KR101390554B1 - 신규한 개 인플루엔자 바이러스(ｈ３ｎ２), 이를 포함하는 백신 조성물 및 ｈ３ｎ２ 바이러스 검정 키트 - Google Patents

신규한 개 인플루엔자 바이러스(ｈ３ｎ２), 이를 포함하는 백신 조성물 및 ｈ３ｎ２ 바이러스 검정 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 인플루엔자 바이러스, 이를 유효성분으로 함유하는 백신 조성물, 상기 조성물을 개체에 투여하여 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법 및 상기 바이러스를 이용한 인플루엔자 바이러스의 검정 키트에 관한 것이다. 본 발명은 신규한 개 인플루엔자 바이러스 및 이들의 항원 대상이 되는 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA)의 아미노산 서열을 제공함으로써, 개 및 그로부터 2차 감염되는 개체의 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방하기 위한 백신 또는 진단 용도로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 개 인플루엔자 바이러스(Ｈ３Ｎ２), 이를 포함하는 백신 조성물 및 Ｈ３Ｎ２ 바이러스 검정 키트{Novel Canine Influenza Virus(H3N2), Composition Comprising thereof and Diagnostic Kits of The Novel Canine H3N2 Influenza Virus}
본 발명은 신규한 인플루엔자 바이러스, 이를 유효성분으로 함유하는 백신 조성물, 상기 조성물을 개체에 투여하여 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법 및 상기 바이러스를 이용한 인플루엔자 바이러스의 검정 키트에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 직경이 약 125nm인 입자 크기를 갖는 RNA 외피 바이러스이다. 바이러스는 기본적으로 리피드 이중층 구조 및 외부 글리코단백질을 갖는 바이러스 외피에 의해 둘러쌓여진 내부 뉴클레오캡시드 또는 핵단백질과 결합된 리보핵산(RNA)의 코어로 이루어져 있다. 바이러스 외피의 내부층은 주로 매트릭스 단백질로 이루어지며, 외부층은 주로 숙주-유래 리피드 물질로 이루어진다.
인플루엔자 바이러스는 두 개의 표면 당단백질인, 헤마글루티닌(Hemagglutinin: HA) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase: NA)로 구성된 고도의 다형성 입자로서, 헤마글루티닌은 바이러스의 숙주 세포에의 부착과 바이러스의 세포 침투 동안 바이러스-세포막의 융합을 매개하며, 이러한 표면 단백질, 특히 헤마글루티닌은 인플루엔자 서브타입의 항원 특이성을 결정하는 것으로 알려져 있다.
인플루엔자 바이러스는 항원의 차이에 기초하여 A형, B형 및 C형으로 분류한다. 인플루엔자 A 바이러스는 서브타입 또는 타입, 지리적 기원, 균주 번호 및 단리 연도를 포함하는 명명법에 의하여, 예를 들면 A/베이징/353/89로 기술된다. 적어도 13개의 HA 서브타입(H1-H13)과 9개의 NA 서브타입(N1-N9)이 있다. 모든 서브타입은 조류에서 발견되나, H1-H3 및 N1-N2는 인간, 돼지 및 말에서 발견된다[참고 문헌 : Murphy and Webster, orthomyxoviruses, in Virology, ed. Fields, B.N., Knipe, D.M., Chanock,R.M., 1091-1152(Raven Press, New York, (1990))].
이러한 인플루엔자는 인수 공통 전염병으로서, 인플루엔자 바이러스는 변이성이 크며 한 종에서 다른 종으로 바로 전파될 수 있는 가능성을 가지고 있어, 고병원성 인플루엔자의 세계적인 전파를 해결하는 일이 큰 과제로 떠오르고 있다. 수의분야와 관련하여 인플루엔자 바이러스는 거의 모든 포유류에 감염을 일으키므로 숙주 범위가 넓은 질병에 속한다. 돼지, 닭과 같은 산업동물의 경우 단일 감염으로 소모성 질병 혹은 다른 바이러스 및 세균과 혼합 감염됨으로써 농가에 막대한 경제적 피해를 주기 때문에, 지속적인 생독 및 사독백신을 통한 주기적인 백신접종을 실시하고 있다. 말의 경우 주로 경주마로 사용되기 때문에 호흡기성 질병의 관리는 곧 경주마의 성적에 중요한 요인이므로 백신접종을 실시하고 있다.
