CN110117544A - 可防控石斑鱼神经坏死病的转基因微藻、饲料及应用 - Google Patents

可防控石斑鱼神经坏死病的转基因微藻、饲料及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种含有SEQ ID NO.1所示序列或与该基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列的外壳蛋白基因的表达载体，该表达载体转化后得到的转基因微藻，以及含有该转基因微藻的饲料。本发明采用含有本发明外壳蛋白基因的表达载体，通过遗传转化石斑鱼幼鱼可食用的微藻后，喂食石斑鱼幼鱼，使石斑鱼持续获得抗原的刺激免疫，达到对鱼类病毒性神经坏死病的预防和治疗，能有效防控石斑鱼神经坏死病，具有环境友好的特色和较高的商业应用价值，例如具体实施方式中将含有本发明外壳蛋白基因表达载体转化衣藻，获得工程藻株，喂养石斑鱼幼鱼，能够有效降低石斑鱼神经坏死病病死率。

Description

可防控石斑鱼神经坏死病的转基因微藻、饲料及应用
技术领域
本发明涉及一种可防控石斑鱼神经坏死病的转基因微藻、饲料及应用。
背景技术
鱼类病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis，VNN)是养殖鱼类常见的疾病之一，主要感染40余种海洋鱼类的幼鱼和稚鱼，给水产苗种养殖企业带来巨大的经济损失(Lin C al.,2007Mu Y al.,2013)，患病鱼临床症状为食欲降低、行为异常、转圈、鱼体发黑、或腹部朝上漂浮于水面，难于下沉，病鱼腹部肿大(Costa JZ al.，2016)，累积死亡率可达到65-100％。珍珠龙胆石斑鱼，是棕点石斑鱼(俗称老虎斑，母本)与鞍带石斑鱼(俗称龙胆斑，父本)杂交培育的新品种，除食用之外，还可以用作观赏鱼养殖，市场前景广阔。由于受神经坏死病毒(nervous necrosis virus，NNV)感染，使珍珠龙胆石斑鱼育苗生产造成极大损失。目前对于此病毒病还没有特效药物。VNN的病原是病毒性神经坏死病毒(nervousnecrosis virus，NNV)，在分类上属于罗达病毒科(Nodaviridae)，野田村病毒属，由2个分子的单股正链RNA1和RNA2组成病毒基因组，分别编码复制酶和外壳蛋白(CP)(Munday B Let al.,2002)。
目前对于此病毒病还没有特效药物，治疗方式有鱼用疫苗或口服免疫等。鱼用疫苗包括传统的灭活疫苗、减毒疫苗、多价疫苗，以及新型疫苗，如合成肽疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗。新型疫苗基本都是通过基因工程的方法将抗原基因转入大肠杆菌，获得抗原蛋白(合成肽疫苗、亚单位疫苗)，或直接将抗原基因转入鱼基因组中(DNA疫苗)，获得持续的保护作用。疫苗接种方法有三种方式：即注射、浸泡、口服。由于幼鱼和稚鱼体质羸弱，发育不全，通过传统的注射鱼身获得免疫的方法将造成鱼苗极大的伤害，从而造成很高的死亡率。口服免疫是近年发展起来的一种新型的接种方式，有关鱼类口服免疫机制，一般认为鱼类口服疫苗在肠道蠕动作用下，小分子抗原可经肠粘膜细胞间隙渗透进入血液；大分子抗原则由肠粘膜附着的巨嗜细胞吞噬后，提呈到达相关的淋巴组织，也可经细胞间转运，运输到循环系统，经血液或淋巴液转运至淋巴结产生免疫反应(Schep et al.,1999)。该机制已在鲤鱼(Cyprinus carpio)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、金鱼(Carassius auratus)等多种鱼类中得到证实(Rombout et al.，1985；Ezeasor et al.,1980；Temkin et al.,1986)。罗晓春等(2005)对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)相关免疫组织结构进行了研究，结果表明眼角膜、鳃、前肠及后肠等粘膜组织中存在杯状细胞、淋巴细胞、巨嗜细胞等免疫相关细胞，具有完成免疫应答的细胞基础。口服疫苗的优点是操作方便，对鱼体无损伤；缺点是免疫效果比注射法低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，构建含本发明外壳蛋白基因的表达载体，通过遗传转化微藻，得到的转基因微藻，可用于石斑鱼病毒性神经坏死病的生物防控，具有环境友好的特色和较高的商业应用价值。
本发明的第一个方面是提供一种防治石斑鱼病毒性神经坏死病的饲料，其含有转基因微藻，所述转基因微藻由含有外壳蛋白基因的表达载体转化石斑鱼幼鱼可食用的微藻制成，其中，所述外壳蛋白基因为下列核苷酸序列之一：
1)石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白(NNVCP)基因，序列表中SEQ ID NO.1所示序列；
2)与石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白(NNVCP)基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
其中，所述表达载体含有接受载体和所述外壳蛋白基因。
