JP2005281239A - 鶏用dnaワクチン - Google Patents
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Abstract
【課題】 抗ニューカッスル病ウイルス活性のある鶏用ワクチンを提供する。
【解決手段】 特定の塩基配列を有するプロモータ、又は、その一部が置換、欠失或いは付加されてなるプロモータの支配下にニューカッスル病ウイルスのFタンパク質をコードするcDNAが接続されていることを特徴とする環状DNAを有効成分とする鶏用DNAワクチン
【選択図】 なし
【解決手段】 特定の塩基配列を有するプロモータ、又は、その一部が置換、欠失或いは付加されてなるプロモータの支配下にニューカッスル病ウイルスのFタンパク質をコードするcDNAが接続されていることを特徴とする環状DNAを有効成分とする鶏用DNAワクチン
【選択図】 なし
Description
本発明は、ニューカッスル病ウイルスの感染を予防する鶏用DNAワクチンに関する。
ニューカッスル病は養鶏界で最も恐れられている病気のひとつで、感染後数日の内に沈うつや嗜眠といった症状を示して数10%から50%以上の鶏が致死する。経過が長引くと斜頚・頭部捻転の神経症状を示すこともある。この病気が恐れられている原因の一つに、全ての日齢の鶏が本疾病に感受性で、強毒株に感染した場合は日齢を問わず劇症となる点である。また、いったん感染した場合、水平感染性が高く、鶏舎全ての鶏を処分して消毒する措置を講じない限り、感染を抑えることができないといわれている。
現在、本疾病に対する予防措置として生ワクチン及び不活化ワクチンが使われているが、副作用や接種時の鶏の体調への留意が必要であったり、ワクチン効果の持続期間が短く、接種回数が多いという問題があり、より簡便に確実なワクチン効果を得ることが求められている。
このような状況のもと、ニューカッスル病予防のためのDNAワクチンが検討されている(特開平8−116976号公報)。この公報によれば、ニューカッスル病ウイルス(以下、NDVという)のFタンパク質をコードするcDNA(以下、F遺伝子という)を用いたDNAワクチンの効果は、環状DNAでは認められず、環状DNAを線状化する必要があると記載されている。しかしながら、こうした方法は、大量の環状DNAを制限酵素処理、精製操作を実施する必要があり実用性に乏しい。
現在、本疾病に対する予防措置として生ワクチン及び不活化ワクチンが使われているが、副作用や接種時の鶏の体調への留意が必要であったり、ワクチン効果の持続期間が短く、接種回数が多いという問題があり、より簡便に確実なワクチン効果を得ることが求められている。
このような状況のもと、ニューカッスル病予防のためのDNAワクチンが検討されている(特開平8−116976号公報)。この公報によれば、ニューカッスル病ウイルス(以下、NDVという)のFタンパク質をコードするcDNA(以下、F遺伝子という)を用いたDNAワクチンの効果は、環状DNAでは認められず、環状DNAを線状化する必要があると記載されている。しかしながら、こうした方法は、大量の環状DNAを制限酵素処理、精製操作を実施する必要があり実用性に乏しい。
我々は抗NDVワクチンを得るべく検討した結果、鶏β−アクチンプロモータの改変体である特定のプロモータとして用いた場合、環状DNAを線状化することなくワクチン効果を発揮することを見出した。
しかもこのDNAワクチンは、移行抗体を保有している市販鶏にも、SPF鶏にもNDVに対して高い防御効果を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。
しかもこのDNAワクチンは、移行抗体を保有している市販鶏にも、SPF鶏にもNDVに対して高い防御効果を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。
かくして本発明によれば、配列番号1記載の塩基配列を有するプロモータ、又は、その一部が置換、欠失或いは付加されてなるプロモータの支配下にニューカッスル病ウイルスのFタンパク質をコードするcDNAが接続されていることを特徴とする環状DNAを有効成分とする鶏用DNAワクチンが提供される。当該ワクチンには、さらに免疫効果付与物質を含有させることができる。免疫効果付与物質としては、核酸が好ましく、特に配列の一部にメチル化されていない連続するシトシン、グアニン塩基をもつ合成DNA及び/又は二重鎖RNAが好ましい。
