TWI776097B

TWI776097B - 增強免疫力或抗病力的食品添加劑

Info

Publication number: TWI776097B
Application number: TW108142727A
Authority: TW
Inventors: 廖朝暐; 廖亭彰; 鄭明珠
Original assignee: 廖朝暐
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2022-09-01
Also published as: TW202119940A

Abstract

本揭露提供一種食品添加劑，其可增強所需主體對禽類流行性感冒病毒的免疫力或抗病力。其中，本揭露的食品添加劑包括：一功能性胜肽。其中，功能性胜肽包括：一轉位肽，其係用於轉位；一具有免疫蛋白酶體切割序列之胜肽；一A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽，具備誘導血清中和力價阻斷流感病毒出芽釋出的功能；以及一羧基終端胜肽。

Description

增強免疫力或抗病力的食品添加劑

本揭露提供一種食品添加劑，尤指一種添加有功能性胜肽的食品添加劑。

A型禽類流行性感冒(簡稱禽流感)為禽鳥類具有高度傳染力及高度致病力危害風險的病毒性傳染疾病。一旦有禽鳥類確診感染高致病與高傳染力之病毒後，為了杜絕後續感染其他區域的禽鳥，則必須進行大量撲殺，而造成重大的經濟損失。最近有些國家(包括中國、越南及印尼等)，實施禽流感疫苗的施打來防治高致病性之流感病毒。人感染高致病性禽流感（以下稱“人禽流感”）是由A型流感病毒某些亞型中的一些毒株引起的急性呼吸道傳染病。儘管目前人禽流感只是在局部地區出現，但是，考慮到人類對禽流感病毒普遍缺乏免疫力、人類感染H5N1 、H7N9等型禽流感病毒後的高病死率以及可能出現的病毒變異等，世界衛生組織（WHO）認爲該疾病可能是對人類存在潜在威脅最大的疾病之一。除此之外，屬於低致病與低傳染力流感病毒，也廣泛存在雞場中，而目前尚未有對此低致病與低傳染力流感病毒進行一個妥善的防控方案。顯然的，低致病與低傳染力流感病毒在雞場中長期存在狀態下，有可能加速新型的變異病毒株出現，對於流感大爆發機率大增。

近來已經證實，部分A型禽流感病毒除了感染禽鳥類外，更會感染人類。目前已知會感染人類的A型禽流感病毒類型為H5N1、H5N6、H6N1、H7N4、H7N9、H9N2和H10N8等。一旦禽流感病毒有了適應力或獲取人類流感病毒的某些基因後，便會由禽鳥傳播到人身上，甚至導致流感症狀。如果再演化成在人與人之間傳播，則有可能成人禽流感大流行。為了克服禽流感病毒的多變性，Michael Schotsaert (2009)等人建議用高原性的M2亞單位設計成廣譜流感疫苗，雖然至今仍未成功發展成功。但是於2018年Emily J Erbelding等人仍再次提出廣譜流感疫苗的重要性。

依據Tong-Ming Fu (2008)A型流行性感冒病毒之抗原M2 N端之表位(M2-N)，具備誘導血清中和力價阻斷流感病毒感染功能。若能應用此高原性表位發展出一種食品或飼料添加劑，誘發功能性抗體，則可添加於禽鳥類的飼料中或人類的食品中以提升禽鳥類或人類產生對抗禽流感病毒的中和力價抗體，則可避免新型變異A型流感大流行的問題。本專利闡述了將此發明設計的功能性多肽產品，在雞隻的飼餵後，利用弱病原性H6N1禽流感病毒感染的細胞模式，證明試驗動物之雞隻可以產生功能性抗體之功效性試驗。

本揭露提供一種食品添加劑，其可增強所需主體對A型禽類流行性感冒病毒的免疫力或抗病力。

本揭露的食品添加劑的核心多肽包括：一功能性胜肽。其中，功能性胜肽包括：一轉位肽，其係用於轉位；一具有免疫蛋白酶體切割序列之胜肽；一A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽(M2-Nr7)，具備誘導血清中和力價阻斷流感病毒出芽釋出功能；以及一羧基終端胜肽。

