KR101345787B1 - 신규한 돼지 인플루엔자 바이러스 ａ ｈ1ｎ1 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

신규한 돼지 인플루엔자 바이러스, A/swine/Korea/GCVP-KS01/2010 (H1N1) 및 상기 돼지 인플루엔자 바이러스의 용도가 제공된다.

Description

신규한 돼지 인플루엔자 바이러스 Ａ Ｈ1Ｎ1 및 그의 용도{Novel swine influenza virus A H1N1 and use thereof}

본 발명은 돼지 인플루엔자 바이러스 A/swine/Korea/GCVP-KS01/2010 (H1N1) 및 그의 용도에 관한 것이다.

"범유행 (pandemic) H1N1"으로도 알려진, 돼지 기원 게놈을 포함하는, 인간 인플루엔자 A H1N1 바이러스는 2009년 4월부터 전세계적으로 출현 (outbreaks)하고 있다. 상기 범유행 H1N1의 돼지 기원에 대한 유전적 증거가 있지만, 역학적 증거는 보고된 바 없다. 돼지 집단을 감염한 범유행 H1N1은 Alberta에서 4월 28일, Manitoba에서 5월, 2009년에 카나다에서 보고된 바 있다. 2009년 5월 2일에, 범유행 H1N1의 첫번째 한국 케이스가 2009년 4월 26일 멕시코 시티로부터 도착한 사람에서 공식적으로 확인되었다. 범유행 H1N1은 돼지 농장에 출현하였고, 상기 바이러스는 2009년 돼지로부터 분리되었다. 상기 범유행 H1N1 출현으로부터, 범유행 H1N1 인간 분리주를 사용하여 돼지에서 여러 실험적 감염 연구가 있었다. 이들 실험은 음상적 증상은 고전적 돼지 인플루엔자 바이러스 감염된 돼지의 증상과 유사하였다.

본 발명에서는 종래 알려진 바 없는 새로운 인플루엔자 바이러스 H1N1을 한국 돼지 농장으로부터 분리하여 그 유전적 실체를 규명하고, 상기 분리주의 병원성이 무특정병원체 (SPF) 돼지에서 재현될 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 구체예는 신규한 돼지 인플루엔자 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 돼지 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 시료 중의 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 돼지 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 돼지의 인플루엔자 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구체예는, 수탁번호 KCTC 11848BP의 돼지 인플루엔자 바이러스 A/swine/Korea/GCVP-KS01/2010 (H1N1)를 제공한다. 상기 바이러스는 한국 돼지로부터 분리된 것이며, SPF 돼지에서 그 병원성이 재생산될 수 있다. 따라서, 상기 바이러스는 SPF 돼지를 이용하여 생산 및 약독화될 수 있다. 상기 바이러스는 일부 유전자에 대하여, A/California/04/2009 스트레인과 부분적 및 완전한 유전자 서열이 99% 이상 유사하였다.

본 발명의 다른 구체예는, 상기 바이러스를 약독화 또는 불활성화시키는 단계를 포함하는, 돼지 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 약독화는 당업계에 알려진 방법에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 약독화된 인플루엔자 바이러스는 화학물질 처리 예를 들면, 포르말린 처리에 의하여 약독화되거나, 자외선 조사 또는 계대배양에 의하여 약독화된 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, "약독화"란 돼지에게 면역반응을 유도할 수 있지만 돼지에게 백신으로 사용할 수 있을 정도로 치명적이지 않은 정도의 독성을 갖는 것을 말한다. 본 명세서에 있어서,약독화는 "불활성화"와 교환가능하게 사용된다. 상기 약독화는 바이러스의 증식 능력이 약화된 것뿐만 아니라 증식능력이 완전하게 상실된 것도 포함한다. 약독화된 바이러스는 상기 바이러스의 서뷰유닛을 포함한다. 상기 "서브유닛"이란 전체 바이러스가 아닌 바이러스의 일 부분을 의미하는 것이다. 상기 서브유닛은 단백질 예를 들면, HA 또는 NA와 같은 개별 단백질 뿐만 아니라 이들의 복합체도 포함한다. 상기 복합체는 예를 들면, 바이러스 입자에 에테르를 처리하여 외피만을 분쇄 및 수득하여 얻어지는 것일 수 있다.