其中，所述接受载体是多基因组装过程中接受和承载外源基因片段的载体，可以采用基因组装过程中常用的接受载体，本发明对此不作特别限定。在本发明的一个具体的实施方式中，所述接受载体采用pCAMBIA1302，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒等。优选地，所述接受载体为pCAMBIA1302，所述外壳蛋白基因位于pCAMBIA1302载体的NcoⅠ和SpeⅠ两限制性内切酶位点之间。
优选地，所述微藻为衣藻(例如莱茵衣藻等)、小球藻(例如核蛋白小球藻，普通小球藻等)。
本发明的第二个方面是提供一种防治石斑鱼病毒性神经坏死病的转基因微藻，其由含有外壳蛋白基因的表达载体转化石斑鱼幼鱼可食用的微藻制成，其中，所述外壳蛋白基因为下列核苷酸序列之一：
1)石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白(NNVCP)基因，序列表中SEQ ID NO.1所示序列；
2)与石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白(NNVCP)基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
优选地，所述微藻为衣藻(例如莱茵衣藻等)、小球藻(例如核蛋白小球藻，普通小球藻等)。
其中，所述表达载体含有接受载体和所述外壳蛋白基因。
其中，所述接受载体是多基因组装过程中接受和承载外源基因片段的载体，可以采用基因组装过程中常用的接受载体，本发明对此不作特别限定。在本发明的一个具体的实施方式中，所述接受载体采用pCAMBIA1302，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒等。优选地，所述接受载体为pCAMBIA1302，所述外壳蛋白基因位于pCAMBIA1302载体的NcoⅠ和SpeⅠ两限制性内切酶位点之间。
本发明的第三个方面是提供一种防治石斑鱼病毒性神经坏死病的表达载体，其含有外壳蛋白基因，所述外壳蛋白基因为下列核苷酸序列之一：
1)石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白(NNVCP)基因，序列表中SEQ ID NO.1所示序列；
2)与石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白(NNVCP)基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
其中，所述表达载体含有接受载体和所述外壳蛋白基因。
其中，所述接受载体是多基因组装过程中接受和承载外源基因片段的载体，可以采用基因组装过程中常用的接受载体，本发明对此不作特别限定。在本发明的一个具体的实施方式中，所述接受载体采用pCAMBIA1302，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒等。优选地，所述接受载体为pCAMBIA1302，所述外壳蛋白基因位于pCAMBIA1302载体的NcoⅠ和SpeⅠ两限制性内切酶位点之间。
本发明的第四个方面是提供本发明第一个方面所述的饲料、本发明第二个方面所述的转基因微藻、或者本发明第三个方面所述的表达载体在制备石斑鱼病毒性神经坏死病的制品中的应用。
本发明的第五个方面是提供外壳蛋白基因在制备防治石斑鱼病毒性神经坏死病的制品中的应用，其中，所述外壳蛋白基因为下列核苷酸序列之一：
1)石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白(NNVCP)基因，序列表中SEQ ID NO.1所示序列；
2)与石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白(NNVCP)基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
其中，所述应用是采用含有所述外壳蛋白基因的表达载体转化石斑鱼幼鱼可食用的微藻，制成石斑鱼幼鱼饵料，来防治石斑鱼病毒性神经坏死病。
优选地，所述微藻为衣藻(例如莱茵衣藻等)、小球藻(例如核蛋白小球藻，普通小球藻等)。
其中，所述表达载体含有接受载体和所述外壳蛋白基因。
其中，所述接受载体是多基因组装过程中接受和承载外源基因片段的载体，可以采用基因组装过程中常用的接受载体，本发明对此不作特别限定。在本发明的一个具体的实施方式中，所述接受载体采用pCAMBIA1302，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒等。优选地，所述接受载体为pCAMBIA1302，所述外壳蛋白基因位于pCAMBIA1302载体的NcoⅠ和SpeⅠ两限制性内切酶位点之间。
本发明采用含有本发明外壳蛋白基因的表达载体，通过遗传转化石斑鱼幼鱼可食用的微藻后，喂食石斑鱼幼鱼，使石斑鱼持续获得抗原的刺激免疫，达到对鱼类病毒性神经坏死病的预防和治疗，能有效防控石斑鱼神经坏死病，具有环境友好的特色和较高的商业应用价值，例如具体实施方式中将含有本发明外壳蛋白基因表达载体转化衣藻，获得工程藻株，喂养石斑鱼幼鱼，能够有效降低石斑鱼神经坏死病病死率。
附图说明
图1为NNVCP的PCR琼脂糖凝胶电泳图。1、2、3、4：NNVCP PCR扩增产物，M：DNAMaker-DL 10000。
图2为重组质粒pCAMBIA1302-NNVCP酶切鉴定结果。4、5：pCAMBIA1302-NNVCP，1、M2：DNA Maker-DL 10000。
图3为转基因藻株(A)及其DNA进行PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图(B)。1、2：部分转基因藻株PCR扩增产物，M：DNA Maker-DL 10000。
