CN108272792B - 一种抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜的组合物，属于微生物技术领域。所述的组合物为黄芩素和抗细菌药物，所述的抗细菌药物为利奈唑胺。本发明组合物联合产生的协同作用，既提高了药物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌效果，又降低了抗细菌药物的使用剂量，进而降低毒副作用，是干预耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜相关感染的一种较为理想的药物组合物。

Description

一种抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜的组合物

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜的组合物以及其应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌是导致卫生保健相关感染和社区获得性感染的常见病原菌。在金黄色葡萄球菌所导致的医院获得性感染中，超过50%的感染菌株为MRSA。除了以直接感染的形式导致机体发生败血症、心内膜炎、化脓性骨髓炎和皮肤组织化脓性感染等之外，MRSA还可以通过在植入性医用生物材料表面定植并形成生物被膜，导致医用材料相关感染的发生。与浮游菌不同，生物被膜状态的菌体被自身分泌的黏稠包外基质包裹，使常规剂量的抗生素难以对其产生杀伤作用，同时得以逃避机体免疫系统的杀伤和清除。因此，临床上MRSA生物被膜所导致的医用材料相关感染治疗相对困难，感染持续且容易复发，多数情况下往往需要通过各种侵入性手段移除形成了生物被膜的植入物（如气管导管、中心静脉置管、人工心

脏瓣膜或人工关节等），甚至需要进行组织器官的摘除。因此，寻找有效干预MRSA体内生物被膜感染的药物或方法是当前临床医源性感染防治工作的迫切需要，也是抗感染领域研究的热点之一。

发明内容

本发明的目的是为了解决日益严峻的金黄色葡萄球菌，抑制金黄色葡萄球菌引起的细菌感染，提供一种抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜的组合物及其应用。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜的组合物，所述的组合物为黄芩素和抗细菌药物。

优选的，所述的抗细菌药物为利奈唑胺。

优选的，所述的组合物为黄芩素和利奈唑胺；所述黄芩素使用浓度为25-200 mg/kg.d，所述利奈唑胺的浓度为40-100 mg/kg.d，用法为：每日总剂量分2-3次使用。

优选的，所述的黄芩素需先预处理，将其溶解于100%无菌二甲基亚砜中。

优选的，所述组合物预先制备成储存液，所述黄芩素配制成浓度为100-150mg/mL的储存液，利奈唑胺配制成浓度为70-90mg/mL的储存液。

优选的，所述组合物作用时间为1-7天。

优选的，所述黄芩素：抗细菌药物体积比为1：0.5-2。

本发明还提供所述组合物在预防或抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物中的应用。

本发明进一步提供所述组合物在预防或抑制耐头孢菌素金黄色葡萄球菌、耐万古霉素金黄色葡萄球菌、万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌的药物中的应用。

高浓度的抗生素可能是治疗BF相关感染所必需的，然而，研究报道利奈唑胺具有严重的副作用，包括依赖于线粒体浓度的血小板减少症和贫血等。结合我们的初期研究中，不同利奈唑胺浓度干预MRSA-BF的结果：高剂量药物干预组死亡率较高，易出现骨髓抑制等药物副作用，而低剂量药物干预组疗效差，所以我们选择了一种更合适的药物剂量组合，不仅可以提高疗效，还可以降低不良反应的风险。同时，通过本发明研究我们选择合适的黄芩素的给药方式、剂量。

本发明的有益效果为：在本发明中，由于医用硅胶片载体在体外培养3天，植入前已经通过SEM观察已经确定形成早期的生物膜，然后植入到SD大鼠背部空气囊袋中。黄芩素联合利奈唑胺组为观察到SD大鼠明显的死亡率。肉眼观察SD大鼠背部空气囊袋炎症病灶的改变与载体表面BF内活菌计数结果一致，联合组与其他干预组相比，其对MRSA-BF的体内抗菌作用最为显着。随着干预时间的延长，其协同作用会持续增强。SEM结果也显示联合组的协同作用最明显。黄芩素联合利奈唑胺的协同作用对载体相关性早期MRSA-BF感染具有重要意义。

药物干预2天后，效果最为明显。经过3天的干预后，SEM几乎没有观察到细菌和生物膜的形态，所以我们考虑观察联合组协同作用的最佳时机是在药物干预2天后。当然，这不能排除大鼠自身防御系统同时对MRSA-BF感染起了一定的吞噬清除作用。

综上所述，本研究中通过建立载体体外培养MRSA-BF3天后植入SD大鼠背部空气囊袋模型，成功的对SD大鼠进行了药物干预，并得出黄芩素联合利奈唑胺对MRSA-BF感染有明显的协同抗菌作用。本实验比较好的模拟了临床生物材料或导管相关BF感染，这为医疗生物材料相关性MRSA-BF感染防范措施的制定提供了一个理想的方向，为开发新的抗MRSA-BF药物提供了研究基础。