약독화 바이러스는 예를 들면, (a) 상기 돼지 인플루엔자 바이러스를 MDCK 세포주에 주입하여 증식시키는 단계; (b) 상기 세포로부터 수득하여 여기에 포르말린, 베타프로피오락톤 (betapropiolactone: BPL) 또는 비나리에틸렌이민 (binary ethylenimine: BEI)를 처리하는 단계; 및 (c) 상기 처리된 혼합물로부터 불활화된 바이러스를 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있다. 수득된 바이러스는 수산화알루미나 겔에 흡착시킬 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는, 약독화 또는 불활성화된 상기 인플루엔자 바이러스를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 당업계에 알려진 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 용매, 면역증강제, 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 용매는 생리식염수, 증류수 또는 PBS와 같은 버퍼일 수 있다. 상기 면역증강제는 프로인트 완전 또는 불완전 어주반트, 알루미늄 히드록시드 겔 및 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 부형제는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 히드록시드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트 (alum)일 수 있다.

상기 조성물은 인플루엔자 바이러스를 2⁶ HAU (hemagglutination unit: 혈구응집 단위)로 포함하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조될 수 있다. 비경구형 제제의 예로는, 주사액제를 포함한다. 상기 조성물은 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비강 또는 경막외 (eidural) 경로로 투여될 수 있는 제형을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 조성물을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는, 돼지의 상기 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 돼지는 인플루엔자 바이러스에 감염되었거나 감염이 의심되는 돼지일 수 있다. 상기 돼지는 인플루엔자 바이러스 증상을 나타내는 것일 수 있다. 예를 들면, 부비강염, 발작적 천식, 중이염, 낭성 섬유종, 기관지염, 폐렴 및 설사로부터 선택되는 증상을 보이는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 방법에 있어서, 투여는 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비강 또는 경막외 (eidural) 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는, 돼지로부터 분리된 시료 중의 상기 인플루엔자 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 돼지의 인플루엔자 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법을 제공한다. 상기 검출은 상기 인플루엔자 바이러스 항원 또는 그에 결합하는 항체를 검출하는 것일 수 있다.

상기 돼지는 인플루엔자 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 돼지일 수 있다. 상기 돼지는 예를 들면, 중증 호흡기질환을 앓고 있는 돼지일 수 있다. 상기 시료는 돼지로부터 분리된 것이면 어느 것이나 될 수 있다. 예를 들면, 상기 시료는 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다.

상기 검출하는 단계는, 당업계에 알려진 바이러스 검출 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 항원 항체 반응을 이용하거나, 핵산 증폭 반응을 이용하는 것일 수 있다. 상기 검출은 상기 인플루엔자 바이러스를 직접 검출하거나 간접적으로 그 존재를 검출하는 것일 수 있다. 직접 검출하는 것은 상기 인플루엔자 바이러스를 직접 분리하는 것을 포함할 수 있으며, 간접 검출하는 것은 인플루엔자 바이러스의 항원 및 그에 결합하는 항체, 또는 인플루엔자 바이러스의 게놈 서열, mRNA 또는 그로부터 발현된 산물의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 예를 들면, 돼지로부터 분리된 시료 중의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 인플루엔자 바이러스 항원에 결합하는 항체를 검출하는 단계; 및 상기 인플루엔자 바이러스 항원 또는 인플루엔자 바이러스 항원에 결합하는 항체가 존재하는 것으로 검출된 경우, 상기 돼지가 인플루엔자 바이러스에 감염된 것으로 결정하고, 상기 인플루엔자 바이러스 H3N2 항원 또는 인플루엔자 바이러스 항원에 결합하는 항체가 존재하지 않는 것으로 검출된 경우, 상기 돼지가 인플루엔자 바이러스에 감염되지 않은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는, 상기 인플루엔자 바이러스 항원을 돼지로부터 분리된 시료와 접촉시키는 단계; 상기 인플루엔자 바이러스 항원과 항-상기 인플루엔자 바이러스 항원의 복합체의 존재를 검출하는 단계; 및 상기 복합체가 존재하는 경우, 상기 시료는 항-상기 인플루엔자 바이러스 항원 항체를 포함하는 것으로 결정하고, 상기 복합체가 존재하지 않는 경우, 상기 시료는 항-상기 인플루엔자 바이러스 항원 항체를 포함하지 않는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 돼지로부터 분리된 시료 중의 항-상기 인플루엔자 바이러스 항원 항체를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 인플루엔자 바이러스 항원을 돼지로부터 분리된 시료와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉은 액체 매질 중에서 상기 인플루엔자 바이러스 항원과 시료를 혼합시키고 배양하는 것에 의하여 수행될 수 있다. 상기 액체 매질은 상기 인플루엔자 바이러스 항원 및 항체를 불안정화시키지 않고 항원-항체 반응을 위한 매질을 제공할 수 있는 것이면 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 상기 액체 매질은 PBS 버퍼와 같은, 버퍼를 포함한다. 상기 접촉은 항원과 항체의 복합체를 형성시키기 위하여 당업계에 알려진 조건이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 접촉은 4 내지 37℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 접촉은 교반 또는 교반 없이 수행될 수 있다.

