CN115919830A

CN115919830A - 尼泊金丁酯在增效多黏菌素类药物抗菌活性中的应用

Info

Publication number: CN115919830A
Application number: CN202211507164.4A
Authority: CN
Inventors: 代重山; 沈建忠; 汤树生
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-11-29
Filing date: 2022-11-29
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明公开了尼泊金丁酯在制备增强多黏菌素抗细菌感染效力的药物中的用途，以及尼泊金丁酯和多黏菌素的组合物在制备抗细菌感染效力增强的药物中的用途，所述多黏菌素优选为多黏菌素E。本发明不仅通过棋盘法最小抑菌浓度试验、体外细菌生长曲线证明尼泊金丁酯协同增效多黏菌素的抗菌活性，同时利用小鼠创伤感染模型证实了尼泊金丁酯可以有效增强多黏菌素以及在体内的有效性。本发明提供的尼泊金丁酯在增效多黏菌素类抗生素抗菌活性中的新用途，可解决多黏菌素临床耐药性和治疗指数低等技术问题。

Description

尼泊金丁酯在增效多黏菌素类药物抗菌活性中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及尼泊金丁酯在增效多黏菌素类抗生素抗菌活性中的应用。

背景技术

多黏菌素类(polymyxins)抗菌药物是一类由多黏芽孢杆菌变种代谢所产生的碱性多肽类抗生素，主要包括多黏菌素A、B、C、D和E五种，其中多黏菌素B和E可应用于临床。多黏菌素E，也被称为黏菌素，在上个世纪40年代末由日本科学家首次发现，对革兰氏阴性菌具有极强的抗菌作用，且不易产生耐药。在20世纪60年代，日本和欧美等国家将黏菌素和多黏菌素B应用于临床，但由于明显的临床肾毒性及神经毒性，至80年代逐渐被“毒性较低”的氨基糖苷类所取代。2000年后，因多重耐药大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等革兰氏阴性“超级细菌”的出现，多黏菌素类抗菌药物被重新应用于临床。随着耐药性在全球加速传播，导致多黏菌素类抗菌药物(主要为多黏菌素B和多黏菌素E)已成为临床治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的首要选择，甚至被认为是“最后的防线”。其中，多黏菌素B和多黏菌素E在抗菌活性和抗菌谱上无明显差异，主要不同之处在于临床毒副作用的差异，但导致这种差异的具体机制尚不清楚。目前，含有硫酸多黏菌素B的复方软膏已被人医临床批准使用治疗外伤感染，注射用硫酸多粘菌素B主要应用于绿脓杆菌及其他假单胞菌引起的创面、尿路以及眼、耳、气管等部位感染，也可用于败血症、腹膜炎。2021年10月，多黏菌素E甲磺酸盐首次在中国获批上市。多黏菌素E硫酸盐在我国兽医领域已被广泛使用。

近年来，由于多黏菌素耐药基因(MCR)的出现，导致临床多黏菌素的治疗输出显著降低，严重危险这一重要抗菌药物的使用寿命。因此，开发有效的多黏菌素增效剂，不仅可以增加临床的治疗效果，还可以降低细菌耐药性的发生率，同时还可以降低多黏菌素的使用剂量，从而降低临床毒性作用的发生。因此，基于黏菌素的联合给药，已成为挽救这一重要抗菌药物使用寿命的重要手段之一。

尼泊金丁酯，又称对羟基苯甲酸丁酯，属对羟基苯甲酸酯类物质，白色结晶，微有特殊气味，溶于醇、醚和氯仿，难溶于水，口尝时有麻舌感。可作为有机合成中间体。尼泊金丁酯外用安全性极高，已被广泛作为杀菌防腐添加剂应用于医药、食品、化妆品、胶片以及高档产品领域。对大鼠、兔、狗、猫等的研究表明，对尼泊金酯类物质可经胃肠道吸收，可以在体内迅速代谢，无论是尼泊金酯类物质或其代谢产物均不在体内蓄积。尼泊金酯类的急性毒性为微毒，尼泊金丁酯皮下注射的半数致死量为16g/kg。目前，尚无关于尼泊金丁酯作为抗菌增效剂的报道。