한편, 개 인플루엔자 바이러스는 신종 바이러스로서 개에서 현재 백신이나 자연 면역이 되어 있지 않은 상태이므로, 모든 종과 연령에서 감수성이 있는 바이러스이다. 개 인플루엔자 바이러스의 경우에는 개에서 급성 호흡기 질환을 야기하며 고열, 기침, 콧물흘림 등의 호흡기 임상증상을 보이며, 다른 바이러스 혹은 세균성 호흡기 질병과 혼합 감염되어 그 임상증상이 증가할 수 있다.
개 인플루엔자 바이러스는 처음 2004년 미국 플로리다 주의 그레이 하운드견 경주장에서 발생되었다고 보도되었다. 그 이후 미국의 텍사스, 알라바마, 알칸소 중 등에서 개 인플루엔자가 발생되면서 개의 신종 전염병으로 인식되기 시작했다. 미국에서 발생한 개 인플루엔자의 역학적 조사에 따르면, 말 인플루엔자 H3N8과 거의 동일하게 밝혀져, 말에서 개에게로 인플루엔자가 옮겨져 새로운 개 인플루엔자 바이러스가 생성되었을 것이라 추측하고 있다. 한편, 국내에서는 집에서 축주와 생활을 함께하는 애완견에서 인플루엔자 감염증이 확인되었으며 그 혈청형은 H3N2로 밝혀졌다.
이러한 개 인플루엔자 바이러스는 2차 감염의 가능성과 치사율이 다양하기 때문에 백신으로 예방하는 것이 중요하다. 하지만 현재 전 세계적으로 시판되는 개 인플루엔자 바이러스 백신이 미미한 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 최근 한국에서 인플루엔자에 감염된 개로부터 신규한 인플루엔자 바이러스 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2)를 분리하였고, 이들 바이러스의 바이러스학적, 혈청학적, 병원소적 및 계통 발생학적 분석을 실시하였다. 그 결과 분리된 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2) 바이러스가 기존에 출원하여 특허를 받은 한국등록특허 제10-0850545호에서 개시한 개 인플루엔자 백신주와 비교하여 헤마글루티닌 아미노산 서열과 97.2% 상동성 및 뉴라미니다아제 아미노산 서열과 93.4%의 상동성을 보이는 것을 확인하였고, 나아가 이들 바이러스의 병원성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
한국등록특허 제10-0850545호
따라서 본 발명의 목적은, 신규한 H3N2형의 인플루엔자 바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 바이러스에 대해 면역을 형성시킬 수 있는 인플루엔자 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 이용하여 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 바이러스 또는 이의 항원을 포함하는 H3N2 혈청형 인플루엔자 바이러스 검정 키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그와 98% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열로 표시되며 동등한 면역원성을 가지는 헤마글루티닌(HA)을 포함하는 H3N2 혈청형의 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 헤마글루티닌은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 또는 그와 98% 이상 상동성을 가지는 뉴클레오타이드 서열로 표시되며 동등한 면역원성을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이러스는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 그와 98% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열로 표시되며 동등한 면역원성을 가지는 뉴라미니다아제(NA)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 뉴라미니다아제는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열 또는 그와 98% 이상 상동성을 가지는 뉴클레오타이드 서열로 표시되며 동등한 면역원성을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이러스는 수탁번호 KCTC 12187BP일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 백신은 개에게 적용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 백신은 면역증강제(adjuvant)로서 알루미늄 하이드록사이드 겔 또는 오일을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 백신은 개 파라인플루엔자 바이러스(canine parainfluenza virus), 개 디스템퍼 바이러스(canine distemper virus), 개 아데노바이러스(canine adenovirus), 개 코로나 바이러스(canine corona virus), 개 헤르페스 바이러스 (canine herpesvirus) 또는 개 보데텔라 브론키셉티카 균(bordetella bronchiseptica)과 혼합 또는 복합된 백신일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 백신은 바이러스를 약독화된 생독 백신, 사독 백신 또는 서브유닛 백신(면역원성 단편)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 백신은 인플루엔자 바이러스를 23 내지 28 HAU 범위로 함유할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항원은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그와 98% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열로 표시되며 동등 면역원성을 가지는 헤마글루티닌 또는 면역원성을 갖는 이의 단편이며, 이러한 항원이 90% 이상 함유될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항원은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 그와 98% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열로 표시되며 동등 면역원성을 가지는 뉴라미니다아제 또는 면역원성을 갖는 이의 단편이며, 이러한 항원이 90% 이상 함유될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이러스 또는 이의 항원을 포함하는 H3N2 혈청형 인플루엔자 바이러스의 검정 키트를 제공한다.
