CN101954075A - 转基因盐藻制备口服型禽流感疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转基因盐藻制备口服型禽流感疫苗的方法，尤其是将盐藻自身的调控元件引入并构建含有禽流感病毒HA、NA重组基因的双元表达载体，然后转化盐藻，经筛选和鉴定，确定高表达重组C3d-H5N1融合蛋白的盐藻转化藻株。再通过稳定表达C3d-H5N1融合蛋白转化藻株的放大和大规模开放培养，离心收集藻细胞，冷冻干燥，无菌条件下分装、制备成口服型禽流感疫苗胶囊。本方法制备的盐藻转化藻株，可供开放培养，因此产量高、成本低，从而实现转基因盐藻制备口服型动物禽流感疫苗的规模化生产，满足市场需求。

Description

转基因盐藻制备口服型禽流感疫苗的方法

技术领域

本发明涉及微藻（盐藻）基因工程，尤其是一种转基因盐藻制备口服型禽流感疫苗的方法，具体是将盐藻自身的调控元件引入并构建高效表达载体，建立高效的禽流感病毒基因表达系统，为口服型疫苗的生产提供了技术平台。

背景技术

禽流感(Avian influenza, AI) 是由流感病毒引起的一种以侵害呼吸系统为主的疾病，自1878年在意大利发现至今已有一百多年的历史，由于候鸟的迁徙，该病毒在全球范围内扩散，给人类健康和畜禽业生产带来了极大的危害。中国是第一养禽大国，养禽总量达130亿羽，同时我国具有禽类较多，水禽分布广泛，饲养粗放、开放，能与野生鸟类密切接触的特点，是禽流感多发、受到严重危害和威胁的国家之一。

国内外的禽流感防治实践表明，疫苗免疫是防止禽流感暴发和造成巨大损失的主要措施和关键环节。20 世纪生物技术的飞跃发展，促进了疫苗学的形成与发展，以疫苗等生物制品为中心的生物技术研究已经成为全球发展最快的领域之一，而疫苗学在预防禽流感中所起到的作用也是世人所瞩目的。目前，应用的禽流感常规疫苗主要是灭活疫苗。近20 年来，灭活疫苗的制备技术不断改进，并已经广泛应用于禽的免疫，大量的临床试验已证实其可以有效地阻止临床发病和死亡。业已证明，疫苗免疫预防是控制禽流感最经济和有效的途径。据报道通过禽流感疫苗免疫接种预防，每年至少可减少经济损失300亿元以上。

传统疫苗预防控制禽流感虽然经济、有效，但其制造方法、免疫程序及免疫效果的可靠性，大面积应用的可行性及动物安全性，均存在不少缺陷，而且其制造成本高，需要用耗时长的注射方式接种。据报道目前所采用的肌肉注射疫苗的方式必须对每只禽类进行注射，每次注射要花半分钟时间，一个规模2万只的养鸡场每次疫苗接种就需要用7天。而使用可掺和在饲料中禽流感口服疫苗，能同时为上千只禽类进行接种，用20分钟时间就能为整个养鸡场接种疫苗。最近，俄罗斯圣彼得堡全俄家养禽兽医科研所和俄罗斯医学科学院圣彼得堡流感研究所的科学家，曾经研究可掺和在饲料中的口服禽流感（H5N1）疫苗。国内学者通过农杆菌介导的方法将禽流感病毒H5N1的HA基因转化烟草，检测到HA基因在转基因烟草中得到表达，获得了能够表达HA基因的植物口服疫苗候选植株。为发展转基因植物生产禽流感口服疫苗开辟了新途径。

与微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比，转基因植物制备的口服疫苗具有许多潜在的优势，特别是利用可食性植物如蔬菜、水果等生产口服型疫苗，由于可大规模种植、生产成本低廉，又不涉及有关转基因动物的伦理道德问题，受到广泛重视和研究。但是，这些植物生长受季节性限制，而且即使是可直接食用的水果、蔬菜也不可能经常生食，加之食用不方便，因此不可能在人群尤其儿童中广泛推广。此外，植物源疫苗还存在生物安全性问题，如转基因植物中外源基因有可能漂移到环境中使生态环境受到破坏以及近缘植物之间交叉授粉是否会导致野生种的杂草化、携带抗生素或除草剂类选择性标记基因的转基因植物是否安全等。 可见寻找环保、安全和便于食用的植物作为转基因制备口服疫苗的宿主是非常必要的。