虽然现有技术已经公开了多黏菌素联用其他抗菌药物，但大多数成药性很差，本发明不仅提供了尼泊金丁酯和多黏菌素的联用细胞水平的协同增效实验，还进一步提供动物水平实验证实其较好的协同杀菌效果。本发明在临床治疗革兰氏阴性细菌感染，特别是耐黏菌素的多重耐药细菌感染方面具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种尼泊金丁酯的药物新用途。

本发明所提供的尼泊金丁酯的药物新用途是其在制备增强多黏菌素类抗菌药物抑菌活性和/或杀菌活性的产品中的应用。

进一步的，所述产品可为多黏菌素类抗菌药物增效剂或抗细菌感染性疾病的药物。

进一步的，所述多黏菌素选自下述至少一种：1)黏菌素(即多黏菌素E)或其药学上可接受的盐(如硫酸多黏菌素E)；2)多黏菌素B或其药学上可接受的盐(如硫酸多黏菌素B)。

进一步的，所述细菌感染性包括产MCR的耐药性细菌感染。

进一步的，所述抑菌活性和/或杀菌活性为对下述至少一种病原菌具有抑制和/或杀灭作用：1、革兰氏阴性细菌；2、变形菌门细菌；3、γ-变形菌纲细菌；4、肠杆菌目细菌或假单胞菌目细菌；5、肠杆菌科细菌或假单胞菌科细菌；6、埃希氏菌属细菌或克雷伯氏菌属细菌或假单胞菌属细菌；7、大肠埃希菌或肺炎克雷伯杆菌或铜绿假单胞菌；8、携带MCR-1基因的大肠埃希菌或携带MCR-1基因的肺炎克雷伯杆菌。

本发明的另一个目的是提供一种抗菌组合物。

本发明所提供的所述抗菌组合物，包括尼泊金丁酯和多黏菌素类抗菌药物。

进一步的，所述尼泊金丁酯与多黏菌素的质量比为(20～1280):1；具体如(20～80):1或(80～640):1或(160～1280):1，更具体如20:1、80:1、160:1、640:1或1280:1。

上述抗菌组合物中，所述抗菌组合物的活性成分可以仅为尼泊金丁酯和所述多黏菌素类抗菌药物；也可以进一步包括其它活性成分，其它活性成分本领域技术人员可根据抗菌效果确定。

上述组合物可对下述至少一种病原菌具有杀灭和/或抑制作用：1、革兰氏阴性细菌；2、变形菌门细菌；3、γ-变形菌纲细菌；4、肠杆菌目细菌或假单胞菌目细菌；5、肠杆菌科细菌或假单胞菌科细菌；6、埃希氏菌属细菌或克雷伯氏菌属细菌或假单胞菌属细菌；7、大肠埃希菌或肺炎克雷伯杆菌或铜绿假单胞菌；8、携带MCR-1基因的大肠埃希菌或携带MCR-1基因的肺炎克雷伯杆菌。

此外，含有上述抗菌组合物的抗菌产品也属于本发明的保护范围。

上述抗菌产品剂型可为下述任意一种：片剂、乳膏、胶囊、缓释片、控释片、口服液、糖浆、滴丸、注射液剂型、冻干粉针剂型。

本发明通过棋盘法最小抑菌浓度试验、体外细菌生长曲线和动物试验证明尼泊金丁酯能够增效多黏菌素的抗菌活性，同时能够恢复多黏菌素E对MCR阳性菌的敏感性，试验中的细菌包括耐多黏菌素的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和对多黏菌素敏感的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌。

本发明为尼泊金丁酯与多黏菌素联合用药开辟了一种新用途，作为多黏菌素类抗菌药物的增效剂，可降低多黏菌素类抗生素的用药剂量，从而减轻了药物的毒副作用。在有效治疗细菌感染特别是产MCR的耐药性细菌感染，具有重要的临床应用价值。