본 발명은 신규한 개 인플루엔자 바이러스 및 이들의 항원 대상이 되는 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA)의 아미노산 서열을 제공함으로써, 개 및 그로부터 2차 감염되는 개체의 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방하기 위한 백신 또는 진단 용도로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 신규한 인플루엔자 바이러스 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2)의 계통발생학적 관련성을 헤마글루티닌 유전자 염기서열로 분석한 것이다.
도 2는 본 발명의 신규한 인플루엔자 바이러스 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2)의 계통발생학적 관련성을 뉴라미니다아제 유전자 염기서열로 분석한 것이다.
도 3은 본 발명의 신규한 인플루엔자 바이러스 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2)를 비글견 5마리에 접종한 후 3일에서 7일까지 비강분비물에서 검출된 바이러스를 수치로 나타낸 것으로서, 도 3에서 파란색 막대그래프는 본 발명의 바이러스만을 접종한 개체군에서의 검출된 바이러스를 나타낸 것이고, 붉은색 막대그래프는 실시예 4를 통해 제조된 백신을 접종한 후 본 발명의 바이러스를 접종한 개체군에서의 검출된 바이러스를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 신규한 인플루엔자 바이러스 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2)를 비글견 5마리에 접종한 후 시간에 따른 체온변화를 측정한 결과를 나타낸 것으로서, 도 4에서 파란색 막대그래프는 본 발명의 바이러스만을 접종한 개체군의 체온변화를 나타낸 것이고, 붉은색 막대그래프는 실시예 4를 통해 제조된 백신을 접종한 후 본 발명의 바이러스를 접종한 개체군의 체온변화를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 신규한 인플루엔자 바이러스 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2)를 비글견 5마리에 접종한 후 시간에 따른 임상증상 스코어 결과를 나타낸 것으로서, 도 5에서 파란색 막대그래프는 본 발명의 바이러스만을 접종한 개체군의 임상증상 스코어를 나타낸 것이고, 붉은색 막대그래프는 실시예 4를 통해 제조된 백신을 접종한 후 본 발명의 바이러스를 접종한 개체군의 임상증상 스코어를 나타낸 것이다(기준: 임상증상 없음=0점, 미약함=1점, 중등도=2점, 심함=3점).
하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그와 98% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열로 표시되며 동등한 면역원성을 가지는 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA)을 포함하는 H3N2 혈청형의 인플루엔자 바이러스에 관한 것이다.
"헤마글루티닌(hemagglutinin)"은 인플루엔자 바이러스의 표면 당단백질 중 하나로서 바이러스의 숙주 세포에의 부착과 바이러스의 세포 침투 동안 바이러스-세포막의 융합을 매개하며, 인플루엔자 서브타입의 항원 특이성을 결정하는 인플루엔자 바이러스의 표면 항원 단백질이다.