於本揭露的食品添加劑中，添加之核心原料為A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽(M2-Nr7)融合蛋白。因此，當所需主體服用本揭露的食品添加劑，功能性胜肽中的流感冒病毒之M2表位重複多肽M2-Nr7，透過Th1表位的免疫路徑而產生有效的特異性抗體可與細胞膜上的流感病毒M2蛋白質結合，阻斷病毒出芽及釋出，可以有效抑制了病毒的繁殖，進而達到增強所需主體對禽類流行性感冒病毒的免疫力或抗病力。

於本揭露的食品添加劑中，具有免疫蛋白酶體切割序列之胜肽是位於轉位肽的C-末端，A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽(M2-Nr7)是位於具有免疫蛋白酶體切割序列之胜肽的C-末端或N-末端，而羧基終端胜肽是位於A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽(M2-Nr7)的C-末端。

於本揭露的食品添加劑中，功能性胜肽可包括：複數具有免疫蛋白酶體切割序列之胜肽。其中，具有免疫蛋白酶體切割序列之胜肽及A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽(M2-Nr7)位於轉位肽及羧基終端胜肽間，且具有免疫蛋白酶體切割序列之胜肽位於A型禽類流行性感冒病毒M2之N端或C端之表位的重複多肽(M2-Nr7)的兩表位胜肽間。因此，當所需主體服用本揭露的食品添加劑，由於多功能性胜肽包括A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽(M2-Nr7)，可以產生有效的M2特異性抗體可與流感病毒出芽釋出病毒前崁在細胞膜的M2蛋白質結合，有效阻斷病毒的繁殖，故可使所需主體對禽類流行性感冒病毒的免疫力或抗病力更加提升。

於本揭露的食品添加劑中，用於轉位的轉位肽為一能夠促進細胞溶質定位和抗原呈現的載體。其中，轉位肽可來自假單胞菌屬外毒素A (pseudomonas exotoxin A, PE)。於本揭露的一實施例中，轉位肽可包含一僅去除第三部位(domain III)之假單胞菌屬外毒素。於本揭露的另一實施例中，轉位肽是來自假單胞菌屬外毒素之第一部位(domain I)與第二部位(domain II)，第一部位係PE之配體部位(ligand)，配體部位可與一標的細胞之接受體進行結合、反應或辨識，以使所帶之胜肽經由細胞接受體之細胞攝粒作用(endocytosis)，而可使A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽(M2-Nr7)進入標的細胞內，並且經由PE之第二部位將表位重複多肽轉送入細胞質內，以及免疫蛋白酶體切割程序產生多個M2之N端表位片段，並配合羧基終端部位之胜肽片段，共同啟動具被anti-M2特異性之免疫反應。

於本揭露的食品添加劑中，羧基終端胜肽可選自任何一種與細胞KDEL受體接合之羧基終端胜肽。於本揭露的一實施例中，羧基終端胜肽可來自假單胞菌屬外毒素之一部分。於本揭露的另一實施例中，羧基終端胜肽可包括KDEL之胺基酸序列。於本揭露的再一實施例中，羧基終端胜肽係KDEL、RDELKDEL、KDELRDELKDEL、KKDLRDELKDEL、KKDELRVELKDEL、KKDELRDELKDEL、或KLDYLKKDELRDELKDEL。

於本揭露的食品添加劑中，具有免疫蛋白酶體切割之胜肽序列可為LLELLEDK、LKLEDRL、LL或L。

於本揭露的食品添加劑中，A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位(M2-N)序列包括LTEVETPTIRNEW、LTEVETPIRNEW或其組合。而將此兩個表位肽M2-N組合成之多肽稱為M2-Nr7。於本揭露的一實施例中，包括複數免疫蛋白酶體切割序列之胜肽及A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽(M2-Nr7)的序列可為：EFLLELLEDK LTEVETPTIRNEW LKLEDR LTEVETPIRNEW LL LTEVETPIRNEWLLLTEVETPTIRNEW LKLEDR LTEVETPIRNEW LL LTEVETPIRNEW LL LTEVETPTIRNEWL TEVETPTIRNEWLKLEDR LTEVETPIRNEWLL LTEVETPIRNEWLL LTEVETPTIRNEWLKLEDR LTEVETPIRNEWLL LTEVETPTIRNEW (SEQ ID NO: 1)。