附图说明

图1为多黏菌素E、尼泊金丁酯单独及联合使用对大肠杆菌B2(E.coli B2)的体外杀菌曲线；

图2为多黏菌素E、尼泊金丁酯单独及联合使用对大肠杆菌25922(E.coliATCC25922)的体外杀菌曲线；

图3为多黏菌素E、尼泊金丁酯单独及联合使用对小鼠皮肤伤口感染大肠杆菌B2(E.coli B2)的治疗效果评价。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

下述尼泊金丁酯购买自成都瑞芬思公司，纯度≥99％。尼泊金丁酯使用二甲基亚砜(DMSO，溶剂)配置成尼泊金丁酯浓度为80mg/mL的尼泊金丁酯母液，-20℃冰箱保存备用。

下述硫酸多黏菌素E(也叫硫酸黏菌素)购买自阿拉丁试剂公司，效价≥19000U/mg黏菌素。以无菌水为溶剂，溶解硫酸黏菌素，配置成硫酸黏菌素含量为32mg/mL的多黏菌素E母液，-20℃冰箱保存备用。

下述硫酸多黏菌素B购自阿拉丁试剂公司，效价大于等于6000U/mg。

下述试验中所用的病原菌：

大肠杆菌标准菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922(以下简称E.coli25922)购自中国兽医监察所菌种保存中心(中国兽医微生物菌种保藏管理中心)；

大肠杆菌E.coli B2(具体信息已在下列文献中记载：Song M,Liu Y,Huang X,Ding S,Wang Y,Shen J,Zhu K.A broad-spectrum antibiotic adjuvant reversesmultidrug-resistant Gram-negative pathogens.Nat Microbiol.2020Aug；5(8):1040-1050.)；

肺炎克雷伯菌K.pneumoniae 1202(ST11,KPC-2-producer)+pHNSHP45(mcr-1)、K.pneumoniae 1202(ST11,KPC-2-producer)(具体信息已在下列文献中记载：Liu YY,WangY,Walsh TR,Yi LX,Zhang R,Spencer J,Doi Y,Tian G,Dong B,Huang X,Yu LF,Gu D,RenH,Chen X,Lv L,He D,Zhou H,Liang Z,Liu JH,Shen J.Emergence of plasmid-mediatedcolistin resistance mechanism MCR-1in animals and human beings in China:amicrobiological and molecular biological study.Lancet Infect Dis.2016

Feb；16(2):161-8.)；

铜绿假单胞菌标准菌株ATCC15692购买自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

其中，K.pneumoniae 1202(ST11,KPC-2-producer)+pHNSHP45(mcr-1)、E.coli B2为含有mcr-1的耐多黏菌素细菌。K.pneumoniae 1202(ST11,KPC-2-producer)、ATCC15692为多黏菌素敏感菌。

公众可以从中国农业大学动物医学院兽药药理与毒理课题组获得以上生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

下述试验中使用细菌培养基：

MHB肉汤培养基购自北京陆桥技术股份有限公司，配制方法如下：称取25.0g于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，备用。

MHA培养基购自北京陆桥技术股份有限公司，配制方法如下：称取38.0g于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷至55℃倾注平板备用。

脑心浸液培养基(BHI)购自北京陆桥技术股份有限公司，配制方法如下：称取本品38.5g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH至7.3，121℃高压灭菌15分钟，备用。

BHI固体培养基购自北京路桥技术股份有限公司，配制方法如下：称取本品50.0g于1000mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌20min，冷却至55℃倾注平板备用。