상기 인플루엔자 바이러스 항원은 고체 기판에 고정된 것일 수 있다. 상기 고체 기판은 웰, 플레이트 및 비드 형상으로부터 선택되는 하나 이상의 형상을 갖는 것일 수 있다. 상기 웰은 마이크로 웰일 수 있다. 상기 돼지는 인플루엔자 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 돼지일 수 있다. 상기 돼지는 예를 들면, 중증 호흡기질환을 앓고 있는 돼지일 수 있다. 상기 시료는 돼지로부터 분리된 것이면 어느 것이나 될 수 있다. 예를 들면, 상기 시료는 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다.

상기 방법은 상기 인플루엔자 바이러스 항원과 항-상기 인플루엔자 바이러스 항체의 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 검출은 당업계에 알려진 항원-항체 복합체 검출방법이 사용될 수 있다. 상기 검출은 예를 들면, 전기적 방법, 분광학적 방법 또는 이들의 조합에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 또한, 상기 검출은 알려진 ELISA 분석 과정에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 검출가능한 표지로 표지된 항-돼지 항-인플루엔자 바이러스 항체를 상기 항체와 결합시키고, 결합된 산물의 상기 표지로부터 신호를 검출함으로써 이루어질 수 있다. 검출가능한 표지는 형광표지, 전기적 표지, 방사성 물질, 기질을 분광학적으로 분석가능한 물질로 전환시키는 활성을 가진 효소 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 효소는 알칼리포스파타제, 호스래디쉬퍼옥시다제 및 베타-갈락토시다제로부터 선택된 하나이상을 포함할 수 있다.

상기 방법은 상기 복합체가 존재하는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 항-인플루엔자 바이러스 항체를 포함하는 것으로 결정하고, 상기 복합체가 존재하지 않는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 항-인플루엔자 바이러스 항체를 포함하지 않는 것으로 결정하는 단계를 포함한다. 상기 인플루엔자 바이러스 위에서 설명한 바와 같다.

상기 방법에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 항원은 바이러스 입자 자체 또는 그의 표면 단백질인 것일 수 있다. 상기 단백질은 고체 기판에 고정된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는, 항-상기 인플루엔자 바이러스 항체와 돼지로부터 분리된 시료를 접촉시키는 단계; 상기 항체와 상기 인플루엔자 바이러스 항원의 복합체를 검출하는 단계; 및 상기 복합체가 존재하는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 상기 돼지 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하는 것으로 결정하고, 상기 복합체가 존재하지 않는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 상기 돼지 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하지 않는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 돼지로부터 분리된 시료 중의 제1항의 돼지 인플루엔자 바이러스 항원을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 인플루엔자 바이러스 항원은 바이러스 입자 자체 또는 그의 표면 단백질인 것일 수 있다.

상기 방법은 항-인플루엔자 바이러스 항체와 돼지로부터 분리된 시료를 접촉시키는 단계를 포함한다. 항-인플루엔자 바이러스 항체는 상기한 방법에 따라 제조될 것일 수 있다. 상기 접촉은 액체 매질 중에서 상기 항-인플루엔자 바이러스 항체와 시료를 혼합시키고 배양하는 것에 의하여 수행될 수 있다. 상기 액체 매질은 상기 항-인플루엔자 바이러스 항체 및 시료를 불안정화시키지 않고 항원-항체 반응을 위한 매질을 제공할 수 있는 것이면 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 상기 액체 매질은 PBS 버퍼와 같은, 버퍼를 포함한다. 상기 접촉은 항원과 항원의 복합체를 형성시키기 위하여 당업계에 알려진 조건이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 접촉은 4 내지 37℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 접촉은 교반 또는 교반 없이 수행될 수 있다.