图4为麻醉后的珍珠龙胆石斑鱼苗。
图5为进行石斑鱼腹腔消毒(左)和腹腔注射神经坏死病毒(右)的工作图。
图6为石斑鱼苗攻毒后7天存活率统计结果。NNVCP-14、NNVCP-15、NNVCP-16：喂食的转基因藻株石斑鱼；饲料：喂食饲料的石斑鱼；CC425：喂食非转基因藻株CC425的石斑鱼。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
一、pCAMBIA1302-NNVCP重组载体的构建
石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白(NNVCP)基因(GenBank登录号：AF245004，序列表中SEQ ID NO.1所示序列)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
将人工合成NNVCP基因连接在pUC57质粒上，得到载体pUC57-NNVCP。对pUC57-NNVCP人工合成载体进行DNA的获取，使用引物
NNVCP-1302–F：TACCTCGCGAATGCATCTAGATAT；
NNVCP-1302-R：CTGCACTAGTCGGGCCCTTAGTTTTC，
对pUC57-NNVCP进行PCR扩增，并进行电泳进行验证(NNVCP目的片段大小1017bp)(图1)。
回收NNVCP的PCR扩增产物，利用NcoⅠ和SpeⅠ的双酶切NNVCP的目的片段和pCAMBIA1302载体，连接后转化大肠杆菌，经过12h的培养后，选取单克隆菌落放入液体培养基培养。用NcoⅠ和SpeⅠ双酶切重组质粒pCAMBIA1302-NNVCP，电泳分析酶切片段大小为1017bp(图2)，与预期相符。由此说明，pCAMBIA1302-NNVCP重组载体的构建成功。
二、NNVCP表达载体转化莱茵衣藻
通过玻璃珠法把上述构建好的pCAMBIA1302-NNVCP表达载体转化莱茵衣藻，将上述转化藻株均匀涂布于含有潮霉素(10ug/ml)的抗性固体TAP培养基上，进行反复筛选。共得到42株NNVCP转基因藻株。
提取NNVCP转基因藻株DNA，以
NNVCP-1302–F：TACCTCGCGAATGCATCTAGATAT；
NNVCP-1302-R：CTGCACTAGTCGGGCCCTTAGTTTTC
为引物，对转基因藻株的DNA进行PCR扩增，鉴定转基因藻株是否有载体插入片段。42株NNVCP转化藻株中PCR鉴定出26株呈阳性(图3)。
值得注意的是，除了本实施例中的莱茵衣藻外，还可以选用其他衣藻、小球藻等，本发明此处仅以莱茵衣藻进行举例说明，并不起限定作用。根据实施方式的记载采用其他藻类均可以实现和莱茵衣藻相同的效果，本发明在此不作赘述。三、转基因工程微藻喂食石斑鱼及VNN攻毒检测
将约4cm长珍珠龙胆石斑鱼鱼苗随机分成喂食饲料组、CC425衣藻组、NNVCP-14、NNVCP-15、NNVCP-16转基因衣藻组。试验用鱼先放入循环养殖体系鱼缸用饲料预养10天，让其适应新的环境。之后饲喂10天的饲料或工程藻株后，选取最佳麻醉浓度进行石斑鱼麻醉和称量，然后注射NNV病毒进行攻毒实验。
攻毒实验：共150条珍珠龙胆石斑鱼苗用鱼以下实验，实验用鱼禁食6小时后进行麻醉，然后每条鱼注射500ul 0.05％NNV，该过程中石斑鱼没有异常行为，也没有意外死亡(图4)。实验用鱼注射病毒后(图5)，放回鱼缸继续饲养(饲喂方法见表1)，并统计石斑鱼存活率、发病情况，上述实验每个处理共10条鱼苗，实验重复3次，结果见图6。存活率统计结果：攻毒后7天，藻株NNVCP-14、NNVCP-15、NNVCP-16喂食的石斑鱼成活率较饲料组分别高出100％、75％、75％，较非转基因对照CC425藻株喂食的石斑鱼成活率高出60％、40％、40％，达到显著水平。由此推断出，转基因工程藻株对防治石斑鱼神经坏死病的效果比较明显。
表1转基因衣藻饲喂方法
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120> 可防控石斑鱼神经坏死病的转基因微藻、饲料及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1017
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
atggtacgca aaggtgaaaa gaaattggca aaacccccga ccaccaaggc cgcgaatccg 60
caaccccgcc gacgtgctaa caatcgtcgg cgtagtaatc gcactgacgc gcctgtgtct 120
aaggcctcga ctgtgactgg atttggacgt gggaccaatg acgtccatct ctcaggtatg 180
tcgagaatct cccaggccgt cctcccagcc gggacaggaa cagacggata cgttgttgtt 240
gacgcaacca tcgtccccga cctcctgcca cgactgggac acgctgctag aatcttccag 300
cgatacgctg ttgaaacact ggagtttgaa attcagccaa tgtgccccgc aaacacgggc 360
ggtggttacg ttgctggctt cctgcctgat ccaactgaca acgaccacac cttcgacgcg 420