杜氏盐藻（以下简称盐藻）属绿藻门团藻目，是一种原生质裸露的嗜盐性浮游单细胞真核绿藻，长约6～15μm，呈椭圆形或梨形，无细胞壁只有细胞膜，且有双鞭毛，能在水中游动，有一个大型杯状叶绿体约占细胞体积的48%左右，兼具动植物细胞的生物学特点。该藻的突出优点在于培养条件极其简单，光合自养，抗逆性极佳，可在0.05～5M的盐水中生长。基于盐藻的这些生物学特点，转基因盐藻生物反应器比传统的生物反应器更具有优越性：

①盐藻为单细胞生物，繁殖快，无季节性生长限制，便于遗传突变体的筛选。

②遗传操作比较容易：盐藻属于低等的真核绿藻，结构简单，无细胞壁，而且基因组相对较小。

③成本低：盐藻属自养生物，不需要昂贵的培养基，只需适宜的光照，温度和无机盐，培养成本低廉。盐藻可在高渗盐培液中生长，这是许多其它生物难以生存的环境，故其大规模培养不需昂贵的发酵罐等设备，可直接采用开放式培养，因此生产成本低。

④保证产品的活性和质量：盐藻为真核生物，其表达产物可自行完成翻译后加工，如二硫键形成，蛋白质糖基化等，因此简化了基因工程技术下游工艺并能保证产品的活性和质量。

⑤盐藻的培养可采用易于控制的培养方法，可避免转基因植物因近缘物种间交叉授粉可能导致的野生种的杂草化或因外源基因漂移使生态环境受到破坏等生物安全性问题。

⑥盐藻本身无毒，而且富含多种天然维生素和多不饱和脂肪酸，食用价值高。如果用盐藻生产口服型疫苗，甚至无须纯化即可直接服用，大大降低生产成本。因此，利用转基因盐藻大规模生产供人/禽用的口服型疫苗，具有明显优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种克服上述缺陷的动物用的口服型禽流感疫苗。本发明所提供的一种基因工程疫苗制备方法，主要是利用盐藻固有的生物学特点，将盐藻自身的调控元件引入并构建高效表达载体，建立禽流感病毒基因表达系统，为更加经济地制备口服型疫苗提供了平台。

本发明的转基因盐藻制备口服型禽流感疫苗的方法，是将盐藻自身的调控元件引入并构建含有禽流感病毒HA、NA重组基因的双元表达载体，然后转化盐藻，经筛选和鉴定，确定高表达重组C3d-H5N1融合蛋白的盐藻转化藻株。再通过稳定表达C3d-H5N1融合蛋白转化藻株的放大培养，制备成口服用禽流感疫苗。

将盐藻自身的调控元件引入并构建含有禽流感病毒HA重组基因的双元表达载体的具体方法包括：

①中间载体 p7-Pnr-nr-Tnr的构建：利用盐藻硝酸盐还原酶（NR）基因5’上游序列（Pnr）和3’端序列(Tnr) 分别作为启动子和终止子，以盐藻NR基因为选择标记基因，构建含Pnr-nr-Tnr筛选标记表达盒的中间载体；

    ②中间载体pActin-C3d-H5N1的构建：将小鼠补体C3d基因片段和禽流感病毒H5N1血凝素（HA）基因、神经氨酸酶（NA）基因顺序连接成C3d-H5N1融合基因；以盐藻actin基因启动子（Pat）和终止子（Tat）为表达调控元件，构建含Pat-C3d-H5N1-Tat表达盒的中间载体pActin-C3d-H5N1；

③盐藻双元表达载体pMNCH的构建：利用盐藻DSM1序列，构建含两个同向的MAR序列的中间载体pDMM。将Pnr-nr-Tnr表达盒和Pat-C3d-H5N1-Tat表达盒顺序连接、插入到两个同向MAR序列之间，构建高效的禽流感疫苗基因盐藻双元表达载体pMNCH。

该制备方法还包括检测由这种转化藻株制备的口服疫苗对禽类的免疫效力及免疫保护维持时间。

本发明的优点在于：通过基因工程技术，建立了能够高表达重组C3d- H5N1融合蛋白的盐藻转化藻株，这种转化藻株适用于开放式培养，因此产量高、生产成本低，从而实现转基因盐藻制备口服型动物禽流感疫苗的规模化生产，满足市场需求。

 