於本揭露的食品添加劑動物試驗功效是以試驗雞的血清樣品，以弱病原性H6N1禽流感病毒感染的細胞感作及血樣抑制了病毒斑增大的試驗來檢定其功效。

於本揭露的食品添加劑中，所需主體可為哺乳動物(例如：人)或禽鳥類(例如：雞、鴨)。

本揭露的食品添加劑中的功能性胜肽可包含於一菌體萃取物中，特別是可包含於一去活化的菌體萃取物中。在此，所使用的菌體的菌株並無特殊限制，只要能表達功能性胜肽，較佳為大量表達功能性胜肽的菌株均可用於本揭露的食品添加劑中。例如，菌株可為大腸桿菌菌株、枯草桿菌菌株、乳酸桿菌菌株或腸球菌菌株。

於本揭露的食品添加劑中，除了包括前述的功能性胜肽或前述的包括功能性胜肽的去活化的菌體萃取物外，食品添加劑可更包括滑石粉、纖維素及抗性澱粉等。其中，功能性胜肽或包括功能性胜肽的去活化的菌體萃取物的含量可為0.1 wt%至1 wt%，滑石粉的含量可為67 wt%至87 wt%，纖維素的含量可為10.5 wt%至18 wt%，而為了增強緩釋效果亦可再添加抗性澱粉其含量可為1.5 wt%至15 wt%。

本揭露的食品添加劑的功能性胜肽或包括功能性胜肽的去活化的菌體萃取物的製備方法可包括下列步驟：培養如前所述的菌株；選擇性的將所培養的菌株進行裂解，且更可選擇性的分離內含體(Inclusion body)，而可得到本揭露的功能性胜肽或包括功能性胜肽的去活化的菌體萃取物。此外，更可包括下列步驟：將功能性胜肽或包括功能性胜肽的去活化的菌體萃取物與滑石粉、纖維素混合亦可再添加抗性澱粉等，而可得到本揭露的食品添加劑。

此外，本揭露更提供一種食品，包括：如前所述的食品添加劑及一食品基質。其中，食品添加劑的含量可為0.03 wt%至1.5 wt%，而食品基質的含量可為99.97 wt%至 98.5 wt%。

以下係藉由具體實施例說明本揭露之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地了解本揭露之其他優點與功效。本揭露亦可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可針對不同觀點與應用，在不悖離本創作之精神下進行各種修飾與變更。

接下來，將以禽類流行性感冒(禽流感)病毒H6N1亞型進行動物功效性試驗。

功能性胜肽的合成

M2-Nr7重複胜肽序列如下：EFLLELLEDKLTEVETPTIRNEWLKLEDRLTEVETPIRNEWLLLTEVETPIRNEWLLLTEVETPTIRNEWLKLEDRLTEVETPIRNEWLLLTEVETPIRNEWLLLTEVETPTIRNEW*VD (SEQ ID NO: 2)

M2-Nr7 (360bp) DNA序列如下： GAATTC CTTTTAGAATTGCTCGAGGATAAACTAACTGAAGTGGAAACACCTACAATTCGCAACGAGTGGCTGAAACTTGAGGACCGTCTTACGGAAGTGGAAACCCCTATCCGCAATGAGTGGTTATTATTGACCGAGGTTGAAACTCCAATACGTAACGAATGGTTGCTCCTCACTGAGGTCGAGACACCGACAATTCGCAACGAATGGCTAAAGCTAGAAGATCGCCTGACGGAGGTAGAGACGCCTATTCGTAATGAATGGCTGCTTCTTACCGAAGTGGAAACCCCTATCCGTAATGAGTGGCTTTTATTAACTGAGGTTGAGACTCCAACAATCCGCAACGAATGGTGA GTCGAC (SEQ ID NO: 3)。

