JPH06509710A

JPH06509710A - バキュロウイルスにおけるインフルエンザａのｍ２蛋白の改良発現及びｍ２蛋白の使用

Info

Publication number: JPH06509710A
Application number: JP5503719A
Authority: JP
Inventors: ケンダル，アラン　ピー．; ブラック，レニー; ロタ，ポール　エー．
Original assignee: アメリカ合衆国
Priority date: 1991-07-31
Filing date: 1992-07-29
Publication date: 1994-11-02
Also published as: EP0597008A4; US5290686A; AU659867B2; CA2111116A1; AU2405692A; WO1993003173A1; EP0597008A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】７　バキュロウィルスにより発現されたインフルエンザＡ　Ｍ２蛋白。

８、バキュロウィルスにより発現されたインフルエンザＡ　Ｍ２蛋白の製造方法であって、請求項５に記載の宿主細胞を、アマンタジン様薬物と共に、その宿主細胞か前記のＭ２蛋白の増加した発現を示すような条件下で培養し、そしてそのＭ２をその細胞から抽出することを含んで成る方法。

９、動物におけるインフルエンザの診断の免疫検定であって、以下の段階・１）表面を、請求項７のバキュロウィルス発現Ｍ２により被覆し。

ｌｌ）上記の被覆表面を、インフルエンザをもつ疑いのある動物からの生物学的サンプルと接触させ：そして、１ｉｉ）上記の蛋白と、上記の生物学的サンプル中に存在するそれに好適な抗体との間に形成された複合体の存在の有無を検出すること、を含んで成る免疫検定。

１０、前記の表面が、免疫プロット又はウェスタン・プロットにより作られた、ポリスチレン・マイクロタイトレージョン・プレート、スライド又はナイロン若しくはニトロセルロース膜である、請求項９に記載の免疫検定。

１１、請求項７に記載のバキュロウィルス発現膜蛋白、及び生物学的サンプル中のその蛋白に対する抗体の存在の有無を検出することにおける使用に好適である補助的試薬を含んで成る診断キット。

１２、インフルエンザＡ又はウィルスに対する、動物のためのワクチンであって、そのウィルスに対する免疫化を誘導するのに十分な量の請求項７に記載のバキュロウィルス発現Ｍ２、及び医薬として許容される担体を含んで成るワクチン。

１３、アジュバントをさらに含んで成る、請求項１２に記載のワクチン。

１４、好ましくない細胞を除去する治療的方法であって、以下の段階。

（ｉ）デリバリ−系内てＭ２蛋白又は組み換え肚遺伝子を発現させ；（１１）上記のデリバリ−系を上記の好ましくない細胞に特異的に的中させ：そして、（ｉｉｉ）上記の細胞に与えられた一定量のアマンタジン様薬物によりその細胞の細胞毒性効果を調節すること、Ｒ，［、Ｓｕｇｒｕｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８０：６１７−６２４　（１９９１））　。幾つかの状況の下では、アマンタジンは、Ｆｏｗｌ　Ｐｌａｑｕｅ　ＶｉｒｕｓのＲｏｓ　ｔｏｃｋ株の解裂した赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）の正しいプロセシングを間接的に妨害するけれとも（Ｒ，Ｊ、　Ｓｕｇｒｕｅ　ｅｔ　ａｌ、　ＥＭＢＯＪ、　９：３４６９−３４７６　（１９９０））　、二のＲｏｓｔｏｃｋウィルスを含む感染性ピリオンのゲノムの転写及び翻訳に先立って生しる、インフルエンザＡウィルスの複製中の初期の事件を、アマンタジン様の剤が抑制するというのが一般的なルールである（Ｈａｙ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）：　Ａ、Ｊ、　Ｈａｙ　ａｎｄ　Ｍ、Ｃ，２ａｍｂｏｎ、　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｍａｎｔａｄｉｎｅ　ａｇａｉｎｓｔ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓｅｓ。

Ｉｎ　Ｂｅｃｋｅｒ　Ｙ、　（ｅｄ）　Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｄｒｕｇｓ　ａｎｄ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ：　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ、　Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、　Ｂｏｓｔｏｎ　ＭＡ、　ｐｐ、　３０１−３１５．　（１９８４））。しかしながら、Ｍ２蛋白の作用又はそれとアマンタジンとの相互作用についての直接的な証拠を欠いている。

Ｍ２蛋白は、インフルエンザＡウィルスの様々な株の中に保存されているので、インフルエンザ・ワクチンとしての使用についての潜在力をもつことができる。

マウスか受け取る受動的に転移された、Ｍ２に対するモノクロナール抗体が、生きたインフルエンザ・ウィルスによる鼻中の挑戦の後にそれらの肺の中で、より低い力価のインフルエンザ・ウィルスをもっことが、最近、証明された（Ｊ、　Ｔｒｅａｎ。

ｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６４：１３７５−１３７７　（１９９０））。

Ｍ２蛋白の構造−作用の研究を容易にし、そして免疫学的研究のために必要な試薬を開発するために、本発明は、１つの特定の態様において、昆虫の細胞内で発現できる組み換えバキュロウィルス中にクローン化されたインフルエンザＡウィルスのＭ２遺伝子を提供する。

組み換えＤＮＡ発現系により作られるウィルス抗原は、血清診断検定、実験的ワクチン、及び基礎的研究における使用のために商業的に決められた物質の尽きることのない源を提供することができる。

これらの技術は、病因ウィルスの大規模培養における費用及び潜在的汚染をも取り去ることができる。例えば、診断的抗原どしてのバキュロウィルス発現Ｈａｎｔａａｎウィルス核蛋白の使用が、最近報告されている（Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６９ニア７７−７８６　（１９８８））。