附图说明

图1是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋MRSA-BF感染载体周围组织空白对照组48h结果。

图2 是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋MRSA-BF感染载体周围组织利奈唑胺组48h结果。

图3是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋MRSA-BF感染载体周围组织黄芩素组48h结果。

图4是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋MRSA-BF感染载体周围组织黄芩素联合利奈唑胺组48h结果。

图5是实施例2黄芩素联合利奈唑胺对SD大鼠体内MRSA-BF感染载体表面BF干预1天后内活菌计数结果。

图6是实施例2黄芩素联合利奈唑胺对SD大鼠体内MRSA-BF感染载体表面BF干预2天后内活菌计数结果。

图7是实施例2黄芩素联合利奈唑胺对SD大鼠体内MRSA-BF感染载体表面BF干预3天后内活菌计数结果。

图8是实施例2黄芩素联合利奈唑胺对SD大鼠体内MRSA-BF感染载体表面BF干预后CFU的下降趋势结果。

图9是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织空白组1天的HE染色结果。

图10是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织空白组2天的HE染色结果。

图11是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织空白组3天的HE染色结果。

图12是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织利奈唑胺组干预1天的HE染色结果。

图13是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织利奈唑胺组干预2天的HE染色结果。

图14是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织利奈唑胺组干预3天的HE染色结果。

图15是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织黄芩素组干预1天的HE染色结果。

图16是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织黄芩素组干预2天的HE染色结果。

图17是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织黄芩素组干预3天的HE染色结果。

图18是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织黄芩素和利奈唑胺组干预1天的HE染色结果。

图19是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织黄芩素和利奈唑胺组干预2天的HE染色结果。

图20是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织黄芩素和利奈唑胺组干预3天的HE染色结果。

图21是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织空白组1天的SEM结果。

图22是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织空白组2天的SEM结果。

图23是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织空白组3天的SEM结果。

图24是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织利奈唑胺组干预1天的SEM结果。

图25是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织利奈唑胺组干预2天的SEM结果。

图26是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织利奈唑胺组干预3天的SEM结果。

图27是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织黄芩素组干预1天的SEM结果。

图28是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织黄芩素组干预2天的SEM结果。

图29是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织黄芩素组干预3天的SEM结果。

图30是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织黄芩素和利奈唑胺组干预1天的SEM结果。

图31是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织黄芩素和利奈唑胺组干预2天的SEM结果。

图32是实施例2 SD大鼠背部空气囊袋组织黄芩素和利奈唑胺组干预3天的SEM结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1 抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜组合物试验

材料和试剂：

一、载体：

医用硅胶片（1cm²）

二、实验菌株：

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）标准菌株：ATCC29213（广西医科大学第一附属医院检验科微生物室提供）

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）临床分离菌株：MRSA 17546（t037）（广西医科大学第一附属医院检验科微生物室鉴定并提供）。

三、主要试剂及药物

LB琼脂、LB肉汤(Sigma公司)；无水乙醇，75%乙醇，氯化钠（国产分析纯）；水合氯醛(国产分析纯)；戊二醛(Sigma公司)，黄芩素(Sigma公司)，利奈唑胺(Sigma公司)，福尔马林(国产分析纯)，二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）。

四、主要仪器及器械

S-800电子扫描显微镜(SEM，日本HITACHI)

恒温摇晃培养箱(中国科学院武汉科学仪器厂)

SPX型智能生化培养箱(宁波江南仪器厂)

高压蒸汽灭菌锅(SS．325，日本TOMY)

台式低温高速离心机(5410R，德国EPPENDOF)

旋涡混合仪(广州仪科实验室技术有限公司)

电子分析天平(PB602--N，上海)

12孔板(BIOFIL公司)

超声震荡清洗机（03—2500 S-MTH必能信超声(上海)有限公司）

手术刀(尖)、碘伏、镊子、组织剪、4号缝合线、一次性注射器

实验方法如下：

一、医用硅胶片的准备：

通过打孔器，将医用硅胶片制成1cm²大小的圆片状，用高压蒸汽灭菌锅高压灭菌备用。

二、实验菌株的准备：

取出-80℃保存的MRSA(17546)菌种，复苏后，接种到LB琼脂平板37℃培养18小时，挑取新鲜培养的MRSA单个菌落，移入20ml的LB培养液中(50ml无菌试管)，37℃恒温摇床培养，250rpm，18小时至20小时后，将菌液离心(5000g×3分钟，共3次)。然后将菌液用LB液稀