상기 항체는 고체 기판에 고정된 것일 수 있다. 상기 고체 기판은 웰, 플레이트 및 비드 형상으로부터 선택되는 하나 이상의 형상을 갖는 것일 수 있다. 상기 웰은 마이크로 웰일 수 있다. 상기 시료는 돼지 유래의 시료이면 어느 것이나 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 시료는 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다.

상기 방법은 상기 항체와 인플루엔자 바이러스 항원의 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 검출은 당업계에 알려진 항원-항체 복합체 검출방법이 사용될 수 있다. 상기 검출은 예를 들면, 전기적 방법, 분광학적 방법 또는 이들의 조합에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 또한, 상기 검출은 알려진 ELISA 분석 과정에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 검출가능한 표지로 표지된 항-인플루엔자 바이러스를 상기 항원과 결합시키고, 결합된 산물의 상기 표지로부터 신호를 검출함으로써 이루어질 수 있다. 검출가능한 표지는 형광표지, 전기적 표지, 방사성 물질, 기질을 분광학적으로 분석가능한 물질로 전환시키는 활성을 가진 효소 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 효소는 알칼리포스파타제, 호스래디쉬퍼옥시다제 및 베타-갈락토시다제로부터 선택된 하나이상을 포함할 수 있다.

상기 방법은 상기 복합체가 존재하는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 항-인플루엔자 바이러스 항원을 포함하는 것으로 결정하고, 상기 복합체가 존재하지 않는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 항-인플루엔자 바이러스 항원을 포함하지 않는 것으로 결정하는 단계를 포함한다. 상기 인플루엔자 바이러스는 위에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 다른 양상은 상기한 바와 같은 인플루엔자 바이러스 (influenza virus) 또는 상기 인플루엔자 바이러스에 결합하는 항체를 포함하는, 돼지 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기 인플루엔자 바이러스와 항-인플루엔자 바이러스 항체의 복합체를 검출할 수 있는 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 시약은 검출가능한 표지로 표지된 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 항-인플루엔자 바이러스 항체에 결합하는 항체일 수 있다. 검출가능한 표지는 형광표지, 전기적 표지, 방사성 물질, 기질을 분광학적으로 분석가능한 물질로 전환시키는 활성을 가진 효소 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 효소는 알칼리포스파타제, 호스래디쉬퍼옥시다제 및 베타-갈락토시다제를 포함할 수 있다. 상기 키트는 표준 대조군, 희석제 및 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 수탁번호 KCTC 11848BP의 돼지 인플루엔자 바이러스 A/swine/Korea/GCVP-KS01/2010 (H1N1)는 SPF 돼지에서 그 병원성이 재생산될 수 있다. 따라서, 상기 바이러스는 SPF 돼지를 이용하여 생산 및 약독화될 수 있다.

본 발명의 돼지 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제조하는 방법에 따라면, 돼지 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 효율적으로 제조할 수 있다.

본 발명의 돼지 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물에 의하면, 돼지 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다.

본 발명의 돼지의 인플루엔자 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법에 의하면, 돼지의 인플루엔자 바이러스 감염 여부를 효율적으로 진단할 수 있다.