본 발명의 상기 헤마글루타닌(HA)은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 또는 그와 98% 이상 상동성을 가지는 뉴클레오타이드 서열로 표시되며 동등한 면역원성을 가질 수 있다.
또한 본 발명의 인플루엔자 바이러스는, 상기 헤마글루티닌(HA) 외에 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 그와 98% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열로 표시되며 동등한 면역원성을 가지는 뉴라미니다아제(neuraminidase: NA)를 더 포함할 수 있다.
"뉴라미니다아제(neuraminidase)"는 인플루엔자 바이러스의 또 다른 표면 당단백질로서 바이러스가 숙주 세포로 침입하거나 빠져나올 때 필요한 효소이며, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA)과 함께 서브타입의 항원 특이성을 결정하는 인플루엔자 바이러스의 표면 항원 단백질이다.
본 발명의 상기 뉴라미니다아제(NA)는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열 또는 그와 98% 이상 상동성을 가지는 뉴클레오타이드 서열로 표시되며 동등한 면역원성을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "상동성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 단백질의 경우 본 발명의 헤마글루티닌(HA) 또는 뉴라미니다아제(NA) 단백질의 아미노산 서열과 바람직하게는 90% 이상 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로, 단백질 상동물은 목적 단백질과 동일한 활성 부위를 포함할 것이다. 이러한 상동성 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2)일 수 있다.
상기 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2)는 기존에 출원하여 특허를 받은 한국등록특허 제10-0850545호에서 개시한 개 인플루엔자 백신주와 비교하여 헤마글루티닌 아니노산 서열과 97.2% 상동성 및 뉴라미니다아제 아미노산 서열과 93.4%의 상동성을 보였다. A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2) 인플루엔자 바이러스는 2012년 4월 23일자로 대한민국 대전시 유성구 어은동에 위치한 한국생명공학연구원 생물자원세터에 기탁하여, 2012년 5월 2일자로 기탁번호 KCTC 12187BP를 부여받았다.
본 발명의 개 인플루엔자 바이러스는 한국 애완견에서 직접 분리한 것으로, 도 1 및 도 2로 도시한 계통도와 같은 계통발생학적 연관성을 갖는다. 하기 도 1은 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2) 인플루엔자 바이러스의 계통발생학적 연관성을 헤마글루티닌(HA)을 이용하여 분석한 것이고, 도 2는 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2) 인플루엔자 바이러스의 계통발생학적 연관성을 뉴라미니다아제(NA)을 이용하여 분석한 것이다.
본 발명의 개 인플루엔자 바이러스는 개에게 공격접종하였을 때 체온상승 및 폐 염증을 일으키는 병원성이 있음을 확인하였고, 국내 개에서 유행하는 바이러스 종임을 알 수 있었다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 감수성 숙주 동물을 감염시키고 질병을 일으킬 수 있는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 백신 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 본 발명의 백신 조성물은 상기 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2) 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물이 면역 반응을 일으킬 수 있는 숙주 동물은 인간, 개, 돼지, 닭, 오리, 칠면조 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 개과 동물이다. 개과 동물의 예로는, 늑대, 코요테 및 여우와 같은 야생 동물과 순종 및/또는 잡종 반려견(companion dog), 쇼견(show dog), 사역견(working dog), 목양견(herding dog), 수렵견(hunting dog), 호위견(guard dog), 경찰견(police dog), 경주견(racing dog), 애완견(pet dog) 및/또는 실험견(laboratory dog)과 같은 사육 동물을 포함한다.
본 발명에서 상기 항원은 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 항원 성분을 말하며, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 표시되는 헤마글루티닌(HA) 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
또한, 상기 항원은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 그와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 표시되는 뉴라미니다아제(NA) 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 백신은 약독화된 생독 백신 또는 사독 백신, 서브유닛 백신(subunit vaccine), 합성 백신(synthetic vaccine) 또는 유전공학 백신(genetic engineering vaccine)일 수 있으나, 효과적인 면역 반응을 유도하는 생독 백신이 바람직하다.