また、本発明によれば、前記本発明の鶏用DNAワクチンを家禽に接種することを特徴とする免疫付与方法、及び環状DNA量が5〜20μgである、免疫効果付与物質を含有する本発明の鶏用DNAワクチンを家禽に接種することを特徴とする免疫付与方法が提供される。
また、本発明によれば、前記本発明の鶏用DNAワクチンを家禽に接種することを特徴とする免疫付与方法、及び環状DNA量が5〜20μgである、免疫効果付与物質を含有する本発明の鶏用DNAワクチンを家禽に接種することを特徴とする免疫付与方法が提供される。
以下に本発明を詳述する。
本発明のDNAワクチンは、特定プロモータとNDVのF遺伝子とを有する環状DNAを有効成分とするものである。この環状DNAは、通常、特定プロモータとF遺伝子とをベクターに組み込んで得られる。
本発明のDNAワクチンは、特定プロモータとNDVのF遺伝子とを有する環状DNAを有効成分とするものである。この環状DNAは、通常、特定プロモータとF遺伝子とをベクターに組み込んで得られる。
(プロモータ)
本発明において、F遺伝子のプロモータとして用いるのは、配列番号1記載の塩基配列を有するもの、又はその一部が置換、欠失、或いは付加されたもの(以下、改変プロモータという)である。もちろん、改変プロモータは、動物細胞中で遺伝子発現用プロモータとして機能するものである。
配列番号1記載の塩基配列を有するプロモータ又は改変プロモータは、特開2001−000188号公報に詳述されている。
本発明において、F遺伝子のプロモータとして用いるのは、配列番号1記載の塩基配列を有するもの、又はその一部が置換、欠失、或いは付加されたもの(以下、改変プロモータという)である。もちろん、改変プロモータは、動物細胞中で遺伝子発現用プロモータとして機能するものである。
配列番号1記載の塩基配列を有するプロモータ又は改変プロモータは、特開2001−000188号公報に詳述されている。
(F遺伝子)
本発明に用いるF遺伝子はNDVのFタンパク質をコードするcDNAであればよく、NDVのセロタイプが何であっても、また、鶏に対して弱毒でも強毒でもかまわない。具体的にはSato株、Miyadera株、D26株、Atami株、Fuji株などのほか、TexasGB株、B1株、LaSota株が上げられるほか、F遺伝子の塩基配列が知られている株や野外から分離した株でもよいが、中でもD26株が好ましい。
本発明においては、F遺伝子以外のNDVの抗原遺伝子を含んでいても構わない。その様な遺伝子としてNDVのHNタンパク質をコードするcDNA、NPタンパク質をコードするcDNA、Lタンパク質をコードするcDNAなどが挙げられる。
F遺伝子やその他の抗原遺伝子は、NDV感染細胞や精製ウイルス粒子やクローン化されたcDNAから容易に調製することができる。
本発明に用いるF遺伝子はNDVのFタンパク質をコードするcDNAであればよく、NDVのセロタイプが何であっても、また、鶏に対して弱毒でも強毒でもかまわない。具体的にはSato株、Miyadera株、D26株、Atami株、Fuji株などのほか、TexasGB株、B1株、LaSota株が上げられるほか、F遺伝子の塩基配列が知られている株や野外から分離した株でもよいが、中でもD26株が好ましい。
本発明においては、F遺伝子以外のNDVの抗原遺伝子を含んでいても構わない。その様な遺伝子としてNDVのHNタンパク質をコードするcDNA、NPタンパク質をコードするcDNA、Lタンパク質をコードするcDNAなどが挙げられる。
F遺伝子やその他の抗原遺伝子は、NDV感染細胞や精製ウイルス粒子やクローン化されたcDNAから容易に調製することができる。
(ベクター)
本発明に用いるベクターに格別な制限はなく、遺伝子組み換え技術で一般的に用いられるプラスミド、コスミド、ファージなどを用いれば良い。プラスミドとしては、例えば、pBR322、pBR325、pUC7、pUC8、pUC18等の市販されたプラスミドが挙げられる。