实施例1、尼泊金丁酯和多黏菌素联合用药的协同抗菌活性评价

1、尼泊金丁酯和多黏菌素单独用药的抗菌活性最低抑菌浓度(MIC)的测定

按照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute,CLSI)的标准方法对菌株进行最小抑菌浓度实验，采用微量肉汤稀释法测定尼泊金丁酯和多黏菌E对菌株的MIC，具体实验方法如下：挑取细菌单菌落于BHI肉汤中，在37℃摇床培养细菌至对数生长期，用麦氏比浊仪调节菌液浓度至0.5麦氏浊度，并用MHB培养基稀释100倍(1.0x10⁶ CFUs/mL)后备用，用MHB培养基分别将尼泊金丁酯和多黏菌素倍比稀释10个浓度梯度，取100μL加入96孔U型板中，随后每孔加入100μL稀释好的待测菌液，最后，每孔尼泊金丁酯的药物终浓度分别为320μg/mL、160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL。多黏菌素B和多黏菌素E的最终药物浓度为16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL。对照组为只含有MHB培养基和含有待测菌液的阴性及阳性对照。加药后培养板放置37℃培养箱中恒温培养18h后观察结果，无菌生长的平皿中所含药物最小的浓度即为最低抑菌浓度(Minimal InhibitoryConcentration，MIC)。试验结果见表1。

表1尼泊金丁酯、多黏菌素E、多黏菌素B对各菌的MIC值(μg/mL)

由表1可知，尼泊金丁酯对所测试菌株E.coli 25922、E.coli B2、ATCC15692、K.pneumoniae 1202(ST11,KPC-2-producer)+pHNSHP45(mcr-1)、K.pneumoniae 1202(ST11,KPC-2-producer)的抗菌活性菌大于160μg/mL。多黏菌素B和多黏菌素E对上述细菌的MIC没有差异，对应的MIC分别为0.25μg/mL、8μg/mL、1μg/mL、8μg/mL、0.25μg/mL。

2、尼泊金丁酯和抗菌药物多黏菌素联合应用抑菌活性实验

尼泊金丁酯和抗菌药物多黏菌素联合应用对耐药菌的联合用药指数(FICI)测定：使用棋盘法测定尼泊金丁酯与抗菌药物联合应用对大肠杆菌标准菌株ATCC25922和产MCR-1大肠杆菌E.coli B2、肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae 1202(ST11,KPC-2-producer)+pHNSHP45(mcr-1)和K.pneumoniae 1202(ST11,KPC-2-producer)、铜绿假单胞菌ATCC15692的FICI值。具体操作如下：

抗菌药物多黏菌素E(作为甲药)和尼泊金丁酯(作为乙药)分别以各自的2MIC为最高浓度，以MHB肉汤培养基倍比稀释成8个浓度，分别沿96微孔培养板横轴、纵轴加入含有不同浓度两药的MH肉汤培养基50μL，然后分别加入各种病原菌菌液100μL，使最终病原菌含量为1×10⁶CFU/孔，37℃恒温培养18～24h，观察结果。记录两药分别单用和联用时各自的MIC，按下述公式计算FICI值(部分抑菌浓度指数)。

FICI＝MIC甲药联合/MIC甲药单用+MIC乙药联合/MIC乙药单用

判断标准：FICI≤0.5，协同作用；0.5＜FICI≤1，相加作用；1﹤FICI≤2，无关作用；FICI＞2，拮抗作用。即：尼泊金丁酯和多黏菌素E的FICI＝MIC(多黏菌素E联合)/MIC(多黏菌素E单用)+MIC(尼泊金丁酯联合)/MIC(尼泊金丁酯单用)。表2尼泊金丁酯与抗菌药物联合应用对大肠杆菌标准菌株ATCC25922、产MCR-1大肠杆菌E.coli B2、肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae 1202(ST11,KPC-2-producer)

+pHNSHP45(mcr-1)、K.pneumoniae 1202(ST11,KPC-2-producer)、铜绿假单胞菌

ATCC15692的FICI值

测定结果如表2所示：

尼泊金丁酯和多黏菌素E联合使用时对大肠杆菌ATCC 25922的MIC分别为40μg/mL、0.03125μg/mL，协同指数FICI为0.25。

尼泊金丁酯和多黏菌素E联合使用时对产MCR-1的肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae1202(ST11,KPC-2-producer)+pHNSHP45(mcr-1)的MIC分别为40μg/mL、0.25μg/mL，协同指数FICI为0.1875。