組み換えバキュロウィルス、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）を使用した、最近開発された真核生物発現系は、ウィルス感染の血清学的診断のための免疫検定のための抗原を作るｅｒａ　ｆｒＢｉｐｅｒｄａ）の感染は、多量の抗原の生産を可能にしている（Ｒ。

Ｄ、　Ｐｏ５ｓｅｅ、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　５：４３−５９　（１９８６））　ｏ　さらに、このバキュロウィルス系は、ウィルス抗原製造の一般的に使用される方法を超える他の重要な利点をもっている。例えば、このバキュロウィルス系により、ウィルス抗原が、はとんどのヒト血清中の抗体と交差反応する抗原を含まない細胞中で作られる。それ故、バクテリア及び酵母発現系内で発現された蛋白に必要な抗原の精製が不要であることかできる。バキュロウィルスは、ヒトに感染せず、そしてそれ故、大量に安全に取扱われることができる。

発明の要約本発明の目的は、インフルエンザＡのＭ２蛋白の、より低コストのより容易な、そして安全な手段を提供することである。Ｍ２は、インフルエンザ感染細胞から精製するのが非常に困難である。

本発明の他の目的は、インフルエンザ・ウィルスについての血清診断検定における使用のために、インフルエンザＡから、バキュロウィルス発現Ｍ２を提供することである。

本発明のさらなる目的は、インフルエンザＡウィルス感染の検出及び診断のための血清診断検定を提供することである。

本発明の様々な他の目的及び利点は、図面及び以下の発明の詳細な説明から明確になるであろう。

１つの態様においては、本発明は、１１１２蛋白インフルエンザＡをコードしているＤＮＡセグメント：並びに、バキュロウィルスからの多角体遺伝子プロモーター、バキュロウィルス・フランキング配列及びバクテリアの複製起点を含んで成るベクターを含んで成るＤＮＡ構築物に関する。この構築物のＤＮＡセグメントは、上記ベクターの多角体遺伝子プロモーターに作用可能な状態で結合されている。

他の態様においては、本発明は、組み換えバキュロウィルス及びれに感染した宿主細胞に関する。本発明か関係する組み換えバキュロウィルスは、インフルエンザＡウィルスのＭ２をコードしている。

本発明の宿主昆虫細胞は、バキュロウィルス内でコードされているへ（２の発現を許容するようなやり方で、組み換えバキュロウィルスにより感染される。

他の態様においては、本発明は、バキュロウィルス発現インフルエンザＡの１（２及びバキュロウィルス発現インフルエンザＡのＭ２の製造方法に関する。バキュロウィルス発現インフルエンザＡのＭ２蛋白は、本発明の宿主昆虫細胞を、アマンタジン様剤の存在中で、Ｍ２蛋白の増加された収率を許容するようなやり方で、培養し、そして次に、その細胞からＭ２蛋白を抽出することにより、製造される。

さらなる態様においては、本発明は、哨乳類におけるインフルエンザＡの診断についての生物検定であって、本発明のバキュロウィルス発現〜（２蛋白で表面を被覆し、その被覆された表面をインフルエンザ八をもつ疑いのある動物からの生物学的サンプルと接触させ、そして、その蛋白質とその生物学的サンプル中に存在するそれに特異的な抗体との間で形成された複合体の存在の有無を検出する段階を含んで成るものに関する。また、本発明は、バキュロウィルス発現Ｍ２、及びその生物学的サンプル中のその蛋白質に対する抗体の存在の有無を検出することにおける使用に好適な補助的試薬にも関する。

さらなる態様においては、本発明は、インフルエンザＡウィルスに対する動物にためのワクチンに関する。このワクチンは、そのライスルに対する免疫化を誘導するのに十分な量の、本発明のバキュロウィルス発現膜蛋白を、そして、医薬として許容される担体を含んで成る。

図面の簡単な説明図１は、インフルエンザＡ／Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ／６／６０ウィルスからの九（２遺伝子のＰＣＲ増幅及びクローニングのために使用するプライマーを示している。Ａ／Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ／６／６０のセグメント７の配列は、ＣＯＸ　ｅｔ　ａｌ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６７：５５４−５６７　（１９８９）により、以前に決定されている。

図２は、バキュロウィルス中てのインフルエンザＭ２遺伝子のクローニング及び発現のために使用する戦略を示している。二〇Ｍ２遺伝子は、全感染細胞ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡからＰＣＲを使用して増幅された。このＰＣＲ生成物は、適切な制限エンドヌクレアーゼＣＢａｍＨ［及びＢｇｌｌ＋）で消化され、そしてバキュロウィルス伝達ベクター、ｐＡｃＹＭｌＢ１中に、その多角体遺伝子開始部位の下流に挿入された。（Ｂａ、ＢａｍＨ［：　Ｂｇ　、　Ｂｇｌ［［；　Ｂｌ　、　ｐＡｃＹＭｌ　前進配列決定（ｆｏｒｗａｒｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｐｒｉｍｅｒ）ブライ７−；　ＢＩＯ、ｐＡｃＹＩｉｌｌ復帰配列決定プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｐｒｉｍｅｒ）：　プラスミド環内の点線は、バキュロウィルスＤＮＡを示している。）図３は、インフルエンサＭ２遺伝子のＰＣＲ増幅を証明している。ＲＮＡは、Ａ／Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ／６／６０ウィルスに感染した６時間後に、ＣＶ−１細胞から精製された軸、ｏ、ｉ、・１０）。Ｍ２のｃＤＮＡを、逆転写酵素及びＭ２のｍＲＮＡの３′末端に特異的なプライマー（Ｍ２Ｒ図１を参照のこと）を使用して全ＲＮＡから調製した。ＰＣＲ（２５サイクル）を、Ｍ２Ｒ及びＭ２Ｆ（図１）のプライマーの両方を使用してＭ２のｃＤＮＡを増幅するために使用した。