본 발명에서 사용된 용어 "생독 백신"이란 살아있는 바이러스 활성성분을 포함하는 백신을 의미한다. 또한 용어 "약독화된(attenuation)"이란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 바이러스의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열의 특정 결실 또는 바이러스 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.
용어 "사독 백신"이란 불활화 백신 또는 사균 백신이라고도 하며, 죽은 바이러스를 포함한 백신이다. 이의 예로는 전 바이러스 백신(whole-virus vaccine)과 분할 백신(split vaccine)이 있으며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 제조가능하다. 예컨대 전 바이러스 백신은 바이러스 전체에 포르말린을 처리하여 제조할 수 있으며, 분할 백신은 바이러스에 에테르를 처리하여 외피만을 분쇄, 수득하여 제조할 수 있다.
용어 "서브유닛 백신"은 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 항원 성분만을 추출하여 제조한 백신으로, 바이러스 방어에 필요한 항원 부위에 대해서면 면역형성을 유도함으로써 부작용을 최소화할 수 있다. 예컨대, 개 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 단백질 및/또는 뉴라미니다아제(NA) 단백질을 추출하여 사용할 수 있다.
"유전공학 백신"은 바이러스의 병원성을 일으키는 특이 유전자를 변형하거나 제거한 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 백신은 개에게 발생하는 인플루엔자 이외의 질병을 예방하기 위하여 사용되는 다른 백신의 제조에 사용되는 불활화된 균체들 또는 항원들과 혼합하여 인플루엔자를 포함한 다른 질병들을 함께 예방할 수 있는 혼합 또는 복합 백신으로 사용될 수 있다. 용어 "혼합 백신"이란 서로 다른 바이러스 백신을 함께 사용한 백신을 말하며, 예를 들어, 개 파라인플루엔자 바이러스(canine parainfluenza virus), 개 디스템퍼 바이러스(canine distemper virus), 개 아데노바이러스(canine adenovirus), 개 코로나 바이러스(canine corona virus), 개 헤르페스 바이러스 (canine herpesvirus) 또는 개 보데텔라 브론키셉티카 균(bordetella bronchiseptica)과 혼합 또는 복합되어 백신으로 이용될 수 있다.
본 발명의 백신은, 일예로 (a) 인플루엔자 바이러스를 부화란에 주입하여 증식시키는 단계; (b) 상기 부화란으로부터 요막강액을 수득하여 여기에 포르말린, BPL(betapropiolactone) 또는 BEL(binaryethilimine)을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 포르말린이 처리된 요막강액을 원심분리 또는 여과를 통하여 불활화된 바이러스를 수득하고 이를 바이러스 백신으로 제조하는 단계를 통하여 제조될 수 있다. 각 단계의 상세방법은 하기와 같다.
상기 (a) 단계는 인플루엔자 바이러스를 9 내지 11일령의 부화란에 주입하고, 부화란은 30~40℃에서 24시간 내지 72시간 두어 바이러스의 증식을 유도한다. 상기 (b) 단계에서는 통상의 방법으로 요막강액을 수득하여 여기에 최종농도 0.005 내지 0.2 (v/w)%로 포르말린, BEI 또는 BPL을 가하고 저온에 방치하여 바이러스를 불활화시킨다. 상기 (c) 단계에서는 포르말린, BEI 또는 BPL이 처리된 요막강액을 원심분리 또는 여과를 통화여 불활화된 바이러스를 수득한다. 수득된 바이러스는 수산화알루미나 겔에 흡착시킨다. 상기한, 백신 제조방법은 공지의 방법을 채택하거나 또는 일부 수정을 가하여 용이하게 변경 실시 가능하다.
또한 본 발명의 백신으로 사용되는 바이러스 폴리펩티드(헤마글루티닌, 뉴라미니다아제) 또는 이의 단편들은 업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 폴리펩티드는 고체상 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있으며, 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성될 수도 있다.