尼泊金丁酯和多黏菌素E联合使用时对K.pneumoniae 1202(ST11,KPC-2-producer)的MIC分别为40μg/mL、0.03125μg/mL，协同指数FICI为0.156。

尼泊金丁酯和多黏菌素E联合使用时对铜绿假单胞菌ATCC15692的MIC分别为40μg/mL、0.03125μg/mL，协同指数FICI为0.156。

尼泊金丁酯和多黏菌素E联合使用时对产MCR-1的大肠杆菌B2的MIC分别为40μg/mL、0.25μg/mL，协同指数FICI为0.156。

综上，尼泊金丁酯与多黏菌素E联用能够降低多黏菌素E对标准大肠杆菌E.coli25922和产MCR-1阳性大肠杆菌的MIC值8-32倍，降低多黏菌素E对肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae 1202(ST11,KPC-2-producer)和MCR-1阳性肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae1202(ST11,KPC-2-producer)+pHNSHP45(mcr-1)菌株的MIC值32-16倍，降低多黏菌素E对铜绿假单胞菌ATCC15692菌株的MIC值32倍，所有检测菌株FICI数值在0.156-0.25之间，表明尼泊金丁酯和多黏菌素E联合应用具有明显的协同抗菌作用。

实施例2、多黏菌素联合尼泊金丁酯联合使用的协同杀菌曲线

(1)针对大肠杆菌(E.coli)B2菌株，设4个处理进行平行实验，分别是对照组(Control)、多黏菌素E组(Colistin)、尼泊金丁酯(butylparaben)组和多黏菌素E(Colistin)联合尼泊金丁酯(butylparaben)处理组。这4个处理除了添加的药物不同外，其它操作均相同。具体分组如下：

对照组(Control)：首先将大肠杆菌E.coli B2于BHI肉汤培养基中培养6小时后，加入等体积的DMSO溶液(溶剂为BHI肉汤培养基)，使得培养体系中DMSO的含量为0.1％；

多黏菌素E组(Colistin)组：首先将大肠杆菌E.coli B2于BHI肉汤培养基中培养6小时后，加入等体积的多粘菌素E溶液，使得培养体系中多粘菌素E的含量为1μg/m L；

尼泊金丁酯(butylparaben)组：首先将大肠杆菌E.coli B2于BHI肉汤培养基中培养6小时后，加入等体积的尼泊金丁酯溶液，使得培养体系中尼泊金丁酯的浓度为80μg/mL；

多黏菌素E(Colistin)联合尼泊金丁酯(butylparaben)处理组：首先将大肠杆菌E.coli B2于BHI肉汤培养基中培养6小时后，加入等体积的尼泊金丁酯和多粘菌素E混液，使得培养体系中尼泊金丁酯的含量为80μg/m L和多粘菌素E的含量为1μg/m L。

然后分别于1h、3h、6h、12h和24h取菌液100μL涂布于MHA培养基上，培养过夜后进行菌落计数。

(2)针对大肠杆菌ATCC25922菌株，设4个处理进行平行实验，分别是对照组(Control)、多黏菌素E组(Colistin)、尼泊金丁酯(butylparaben)组和多黏菌素E(Colistin)联合尼泊金丁酯(butylparaben)处理组。具体如下：

对照组(Control)：首先将大肠杆菌ATCC25922于BHI肉汤培养基中培养6小时后，加入等体积的DMSO溶液(溶剂为BHI肉汤培养基)，使得培养体系中DMSO的含量为0.1％；

多黏菌素E组(Colistin)组：首先将大肠杆菌ATCC25922于BHI肉汤培养基中培养6小时后，加入等体积的多粘菌素E溶液，使得培养体系中多粘菌素E的含量为0.125μg/m L；