パネルＡは：　ｃＤＮＡ反応において感染細胞ＲＮＡのｌμｇ（レーン１）、５ μｇ（レーン２）又はｌＯμｇ（レーン３）を使用した後に得られたＰＣＲ生成物である。１０７８塩基対及び３１０塩基対の分子量マーカーの−を示す。

Ｍ２・３１５塩基対：Ｍｌ＝１０２７塩基対である。パネルＢは：２２Ｐ−ラベル八１−遺伝子特異的プライマーとのハイブリダイモーション後のＰＣＲ生成物（パネルＡ）のサザン・プロットである。

図４は、組み換えバキュロウィルスに感染したＳＦ９細胞中のインフルエンザ核蛋白を検出するための間接的免疫蛍光検定を示している。感染（Ａ）又は非感染ＣＢ）のＳＦ９細胞を、アセトンで固定し、モしてＭ２−特異的モノクロナール抗体（１４Ｃ２）と共にインキュベートした。結合モノクロナール抗体を、ＦＩＴＣ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧを使用して検出した。対比染色を、Ｅｖａｎｓ　Ｂｌｕｅにより行った。倍率は、４００倍である。

図５は、バキュロウィルス発現インフルエンザ核蛋白のウェスタン・プロット検定を示している。組み換えバキュロウィルスに感染したＳＦ９細胞の溶解物を、２％ｔｒｉｔｏｎ　、０．５Ｍ　ＫＣＩＣ講中し、そして４Ｍ尿素を含む１７％ポリアクリルアミド・ゲル上て電気泳動に供した。

龍蛋白を、Ｍ２特異的モノクロナール抗体（１４Ｃ２）を使用して検出し、そして結合抗体を＋２５　［蛋白Ａにより検出した。レーンＡはＡ／ＡｎｎＡｒｂｏｒ／６／６０ウィルスに感染したＣＶ−１細胞の、放射ラベル（３５Ｓ−ノステイン）溶菌物であり、レーンＢは＋Ａ／Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ／６／６０ウィルスに感染したＣＶ−１細胞の、非放射ラベル溶菌物であり、レーンＣ，Ｄ、及びＥ（それぞれ４００．３４０及び２４０μｇの蛋白を含んでいた）は：インフルエンザＭ２を発現する組み換えバキュロウィルスに感染したＳＦ９細胞の溶菌物であり、Ｍ２は、約＋５０００ｋｄのサイズであり；−ンＦは・インフルエンザ核蛋白（３４０μｇ）を発現する組み換えバキュロウィルスに感染したＳＦ９細胞の溶菌物てあり、レーンＧは：非感染ＳＦ９細胞の溶菌物である。

図６は、ＥＩＡによるヒト血清サンプル中のＭ２特異的抗体の検出を示している。Ｍ２を発現する組み換えバキュロウィルスに感染したＳＦ９細胞の溶菌物を、Ｅ［Ａプレートの種まきに使用した。プレートを、急性（Ｉｌｌ　Ｓｌ）又は回復期（Ｉｌｌ　Ｓ２）の血清のどちらかの希釈物と共にインキュベートした。結合抗体を、蛋白Ａと結合したｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈペルオキシダーゼにより検出した。

図７は、ウェスタン・プロットによるヒト血清サンプル中のＭ２特異的抗体の検出を示している。Ｍ２を発現する組み換えバキュロウィルスに感染したＳＦ９細胞の溶菌物を、５ＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして図５中に記載したように、ナイロン・フィルターに移した。フィルターを、インフルエンザＡ又はインフルエンザＢのどちらかの確認ケースに伴う患者からの急性（Ｓｌ）又は回復期（Ｓ２）の抗血清と共にインキュベートした。結合抗体を、先に記載したように検出した。Ｃ＝　１４ｃｍ２　ＭａｂにハイブリダイズしたＡ／Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ／６／６０　に感染したｍｏｃｋ細胞の対照溶菌物。

図８は、ウェスタン・プロットにより検出されたＭ２２蛋白現に対するアマンタジンの効果を証明している。Ｔ−１５０フラスコ中て増殖しているＳＦ９細胞を、１ｍｌの組み換えバキュロウィルス（約３ＸｌＯ’ｐｆｕ）により感染させ、そして接種後の異なる時間に収穫し、そして低速遠心分離により細胞を回収した。ＳＤＳ及びメルカプトエタノールを含む電気泳動サンプル・バッファー中ての加熱により破壊した後、一部を、４Ｍ尿素を含む１７％アクリルアミド・ケルに供し、そしてマーカー・ダイかそのゲルの端に到達するまで電気泳動した。ケルを、ニトロセルロース・フィルター上にトランスプロットし、モしてＭ２蛋白の存在を、モノクロナール抗体による染色により検出した。Ｍ＝”Ｒａｉｎｂｏｗ　Ｍマーカー”蛋白；　リゾチーム（ｌｙｓ）　、カルボニック・アンヒドラーセ（Ｃ，Ａ、）、オボアルブミン（ｏｖａｌｂ）　、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。２Ｄ　、３Ｄ、−組み換えバキュロウィルスＡＡ−Ｍ２−Ｓに感染した２及び３日後に収穫された細胞。細胞を、２μｇ／ｍｌのアマンタジンの有（＋）又は無（−）で維持した。