본 발명의 백신 조성물은 나출된(naked) 핵산 조성물들도 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 핵산은 본 발명의 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 및/또는 뉴라미니다아제(NA) 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 핵산 백신접종 방법들은 업계에 공지되어 있는 방법을 통해 실시할 수 있다. 예를 들어, 미국등록특허 제6,063,385호 및 제6,472,375호에 설명되어 있다. 상기 핵산은 플라스미드 또는 유전자 발현 카세트(expression cassette)의 형태일 수 있다. 일실시예에서, 상기 핵산은 동물에 투여되는 리포좀에 둘러싸여진 채로 제공된다.
또한, 본 발명의 백신 조성물을 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 면역증강제로는 프레운즈(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔과 식물성 및 광물성 오일 등이 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 인플루엔자 바이러스를 23~28 HAU(hemagglutination unit, 혈구응집 단위)로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 백신의 혈구응집 단위가 23 HAU 미만인 경우, 개에 효과적으로 항체형성을 유도하지 못할 수 있으며, 28 HAU을 초과하는 경우, 효율 대비 비경제적일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물을 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 비강 또는 경막외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 인플루엔자 바이러스 감염이 의심되는 개체에 투여하여 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "인플루엔자 바이러스 감염 질환"이란 인플루엔자 바이러스의 감염으로 유발되는 질환으로서, 부비강염, 발작적 천식, 중이염, 낭성 섬유종, 기관지염, 폐렴, 설사 등을 예시할 수 있으나(Pitkaranta와 Hayden, 1998. Ann. Med.), 본 발명은 이들에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "개체"란 인플루엔자 바이러스에 이미 감염되었거나 감염될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물을 개체에 투여함으로써, 상기 질환을 효율적으로 예방 및 치료할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물로 다양한 인플루엔자 바이러스 아형 또는 변이형의 인플루엔자 바이러스로 감염된 인간을 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물로 다양한 인플루엔자 바이러스 아형 또는 변이형의 조류 인플루엔자로 감염된 닭 또는 돼지를 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물로 다양한 인플루엔자 바이러스 아형 또는 변이형의 개 인플루엔자로 감염된 개과 동물을 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물은 기존의 인플루엔자 바이러스 감염 질환 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어 "치료"란 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원을 포함하는 H3N2 혈청형 인플루엔자 바이러스의 검정 키트에 관한 것이다.
본 발명의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원은 항원-항체 복합체 반응을 통해 감염될 또는 감염된 세포 중의 인플루엔자 바이러스를 제거하는데 사용될 뿐만 아니라, 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 검출하기 위해서도 사용될 수 있다.
이러한 검정 키트에는 본 발명의 인플루엔자 바이러스 뿐만 아니라, 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함될 수 있으나 이를 제한하는 것은 아니다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(PBS), 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종리, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블럿(Western blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시퍼라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으나, 이로 제한되지는 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 비오틴 유도체 등이 있다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이롤로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선 동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
검체의 확보 및 바이러스 분리
본 발명의 인플루엔자 바이러스는 2012년 동물병원에서 내원한 애완견에서 샘플을 받아서 충남대학교 수의과대학 독감연구소에서 분리하였다.
상기 샘플은 항생제와 항균제가 함유된 버퍼로 희석하여 3000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 0.2μm 포어 필터를 이용하여 정제를 한 다음, 10일령 SPF 유정란(SPF embroynated hen egg)의 요막강내에 0.2ml 접종하였다. 접종부위는 파라핀으로 매우고 37℃에서 72시간 저장한 후, 4℃로 옮겨서 하루 동안 저장한 후 요수를 채취하였으며, 0.5% 칠면조 적혈구액을 이용하여 응집반응을 수행하였다(인플루엔자 바이러스 표면의 헤마글루티닌 단백질은 칠면조의 적혈구와 결합되어 응집반응이 일어남).