禽流感病毒的M2蛋白質對於細菌具有毒性，而於大腸桿菌(E. coli)的表現不佳。在此，將M2蛋白質的疏水區域移除，而僅保留其親水區域。於本實施例中，所得到的M2蛋白質為H5N1-eM2，其可在大腸桿菌中大量表現，經內涵體萃取及親合性管柱純化後，可做成EIA抗原盤，可以檢測血清抗體活性。

H6N1的M2蛋白質序列是由美國國家生物資訊技術中心(NCBI, USA)資料庫所取得。將蛋白質序列輸入DNA strider軟體後，評估其疏水性，以預測蛋白質折疊。抗原序列至少需位於蛋白質的表面且可與水接觸，故選擇親水區域合成本實施例的功能性胜肽；但本揭露並不僅限於此，可根據需求選擇其他能達到相同功能的區域。

將M2-Nr7所得的可編碼多肽的DNA序列插入經EcoRI及SalI限制酶切割插入PE(ΔIII)及羧基終端胜肽序列之間。將所得到的質體轉殖到大腸桿菌中，並以安比西林(Ampicillin)篩選殖株。將所選擇的殖株大量表現後，進行萃取，則可得到本實施例的功能性PE-M2-Nr7，其DNA序列為ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCCGAAGAAGCTTTCGACCTCTGGAACGAATGCGCCAAAGCCTGCGTGCTCGACCTCAAGGACGGCGTGCGTTCCAGCCGCATGAGCGTCGACCCGGCCATCGCCGACACCAACGGCCAGGGCGTGCTGCACTACTCCATGGTCCTGGAGGGCGGCAACGACGCGCTCAAGCTGGCCATCGACAACGCCCTCAGCATCACCAGCGACGGCCTGACCATCCGCCTCGAAGGCGGCGTCGAGCCGAACAAGCCGGTGCGCTACAGCTACACGCGCCAGGCGCGCGGCAGTTGGTCGCTGAACTGGCTGGTACCGATCGGCCACGAGAAGCCCTCGAACATCAAGGTGTTCATCCACGAACTGAACGCCGGCAACCAGCTCAGCCACATGTCGCCGATCTACACCATCGAGATGGGCGACGAGTTGCTGGCGAAGCTGGCGCGCGATGCCACCTTCTTCGTCAGGGCGCACGAGAGCAACGAGATGCAGCCGACGCTCGCCATCAGCCATGCCGGGGTCAGCGTGGTCATGGCCCAGACCCAGCCGCGCCGGGAAAAGCGCTGGAGCGAATGGGCCAGCGGCAAGGTGTTGTGCCTGCTCGACCCGCTGGACGGGGTCTACAACTACCTCGCCCAGCAACGCTGCAACCTCGACGATACCTGGGAAGGCAAGATCTACCGGGTGCTCGCCGGCAACCCGGCGAAGCATGACCTGGACATCAAACCCACGGTCATCAGTCATCGCCTGCACTTTCCCGAGGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTGACCGCGCACCAGGCTTGCCACCTGCCGCTGGAGACTTTCACCCGTCATCGCCAGCCGCGCGGCTGGGAACAACTGGAGCAGTGCGGCTATCCGGTGCAGCGGCTGGTCGCCCTCTACCTGGCGGCGCGGCTGTCGTGGAACCAGGTCGACCAGGTGATCCGCAACGCCCTGGCCAGCCCCGGCAGCGGCGGCGACCTGGGCGAAGCGATCCGCGAGCAGCCGGAGCAGGCCCGTCTGGCCCTGACCCTGGCCGCCGCCGAGAGCGAGCGCTTCGTCCGGCAGGGCACCGGCAACGACGAGGCCGGCGCGGCCAACGCCGACGTGGTGAGCCTGACCTGCCCGGTCGCCGCCGGTGAATGCGCGGGCCCGGCGGACAGCGGCGACGCCCTGCTGGAGCGCAACTATCCCACTGGCGCGGAGTTCCTCGGCGACGGCGGCGACGTCAGCTTCAGCACCCGCGGCACGCAGAACTGGACGGTGGAGCGGCTGCTCCAGGCGGAATTCCTTTTAGAATTGCTCGAGGATAAACTAACTGAAGTGGAAACACCTACAATTCGCAACGAGTGGCTGAAACTTGAGGACCGTCTTACGGAAGTGGAAACCCCTATCCGCAATGAGTGGTTATTATTGACCGAGGTTGAAACTCCAATACGTAACGAATGGTTGCTCCTCACTGAGGTCGAGACACCGACAATTCGCAACGAATGGCTAAAGCTAGAAGATCGCCTGACGGAGGTAGAGACGCCTATTCGTAATGAATGGCTGCTTCTTACCGAAGTGGAAACCCCTATCCGTAATGAGTGGCTTTTATTAACTGAGGTTGAGACTCCAACAATCCGCAACGAATGGTGAGTCGAG CACCACCACCACCACCACTGA (SEQ ID NO: 4)。