도 1a 및 1b는 A/swine/Korea/ GCVP-KS01/2010(H1N1)의 HA (도 1a) 및 NA (도 1b) 유전자 서열의 발생계통적 분석을 나타낸다. 참조 스트레인은 다음과 같다: A/Gangwon/1805/2009(H1N1): CY060460/CY060461; A/California/04/2009(H1N1): GQ280797/FJ969517; A/Texas/ 44312415/2009(H1N1): CY052338/CY052340; A/Singapore/ ON355 /2009(H1N1): CY049372/CY049374; A/Australia/4/2009(H1N1): CY055067 /CY055069; A/Paris/ 2629/2009(H1N1): GQ249337 /GQ254714; A/Kobe/1/2009(H1N1): GQ219577/GQ 220733; A/Netherlands/2009(H1N1): CY039527/CY039528; A/Beijing/01/2009(H1N1): GQ 183617 /GQ183619; A/MexicoCity /MCIG01/2009(H1N1): CY054296/CY054297; A/swine /Indiana/1726/1998(H1N1): CY039925/CY039927; A/swine/Memphis/1/1990(H1N1) : CY035070/CY035072; A/ swine/Iwoa/24297/1991(H1N1): CY027155/CY027157; A/swine/ Shanghai/2/2005(H1N1): EU502885/FJ789827. A/swine/Korea/SCJ01/2009 (H1N1): HM189542/HM189430. * 스트레인: HA/NA에 대한 허가번호 (accession No.)임.
도 2a는 바이러스 접종군 (VI)과 비접종군 (NI)에서 평균 체온 (BT) 및 바이러스 흘림 (Virus)의 변화를 나타낸 도면이다. VI 군의 체온은 NI 군에 비하여 유의하게 더 높았다. VI 군에서 비 스왑은 DPI 1일로부터 바이러스 흘림이 검출된 반면, NI 군에서는 바이러스 검출이 관찰되지 않았다. 회색 막대는 VI 군의 체중을 흰색 막대는 NI 군의 체중을 나타낸다. 삼각형을 가진 대시 선(dashed line)은 VI 군에서 바이러스 흘림을, 다이아몬드는 NI 군에서 바이러스 흘림을 나타낸다.
도 2b는 중증 suppurative necrotizing bronchopneumonia를 보이는, A/swine/GCVP-KS01/2010(H1N1) 바이러스로 감염된 돼지의 폐를 나타내고 (1), 또는 감염되지 않은 돼지의 정상 상흔 (lesion)을 나타낸다. H&E 염색. 원 확대 (original magnification), x200.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 돼지 인플루엔자 A H1N1 바이러스의 분리 및 서열분석

2009년 12월 중 한국 돼지 농장에서 첫번째 범유행 (pandemic) H1N1 발병 (outbreak) 후 범유행 H1N1의 모니터링한 후, 약 6000 두의 돼지를 가진 육종 농장 (breeding farm)으로부터의 표본에 대하여 범유행 H1N1에 특이적인 실시간 RT-PCR (Bionote, Hwasung, Korea)을 사용하여 범유행 H1N1 바이러스를 시험하였고 그 결과는 양성이었다.

흥미롭게도, 감염된 돼지는 뚜렷한 호흡기 증상이 없었다. 또한 상기 농장은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)에 대하여 바이러스적으로 음성으로 알려졌다. 마딘-다르비 개 신장 (Madin-Darby canine kidney: MDCK) 세포 및 부화란 (embryonated eggs)을 이용하여 폐 시료 균질물 (homogenate)로부터 바이러스 분리를 시도하였다. 상기 바이러스는 두번째 계대 후 MDCK 세포주에서만 성공적으로 분리되었다. 분리된 바이러스를 A/swine/Korea/GCVP-KS01/2010 (H1N1) (이하 "GCVP-KS01"라고도 함)라고 명명하였다. 본 분리주는 부타페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology: KRIBB)에 2011.1.21일자로 수탁번호 KCTC 11848BP로 수탁되었다.

분리된 범유행 H1N1의 뉴클레오티드 서열은 HA (hemagglutinin) (772 bp), NA (neuraminidase) (791 bp), NP (nucleoprotein) (1226 bp), NS (non-structural protein) (562 bp) 및 PA (RNA polymerase) (637 bp) 유전자에 대하여는 부분적으로, M (matrix protein) 유전자에 대하여는 완전하게 서열확인되었다. 확인된 HA, NA, PA, NS, NP 및 M의 서열은 각각 서열번호 1 내지 6에 나타내었다. 서열확인 분석은 분리된 바이러스의 실체를 확인하기 위하여 상업적으로 수행되었다 (Genotech, Daejon, Korea). GCVP-KS01의 뉴클레오티드 서열을 다른 범유행 H1N1 및 고전적 돼지 H1N1 바이러스의 것과 비교하였고, MEGA 4.0 프로그램의 이웃연결법 (neighbor joining method)을 사용하여 HA 및 NA 유전자에 대하여 발생계통도를 작성하였다.