さらに、pJB8やpHC79等の市販コスミドベクターあるいはλファージやM13mp18等の市販ファージベクターでも良い。
本発明に用いるベクターに格別な制限はなく、遺伝子組み換え技術で一般的に用いられるプラスミド、コスミド、ファージなどを用いれば良い。プラスミドとしては、例えば、pBR322、pBR325、pUC7、pUC8、pUC18等の市販されたプラスミドが挙げられる。
さらに、pJB8やpHC79等の市販コスミドベクターあるいはλファージやM13mp18等の市販ファージベクターでも良い。
(環状DNA)
本発明のワクチンの有効成分である環状DNAは、ベクターに上述したプロモータとF遺伝子とを挿入したものである。
挿入方法に格別な制限はなく、通常、ベクターの制限酵素サイトを利用して、任意の遺伝子をクローニングする、一般的な遺伝子組み換え技術を利用すれば良い。
本発明のワクチンの有効成分である環状DNAは、ベクターに上述したプロモータとF遺伝子とを挿入したものである。
挿入方法に格別な制限はなく、通常、ベクターの制限酵素サイトを利用して、任意の遺伝子をクローニングする、一般的な遺伝子組み換え技術を利用すれば良い。
(鶏用DNAワクチン)
本発明のワクチンは、上述した環状DNAを有効成分とするものであり、通常、薬理学的に許容される媒体(生理食塩水等)と共にワクチン製剤として調製される。
有効成分である環状DNAの1個体に接種する量に格別な制限はないが、通常5〜200μg、好ましくは5〜150μgである。特に、後述する免疫付与物質を用いる場合、環状DNAの量が少なくても高い効果を与えられるため、1個体に接種する環状DNA量は5〜20μgで良い。
本発明のワクチンは、上述した環状DNAを有効成分とするものであり、通常、薬理学的に許容される媒体(生理食塩水等)と共にワクチン製剤として調製される。
有効成分である環状DNAの1個体に接種する量に格別な制限はないが、通常5〜200μg、好ましくは5〜150μgである。特に、後述する免疫付与物質を用いる場合、環状DNAの量が少なくても高い効果を与えられるため、1個体に接種する環状DNA量は5〜20μgで良い。
(免疫賦与効果物質)
更に、ワクチン効果を高めるため、ワクチンに一般に使用される免疫付与効果物質(アジュバント)をワクチンに添加することもできる。
免疫付与効果物質の添加量に格別な制限は無いが、環状DNAに対して、通常5〜200重量%、好ましくは10〜100重量%である。
好ましい免疫付与効果物質としては、核酸系の免疫賦与物質が挙げられ、例えば配列の一部にメチル化されていない連続するシトシンとグアニンとが並んでいる部分配列をもつ合成DNA;二重鎖RNA;が特に好ましい例として挙げられる。これらは、単独で用いても、2種類を組み合わせて用いてもよい。組み合わせて用いる場合、合成DNAと二重鎖RNAの割合(重量比)は、通常10:1〜1:10、好ましくは3:7〜7:3である。
更に、ワクチン効果を高めるため、ワクチンに一般に使用される免疫付与効果物質(アジュバント)をワクチンに添加することもできる。
免疫付与効果物質の添加量に格別な制限は無いが、環状DNAに対して、通常5〜200重量%、好ましくは10〜100重量%である。
好ましい免疫付与効果物質としては、核酸系の免疫賦与物質が挙げられ、例えば配列の一部にメチル化されていない連続するシトシンとグアニンとが並んでいる部分配列をもつ合成DNA;二重鎖RNA;が特に好ましい例として挙げられる。これらは、単独で用いても、2種類を組み合わせて用いてもよい。組み合わせて用いる場合、合成DNAと二重鎖RNAの割合(重量比)は、通常10:1〜1:10、好ましくは3:7〜7:3である。
本発明の環状DNA構築は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. N.Y. 1989)記載の標準的な分子生物学手法を用いて行った。尚、制限酵素断片はアガロースゲルからQIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN、Cat # 28704)を使って精製した。
(1)環状DNAの構築