本實施例的功能性胜肽包括：PE(ΔIII) (轉位肽)、具有免疫蛋白酶體切割序列之胜肽、A型流感病毒M2之N端表位重複多肽(M2-r7)以及羧基終端胜肽。

其中，包括複數免疫蛋白酶體切割序列之胜肽及A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽(M2-Nr7)的序列為：EF LLELLEDK LTEVETPTIRNEW LKLEDR LTEVETPIRNEW LL LTEVETPIRNEWLLLTEVETPTIRNEW LKLEDR LTEVETPIRNEW LL LTEVETPIRNEW LL LTEVETPTIRNEWL TEVETPTIRNEWLKLEDR LTEVETPIRNEWLL LTEVETPIRNEWLL LTEVETPTIRNEWLKLEDR LTEVETPIRNEWLL LTEVETPTIRNEW(SEQ ID NO: 1)。

接下來，將以本實施例所製備的功能性胜肽進行雞隻的抗禽流感H6N1試驗。

阻斷禽流感病毒的免疫力功效性試驗

試驗步驟

無特定病源的萊亨雞(Leghorn Specific-pathogen-free, SPF)是由淨旦生物科技股份有限公司(台灣桃園)所提供。

將50隻一天大的小雞分成a、b及c三組，其飼料分別添加0.05%、0.2%及0% (W/W)的功能性胜肽。a組及b組分別包括20隻雞，而c組(控制組)包括10隻雞。每天餵食一次，共餵食四週。每週收集血清。

此外，以添加有0.1% (W/W)含有功能性胜肽PE-M2-Nr7核心原料的飼料，餵食12隻15週大的公雞。於4週後收集血清。

檢測方法

禽流感酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)抗體偵測

在此，使用商業化(IDEXX)的A型流感抗體偵測ELISA套組，測量餵食含功能性胜肽飼料前的所有雞隻。實驗步驟係依照套組的使用說明操作。

以ELISA偵測抗eM2蛋白IgY及IgA

LISA檢測盤係塗佈有A型流感病毒的eM2抗原，以偵測雞隻血清中的抗M2蛋白IgY及IgA，其中A型流感病毒的eM2抗原是以載體表現及純化而得。實驗步驟係依照套組的使用說明操作。

斑點形成抑制測試

斑點形成能力去活化的偵測方法是依照“2008-12-15 Plaque assay under Avicel brief description modified for training at NIMR”進行，並稍加修改。在此使用H6N1病毒進行測試。將血清以1:2至1:32的比例連續稀釋，每個血清進行二重複試驗。以H6N1病毒感染雞纖維母細胞的細胞株(DF1細胞)，並進行斑點形成測試。將特敏福(Tamiflu) (1.2μg/mL)連續稀釋10^-1 至10^-6 倍，以作為本測試中的斑點形成抑制控制組，其中特敏福的作用為影響感染細胞的病毒釋放。將DF1細胞(10⁶ 個細胞)培養於12孔盤中。當細胞生長到填滿孔盤時，將H6N1 AIV(10 PFU/孔)接種至每個孔中，於室溫下培養一小時。培養完後，移除培養溶液並添加稀釋的測試血清。而後，添加含有0.3%洋菜膠(agarose)的為依格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)，並置於45°C的溫水浴中。當洋菜膠固化後，將孔盤移至含5% CO₂ 的培養箱中，並於37°C下培養三天。接著，將細胞以10%中性福馬林緩衝溶液固定60分鐘。將洋菜膠洗去，再將細胞晾乾。以1%的結晶紫染色細胞5分鐘。而後，以水洗去染色溶液後，觀察斑點的大小及計算斑點數量。