尼泊金丁酯(butylparaben)组：首先将大肠杆菌ATCC25922于BHI肉汤培养基中培养6小时后，加入等体积的尼泊金丁酯溶液，使得培养体系中尼泊金丁酯的浓度为80μg/mL；

多黏菌素E(Colistin)联合尼泊金丁酯(butylparaben)处理组：首先将大肠杆菌ATCC25922于BHI肉汤培养基中培养6小时后，加入等体积的尼泊金丁酯和多粘菌素E混液，使得培养体系中尼泊金丁酯的含量为80μg/m L和多粘菌素E的含量为0.125μg/m L。

然后分别于1h、3h、6h、12h和24h取菌液100μL涂布于MHA琼脂培养板上，培养过夜后进行菌落计数。

结果如下：

针对大肠杆菌B2菌，结果如图1所示，与多黏菌素E(1μg/mL)或尼泊金丁酯(80μg/mL)单独相比，多黏菌素E(colistin)1μg/mL和尼泊金丁酯(Butylparaben)80μg/mL联合使用显著降低细菌菌落数，在处理1h后，细菌菌落数快速降低到0Log10CFU/mL，而对应的多黏菌素E(colistin)1μg/mL处理组，细菌菌落数为6.0Log10CFU/mL，对应的尼泊金丁酯(Butylparaben)80μg/mL组，细菌菌落数为4.0Log10CFU/mL。多黏菌素E(colistin)1μg/mL和尼泊金丁酯(Butylparaben)80μg/m L联合使用效果直到第24h，细菌菌落数均为0Log10CFU/mL。

针对大肠杆菌ATCC25922细菌，结果如图2所示，与多黏菌素E(0.125μg/mL)或尼泊金丁酯(80μg/mL)单独相比，多黏菌素E(colistin)0.125μg/m L和尼泊金丁酯(Butylparaben)80μg/mL联合使用显著降低细菌菌落数，在处理1h后，细菌菌落数快速降低到0Log10 CFU/mL，一直持续到第24h。

实施例3、多黏菌素E联合尼泊金丁酯对小鼠创伤感染细菌清除率的治疗效果

BALB/c小鼠，体重18～20g，雌性，购自北京维通利华有限公司。小鼠饲养于中国农业大学动物医学院国家兽药安全中心实验动物房，室温(25±2℃，相对湿度50±10％，采用常规光照，昼：夜＝12h:12h，饲喂常规小鼠维持颗粒饲料。正式实验前小鼠在动物房适应性饲养1周。所有动物实验全部经过中国农业大学动物伦理道德委员会批准。0.2&50/10g

小鼠在实验室适应性饲养一周后，所有小鼠建立皮肤创伤模型，主要步骤如下：用电动脱毛器除去背部毛发，腹腔注射4％水合氯醛麻醉小鼠，每只按照10mg/kg给药。用酒精给背部脱毛部位消毒，记号笔预先做圆形记号，高压灭菌眼科剪剪开背部皮肤，做出直径为1cm的圆形伤口，并将皮肤剪下。随后，小鼠感染接种E.coli B2，用微量移液枪在伤口上滴加10μL(1×10⁹CFU/mL)的E.coli B2菌液，每只小鼠的感染的细菌量为1×10⁷CFU，对照组于创伤表面滴加PBS，等待皮肤将滴加的液体吸收，并观察小鼠状态至苏醒。将感染E.coli B2的小鼠再继续分为4组，分别为溶剂治疗对照组、多黏菌素E治疗组、尼泊金丁酯治疗组、多黏菌素E联合尼泊金丁酯治疗组，每组6只小鼠。分别在E.coli B2感染第1h和24h，分别在皮肤感染出直接滴加10μL的生理盐水、10μL多黏菌素E(1mg/mL，相当于每只小鼠给予0.5mg多黏菌素E/kg体重)、10μL尼泊金丁酯(20mg/mL，相当于每只小鼠给予10mg尼泊金丁酯/kg体重)、10μL多黏菌素E(1mg/mL)+尼泊金丁酯(20mg/mL)(相当于每只小鼠同时给予0.5mg多黏菌素E/kg体重和10mg尼泊金丁酯/kg体重)的混合液。在感染后第48h后，麻醉处死小鼠，用高压灭菌手术器械将创口及周围皮肤组织剪下，并剥离皮下黏连组织。将皮肤组织到2mL研磨离心管中，加入500μL PBS、研磨珠，于高温低速组织研磨仪中研磨，选取皮肤组织研磨程序，4℃条件下充分研磨。将组织匀浆稀释至合适的倍数(500倍)：取20μL原液于2mL离心管中，加入1.98mL无菌PBS倍比稀释。取100μL稀释后的菌液，滴加于含有多黏菌素E(终浓度为2μg/mL，主要目的是防治操作过程中的其它杂菌污染)的BHI固体培养基上，使用涂布器将菌液涂布均匀，于37℃培养箱中培养14～16h，观察菌落生长情况，并计数。