1.1 プラスミドpGIBacpAの構築
WO99/18215号公報に記載されたプラスミドpGIMCSpolyASfi(2,773bp)を制限酵素BamHIとApaIとで切断し、合成オリゴヌクレオチドAd−B−A−U(配列番号2)と合成オリゴヌクレオチドAd−B−A−L(配列番号3)をアニールさせて調製した合成二本鎖DNAアダプターを挿入してプラスミドpGIMCS2(2,765bp)を作製した。
1.1 プラスミドpGIBacpAの構築
WO99/18215号公報に記載されたプラスミドpGIMCSpolyASfi(2,773bp)を制限酵素BamHIとApaIとで切断し、合成オリゴヌクレオチドAd−B−A−U(配列番号2)と合成オリゴヌクレオチドAd−B−A−L(配列番号3)をアニールさせて調製した合成二本鎖DNAアダプターを挿入してプラスミドpGIMCS2(2,765bp)を作製した。
1.2 プロモータのクローニング
鶏胚繊維芽細胞(CEF)のゲノムDNAを調製し、これをテンプレートとして、PrBac1(配列番号4)およびPrBac2(配列番号5)の合成プライマーを用いてPCR増幅し、β−アクチンプロモータを含むDNA断片(約1.5Kbp)を得た。
次に、制限酵素PstIとXbaIとで二重切断して切り出した鶏β−アクチンプロモータ(1,523bp)とpGIMCS2を同じく制限酵素PstI/XbaIで切断したプラスミド断片とを連結させ、pGIBac(4,272bp)を作製した。
更にプラスミドpBK−CMV(STRATAGENE社製、カタログ番号#212209)をテンプレートにして、プライマーPolyA−F(配列番号6)とプライマーPolyA−R(配列番号7)でPCRを行い、SV40のpolyAシグナルのDNA断片(334bp)を増幅し、これを制限酵素ApaIとKpnIとで切断して切り出したDNA断片(324bp)を、同じく制限酵素ApaIとKpnIとで二重切断したpGIBacに挿入し、pGIBacpA(4,584bp)を作製した。このプラスミドには、配列番号1記載の塩基配列を有するプロモータが挿入されている。
鶏胚繊維芽細胞(CEF)のゲノムDNAを調製し、これをテンプレートとして、PrBac1(配列番号4)およびPrBac2(配列番号5)の合成プライマーを用いてPCR増幅し、β−アクチンプロモータを含むDNA断片(約1.5Kbp)を得た。
次に、制限酵素PstIとXbaIとで二重切断して切り出した鶏β−アクチンプロモータ(1,523bp)とpGIMCS2を同じく制限酵素PstI/XbaIで切断したプラスミド断片とを連結させ、pGIBac(4,272bp)を作製した。
更にプラスミドpBK−CMV(STRATAGENE社製、カタログ番号#212209)をテンプレートにして、プライマーPolyA−F(配列番号6)とプライマーPolyA−R(配列番号7)でPCRを行い、SV40のpolyAシグナルのDNA断片(334bp)を増幅し、これを制限酵素ApaIとKpnIとで切断して切り出したDNA断片(324bp)を、同じく制限酵素ApaIとKpnIとで二重切断したpGIBacに挿入し、pGIBacpA(4,584bp)を作製した。このプラスミドには、配列番号1記載の塩基配列を有するプロモータが挿入されている。
1.3 NDV−Fベクターの作製
プラスミドpNZ98(米国特許第6312696号)をSacIで完全消化した後、BamHIで部分消化して得られる約1.7Kbの断片を、pGTPs(米国特許第6312696号)をSacIとBamHIで消化したプラスミドに接続して得られたpGTPsFをテンプレートとしてPCRを行い目的とするNDVのF遺伝子を得た。PCRはPrF1(配列番号8)およびPrF2(配列番号9)の合成プライマーを用いた。ここで、PrF1にはXbaI、PrF2にはKpnIを付加してある。プライマーPrF1とPrF2を用いてPCR増幅した断片は、約1.7Kbpであり、Virus Research、7、241−255(1987)記載のF遺伝子と同一の553アミノ酸をコードしていた。得られた断片を制限酵素XbaIおよびKpnIで処理し、同酵素でpGIBacpAを切断して得られた断片(約6.4Kbp)と連結してpGIBacFpA(6145bp)を作製した。このプラスミドは、鶏用DNAワクチンの有効成分である環状DNAである。