図９は、５ｌｏｔ　ｂｌｏｔ検定による、Ｍ２２蛋白現の量を表している。

細胞を、図８のように感染させ、そして回収及びＰＢＳ中ての洗浄後、０、　ＩＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　ｐＨ７，８バツフアー中の６Ｍ　塩化グアニジウムの１ｍｌの添加により破壊した。サンプルを、この溶液中で逐次希釈し、そして次に５０ｕｌの部分を５ｌｏｔ　ｂｌＯｔ装置内に支持されたニトロセルロース・フィルターに使用した。それらを、直ちに０．５％Ｔｗｅｅ口２０を含むＰＢＳて洗浄し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液中の３％ウシ血清アルブミンにより妨害腰モしてＭ２蛋白を、Ｍ２蛋白に対するモノクロナール抗体、次ニ、ヒオチン化ヒツジ抗−７ウス［ｇ、そして５ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ａにより検出した。４−クロロ−１−ナフトールを含むＰＢＳ（０゜５ｍｇ／’ｍｌ）中に上記フィルターを浸漬することにより発色した。カラム２Ｄ、３Ｄ、４Ｄは、それぞれ、感染後２．３．４日目に収穫されｔこ細胞のす〉プルである。

１／２００から１／１２８００までの希釈を、２　μｇ／ｍｌのアマンタジンの有（＋）又は無（−）で、感染後維持された細胞（二ついて使用した。非感染細胞の１／２００希釈を対照（Ｃ）として使用した。

好ましい態様の説明本発明は、バキュロウィルスを利用したインフルエンザＡ　Ｍ２蛋白の発現系及びそれにより作られた蛋白質に関する。本発明に関係するＭ２蛋白は、抗−インフルエンザＡ抗体と特異的に反応し、そしてそれ故、血清診断検定において使用されることができる。本発明は、インフルエンザ・ウィルスλ（２の製造の、より容易なそしてより安全な手段を提供し、そして現在の方法よりもコストとしてより低い。

例えば、本発明は、本発明の組み換えウィルスが哺乳類に感染しないので、ウィルス全体からのＭ２の単離よりもより安全である。さらに、本発明のＭ２抗原は、ヒト血清とより強く反応する他の蛋白質からそれらを分離するためのさらなるコストのかかる精製を必要としない。このような分離は、バクテリア系内で作られるＭ２抗原のためには必要である。

１つの態様においては、本発明は、インフルエンザ・ウィルスのＭ２抗原をコードしているＤＮＡ構築物に関する。このＤＮＡ構築物は、インフルエンザＡウィルスのＭ２をコートしているＤＮＡセグメント及びベクターを含んで成る。このベクターは、バキュロウィルスの多角体遺伝子のプロモーター領域、組み換えの間の適切な交差（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ）に必要なバキュロウィルスのフランキング配列（このフランキング配列は、上記のプロモーター配列に隣接する約２００−３００塩基対を含んで成る）、及びその構築物がバクテリア内で複製されることを可能にするバクテリアの複製起点を含んで成る。このベクターは、（ｉ）ＤＮＡセグンメントか多角体遺伝子プロモーターに隣接して（又は、それに作用可能な状態て結合されて、又はその“下流“又は“制御下”に）置かれるように、そして（ｉｉ）プロモーター−Ｍ２抗原の組み合わせ物かバキュロウィルスＤＮＡの２００−３００塩基対により両側に隣接されている（フランキング配列）、ように構築される。

本発明における使用のための好適なベクターは、ｐＡｃＹＭｌを含むか、これに限定されない。

本発明のＤＮＡ構築物を作るために、インフルエンサＡウィルスの全体の長さのＭ２をコートしているｃＤＮＡクローンを、当業者に知られ、り方法を、本発明の場合には、Ｍ２　ＲＮＡのＰＣＲ増幅を使用して得る。

本発明のＤＮＡ構築物は、組み換えハキュロウーイルスを作るために使用される。このＤＮＡ構築物は、組み換えか行われるような条件■”・パ、適切なバキュロウィルスのバキュロウィルスＤＮＡ　（すなわち、そ（−ｒ）構築物内でコートされでいるプロモーターど同し種のハキュロウイｒｐ・スのもの）により、宿主細胞内て構築される。得られた組み換（ハキ、「コウィルスは、全体の長さのインフルエンザＡ　Ｍ２をコートしでいる。例えば、昆虫細胞を、本発明のＤＮＡ構築物及び機能的ハキコロウィルスにより共同トランスフエ）ト又は別々にトランスフェクトするかてきる。次に、得られた組み換えバキュロウィルスを準離し、そしてＭ２蛋白の製造を行うための細胞感染のために使用することかできる。

他の態様においては、本発明は、バキュロウィルス−発現インフウイルスにより感染させ、そしてバキュロウィルス−コードＭ２の発現かハキ二〇ウィルス発現Ｍ２抗原を作るのを可能にする条件下で培養した。このように作られたん（２を、次に、当業者に知られた方法を使用し、てその細胞から抽出する。さらに、宿主細胞を本発明のＤＮＡ構築物により好適に形質転換することかできることを考慮した。

加させる方法に関する。この方法は、本発明の組み換えバキュロウィルス感染宿主昆虫細胞を、アマンタジン様薬物、例えば、リマンチソン（ｒｉｍａｎｔｉｄｉｎｅ）と共に、その薬物と一緒に培養された感染細胞かその細胞内てＭ２蛋白の増加された濃度を作り出すような条件下で、培養することをもくろんでいる。