附图说明

图1 禽流感疫苗HA和NA基因盐藻双元表达载体pMNCH的构建模式图

Pnr-nr-Tnr：氮源可控性筛选标记表达盒

 C-HN：分子免疫佐剂C3d基因和HA和NA基因的融合基因

MAR序列：利于定点整合，提高表达效率和降低转基因沉默

图2.禽流感疫苗HA和NA基因盐藻双元表达载体pMNCH的构建流程图

具体实施方式

本发明所述的转基因盐藻制备口服型禽流感疫苗方法，是采用基因工程等方法获得的禽流感病毒HA、NA基因的重组基因构建盐藻双元表达载体，然后转化盐藻，再通过筛选和鉴定，确定高表达重组C3d-H5N1融合蛋白的盐藻转化藻株。继之大规模培养转化藻株，离心收集藻细胞，冷冻干燥，无菌条件下分装、制备成口服用禽流感疫苗胶囊。

下面通过结合实施例详细叙述本发明的具体内容：

实施例1、禽流感病毒HA基因盐藻表达载体的构建

 （1）盐藻硝酸盐还原酶（NR）基因cDNA的克隆与鉴定: 取10 ml生长至对数生长期的杜氏盐藻细胞，按Trizol说明书提取总RNA，电泳分析其完整性，测纯度，定量。按逆转录酶试剂操作说明合成cDNA。根据GenBank 登录的盐藻 NR cDNA序列（GenBank登录号：AY312143.1），设计引物如下：

           nr1:5′-atgcccgcactcgccaacaacaca-3′；

           nr2:5′-tcagaagctcaccgtgcgctcttt-3′

以cDNA为模板，扩增盐藻NR基因，PCR反应体系为94 ℃预变性2.5 min，94 ℃变性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环，72 ℃延伸5 min，4℃终止反应。产物克隆到pMD18-T载体上，挑选酶切鉴定正确的克隆进行测序。

 （2）盐藻基因组DNA的提取:取对数生长期的盐藻10 ml ,5000 r/min离心15 min ,弃上清,利用修饰的SDS法提取盐藻基因组DNA：加SDS裂解缓冲液（Tris-HCl 10 mmol/L，EDTA 100 mmol/L SDS 0.5%）3 mL，37℃ 1 h；加蛋白酶K至终浓度100μg/ml，用宽口径移液管上下移取溶液5次，当样品呈透明状时，才能进行下一步，否则，颗粒碎片在随后的提取分离中得到捕获，50℃水浴3 h。室温冷却，加等体积的酚/氯仿：异戊醇（体积比25：24：1）混匀，12000 r/min离心15 min，转移上清至另一离心管，重复抽提两次。加入1/12体积的5 mol/L NaCl，加入2.5倍冷无水乙醇，4℃放置10 min，12000 r/min离心10 min，70%乙醇洗去沉淀盐类，12000 r/min离心10 min，吹干沉淀，加60μl无菌超纯水溶解，最后经RNase A 消化去除RNA。各取3μl基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳并测其OD 260/280，检查其纯度及含量。

  （3）PCR扩增盐藻NR基因5′及3′侧翼区:根据GenBank 登录的盐藻NR基因

5′及3′侧翼区序列（GenBank登录号：DQ217416.1、EF156403.1和EF535104.1），合成如下引物：

        Pnr1:5′-agccttcagcttagacagcatcatctcg-3′；

        Pnr2:5′-gtgttgttggcgagtgcgggcat-3′；

        Tnr1:5′-atctctttcatttcagtatcagga-3′；

        Tnr2:5′-tcgatcagcctttgcaatccctc-3′

以上述盐藻基因组DNA为模板，分别以Pnr1和Pnr2为引物进行PCR扩增盐藻NR基因5′侧翼区；以Tnr1和Tnr2为引物进行PCR扩增盐藻NR基因3′侧翼区。

PCR反应条件为94℃ 30 s，55℃ 2 min，72℃ 1 min，29个循环；将产物克隆到pMD18-T 载体上，挑选酶切鉴定正确的克隆进行测序。

  （4）中间载体p7-Pnr-nr-Tnr的构建:利用上述已克隆并鉴定的盐藻NR基因5’上游序列（Pnr）和3’ 端序列(Tnr) 分别作为启动子和终止子，以盐藻硝酸盐还原酶（NR）基因为选择标记基因，将Pnr、NR基因和Tnr切下、补平，顺序连接成Pnr-nr-Tnr表达盒，并在表达盒的上下游均引入Xho I位点，连接入质粒pGEM-7zf(+)(Promega 公司)的Xho I位点，构建中间载体p7-Pnr-nr-Tnr。