作製したpGIBacFpAを大腸菌JM109株に導入した後、大腸菌を大量培養して、プラスミドを増殖させプラスミド精製キット(キアゲン社製)を使用して、環状DNAを大量に得た。
プラスミドpNZ98(米国特許第6312696号)をSacIで完全消化した後、BamHIで部分消化して得られる約1.7Kbの断片を、pGTPs(米国特許第6312696号)をSacIとBamHIで消化したプラスミドに接続して得られたpGTPsFをテンプレートとしてPCRを行い目的とするNDVのF遺伝子を得た。PCRはPrF1(配列番号8)およびPrF2(配列番号9)の合成プライマーを用いた。ここで、PrF1にはXbaI、PrF2にはKpnIを付加してある。プライマーPrF1とPrF2を用いてPCR増幅した断片は、約1.7Kbpであり、Virus Research、7、241−255(1987)記載のF遺伝子と同一の553アミノ酸をコードしていた。得られた断片を制限酵素XbaIおよびKpnIで処理し、同酵素でpGIBacpAを切断して得られた断片(約6.4Kbp)と連結してpGIBacFpA(6145bp)を作製した。このプラスミドは、鶏用DNAワクチンの有効成分である環状DNAである。
作製したpGIBacFpAを大腸菌JM109株に導入した後、大腸菌を大量培養して、プラスミドを増殖させプラスミド精製キット(キアゲン社製)を使用して、環状DNAを大量に得た。
(2)in Vitro遺伝子発現確認
2×106個の鶏胚繊維芽細胞(CEF)に1μgのpGIBacFpAプラスミドをジーンパルサー(Bio−Rad社製)を用いてエレクトロポレーション法にて遺伝子を導入した後、直径6cmのシャーレにて37℃、24時間培養し、冷アセトンにて細胞を固定した。間接蛍光抗体法により発現した抗原を検出するため、市販NDVワクチン(財団法人化学及血清療法研究所製)免疫鶏血清及びF蛋白免疫ウサギ血清を1次抗体として使用し、それぞれ500倍にリン酸緩衝液(PBS)で希釈して用いた。1次抗体で室温、45分間反応させ、PBSで三回洗浄後、蛍光物質(FITC)を結合した抗鶏イムノグロブリンまたは抗ウサギIgGをPBSで100倍に希釈した溶液と約一時間室温にて反応させた。その後、PBSで三回洗浄後、蛍光励起波長光下で顕微鏡観察して反応性を調べた。対照としてpGIBacpAプラスミドを移入したCEF細胞を使用した。その結果、pGIBacFpAを移入したCEF細胞でのみ抗体と反応する特異抗原が観察され、pGIBacFpAによりFタンパク質が発現しているのを確認した。
2×106個の鶏胚繊維芽細胞(CEF)に1μgのpGIBacFpAプラスミドをジーンパルサー(Bio−Rad社製)を用いてエレクトロポレーション法にて遺伝子を導入した後、直径6cmのシャーレにて37℃、24時間培養し、冷アセトンにて細胞を固定した。間接蛍光抗体法により発現した抗原を検出するため、市販NDVワクチン(財団法人化学及血清療法研究所製)免疫鶏血清及びF蛋白免疫ウサギ血清を1次抗体として使用し、それぞれ500倍にリン酸緩衝液(PBS)で希釈して用いた。1次抗体で室温、45分間反応させ、PBSで三回洗浄後、蛍光物質(FITC)を結合した抗鶏イムノグロブリンまたは抗ウサギIgGをPBSで100倍に希釈した溶液と約一時間室温にて反応させた。その後、PBSで三回洗浄後、蛍光励起波長光下で顕微鏡観察して反応性を調べた。対照としてpGIBacpAプラスミドを移入したCEF細胞を使用した。その結果、pGIBacFpAを移入したCEF細胞でのみ抗体と反応する特異抗原が観察され、pGIBacFpAによりFタンパク質が発現しているのを確認した。
(3)ウエスタンブロッティング法による遺伝子発現の確認