释到10⁷CFU/mL，备用。

三、实验药物的准备：

黄芩素用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配成终浓度为130mg/mL备用；利奈唑胺用DMSO溶解，配成终浓度为80mg/mL，备用。

四、实验动物准备：

从广西医科大学实验动物中心购置6-8周龄的雄性SD大鼠，体重约200g-250g。进行实验前，SD大鼠在温度20℃至24℃和湿度在5%至60%环境下，给予标准鼠粮，自由饮水和饮食，12小时的明暗周期交替，分笼饲养观察一周。所有的动物研究和实验方案均得到了广西医

科大学动物管理和使用委员会的批准。

五、载体体外培养MRSA-BF3天后，植入SD大鼠背部空气囊袋模型的建立：

1. 用宠物剃毛器剃掉背部肩胛区域毛发后，使用21号的注射器针头将10ml无菌空气皮下注射到此区域内，从而形成空气囊袋。

2. 在12孔板中每孔加入菌液2ml，同时每孔置入无菌医用硅胶载体一个，37℃静止培养24小时后换液，以后隔天换液。3天形成早期MRSA-BF。载体植入SD大鼠背部肩胛区空气囊袋前，取6片进行载

体表面细菌计数。

3. 予SD大鼠10％水合氯醛（0.1mL/100g）腹腔内注射，致其处于麻醉状态。使用碘伏在SD大鼠背部肩胛区空气囊袋处消毒2遍，在消毒处做1cm长的切口，逐层暴露SD大鼠皮肤以及皮下组织，暴露至空气囊袋空腔，置入带有MRSA-BF的载体。切口用4号丝线缝合。载

体置入完成后，用碘伏在SD大鼠手术切口处消毒2遍。

六、实验动物分组和处置：

1. 将SD大鼠随机分成四组，每组24只。空白对照组：DMSO，0.15mL/次，q12h，i.p.；单药干预组：利奈唑胺组：40mg/Kg/q12h，i.p.[42]；黄芩素组：100mg/Kg/q12h，i.p.；联合干预组：黄芩素100mg/Kg/q12h，i.p.+利奈唑胺40mg/Kg/q12h，i.p.。（利奈唑胺合适

的干预剂量的选择见附录图3-9）。

2. 载体植入SD大鼠背部空气囊袋后，立即开始给药，持续给药3天。给药后第1d、2d、3d，各组分别取6只SD大鼠背部空气囊袋内载体进行载体表面细菌计数，2只SD大鼠背部空气囊袋内载体行SEM观察载体表面MRSA-BF情况。实验结束时用10％水合氯醛1mL/100g腹

腔注射处死实验动物。

七、运用光学显微镜对空气囊袋组织苏木精和伊红染色

（haematoxylin and eosin, HE染色）进行病理图像分析：予SD大鼠10％水合氯醛（0.1mL/100g）腹腔内注射，致其处于麻醉状态。完整剥离背部囊袋，取囊袋部分组织，用10％福尔马林固定，然后包埋在石蜡块中。切片用苏木精和HE染色。组织炎症程度根据光学显微镜下观察的炎症浸润细胞种类（嗜中性粒细胞，巨噬细胞，淋巴细胞）和数量进行评分（0级：未检测到；1级：最小程度；2级：轻度；3级：中度；4级：严重）。

八、运用SEM观察载体表面MRSA-BF

1．予SD大鼠10％水合氯醛（0.1mL/100g）腹腔内注射，致其处于麻醉状态。消毒并切开囊袋约1cm长，取囊袋内载体，灭菌生理盐水冲洗去掉组织上的浮游菌；

2．2.5%戊二醛固定；

3．PH7.4的PBS漂洗3次；

4．30%乙醇浸泡，25min；

5．50%乙醇浸泡，25min；

6．70%乙醇浸泡，20min；

7．80%乙醇浸泡，20min；

8．90%乙醇浸泡，20min；

9．100%乙醇浸泡脱水3次，第一次和第二次均为20min，第三

次为25min；

10．真空条件下镀金粉，在SEM下观察。

九、统计学方法：数据使用SPSS 20进行分析组间差异采用方差

分析(ANOVA)进行评估，并且用平均值±标准差(SD)表示。P <0.05

认为有统计学意义。

实施例2 药物组合物试验结果

一、SD大鼠背部空气囊袋MRSA-BF感染载体周围组织肉眼观：

肉眼观：如图1至图4所示（MRSA-BF感染后48小时），感染模型建立后随着感染时间延长，空白对照组囊袋壁炎性渗出液逐渐增多，但各干预组渗出液均少于空白对照组，尤其是在黄芩素联合利奈唑胺干预组中，囊袋壁几乎没有渗出。