GCVP-KS01의 뉴클레오티드 서열은 각각 HA, NA, M, NS, NP, 및 PA에 대하여, A/California/04/2009 스트레인에 대하여 99%, 99.3%, 99.6%, 99.1%, 99.1%, 및 99.5% 유사도(similarity)를 보였다. 상기 분리주의 NA, HA, PA, NS, NP 및 M 유전자의 대응되는 서열을 포함하는, A/California/04/2009 스트레인의 NA, HA, PA, NS, NP 및 M 유전자의 부분 서열은 서열번호 7 내지 12에 각각 나타내었다. HA 및 NA 뉴클레오티드에 대한 발생계통적 분석에 따르면, GCVP-KS01은 2009년 내지 2010년의 인간으로부터 분리된 범유행 H1N1 바이러스와 함께 분류되었다 (clustered). 흥미롭게도, 한국의 인간으로부터 분리된 범유행 H1N1 바이러스의 HA 유전자는 본 발명의 분리주 (isolate)의 그것에 밀접하게 관련되었다. 또한 돼지에서 분리된 이전에 보고된 범유행 H1N1 스트레인, A/swine/Korea/SCJ01/2009도 같은 그룹에 분류되었다 (Song MS 등, J Clin Microbiol. 2010; 48: 3204-3211). 반면, 2009년 이전에 돼지에서 분리된 고전적 돼지 H1N1 바이러스는 다른 그룹의 범유행 H1N1 바이러스에 분류되었다 (도 1). 이 연구에서 유전적 분석의 한계는 전장 게놈의 완전한 서열분석이 이용가능하지 않다는 것이다. 그러나, 인플루엔자 바이러스 타입을 확인하기 위하여는 사용되는 가장 중요한 유전자, HA 및 NA가 포함되었고, 부분적 서열분석은 거의 99% 유사도를 입증하였다. 이들 주의사항 (caveats)에도 불구하고, 뉴클레오티드 분석으로부터의 데이터는 돼지 기원의 상기 인플루엔자 H1N1 한국 분리주는 고전적 돼지 H1N1 인플루엔자 바이러스가 아닌, 범유행 H1N1에 밀접하게 관련되었다는 것을 제시한다.

실시예 2: 무특정병원체 ( specific pathogen free : SPF ) 돼지에서 돼지 인플루엔자 A H1N1 바이러스의 변원성 ( pathogenicity ).

A/swine/ Korea/GCVP-KS01/2010 (H1N1)로 명명된 상기 분리주를 SPF 미니어처 돼지 (miniature pigs) (Medipig, South Korea)에 비강으로 접종하였다. 3개 5주령 신클레어 미니어처 돼지들 (Sinclair miniature pigs)을 본 실시예에 사용하였다. 이들 중 2개는 바이러스 접종군 (virus inoculation: VI)에 대하여 사용하고, 한 돼지는 비접종 (no inoculation: NI) 대조군으로 사용하였다.

2mL의 바이러스 (2⁷HAU의 바이러스, 계대수준 4(passage level 4)을 비강 경로를 통하여 VI 군에 비강내로 접종하였다. 동일 부피의 통상 염수 (normal saline)를 대조군 돼지에 동일한 방식으로 투여하였다. 온도 및 비 분비물 (nasal discharge) 중의 바이러스 흘림(viral shedding)의 양을 포함한 임상증상을 매일 접종후 (days post-inoculation :DPI) 8일 동안 모니터링하였다. 비 스왑(nasal swab)을 양 코 트릴 (nose trills) 중의 멸균도니 면 스왑을 사용하여 수집하고, 2mL의 포스페이트 버퍼된 염수 (PBS) 중에서 현탁시키고, 실시간 RT-PCR에 사용하여 바이러스 흘림의 양 (load)을 검사하였다. DPI 9일에, 모든 실험 돼지는 안락사시키고 부검하여 병리적 분석을 수행하였다. DPI 9일에 수집된 혈액 시료의 혈청학적 분석은 마트릭스 단백질에 대한 상업적 ELISA kit (Bionote, South Korea)를 사용하여 수행하였다. 모든 실험적 과정은 독립적 동물 관리 및 사용 위원회 (independent animal care and use committee)에 의하여 승인되었고, 돼지 병리의 재생산에 대한 녹십자수의약품의 기준 (guidelines from the Green Cross Veterinary Products for the reproduction of pathogenesis in pigs)은 존중되었다.