5×106個の鶏胚繊維芽細胞(CEF)に1μgのpGIBacFpAプラスミドをジーンパルサー(Bio−Rad社製)を用いてエレクトロポレーション法にて遺伝子を導入した後、直径10cmのシャーレにて37℃、24時間培養した。培養細胞を、スクレーパーを用いて回収し遠心して細胞を集めた後、SDS−GELローディングバッファーを用いて可溶化した。対照としてpGIBacpAを移入したCEF細胞を使用したものも同様に可溶化した。これらのサンプルを通常の変性還元状態のアクリルアミド電気泳動(SDS−PAGE)に供し、泳動たんぱく質をSDSゲルからポリビニリデンフルオライド(PVDF)膜(Immobilon−P、Millipore社製)に転写した。転写後、PVDF膜は1%スキムミルクを含むリン酸バッファー(PBS、pH6.5)で1時間室温にてブロッキングした。その後、PBSで500倍希釈した抗Fウサギ血清と室温にてインキュベートし、PBSで3回洗浄後、500倍希釈したビオチン化抗ウサギ抗体(ヤギ)と1時間インキュベートした。PBSで3回洗浄後、アビジンアルカリフォスファターゼ複合体にて1時間インキュベートして、PBSで3回、TBSで1回洗浄ののち、アルカリフォスファターゼの基質であるBCIP−NBTにて発色させた。その結果、pGIBacFpAを移入した細胞でのみ、分子量65キロダルトンの位置にFタンパク質の存在が確認できた。
5×106個の鶏胚繊維芽細胞(CEF)に1μgのpGIBacFpAプラスミドをジーンパルサー(Bio−Rad社製)を用いてエレクトロポレーション法にて遺伝子を導入した後、直径10cmのシャーレにて37℃、24時間培養した。培養細胞を、スクレーパーを用いて回収し遠心して細胞を集めた後、SDS−GELローディングバッファーを用いて可溶化した。対照としてpGIBacpAを移入したCEF細胞を使用したものも同様に可溶化した。これらのサンプルを通常の変性還元状態のアクリルアミド電気泳動(SDS−PAGE)に供し、泳動たんぱく質をSDSゲルからポリビニリデンフルオライド(PVDF)膜(Immobilon−P、Millipore社製)に転写した。転写後、PVDF膜は1%スキムミルクを含むリン酸バッファー(PBS、pH6.5)で1時間室温にてブロッキングした。その後、PBSで500倍希釈した抗Fウサギ血清と室温にてインキュベートし、PBSで3回洗浄後、500倍希釈したビオチン化抗ウサギ抗体(ヤギ)と1時間インキュベートした。PBSで3回洗浄後、アビジンアルカリフォスファターゼ複合体にて1時間インキュベートして、PBSで3回、TBSで1回洗浄ののち、アルカリフォスファターゼの基質であるBCIP−NBTにて発色させた。その結果、pGIBacFpAを移入した細胞でのみ、分子量65キロダルトンの位置にFタンパク質の存在が確認できた。
(4)鶏動物実験
4.1
(1)で得られた環状DNAであるpGIBacFpAのワクチン効果を判定するために、Specific Pathogen Free(SPF)鶏(Line M、日本生物科学研究所)を用いたワクチン効果試験を実施した。
濃度1mg/mlとなるようにPBS(pH6.5)に精製pGIBacFpAプラスミド(環状DNA)を溶解して、評価用DNAワクチンを得た。
環状DNAの接種量が100μgになるように得られたワクチンを、鶏の後肢筋肉に注射した後、ただちに接種部位に電気パルス発生装置(BTX社製、ECM830)を使用して50V、20μ秒の電気パルスを1秒間隔で3回付与し、電極極性を逆にして同条件のパルスを3回付与した(合計6回パルス)。
4.1
(1)で得られた環状DNAであるpGIBacFpAのワクチン効果を判定するために、Specific Pathogen Free(SPF)鶏(Line M、日本生物科学研究所)を用いたワクチン効果試験を実施した。
濃度1mg/mlとなるようにPBS(pH6.5)に精製pGIBacFpAプラスミド(環状DNA)を溶解して、評価用DNAワクチンを得た。
環状DNAの接種量が100μgになるように得られたワクチンを、鶏の後肢筋肉に注射した後、ただちに接種部位に電気パルス発生装置(BTX社製、ECM830)を使用して50V、20μ秒の電気パルスを1秒間隔で3回付与し、電極極性を逆にして同条件のパルスを3回付与した(合計6回パルス)。
攻撃時抗NDV抗体価は、ELISAキット(IDEXX社製、ニューカッスル病診断用酵素抗体反応キット)で測定した値である。