헤마글루티닌 테스트를 수행한 결과 역가는 29으로 나타났다. 분리된 바이러스는 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2)라고 명명하고, 2012년 4월 23일자로 대한민국 대전시 유성구 어은동에 위치한 한국생명공학연구원 생물자원세터에 기탁하여, 2012년 5월 2일자로 기탁번호 KCTC 12187BP를 부여받았다.
< 실시예 2>
분리된 바이러스의 유전적 특성
분리한 바이러스의 유전자 분석을 위해, 트리졸 LS를 이용하여 요막강액으로부터 인플루엔자 바이러스 RNA를 추출하고 U12 프라이머(5'AGCAAAAGCAGG3')로 RT-PCR을 수행하였다. 또한 이를 통해 얻은 cDNA는 하기 표 1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다.
PCR 반응은 cDNA(1μl)를 반응혼합물 [5μl, 10X Taq DNA 중합효소 완충액, dNTPs(2.5mM/μl) 1.0μl, 각 특정 프라이머 (각 20pmol) 1μl, Taq DNA 중합효소(Promega, USA) 1μl] 와 혼합하고 증류수를 첨가하여 전체 부피 50μl로 만들었다. PCR은 94℃에서 10분간 반응시키고, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분의 반응을 35회 반복수행한 후, 72℃에서 10분간 연장 반응한 다음, 4℃에서 반응을 정지시켰다.
상기 동정된 바이러스의 유전자 분석을 위하여 증폭된 상기 DNA는 T-백터에 삽입되어 형질전환 과정을 통하여 타겟 유전자가 들어간 콜로니를 선택적으로 수득하였다. 이후 간단한 DNA 정제 과정을 통하여 플라스미드를 선별하였으며, M13 포워드(M13 forward primer: 5'CAGGGTTTTCCCAGTCACGA 3'), M13 리버스 프라이머(M13 reverse primer:5'GAAACAGCTATGACCATG 3')를 이용하여 유전자를 분석하였다. 유전자 분석은 DNA star를 통해서 하였으며 이를 기반으로 상동성 및 계통도를 작성하였다.
그 결과, 항원 대상이 되는 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA)를 시퀀싱하였으며(헤마글루티닌(HA)의 서열은 서열번호 1로, 뉴라미니다아제(NA)의 서열은 서열번호 3으로 나타냄), 본 발명의 분리된 바이러스인 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2)는 본 발명자들이 기존에 출원하여 특허를 받은 한국등록특허 제10-0850545호에서 개시한 개 인플루엔자 바이러스(백신주)의 헤마글루티닌 아미노산 서열과 97.2% 상동성 및 뉴라미니다아제 아미노산 서열과 93.4%의 상동성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 또한 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2) 바이러스의 계통학적 분류는 도 1 및 도 2에서 나타내었다.
Figure 112012040738212-pat00001
참고:Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses - E. Hoffmann1, J. Stech2, Y. Guan3, R. G.Webster1,4, and D. R. Perez1
< 실시예 3>
분리된 바이러스의 병원성 시험
분리된 인플루엔자 바이러스 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2)의 병원성 유무를 확인하기 위하여, 개에 대한 공격접종 실험을 실시하였다.
10주령 비글견 5마리에 1:64 HA 역가(106.9 EID50/0.1ml)를 가진 분리된 바이러스 2ml를 비강으로 투여하였다. 투여 후, 임상증상을 관찰하였으며, 바이러스 배출은 접종 후 14일 동안 분변과 비강 분비물을 통하여 EID50을 통한 virus tiration 시행하여 확인하였다.
그 결과 도 3의 파란색 막대그래프에서 볼 수 있듯이 백신 접종 없이 바이러스를 접종한 개체에서 3일에서 7일까지 비강분비물에서만 바이러스가 검출되었으나 분변에서는 바이러스가 (분변 바이러스 정량 자료 생략) 검출되지 않았다.