かなりの量のＭ２蛋白か細胞内に蓄積したときには、Ｍ２蛋白が昆虫細胞に対して高い毒性をもつことは明らかである。この毒性の部分的抑制は、！１１２蛋白のイオン−チャンネル活性の推定の抑制剤であるアマンタジン様剤の添加により見られる。推定では、二の剤の存在は、その推定される細胞毒性効果か全て現れる前に、へ１２蛋白が細胞内に１、より高い濃度まで蓄積することを許容する。

他の態様においては、本発明は、動物における、インフルエンザ・ウィルス感染の診断のための免疫検定に関する。標準的な診断手順を使用して、本発明のバキュロウィルス発現Ｍ２を、生物学的サンプル内の、それにより特異的な抗体の存在について、過度の実験方法を伴わないで、検出するために使用することかできる。Ｍ２蛋白はインフルエンザＡウィルスに特異的なタイプであるので、血清診断テストにおける抗原としてそれか含まれることは、上記のようなテストの利用の効率及び広さを改善することができる。

例えば、固体表面、例えば、免疫プロット又はウェスタン・プロットにより作られた、ポリスチレンのマイクロタイトレージョン・プレート、スライド、又はナイロン若しくはニトロセルロース膜を、本発明のバキュロウィルス発現Ｍ２により被覆し、そして生物学的サンプル、例えば、血清をその表面に接触させることにより、インフルエンザＡの存在の有無を検出することかできる。そのサンプル中に抗体か存在する場合には、抗体−蛋白複合の形成か行われる。

これらの複合体を、当業者に知られた標準的な方法を使用して検出することかできる。

本発明は、さらに、診断キットに関する。本発明の診断キットは、Ｍ２及び補助試薬の製造のために必要な、本発明のバキュロウィルス発現Ｍ２抗原、及び本発明のＤＮＡ構築物の抗体の存在の有無を検出することにおいて好適な補助試薬を含んで成る。

さらなる態様においては、本発明は、インフルエンザＡ感染に対する動物のためのワクチンに関する。インフルエンザに対する抗体は、医薬として許容される担体中に本発明のバキュロウィルス発現Ｍ２を含んで成るワクチン又は生きた組み換えウィルス・ワクチンと同様のものを、動物に投与することにより作られる。

このバキュロウィルス発現Ｍ２抗原は、そのウィルスに対して保護的であることかできる免疫化を誘導するのに十分な量で、そのワクチン内に存在する。本発明のワクチンは、免疫応答を強化することか知られている有効量の免疫学的アジュバントを含むこともできる。

さらなる態様においては、本発明は、病気及び感染、例えば、癌、ＡＩＤＳ及び神経疾患の治療において、膜機能を変更する治療的方法に関する。

Ｍ２蛋白の高い細胞毒性かあるという推定は、膜機能の変更におけるこの蛋白の役割についての興味ある問題を提起した。膜スバニング蛋白であるＭ２蛋白は、膜関連酵素複合体に影響を与え、又は細胞膜機能、例えば、イオン伝達（ｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）　、他のクリティカル分子の伝達、コンダクタンス（ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ）　、又はレセプター分子を制御すること、を直接的に変更することかできる。上記のいずれの活性も、龍蛋白か特定の医学的用途をもつことかできる可能性を生しさせる。

本発明によりもくろまれる方法においては、Ｍ２蛋白又はん（２遺伝子を含む発現系は、特定のデリバリ−系、例えば、リポソーム又は遺伝子組み換えウィルスにより、望ましくない細胞（例えば、癌細胞、旧〜５染Ｔ細胞及び神経細胞）に対して標的とされることかできる。

アマンタジン、認可されたヒトの治療薬物、又はアマンタジン様薬物の使用による効果を制御することは、上記の場合において重要であることかてきる。

以下の例は、本発明を限定するものとして見做すことなく、本発明をさらに説明するために与えられる。

例以下の物質７手順を、それ以降の例の中で、使用する。

モノクロナール抗体Ｍ２特異的モノクロナール抗体を作るハイブリドーマ細胞を、２ｅｅｂｅｄｅｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８に従って使用した、これらの細胞（１４Ｃ−２）は、％ウシ胎児血清を含むＯｐｔｉｍｅｍ中で増殖させ、そしてｐｒｉｓｔａｎｅ− ｐｒｉｍｅｄ　Ｂａ１ｂ／Ｃマウス（６−３２ｘ１０５細胞／マウス）中に接種する。得られた腹水液を収穫し、そして全てのＦＡ、ウェスタン・プロット、及びＥＩＡテストのための抗−Ｍ２モノクロナール抗体の源として使用する。

インフルエンザＭ２遺伝子のｃＤＮＡクローニングＲＮＡを、Ａ／Ａｎｎ　Ａｎｂｏｒ／６／６０ウィルス（ｍ、　ｏ、　ｉ、　□ＩＯ）による感染後６時間目にＣＶ−を細胞から精製する。細胞を、冷ＰＢＳて３回洗浄し、そして５．８Ｍ　グアニジウム・イソチオシアネート、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、２％　ナトリウム・ラウリル・サルコシネート、及び１％２−メルカプトエタノール中に溶解する。溶菌物を、５．７１ｔｌＣｓｃｌ　クッションを通して遠心分離し、そしてＲＮＡペレットを先に記載したように回収した（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙｌ１９８２乃。ＲＮＡをさらに、フェノール・クロロホルム抽出により精製し、そしてエタノール沈殿により濃縮した。約５０μｇのＲＮＡを、Ｍ２　ｍＲＮＡの存在を確認するために、Ｍ２復帰（ｒｅｖｅｒｓｅ）メッセーノ・コンブリメント（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）・プライマー（図１）を使用して、それぞれの配列決定反応において使用した。ｋｉ２　ｃＤＮＡを、５０μ ｍの反応液中に、ｌ、５、又は１０μｇ　ＲＮＡ　、２．５Ｘ　ＰＣＲノ輝ファー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）、５００ｕＭ　ｄＴＮＰＳｌ　μ ｇ　Ｍ２Ｒプライマー（図１）、２００　ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び２０Ｌｌ逆転写酵素を含む反応において、全ての感染細胞ＲＮＡから調製する。