cttcaagcaa ctcgtggtgc agtcgttgcc aaatggtggg aaagcagaac agtccgacct 480
cagtacaccc gcacgctcct ctggacctcg tcgggaaagg agcagcgtct cacgtcacct 540
ggtcggctga tactcctgtg tgtcggcaac aacactgatg tggtcaacgt gtcagtgctg 600
tgtcgctgga gtgttcgact gagcgttcca tctcttgaga cacctgaaga gaccaccgct 660
cccatcatga cacaaggttc cctgtacaac gattcccttt ccacaaatga ctttaagtcc 720
atcctcctag gatccacacc actggacatt gcccctgatg gagcagtctt ccagctggat 780
cgaccgctgt ccattgacta cagccttgga actggagatg ttgaccgtgc tgtttactgg 840
cacctcaaga agtttgctgg aaatgctggc acacctgcag gctggtttcg ctggggcatc 900
tgggacaact tcaacaagac gttcacagat ggcgttgcct actactctga tgagcagccc 960
cgtcaaatcc tgctgcctgt tggcactgtc tgcaccaggg ttgactcgga aaactaa 1017
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
tacctcgcga atgcatctag atat 24
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
ctgcactagt cgggccctta gttttc 26

Claims (10)

1.一种防治石斑鱼病毒性神经坏死病的饲料，其特征在于，其含有转基因微藻，所述转基因微藻由含有外壳蛋白基因的表达载体转化石斑鱼幼鱼可食用的微藻制成，其中，所述外壳蛋白基因为下列核苷酸序列之一：
1)石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白基因，序列表中SEQ ID NO.1所示序列；
2)与石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的饲料，其特征在于，所述表达载体含有接受载体和所述外壳蛋白基因，所述接受载体为pCAMBIA1302，所述外壳蛋白基因位于pCAMBIA1302载体的NcoⅠ和SpeⅠ两限制性内切酶位点之间。
3.一种防治石斑鱼病毒性神经坏死病的转基因微藻，其特征在于，其由含有外壳蛋白基因的表达载体转化石斑鱼幼鱼可食用的微藻制成，其中，所述外壳蛋白基因为下列核苷酸序列之一：
1)石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白基因，序列表中SEQ ID NO.1所示序列；
2)与石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的转基因微藻，其特征在于，所述表达载体含有接受载体和所述外壳蛋白基因，所述接受载体为pCAMBIA1302，所述外壳蛋白基因位于pCAMBIA1302载体的NcoⅠ和SpeⅠ两限制性内切酶位点之间。
5.一种防治石斑鱼病毒性神经坏死病的表达载体，其特征在于，其含有外壳蛋白基因，所述外壳蛋白基因为下列核苷酸序列之一：
1)石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白基因，序列表中SEQ ID NO.1所示序列；
2)与石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有接受载体和所述外壳蛋白基因，所述接受载体为pCAMBIA1302，所述外壳蛋白基因位于pCAMBIA1302载体的NcoⅠ和SpeⅠ两限制性内切酶位点之间。
7.如权利要求1或2所述的饲料、权利要求3或4所述的转基因微藻、或者权利要求5或6所述的表达载体在制备石斑鱼病毒性神经坏死病的制品中的应用。
8.外壳蛋白基因在制备防治石斑鱼病毒性神经坏死病的制品中的应用，其中，所述外壳蛋白基因为下列核苷酸序列之一：
1)石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白基因，序列表中SEQ ID NO.1所示序列；
2)与石斑鱼病毒性神经坏死病毒外壳蛋白基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，采用含有所述外壳蛋白基因的表达载体转化石斑鱼幼鱼可食用的微藻，制成石斑鱼幼鱼饵料。
10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述表达载体含有接受载体和所述外壳蛋白基因，所述接受载体为pCAMBIA1302，所述外壳蛋白基因位于pCAMBIA1302载体的NcoⅠ和SpeⅠ两限制性内切酶位点之间。
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Citations (7)

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