試驗結果

在餵食含功能性胜肽飼料前的抗A型流感病毒的雞隻血清抗體

在實驗進行前，收集所有雞隻的血清樣本以測量其A型流感病毒抗體。在此是使用商業化ELISA套組(IDEXX)進行實驗，結果顯示陰性。此結果表示，此批SPF雞隻在測試前不具有A型流感病毒抗體。

比較服用不同劑量的功能性胜肽之1至4週後雞隻內的禽流感eM2抗體

測量餵食添加有0.2%、0.05%及0%功能性胜肽的飼料的雞隻血清中抗eM2之IgY及IgA。結果如圖1至圖4所示。如圖1所示，持續餵食添加有功能性胜肽的飼料的SPF雞隻，可觀察到血清中抗eM2抗原的IgY陽性反應；且相較於控制組，添加有0.2%及0.05%功能性胜肽的組別有顯著差異(*: P > 0.05)。此外，如圖2所示，餵食添加有功能性胜肽的飼料的SPF雞隻四週後，血清中抗eM2抗原的IgY的陽性比率大幅提升。同樣的，如圖3所示，持續餵食添加有功能性胜肽的飼料的SPF雞隻，可觀察到血清中抗eM2抗原的IgA陽性反應；且相較於控制組，添加有0.2%及0.05%功能性胜肽的組別有顯著差異(*: P > 0.05)。此外，如圖4所示，餵食添加有功能性胜肽的飼料的SPF雞隻四週後，血清中抗eM2抗原的IgA的陽性比率大幅提升。

圖1至圖4結果顯示，持續於飼料中添加0.2%及0.05%功能性胜肽超過四週，雞隻血清中不僅含有抗流感病毒eM2的IgY抗體，於血清中更能測得黏膜免疫(mucosal immunity)的IgA。此結果顯示，雞隻口服功能性胜肽可誘發腸道黏膜免疫反應而產生IgA。

持續餵食15週大雞隻功能性胜肽四週後，抗eM2之IgY及IgA抗體偵測

於飼料中添加0.1%功能性胜肽，餵食15週大的雞隻。在持續四週餵食後，收集雞隻血清。以ELISA測量血清中的抗eM2之IgY及IgA，結果如圖5所示，其中對照1及對照2為餵食未添加功能性胜肽飼料的雞隻，而試驗1至試驗12為餵食0.1%功能性胜肽飼料的雞隻，每個對照及試驗組的左側長條為IgY數據，右側長條為IgA數據。當15週大的SPF雞隻持續餵食添加有0.1%功能性胜肽的飼料四週後，12隻雞中的11隻(91.6%)，血清中的抗eM2之IgY及IgA為陽性。此結果顯示，持續餵食功能性胜肽四週，能誘發抗eM2之體液(IgY)及黏膜(IgA)免疫反應。

餵食功能性胜肽的雞隻血清對禽流感病毒的病毒斑直徑抑制效果試驗

在此使用DF1細胞作為H6N1禽流感病毒感染平台，感染後產生的病毒斑如圖6所示。特敏福(Tamiflu)可抑制H6N1禽流感病毒感染後之病毒斑生成，如圖7所示的針狀小病毒斑，在此作為正控制組。使用15週大實驗組雞隻血清進行病毒斑直徑抑制試驗，結果如下表1及圖8所示。於圖8中，VC為病毒控制組，其未添加特敏福及血清的組別；正控制組為添加特敏福的組別；而其餘為添加不同血清稀釋濃度的組別。

表1

雞隻編號	病毒斑直徑抑制效價
1	1:16
2	1:16
3	1:4
4	1:32
5	1:32
6	1:32
7	1:16
8	1:32
9	1:32
10	1:8
11	1:16
12	1:8
負控制組	>1:4