４２°Ｃにおいて４０分間インキュベートシた後、２５μｌのｃＤＮＡを、ｌ　 μｇ　Ｍ２Ｆ（図１）及び２００　Ｔａｑボリメラーセを含む７５μｌのＰＣＲ混合物に添加した。ＰＣＲ条件は、９４°Ｃ１５分間：９４°Ｃ１分間、５０° Ｃ２分間、７２°Ｃ３分間の２５サイクル：及び７２°Ｃ５分間、１０分間である。二〇ＰＣＲ生成物を、０．８％アガロース・ゲル上の電気泳動、次のサザン・プロット法部ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　＋９８２）により分析した。

ユニークＢａｍＨ［ＢｇｌＩＩ　クローニング部位を含むＭ２　ＰＣＲ生成物及びｐＡｃＹＭｌベクターを、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ［及びＢｇｌｌｌにより消化し、そしてアガロース・ゲル電気泳動により精製した。ベクター及び挿入物を結合させ、そして大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換するために使用した。龍遺伝子を含むコロニーを、放射ラヘルされたＭ２特異的プライマーを使用したハイブリダイセーンヨンにより同定した。クローンＹＭＩ／Ｍ２／１９からのプラスミドＤＮＡを、ＣｓＣ１遠心分離により精製し、そして上記の８１及びＢＩＯ配列決定プライマー（図２）を使用して配列決定した。

これらのオリゴヌクレオチド・プライマーを、ｐａｃＹＭｌのマルチ・クローニング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ）部位に挿入されたＤＮＡフラグメントの５′及び３°末端を配列決定するために設計した。

組み換えバキュロウィルスの構築ＹＭＩ／Ｍ２／１９からのプラスミドＤＮＡを、Ｍ、Ｄ、　Ｓｕｍｍｅｒｓ　ａｎｄ　Ｇ、Ｅ、　Ｓｍ１ｔｈ、Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔＣｅ１．ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　（１９８６）のＣａＣｌ法を使用して、野性ＷＡｃＮＰＶ　ＤＮＡにより、ＳＦ９細胞中に共同トランスフェクトした。トランスフェクション後６〜１０日開目に、Ｍ２発現を、１２０希釈における１４Ｃ−２モノクロナ一ル抗体及び（Ｔａｇｏ）ヤギ抗マウスＦ［ＴＣ結合物を使用して、アセトン−固定した細胞上の間接的免疫蛍光抗体により検出した。組み換えバキュロウィルス（Ｂａｃ−Ｍ２）を、希釈検定を制限し、その後のＲｏｔａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、７１：１５４５−１５５４（１９９０）により記載されたようなプラーク精製により精製した。

バキュロウィルス発現Ｍ２蛋白の分析ＳＦ９細胞を、０．２ｍｌ細胞／室において室スライド（ｃｈａｍｂｅｒｅｄ　５ｌｉｄｅｓ）内に接種した。細胞を一夜癒着させた。このＢａｃ−Ｍ２ウィルスをいくつかの希釈物５０−１００μｌ／ｗｅｌｌにおいて接種し、そして３０分間吸収させ、そして８％ＦＢＳを含む全容量３００μのＨｉｎｋｓ培地を添加した。

上記のＣＰＥが２５％〜５０％最終であったとき、この培地を、吸引し、そしてその細胞をｐＨ６，５において冷ＰＢＳて洗浄した。表面蛍光ののために、細胞を乾燥させないようにし、そして冷却した新たな、ＰＢＳ　ｐＨ６，５中の２％パラホルムアルデヒドを細胞に添加し、そして４°Ｃで３０分間インキュベートした。内部蛍光を測定するために、細胞を乾燥させ、そして冷却アセチン（ａｃｅｔｉｎｅ）をｗｅｌｔｓに添加し、そして４°Ｃで１０分間インキュベートした。次にこの細胞を、Ｍ２蛋白を検出するためにＣ１４−２モノクロナ一ル抗体と共にインキュベートした。

結合したＭａｂを、Ｅｖａｎｓ　Ｂｌｕｅを含むヤギ抗マウスＦＩＴＣラベル［ｇＧを使用して検出した。

Ｂａｃ−Ｍ２により感染されたＳＦ９細胞の溶菌物を、１０ｍＭ　ｔｒｉｓ　、　１ｍＭＥＤＴＡ、２％ｒｒｉｔｏｎ　１００及び０．５Ｍ　ＫＣＩ（Ｚｅｂｅｄｅｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５６：５０２−５１１（１９８５乃中で調製し、そして４Ｍ　尿素を含む２０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の電気泳動（Ｒ，Ｌａｍｂ　ｅｔ　ａｌ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　９１：６Ｏ−７８（１９７８））に供した。

蛋白質を、半一乾燥トランスプロット細胞を使用したウェスタン・プロントのためのニトロセルロース・フィルターに移した。Ｍ２蛋白を、Ｃ１４−２モノクロナ一ル抗体により検出し、そして結合抗体を、１２５＋−ラヘルされた蛋白Ａオートランオグラフイーにより検出した。