结果如下：溶剂治疗对照组皮肤伤口载菌量为7.45Log₁₀CFU，多黏菌素E和尼泊金丁酯治疗组的载菌量分别为6.22Log₁₀CFU和7.19Log₁₀CFU，多黏菌素E和尼泊金丁酯联合治疗组菌落数降低到2.48Log₁₀CFU。这表明，多黏菌素E和尼泊金丁酯联合治疗较黏菌素E或尼泊金丁酯单独治疗，显著提高了对皮肤伤口的细菌清除率。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.尼泊金丁酯在制备增强多黏菌素类抗菌药物抑菌活性和/或杀菌活性的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为多黏菌素类抗菌药物增效剂或抗细菌感染性疾病的药物。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述多黏菌素类抗菌药物选自下述至少一种：1)多黏菌素E或其药学上可接受的盐；2)多黏菌素B或其药学上可接受的盐。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述抑菌活性和/或杀菌活性为对下述至少一种病原菌具有抑制和/或杀灭作用：1、革兰氏阴性细菌；2、变形菌门细菌；3、γ-变形菌纲细菌；4、肠杆菌目细菌或假单胞菌目细菌；5、肠杆菌科细菌或假单胞菌科细菌；6、埃希氏菌属细菌或克雷伯氏菌属细菌或假单胞菌属细菌；7、大肠埃希菌或肺炎克雷伯杆菌或铜绿假单胞菌；8、携带MCR-1基因的大肠埃希菌或携带MCR-1基因的肺炎克雷伯杆菌。

5.一种抗菌组合物，包括尼泊金丁酯和权利要求1-4中任一项所述的多黏菌素类抗菌药物。

6.根据权利要求5所述的抗菌组合物，其特征在于：所述尼泊金丁酯与多黏菌素类抗菌药物的质量比为(20～1280):1。

7.根据权利要求5或6所述的抗菌组合物，其特征在于：所述抗菌组合物对下述至少一种病原菌具有杀灭和/或抑制作用：1、革兰氏阴性细菌；2、变形菌门细菌；3、γ-变形菌纲细菌；4、肠杆菌目细菌或假单胞菌目细菌；5、肠杆菌科细菌或假单胞菌科细菌；6、埃希氏菌属细菌或克雷伯氏菌属细菌或假单胞菌属细菌；7、大肠埃希菌或肺炎克雷伯杆菌或铜绿假单胞菌；8、携带MCR-1基因的大肠埃希菌或携带MCR-1基因的肺炎克雷伯杆菌。

8.一种抗菌产品，含有权利要求5-7中任一项所述的抗菌组合物。

9.根据权利要求8所述的抗菌产品，其特征在于：所述产品为药物制剂，所述药物制剂的剂型选自下述任意一种：片剂、乳膏、胶囊、缓释片、控释片、口服液、糖浆、滴丸、注射液剂型、冻干粉针剂型。