바이러스로 접종된 돼지는 DPI 2일부터 기침과 나른함 (lethargy)을 보인 반면, 접종되지 않은 돼지는 실험 동안 어떠한 임상적 증상을 나타내지 않았다. VI 군의 직장 온도는 NI 군보다 유의하게 더 높았다 (P<0.01, Tukey's tes). 열성 반응 (febrile response)은 VI 군에서 DPI 1일부터 발견되었다 (>39℃). 특히, DPI 2일에 모든 접종된 돼지에서 직장 온도는 39.5℃까지 급상승하였다 (도 2). VI 군에서 바이러스 흘림은 DPI 1 내지 DPI 7에서 비강 스왑에서 관찰되었다. 부검 중 gross lesions가 조사된 경우 바이러스 접종된 돼지의 폐에서 Focal reddish consolidation가 나타났고 현미경적 상흔 (lesions) 중에서 심한 suppurative necrotizing bronchopneumonia가 발견되었다. 인플루엔자 바이러스에 대한 항체가 또한 VI 군에서 검출되었고, NI 동물에서는 항체에 대한 혈청학적 증거는 없었다 (데이터는 보이지 않음).

이전의 연구에 기초하여 예측된 바와 같이, 발열 및 gross-조직병리학적 상흔 (gross-histopathological lesions)을 포함한, 임상증상은 범유행 H1N1 접종된 SPF 돼지의 폐에서 성공적으로 재생산되었다 (reproduced). 본 실시예는 돼지-분리된 범유행 H1N1 바이러스의 SPF 돼지에서의 병원성 재생산 (pathogenicity reproduction)을 검증하였고, 돼지군 (pig herds) 중에 범유행 H1N1의 바이러스 순환의 잠재적 우려 및 돼지 집단 중에서 새로운 변이체의 출현 가능성을 입증하였다.

한국생명공학연구원 KCTC11848BP 20110121

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Claims (12)

1. 수탁번호 KCTC 11848BP의 돼지 인플루엔자 바이러스 A/swine/Korea/GCVP-KS01/2010 (H1N1).
2. 제1항의 바이러스를 약독화 또는 불활성화시키는 단계를 포함하는, 돼지 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제조하는 방법.
3. 약독화 또는 불활성화된 제1항의 인플루엔자 바이러스를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
4. 돼지로부터 분리된 시료 중의 제1항의 인플루엔자 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 돼지의 인플루엔자 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 검출은 제1항의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 그에 결합하는 항체를 검출하는 것인 방법.
6. 제1항의 인플루엔자 바이러스 항원을 돼지로부터 분리된 시료와 접촉시키는 단계;
   제1항의 인플루엔자 바이러스 항원과 항-제1항의 인플루엔자 바이러스 항원 항체의 복합체의 존재를 검출하는 단계; 및
   상기 복합체가 존재하는 경우, 상기 시료는 항-제1항의 인플루엔자 바이러스 항원 항체를 포함하는 것으로 결정하고, 상기 복합체가 존재하지 않는 경우, 상기 시료는 항-제1항의 인플루엔자 바이러스 항원 항체를 포함하지 않는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 돼지로부터 분리된 시료 중의 항-제1항의 인플루엔자 바이러스 항원 항체를 검출하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 제1항의 인플루엔자 바이러스 항원은 바이러스 입자 자체 또는 그의 표면 단백질인 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 단백질은 고체 기판에 고정된 것인 방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 시료는 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장인 것인 방법.
10. 항-제1항의 인플루엔자 바이러스 항체와 돼지로부터 분리된 시료를 접촉시키는 단계;
    상기 항체와 제1항의 인플루엔자 바이러스 항원의 복합체를 검출하는 단계; 및
    상기 복합체가 존재하는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 제1항의 돼지 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하는 것으로 결정하고, 상기 복합체가 존재하지 않는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 제1항의 돼지 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하지 않는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 돼지로부터 분리된 시료 중의 제1항의 돼지 인플루엔자 바이러스 항원을 검출하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 제1항의 인플루엔자 바이러스 항원은 바이러스 입자 자체 또는 그의 표면 단백질인 것인 방법.
12. 수탁번호 KCTC 11848BP의 돼지 인플루엔자 바이러스 A/swine/Korea/GCVP-KS01/2010 (H1N1) 또는 그에 결합하는 항체를 포함하는, 돼지 인플루엔자를 검출하기 위한 키트.

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