  （5）小鼠补体C3d基因片段和禽流感病毒H5N1 血凝素（HA）基因、神经氨酸酶（NA）基因的克隆及C3d-HANA融合基因的连接:取BALB/c小鼠新鲜肝脏5g，匀浆后抽提mRNA，电泳分析其完整性，测纯度，定量。按逆转录酶试剂操作说明合成cDNA。根据GenBank 登录的小鼠补体C3d基因片段的序列（GenBank登录号： DQ408205.1），设计引物如下：

            cd1:5′-acccccgcaggctgtggggaacagca-3′；

            cd2:5′-gctacggctggggaggtggaagga-3′

以小鼠肝脏cDNA为模板，扩增补体C3d基因片段（897 bp），PCR反应体系为94 ℃预变性2.5 min，94 ℃变性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃终止反应。产物克隆到pMD18-T载体上，挑选酶切鉴定正确的克隆进行测序。

根据GenBank 登录的禽流感病毒H5N1 血凝素（HA）基因、神经氨酸酶（NA）基因的序列（GenBank登录号：HQ200450.1和HQ200451.1），设计引物如下：

      ha1:5′-atagtgcttctttttgcgatag-3′；

      ha2:5′-aatgcaaattctgcattgtaacg-3′；

      na1:5′-ccaaatcagaagataataaccat-3′；

     na2:5′-cttgtcaatggtgaatggcaactc-3′

以禽流感病毒H5N1标准株，抽提RNA，按逆转录酶试剂操作说明合成cDNA。以cDNA为模板，分别扩增扩增禽流感病毒H5N1 HA基因和NA基因，PCR反应体系为94 ℃预变性2.5 min，94 ℃变性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃终止反应。产物克隆到pMD18-T载体上，挑选酶切鉴定正确的克隆进行测序。

将上述已克隆并鉴定的小鼠补体C3d基因片段和禽流感病毒H5N1血凝素（HA）基因、神经氨酸酶（NA）基因从克隆载体上切下、补平，顺序连接成C3d-H5N1融合基因。

  （6）PCR扩增盐藻肌动蛋白（actin）基因5′及3′侧翼区:根据本发明人从前的研究（Acta Genetica Sinica，2005，32:424一433）和GenBank 登录的盐藻actin基因5′及3′侧翼区序列（GenBank登录号：AF539623.1和AF163669.2），合成如下引物：

          Pat1:5′-tcaccatcttgtttcccgagctag-3′；

          Pat2:5′-tctgtcaccccttccctacgcgt-3′；

          Tat1:5′-catccaatttcaagtaactccaatc-3′；

          Tat2:5′-gaatccaactcctccctgggagc-3′

以上述盐藻基因组DNA为模板，分别以Pat1和Pat2为引物进行PCR扩增盐藻actin基因5′侧翼区；以Tat1和Tat2为引物进行PCR扩增盐藻actin基因3′侧翼区。

PCR反应体系为94 ℃预变性2.5 min，94 ℃变性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共同30个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃终止反应。产物克隆到pMD18-T载体上，挑选酶切鉴定正确的克隆进行测序。

   （7）中间载体pActin-C3d-H5N1的构建：利用上述已克隆并鉴定的盐藻actin基因5′侧翼区（Pat）和actin基因3′侧翼区（Tat）分别作为启动子和终止子，以C3d-H5N1融合基因为外源基因，将Pat序列、C3d-H5N1融合基因、Tat序列切下、补平，顺序连接成Pat-C3d-H5N1-Tat表达盒，并在表达盒的上下游均引入Xba I位点，连接入质粒pUC18的Xba I位点，构成中间载体pActin-C3d-H5N1。

  （8）盐藻核基质结合区(MAR)片段DSM1序列的克隆:根据GenBank 登录的盐藻核基质结合区(MAR)片段DSM1序列（GenBank登录号：AY583586.1），设计引物如下：