コントロールにはプラスミド非接種鶏を用いた。最終免疫から4週間後、各群の鶏に、アメリカ標準攻撃株であるNDV TexasGB株の103EID50を大腿部に筋肉注射で攻撃し、攻撃後毎日経過観察を行い14日間の死亡状況を確認した。結果を表1に示す。
コントロールにはプラスミド非接種鶏を用いた。最終免疫から4週間後、各群の鶏に、アメリカ標準攻撃株であるNDV TexasGB株の103EID50を大腿部に筋肉注射で攻撃し、攻撃後毎日経過観察を行い14日間の死亡状況を確認した。結果を表1に示す。
この結果、環状DNAを含有する本発明のワクチンは、抗NDV活性を有することがわかる。
4.2 核酸免疫効果付与物質の併用効果比較実験
4.1で調製したpGIBacFpAを含有する評価用ワクチンと、核酸免疫効果付与物質とを、表2記載の日齢の市販鶏(イセファーム社)に、表2記載の量(単位=μg)接種した。4週間後、4.1と同様にして攻撃し、攻撃後毎日経過観察を行い14日間の鶏の死亡状況を確認した。コントロールにはプラスミド非接種鶏を用いた。
評価用ワクチンの接種量は、環状DNAが10μgとなる量にした。
免疫効果付与物質としては、配列番号10記載の塩基配列を有する合成DNAと配列番号11記載の塩基配列を有する合成DNAとを1:1(重量比)で混合した合成DNA(CpG)、及び、シグマ社製、ポリアデニル酸ポリウリジル酸、および、ポリイノシン酸ポリシチジル酸を、重量比1:1で混合した二重鎖RNA(dsRNA)を用いた。
4.1で調製したpGIBacFpAを含有する評価用ワクチンと、核酸免疫効果付与物質とを、表2記載の日齢の市販鶏(イセファーム社)に、表2記載の量(単位=μg)接種した。4週間後、4.1と同様にして攻撃し、攻撃後毎日経過観察を行い14日間の鶏の死亡状況を確認した。コントロールにはプラスミド非接種鶏を用いた。
評価用ワクチンの接種量は、環状DNAが10μgとなる量にした。
免疫効果付与物質としては、配列番号10記載の塩基配列を有する合成DNAと配列番号11記載の塩基配列を有する合成DNAとを1:1(重量比)で混合した合成DNA(CpG)、及び、シグマ社製、ポリアデニル酸ポリウリジル酸、および、ポリイノシン酸ポリシチジル酸を、重量比1:1で混合した二重鎖RNA(dsRNA)を用いた。
この結果、本発明のDNAワクチンであるpGIBacFpAを接種するにあたり、核酸を免疫効果付与物質として併用することで、ワクチン効果が上昇することが確認された。
Claims (6)
- 配列番号1記載の塩基配列を有するプロモータ、又は、その一部が置換、欠失或いは付加されてなるプロモータの支配下にニューカッスル病ウイルスのFタンパク質をコードするcDNAが接続されていることを特徴とする環状DNAを有効成分とする鶏用DNAワクチン。
- さらに免疫効果付与物質を含有してなる請求項1の鶏用DNAワクチン。
- 免疫付与物質が核酸である請求項2記載の鶏用DNAワクチン。
- 免疫効果付与物質が、配列の一部にメチル化されていない連続するシトシン、グアニン塩基をもつ合成DNA及び/又は二重鎖RNAである請求項2記載の鶏用DNAワクチン。
- 請求項1〜4のいずれかに記載された鶏用DNAワクチンを家禽に接種することを特徴とする免疫付与方法。
- 1個体に接種する環状DNAの量が5〜50μgである請求項2〜4のいずれかに記載の鶏用DNAワクチンを家禽に接種することを特徴とする免疫付与方法。
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---|---|---|---|---|
JP2014500250A (ja) * | 2010-11-06 | 2014-01-09 | マリン ポリマー テクノロジーズ,インコーポレーテッド | ナノポリマーをベースとした核酸送達のための組成物および方法 |
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-
2004
- 2004-03-30 JP JP2004100011A patent/JP2005281239A/ja active Pending
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