또한 도 4 및 도 5의 파란색 막대그래프 나타낸 바와 같이, 백신 접종 없이 바이러스를 접종한 개체에서 체온상승 및 재채기와 콧물을 동반한 임상증상이 접종 후 2일부터 10일까지 관찰되었다. 이를 통해, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2)가 개에서 체온상승과 폐 염증을 일으키는 병원성이 있음을 확인할 수 있었다. 또한 6일 동안 바이러스가 배출됨을 확인할 수 있었다.
< 실시예 4>
백신 제조
분리한 개 인플루엔자 바이러스 A/Canine/Korea/SEO77/2012 (H3N2)를 종(seed) 바이러스로 하여 백신을 제조하였다. 10일령 부화란의 요막강에 종(seed) 바이러스를 접종하고 3일 후 요막강액을 채취하여 바이러스 벌크로 하였다. 이 바이러스 벌크에 0.2% 포르말린을 첨가하여 실온에서 24시간 불활화하였다. 불활화 여부는 불활화된 벌크를 부화란에 재접종하여 바이러스가 생존하지 않았을 때 불활화된 것으로 확인하였다. 불활화가 완료된 바이러스 벌크는 25 HAU 이상이 되게 하였다. 이 벌크 70% 와 알루미늄 하이드록사이드 겔 30%를 10,000rpm으로 10분간 혼합한 후 무균검사를 실시하고, 이상이 없음을 확인한 후 백신으로 이용하였다.
< 실시예 5>
백신접종 후 공격실험
상기 실시예 4를 통해 제조된 백신 2ml를 10 주령 비글 5마리에 근육에 주사하여 2주후에 1:64 HA 역가(106.9 EID50/0.1ml)를 가진 분리된 바이러스 2ml를 비강으로 투여하였다. 도 3의 붉은색 막대그래프에서와 같이 백신 접종군에 있어서는 바이러스 검출량이 대조군(백신 접종 없이 바이러스를 접종한 개체군)에 비하여 감소하였다. 도 4의 붉은색 막대그래프에서는 백신 접종군에서 공격접종 후 체온 상승은 없었으며, 또한 도 5의 붉은색 막대그래프에서는 공격접 종 후 1~4일 동안 1~2마리의 개체에서 미비한 임상증상을 보였으나 대조군에 비해서는 임상증상이 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC12187BP 20120423
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Claims (15)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 헤마글루티닌(HA)을 포함하는 H3N2 혈청형의 인플루엔자 바이러스(수탁번호 KCTC 12187BP).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 헤마글루티닌은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 H3N2 혈청형의 인플루엔자 바이러스(수탁번호 KCTC 12187BP).
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 뉴라미니다아제(NA)를 포함하는 H3N2 혈청형의 인플루엔자 바이러스(수탁번호 KCTC 12187BP).
  4. 제3항에 있어서,
    상기 뉴라미니다아제는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 H3N2 혈청형의 인플루엔자 바이러스(수탁번호 KCTC 12187BP).
  5. 삭제
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 백신은 개에게 적용되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 백신은 면역증강제(adjuvant)로서 알루미늄 하이드록사이드 겔 또는 오일을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 백신은 개 디스템퍼 바이러스(canine distemper virus), 개 아데노바이러스(canine adenovirus), 개 코로나 바이러스(canine corona virus), 개 헤르페스 바이러스 (canine herpesvirus) 또는 개 보데텔라 브론키셉티카 균(bordetella bronchiseptica)과 혼합 또는 복합된 백신인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 백신은 바이러스를 약독화된 생독 백신 또는 사독 백신인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 백신은 인플루엔자 바이러스를 23 내지 28 HAU 함유한 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  12. 제6항에 있어서,
    상기 항원은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 헤마글루티닌이며, 이러한 항원이 90% 이상 함유된 백신 조성물.
  13. 제6항에 있어서,
    상기 항원은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 뉴라미니다아제이며, 이러한 항원이 90% 이상 함유된 백신 조성물.
  14. 제6항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 이의 항원을 포함하는 H3N2 혈청형 인플루엔자 바이러스의 검정 키트.
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