            MAR1：5′-aaggttattgttaaagcggg-3′；

            MAR2：5′-aaggtttttttcgtaaagag-3′

以盐藻基因组DNA为模板， PCR扩增盐藻核基质结合区(MAR)片段DSM1序列。

PCR反应条件为94℃ 30 s，55℃ 2 min，72℃ 1 min，29个循环；将产物克隆到pMD18-T 载体上，挑选酶切鉴定正确的克隆进行测序。

   （9）中间载体pDMM的构建:利用上述已克隆并鉴定的盐藻DSM1序列，分别切下、补平，同向连接到载体pUC18的EcoR I/Hind III位点，并在两个序列间添加Xba I和Xho I位点，构建成含两个同向的盐藻DSM1序列的中间载体pDMM。

   （10）盐藻双元表达载体pMNCH的构建：

将上述构建的中间载体p7-Pnr-nr-Tnr和pActin-C3d-H5N1分别用Xho I切下Pnr-nr-Tnr表达盒，用Xba I切下Pat-C3d-H5N1-Tat表达盒，再依次插入中间载体pDMM的Xho I位点和Xba I位点，酶切鉴定其方向，挑选片段方向与盐藻DSM1序列相同的克隆，构建成高效的禽流感基因盐藻双元表达载体pMNCH（图1，2）。

 

实施例2、转化藻株的筛选和鉴定

（1）筛选：将盐藻高效表达载体pMNCH通过基因枪法转化盐藻硝酸盐营养缺陷型藻株，用接种环划线于以硝酸盐为唯一氮源的固体盐藻培养基上，7天后观察转化细胞的生长情况并计算转化率。挑取在硝酸盐为唯一氮源的盐藻固体培养基上能够恢复生长的单藻落细胞，分别用液体盐藻培养基扩大培养，进一步检测和鉴定。

（2）氯酸盐毒性鉴定：具有NR活性的盐藻细胞因对氯酸盐毒性敏感而死亡，将转化的盐藻细胞划线于含有氯酸盐的固体培养基上，观察氯酸盐对盐藻转化细胞的毒性。

（3） Southern blots：利用修饰的SDS法提取盐藻野生型和转化株基因组DNA，将转化株和野生型基因组DNA分别用Xba I、Hind III和EcoR I过夜酶切，鉴定酶切完全后，配制无EB的0.8%琼脂糖凝胶，将酶切过的基因组点样后电泳，分别与H5N1基因探针和C3d基因探针杂交，确定外源基因是否已整合入盐藻基因组中。

（4） 实时荧光定量RT-PCR：根据表达载体上H5N1和C3d基因序列设计引物，提取各转化株及对照藻株总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，应用实时荧光定量PCR 法检测转化盐藻细胞H5N1基因、C3d基因和C3d-H5N1融合基因的mRNA表达，从而在转录水平分析已转化的盐藻细胞外源基因的表达量。

（5） Western blots：用蛋白裂解液提取生长至对数期的pMNCH载体转化株细胞和野生型的细胞总蛋白，用考马斯亮蓝标准曲线法测蛋白浓度, -20℃保存备用。SDS-PAGE电泳及Western blots分析C3d-H5N1融合蛋白的表达量。，并且将各转化株用不同浓度的NaCl诱导，分析重组C3d-H5N1融合蛋白的诱导表达情况。

（6） ELISA试验：在ELISA板的小孔中加入50 μl的蛋白提取液，按“禽流感病毒H5N1诊断试剂盒（酶联免疫法）”使用说明进行检测。用酶标仪于450 nm处测量吸收值。

 

实施例3、盐藻禽流感疫苗的免疫学实验：

（1）抗体产生试验：将80只35日龄试验鸡随机分为4组，每组20只。Ⅰ组拌料转基因盐藻量为10g/KG；Ⅱ组拌料转基因盐藻量为5g/KG；Ⅲ组拌料转基因盐藻量为1g/KG；Ⅳ组（对照组）拌料野生型盐藻量为10g/KG。免疫后分别在7、14、21、28、35、42和49天心脏采血分离血清，测其血清HI抗体水平。

.血凝试验：采用96孔V型反应板，测定抗原效价

a.首先用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25 μl。

b.用微量移液器吸取待测抗原25 μl于第一 1孔中并挤压6次混合，后吸出25 μl至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25μl。

c.微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25μl。

d.置于微量振荡器上振荡1 min。

e.室温静置30 min后观察结果。

f.结果观察：将反应板倾斜成45°，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。

 4 u抗原校正：

a.首先用微量移液器向反应板的第二孔至第六孔加生理盐水25μl。第1孔不加。

b.用微量移液器吸取4 u抗原25μl分别加入第1孔、第2孔中，从第2孔开始挤压6次混合，后吸出25μl至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25μl。

c.用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-6孔，每孔25 μl。

d.于微量振荡器上振荡1 min。

e.室温静置30 min后观察结果。

f.结果观察：第1、2、3孔为完全凝集，第4孔红细胞为50%沉淀，第5孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4 u抗原准确，校正成立。