εＩＡ手順Ｅ［Ａのための抗原を調製するために、０．３５ｍ１の水中に沈殿した０１ｍ１の感染ＳＦ９細胞を、３７°Ｃてインキュベートし、そして０．０５ｍ１の１０Ｘアルカリ性グリシンを添加した（１０Ｘグリシン：ＩＭ　ＮａＣ１中の１Ｍグリシン：　ＩＮ　ＮａＯＨｐＨ１０に添加されたグリシン／ＮａＣ１）。この混合物を音波破砕し、そして３７°Ｃて３０分間インキュベートし、そしてその細胞死骸をペレット化した。上澄を含むＭ２抗原を、炭酸ノくソファ−ｐＨ９，６中に希釈し、そして先に記載したように（Ｒｏｔａ　ｅｔ　ａｌ、、１９９０）Ｅ［Ａのためのポリスチレンのマイクロタイター・プレートを被覆するために使用した。患者からの急性期及び回復期のヒト血清サンプルを、インフルエンザＡに応答する抗体を確認するために使用した。

また、血清サンプルを、先に記載したようにウェスタン・プロ・ノドによっても分析した。

インフルエンザＡのＭｌ蛋白は、線状の対応性（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）転写（こよりコートされているか、そのＭ２蛋白は、スプライシングされたｍＲＮＡから翻訳されている（Ｒ，Ｌａｍｂ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７８））。それ故、そのＰＣＲ生成物のアガロース・ゲル及びサザン・プロット検定（図３）により例示されるように、そのＭ２遺伝子を増幅する必要かあつｔこ。二のＰＣＲ生成物を、その遺伝子の同一性を確認し、そして挿入される・＼きＭ２遺伝子の大きさを証明するために、Ｈｉｎｆｌにより消化した。

上記の前進プライマー上のＢａｍＨｌ制限酵素部位及び上記の復帰コンブリメント（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）プライマー上のＢｇｌ＋１部位をもつ、特に構築されたへ（２プライマーは、ＰＣＲにより増幅されたＭ２遺伝子を上記のバキュロウィルス伝達ベクターｐＡｃＹＭｌ（図１及び２）に挿入することを容易にした。ＹＭＩベクターのＢ１前進及びＢＩＯ復帰プライマーをもつＹＭＩ／Ｍ２による配列決定後、Ｍ２遺伝子が、Ｂａｍ８１部位において始まる多角体開始部位に比へて正しい方向に合ったことが見つかった（Ｙ、Ｍａｔｓｕｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６８：１２３３−１２５０　（１９８７乃。上記のＹＭＩ／Ｍ２プラスミドを、ＡｃＮＰＶ　ＤＮＡによりＳＦ９細胞内に共同トランスフェクトし、先に記載したように、インフルエンザＭ２蛋白を発現する、組み換えバキュロウィルス、Ｂａｃ−Ｍ２を作った。

上記の組み換えウィルス、Ｂａｃ−Ｍ２により感染されたＳＦ９細胞を、蛍光抗体検定により分析した。これらの細胞は、Ｍ２蛋白に特異的なモノクロナール抗体と共にインキュベートされ、モしてＦＩＴＣ結合体により染色されたとき、強い核周囲の蛍光を示した（図４）。細胞を、表面蛍光を検出するために、２％バラホルムアルデヒドによっても処理した。結果は、Ｍ２か細胞膜上に存在することを示していた。

例２．　組み換えバキュロウィルスの分析ウェスタン・プロット分析は、組み換えＭ２蛋白及び精製ウィルスから得られたＡ／ＡＡ／６／６０　Ｍ２蛋白が、抗 −Ｍ２２モノクロナ一ル抗により同定されたとき、大きさ及び電気泳動の挙動が同一であることを証明した（図５）。このモノクロナール抗体は、未感染Ｓｆ９細胞から調製された溶菌物と、又はインフルエンザＢ　ＮＰ蛋白を発現する組み換えバキュロウィルスにより感染したＳｆ９細胞からの溶菌物とは、交差反応しなかった。これらの結果は、Ｂａｃ−Ｍ２か、インフルエンザＡウィルス感染細胞内で見つかったＭ２蛋白にほとんと同し蛋白質を作っていること、そしてこの組み換えＭ２蛋白かその細胞表面において発現されていることを示唆している。

例３　バキュロウィルス発現Ｍ２蛋白抗原の抗原反応性組み換えバキュロウィルスにより作られた抗原が、ウィルス成分に特異的な抗体を検出するためのＥ［Ａテストにおいて使用される前に、厳格に精製される必要がないことは、先に示されている。Ｂａｃ−Ｍ２の構築により、Ｍ２蛋白に好適な抗体について、インフルエンザにより感染したヒトからの血清サンプルをテストすることが可能になっている。このようなテストは、適切な源のＭ２抗原なしには、不可能である。グリシン溶菌物を、感染Ｓｆ９細胞から調製し、そしてεＩＡプレートを調製するために使用した。インフルエンザ感染患者からの一連の急性及び回復期の血清の対をテストした。この対のいくつかは、感染後、Ｍ２に対して力価の有意な増加を示している（図６）。Ｍ２に対して生じた力価の程度は、血清の対の間でばらつき、そして、他のインフルエンザ感染患者に対して生じた抗体力価の程度と常に相互に関連してはいなかった（表１）。この血清サンプルを、また、Ｍ２が標的抗原であることを確認するためにウェスタン・プロット検定においてテストした。図７は、Ｓ１血清かＭ２抗原と反応しなかったことを、一方、インフルエンザＡ感染患者からの３２血清が非常に強＜Ｍ２と反応したことを示している。インフルエンザＢにより感染した患者からのＳｌ又はＳ２血清標本のどちらも、ウェスタン・プロット（図７）又はＥＩＡにおいて、Ｍ２抗原と全く反応しなかった。これらのデータは、Ｍ２蛋白か、インフルエンザに対する免疫応答の標的であることを示唆している。

