植入试验中测试时不起反应。
4.权利要求3的方法，其中所述疾病与细菌感染有关。
5.权利要求3或4的方法，其中所述疾病为皮肤疾病或胃肠道疾病。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述感染是医院内感染。
7.一种用于预防细菌感染相关疾病的方法，所述方法包括：
将包含sNAG纳米纤维的组合物局部给予对象，
其中超过50％的sNAG纳米纤维的长度介于约1至15μm之间，
其中所述sNAG纳米纤维体外对金黄色葡萄球菌细菌培养物的细菌生长或存活不起作用，和
其中所述sNAG纳米纤维当在肌内植入试验中测试时不起反应。
8.权利要求7的方法，其中所述对象带有伤口或进行过手术。
9.一种用于治疗对象的被细菌感染的伤口的方法，所述方法包括：
将包含sNAG纳米纤维的组合物局部给予被诊断患有细菌感染或出现细菌感染的一种或多种症状的对象的伤口部位，
其中超过50％的sNAG纳米纤维的长度介于约1和15μm之间，
其中所述sNAG纳米纤维体外对金黄色葡萄球菌细菌培养物的细菌生长或存活不起作用，和
其中所述sNAG纳米纤维当在肌内植入试验中测试时不起反应。
10.权利要求9的方法，其中所述伤口是开放性伤口。
11.权利要求10的方法，其中所述开放性伤口是枪弹伤、刺伤、撕裂伤、割伤、擦伤、贯通伤或手术创伤。
12.权利要求11的方法，其中所述伤口是刺伤，其中所述刺伤由血液透析术或导管插入术造成，且其中人类对象被诊断患有血液透析相关感染或导管插入相关感染。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述感染具有一种或多种下列菌种的细菌：炭疽芽孢杆菌、百日咳鲍特氏菌、布氏疏螺旋体、流产布鲁氏菌、狗布鲁氏菌、马耳他布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、空肠弯曲杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、白喉棒杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌、流感嗜血菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、肺炎性钩端螺旋体、问号钩端螺旋体、单核细胞增生李斯特氏菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、肺炎枝原体、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、铜绿假单胞菌、奇异变形菌、立氏立克次氏体、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、非解乳糖链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、苍白密螺旋体、霍乱弧菌和鼠疫耶尔森氏菌。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述细菌对标准抗生素疗法有抗性。
15.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述感染是MRSA感染、假单胞菌感染或艰难梭菌感染。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述对象是人。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中将所述sNAG纳米纤维配制成乳膏剂、凝胶剂、软膏剂、膜、粉剂、喷雾剂或栓剂。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述组合物包含一种或多种其它抗菌剂。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述组合物与一种或多种抗菌剂联合给予。
20.权利要求18或19的方法，其中所述抗菌剂是抗生素。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中超过50％的sNAG纳米纤维的长度介于约2-10μm之间。
22.权利要求1-20中任一项的方法，其中超过50％的sNAG纳米纤维的长度介于约4-7μm之间。
23.权利要求1-20中任一项的方法，其中100％的sNAG纳米纤维的长度介于约1至15μm之间。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述sNAG纳米纤维通过γ辐射聚-N-乙酰葡萄糖胺或其衍生物而产生，且其中以500-2,000kgy照射呈干燥纤维形式的聚-N-乙酰葡萄糖胺或其衍生物，或以100-500kgy照射呈湿纤维形式的聚-β-N-乙酰葡萄糖胺或其衍生物。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述sNAG纳米纤维自微藻聚-N-乙酰葡萄糖胺产生。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述sNAG纳米纤维包含N-乙酰葡萄糖胺单糖和/或葡萄糖胺单糖，且其中超过70％的sNAG纳米纤维的单糖是N-乙酰葡萄糖胺单糖。
27.一种包含sNAG纳米纤维和抗生素的组合物，
其中超过50％的sNAG纳米纤维的长度介于约1至15μm之间，
其中所述sNAG纳米纤维体外对金黄色葡萄球菌细菌培养物的细菌生长或存活不起作用，和
其中所述sNAG纳米纤维当在肌内植入试验中测试时不起反应。
28.权利要求27的组合物，其中所述抗生素是来自下列抗生素类之一的抗生素：大环内酯类(例如红霉素、阿奇霉素)、氨基糖苷类(例如阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素)、头孢菌素类(例如头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢噻肟、头孢吡肟)、氟喹诺酮类(例如环丙沙星、左氧氟沙星)、青霉素类(例如青霉素、氨苄西林、阿莫西林)、四环素类(例如四环素、多西环素)和碳青霉烯类(例如美罗培南、亚胺培南)。
29.一种包含sNAG纳米纤维和锌的组合物，
其中超过50％的sNAG纳米纤维的长度介于约1至15μm之间，
其中所述sNAG纳米纤维体外对金黄色葡萄球菌细菌培养物的细菌生长或存活不起作用，和
其中所述sNAG纳米纤维当在肌内植入试验中测试时不起反应。
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