血凝抑制（HI）试验：每排孔检查1份血清。步骤如下：

a.用微量移液器先加25μl生理盐水于各孔中。

b.用微量移液器吸取待检血清25μl置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去25μl。最后一孔不稀释，作为对照。

c.用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25μl。

d.置于微量振荡器上振荡1 min，混合均匀。

e.室温下静置20 min。

f.每孔各加25μl的1%红细胞悬液。

g.置于微量振荡器上振荡1 min，混合均匀。

h.室温静置40 min后观察结果。

（2）攻毒保护试验：免疫后21天, 4组鸡同时用4-10倍稀释的H5N1尿囊液攻击(口服、滴鼻、点眼或肌注), 每只 0.2 ml, 隔离饲养, 观察14天,记录发病及死亡鸡数,并剖检病死鸡的病理变化, 观察疫苗的保护效果。

免疫保护力产生时间的检测

取80只35日龄试验鸡拌料转基因盐藻量为5g/KG; 在免疫后的3、5、7、9、11、13和15天各取出8只，同时用1－10倍稀释的H5N1尿囊液攻击(口服、滴鼻、点眼、肌注), 每只 0.2 ml, 隔离饲养, 观察14天,记录发病死亡情况,并剖检病死鸡的病理变化, 观察疫苗的保护效果。

不同抗原含量的疫苗的免疫效力及免疫保护维持时间检测

将240只180日龄试验鸡随机分为四组,每组60只。Ⅰ组拌料转基因盐藻量为10g/KG;Ⅱ组拌料转基因盐藻量为5g/KG;Ⅲ组拌料转基因盐藻量为1g/KG;Ⅳ组拌料野生型盐藻量为10g/KG。四组试验鸡在免疫后的21天、42天、84天、168天、252天和336天各取出8只，同时用4－10倍稀释的H5N1尿囊液攻击(口服、滴鼻、点眼、肌注), 每只 0.2 ml, 隔离饲养, 观察14天,记录发病死亡情况,并剖检病死鸡的病理变化, 观察疫苗的保护效果。

Claims (3)

1.一种转基因盐藻制备口服型禽流感疫苗的方法，其特征在于：是将盐藻自身的调控元件引入并构建含有禽流感病毒HA、NA重组基因的双元表达载体，然后转化盐藻，经筛选和鉴定，确定高表达重组C3d-H5N1融合蛋白的盐藻转化藻株；再通过稳定表达C3d-H5N1融合蛋白转化藻株的放大培养，制备成口服用禽流感疫苗。

2.根据权利要求1所述的转基因盐藻制备口服型禽流感疫苗方法，其特征在于：盐藻自身的调控元件引入并构建含有禽流感病毒HA、NA重组基因的双元表达载体的方法包括：

①中间载体 p7-Pnr-nr-Tnr的构建：利用盐藻NR基因5’上游序列（Pnr）和3’ 端序列(Tnr) 分别作为启动子和终止子，以盐藻硝酸盐还原酶（NR）基因为选择标记基因，构建含Pnr-nr-Tnr筛选标记表达盒的中间载体；

②中间载体pActin-C3d-H5N1的构建：将小鼠补体C3d基因片段和禽流感病毒H5N1血凝素（HA）基因、神经氨酸酶（NA）基因顺序连接成C3d-H5N1融合基因；以盐藻actin基因启动子（Pat）和终止子（Tat）为表达调控元件，构建含Pat-C3d-H5N1-Tat表达盒的中间载体pActin-C3d-H5N1；

③盐藻双元表达载体pMNCH的构建：利用盐藻DSM1序列，构建含两个同向的MAR序列的中间载体pDMM；将Pnr-nr-Tnr表达盒和Pat-C3d-H5N1-Tat表达盒顺序连接、插入到两个同向MAR序列之间，构建高效的禽流感疫苗基因盐藻双元表达载体pMNCH。

3.根据权利要求1所述的转基因盐藻制备口服型禽流感疫苗的方法，其特征在于：该制备方法还包括检测由这种转化藻株制备的口服疫苗对禽类的免疫效力及免疫保护维持时间。

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