如圖8所示，超過1:4的血清抑制效價表示陽性反應。如表1結果顯示，12隻雞隻血清的病毒斑抑制效價，其中5隻為1:32，4隻為1:16，2隻為1:8，1隻為1:4，平均效價超過1:16。若效價超過1:4為陽性，則在所測試的雞隻中，抗禽流感病毒病毒斑形成的抗體的陽性比率為91.6% (11/12)。

此外，如圖8所示，雞隻血清的病毒斑抑制效果與特敏福相似，其可抑制禽流感感染病毒釋放及再感染。

上述實驗結果顯示，無論是1天大的小雞或15週大的公雞，持續餵養含本揭露功能性胜肽的飼料超過四週，可提升抗流感病毒eM2抗原的體液及黏膜免疫反應，而可誘發抗流感eM2抗原的IgY及IgA。此外，體外細胞模型測試結果顯示，血清更含有能抑制禽流感病毒H6N1感染病毒斑形成的抗體。

因此，當本揭露的功能性胜肽添加至食品或飼料中，可誘發所需主體的抗eM2體液(IgY)及黏膜(IgA)免疫反應，進而提升對抗禽流感病毒的免疫力或抗病力。

上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本揭露所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。

無

圖1為服用不同劑量功能性胜肽1至4週後雞隻血清中抗H5N1的eM2之IgY測量結果圖。

圖2為服用不同劑量功能性胜肽1至4週後雞隻血清中抗H5N1的eM2之IgY之陽性比率結果圖。

圖3為服用不同劑量功能性胜肽1至4週後雞隻血清中抗H5N1的eM2之IgA測量結果圖。

圖4為服用不同劑量功能性胜肽1至4週後雞隻血清中抗H5N1的eM2之IgA之陽性比率結果圖。

圖5為服用0.1%功能性胜肽4週後雞隻血清中抗H5N1的eM2之IgY及IgA的檢測結果圖。

圖6為禽流感病毒H6N1於體外細胞模型中，病毒液序列稀釋後感作細胞後，斑點形成單元(PFU)之定量試驗結果圖。

圖7為以特敏福(Tamiflu)序列稀釋處理感作細胞盤，可以抑制病毒出芽再繁殖，所形成小尺寸斑點之有效濃度，做為具備阻斷出芽效果之陽性反應結果圖。

圖8為服用功能性胜肽後雞隻血清樣品兩倍序列稀釋後處理感作細胞盤，序列稀釋血樣的病毒斑形成之抑制試驗結果圖。

無。

Claims

一種食品添加劑，包括一功能性胜肽，其中該功能性胜肽包括：一轉位肽，其係用於轉位；複數具有免疫蛋白酶體切割序列之胜肽；一A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽；以及一羧基終端胜肽；其中該些具有免疫蛋白酶體切割序列之胜肽及該A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽位於該轉位肽及該羧基終端胜肽間，且該些具有免疫蛋白酶體切割序列之胜肽分別位於該A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽的兩胜肽間。
如申請專利範圍第1項所述的食品添加劑，其中該轉位肽係來自假單胞菌屬外毒素A。
如申請專利範圍第1項所述的食品添加劑，其中該轉位肽包含一僅去除第三部位(domain III)之假單胞菌屬外毒素A。
如申請專利範圍第1項所述的食品添加劑，其中該A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽包括一Th1表位。
如申請專利範圍第1項所述的食品添加劑，其中該羧基終端胜肽來自假單胞菌屬外毒素。
如申請專利範圍第1項所述的食品添加劑，其中該羧基終端胜肽係包括KDEL之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項所述的食品添加劑，其中該羧基終端胜肽係KDEL、RDELKDEL、KDELRDELKDEL、KKDLRDELKDEL、KKDELRVELKDEL、KKDELRDELKDEL、或KLDYLKKDELRDELKDEL。
如申請專利範圍第1項所述的食品添加劑，其中該具有免疫蛋白酶體切割之胜肽的序列為LLELLEDK、LKLEDRL、LL或L。
如申請專利範圍第1項所述的食品添加劑，其中該A型禽類流行性感冒病毒M2之N端之表位的重複多肽的序列包括LTEVETPTIRNEW、LTEVETPIRNEW或其組合。