二、黄芩素联合利奈唑胺对SD大鼠体内MRSA-BF感染载体表面BF内活菌计数的协同作用：

空白对照组，利奈唑胺组，黄芩素组和黄芩素联合利奈唑胺大鼠体内载体表面BF内活菌数，在干预1天后CFU（lg10）分别为6.42±0.49，5.63±0.53，5.31±0.28和5.00±0.60（图5）；在干预2天后CFU（lg10）分别为5.96±0.41，5.09±0.47，4.54±0.80和3.26±0.48（图6）；在干预3天后CFU（lg10）分别为5.21±1.09，4.19±0.56，4.11±0.42和2.32±1.79（图7）。在药物干预后第1天，黄芩素联合利奈唑胺组的菌落数明显低于利奈唑胺组（P<0.05），而与黄芩素组相比则无明显变化（P> 0.05）。干预后2天和3天后，与空白对照组相比，利奈唑胺组，黄芩素组和黄芩素联合利奈唑胺组载体表面BF内活菌计数CFU均有减少（𝑃<0.05），尤其是联合组CFU显著低于其它任何一个干预组（P<0.05）（图8）。这些CFU结果显示黄芩素联合利奈唑胺对MRSA-BF有协同杀菌作用。

三、黄芩素联合利奈唑胺对SD大鼠MRSA-BF感染空气囊袋组

织病理学图像分析：

SD大鼠背部空气囊袋组织HE染色，如图9至图20所示。空白对照组中，背部囊袋组织感染早期HE染色可见大量的炎症细胞，如嗜中性粒细胞和巨噬细胞，坏死和脓肿；随着感染时间的延长，空白对照组的炎症细胞越来越多，感染中晚期可见较多淋巴细胞、泡沫细胞，炎症分级为重度。利奈唑胺组和黄芩素组囊袋组织HE染色结果显示可见较多炎症细胞，但较空白对照组仍有较明显的减少，炎症分级为中-轻度。然而，黄芩素联合利奈唑胺组囊袋组织HE染色显示，随着干预时间的延长，炎症细胞明显减少，见极少的嗜中性粒细胞，炎症分级为轻-极轻度。这些组织学结果表明，单药干预组（黄芩素组和利奈唑胺组）可轻度减轻炎症反应，黄芩素联合利奈唑胺可协同抑制MRSA-BF感染相关的炎症反应，组织病理学的结果与CFU结果一致。

四、黄芩素联合利奈唑胺对SD大鼠MRSA-BF感染干预后，载体SEM观察的形态学分析：

SD大鼠背部空气囊袋内载体SEM观察的形态学，如图21至图32所示。空白对照组中，载体表面可见粘附的细菌聚集的微菌落，少许游离的细菌；随着感染时间的延长，空白对照组的载体表面可见较多纤维渗出、粘液包裹菌落。利奈唑胺组和黄芩素组载体表面SEM显示仍可见纤维渗出物包裹的结构，较少粘附聚集的菌落，可见红细胞或白细胞。然而，黄芩素联合利奈唑胺组载体表面SEM显示，随着干预时间的延长，生物膜结构密度显著的变稀疏，可见极少的MRSA菌落，较其他干预组明显减少，偶可见白细胞。这些载体表面SEM观察的形态学结果表明，黄芩素联合利奈唑胺可协同抑制MRSA-BF感染相关的炎症反应。SEM观察的载体表面BF形态学改变的结果与组织病理学图像分析的结果及载体表面菌落CFU结果一致。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。

Claims (7)

1.一种抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜的组合物，其特征在于，所述的组合物由黄芩素和抗细菌药物组成；所述的抗细菌药物为利奈唑胺；所述组合物预先制备成储存液，所述黄芩素配制成浓度为100-150mg/mL的储存液，利奈唑胺配制成浓度为70-90mg/mL的储存液。

2.根据权利要求1所述的抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜的组合物，其特征在于，所述的组合物由黄芩素和利奈唑胺组成；所述黄芩素使用剂量为25-200 mg/kg.d，所述利奈唑胺的剂量为40-100 mg/kg.d，用法为：每日总剂量分2-3次使用。

3.根据权利要求1所述的抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜的组合物，其特征在于，所述的黄芩素需先预处理，将其溶解于100%无菌二甲基亚砜中。

4.根据权利要求1或2所述的抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜的组合物，其特征在于，所述组合物作用时间为1-7天。

5.根据权利要求1所述的抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜的组合物，其特征在于，所述黄芩素：抗细菌药物体积比为1：0.5-2。

6.根据权利要求1-5任意一项所述组合物在制备预防或抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物中的应用。

7.根据权利要求1-5任意一项所述组合物在制备预防或抑制耐头孢菌素金黄色葡萄球菌、耐万古霉素金黄色葡萄球菌、万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌的药物中的应用。

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