例４゜ＢＡＣ−Ｍ２感染細胞内のＭ２蛋白を、ウェスタン・プロットにおいて検出した、そしてその蛋白の量は、アマンタジンがその細胞培養培地中に２μｇ／ｍｌで含まれているとき、かなり多くなった（図８）。スロット・プロット検定を、Ｍ２蛋白の製造におけるアマンタジンの効果をより良好に定量化するために開発した。感染細胞を、６！Ｉ（塩化グアニジウムにより溶菌し、そしてこの試薬により調製された溶液を、ニトロセルロース・フィルターに塗布した。ん（２蛋白を、Ｍ２に特異的なモノクロナール抗体ＣＩ４、ピオチン結合抗−マウス抗体、及びａＶｉｄｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により検出した。

λ（２蛋白の濃度は、アマンタジンの存在中で維持した細胞の場合には、約１６倍高いものであった（図２）。このような観察を、数多くの実験において繰り返しこれまでに述べた全ての刊行物を、引用により本明細書中に取り込む。

これまでの発明は、明瞭に、そして理解できるようにする目的をもって幾分詳細に記載したけれども、形態における様々な変更及び詳細を本発明の範囲から外れることなく行うことができることは、本開示を読むことにより、当業者により理解されるであろう。

ＰＲＩＭＥＲＭ２Ｆ　ｍＲＮＡ　ＳＥＮＳＥＰＲＩＭＥＲＭ２ＲＲＥＶＥＲ３Ｅ −ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＦＩＧ、１Ｍ２　ＰＣＲＰＲＯＤＵＣＴ（３３９ｎ、↑、）ＦＩＧ、２゜ＦＩＧ、４Ａ、　ＦＩＧ、４８ＦＩＧ、？ロー（ＴＨＯｕＳＡＮＤＳ）ＳＥＲＵＭ　ＤＩＬＬＪＴＩＯＮＦＩＧ、６ＦＩＧ　８゜ｈ寛９補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成６年７月ｊ／日

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＤＮＡ構築物であって、ｉ）インフルエンザＡウイルスをコードしているＤＮＡセグメント：ｉｉ）バキュロウイルスからの多角体遺伝子プロモーター、バキュロウイルス・ブランキング配列及びバクテリアの複製起点を含んで成るベクター、を含んで成り、上記ＤＮＡセグメントが上記ベクターの多角体遺伝子プロモーターに作用可能な状態で結合されているＤＮＡ構築物。
２．前記のバキュロウイルス・プロモーターが、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの核多角体ウイルス・プロモーターである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
３．前記のベクターが、ｐＡｃＹ１Ｂ１である、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
４．インフルエンザＡウイルスのＭ２をコードしている組み換えバキュロウイルス。
５．前記のバキュロウイルス内でコードされている前記のＭ２の発現を可能にするようなやり方で、請求項４に記載の前記の組み換えバキュロウイルスにより感染した昆虫細胞。
６．Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞である、請求項５に記載の昆虫細胞。
７．バキュロウイルスにより発現されたインフルエンザＡＭ２蛋白。
８．バキュロウイルスにより発現されたインフルエンザＡＭ２蛋白の製造方法であって、請求項５に記載の宿主細胞を、アマンタジン様薬物と共に、その宿主細胞が前記のＭ２蛋白の増加した発現を示すような条件下で培養し、そしてそのＭ２をその細胞から抽出することを含んで成る方法。
９．動物におけるインフルエンザの診断の免疫検定であって、以下の段階：ｉ）表面を、請求項７のバキュロウイルス発現Ｍ２により被覆し；ｉｉ）上記の被覆表面を、インフルエンザをもつ疑いのある動物からの生物学的サンプルと接触させ；そして、ｉｉｉ）上記の蛋白と、上記の生物学的サンプル中に存在するそれに好適な抗体との間に形成された複合体の存在の有無を検出すること、を含んで成る免疫検定。
１０．前記の表面が、免疫プロット又はウェスタン・プロットにより作られた、ポリスチレン・マイクロタイトレーション・プレート、スライド又はナイロン若しくはニトロセルロース膜である、請求項９に記載の免疫検定。
１１．請求項７に記載のバキュロウイルス発現膜蛋白、及び生物学的サンプル中のその蛋白に対する抗体の存在の有無を検出することにおける使用に好適である補助的試薬を含んで成る診断キット。
１２．インフルエンザＡ又はウイルスに対する、動物のためのワクチンであって、そのウイルスに対する免疫化を誘導するのに十分な量の請求項７に記載のバキュロウイルス発現Ｍ２、及び医薬として許容される担体を含んで成るワクチン。
１３．アジュバントをさらに含んで成る、請求項１２に記載のワクチン。
１４．好ましくない細胞を除去する治療的方法であって、以下の段階：（ｉ）デリバリー系内でＭ２蛋白又は組み換えＭ２遺伝子を発現させ；（ｉｉ）上記のデリバリー系を上記の好ましくない細胞に特異的に的中させ；そして、（ｉｉｉ）上記の細胞に与えられた一定量のアマンタジン様薬物によりその細胞の細胞毒性効果を調節すること、を含んで成る方法。