CN114891753A - 新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株，已于2021年05月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202144，保藏地址为：中国武汉武汉大学。本发明还公开了以该致弱毒株为种毒的新型鸭呼肠孤病毒活疫苗。本发明的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株，是在鸡胚成纤维细胞上传代后经克隆纯化而得的自然缺失弱毒株，毒力显著降低，接种雏鸭无不良反应，是具有较高安全性的疫苗候选弱毒株。以该弱毒株研制的疫苗免疫雏鸭可有效抵挡强毒攻击，安全性高，不返强，遗传稳定性好。

Description

新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株及其应用
技术领域
本发明涉及一株新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株及其应用，属于动物医学疫苗领域。
背景技术
禽呼肠孤病毒(avian reovirus，ARV)属于呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属，病毒粒子无囊膜，为20面体对称，基因组为线性双股RNA，分10个节段，极易发生基因重配与突变。该病毒宿主广泛，可感染多种禽类。
目前禽呼肠孤病毒在我国主要存在3种不同致病型：1、由鸡呼肠孤病毒(Chickenreovirus,CRV)引起的鸡病毒性关节炎、矮小综合征等，主要表现关节炎、腱鞘炎、生长发育不良；2、由番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)引起的番鸭、鹅“花肝病”，主要表现肝脏有黄白色坏死灶；3、由新型鸭呼肠孤病毒(Novel Duck Reovirus,NDRV)引起的鸭鹅“脾坏死病”，主要表现肝脾坏死和出血。造成这3种疾病的禽类呼肠孤病毒无论从流行病学、临床症状和病理变化，还是从基因序列和血清学等方面，均表现出较大的差异。
新型鸭呼肠孤病毒可以感染樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭、半番鸭、野鸭、鹅等多个水禽品种，主要引起雏鸭发病死亡，成年鸭感染不表现症状，但能垂直传播，引起后代雏鸭发病。该病在2005年前后在中国南方一些省份，如福建、广东、浙江等地的鸭群中开始出现，后蔓延至全国主要养鸭区。目前该病在中国已成为常见病、多发病。发病日龄一般为5～25日龄，其中以7～14日龄居多，发病率5％～35％，死亡率2％～20％，一般发病鸭日龄愈小，发病率和死亡率愈高。该病毒能引起患鸭脾脏坏死、法氏囊损伤，导致免疫抑制，极易继发细菌感染，且很难治疗，从而造成更高的死亡率，给我国的养鸭业造成了很大的经济损失。目前该病尚无商品化的疫苗。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一株新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株，及其在防治新型鸭呼肠孤病毒中的应用，在制备新型鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗中的应用，在制备防治新型鸭呼肠孤病毒的药物中的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一株新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株——DE150株，已于2021年05月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202144，保藏地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072。
该毒株是由强毒株DE株突变而得，突变至少包括以下5个σC基因上的核苷酸突变位点和4个氨基酸突变位点：
核苷酸突变位点：第41位C突变为T，第201位C突变为T，第218位T突变为G，第851位T突变为C，第924位T突变为G；
氨基酸突变位点：第14位P突变为L，第73位L突变为R，第284位L突变为S，第308位N突变为K。
所述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在防治新型鸭呼肠孤病毒中的应用。
所述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在制备新型鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗中的应用。
所述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在制备防治新型鸭呼肠孤病毒的药物中的应用。
所述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在制备防治由新型鸭呼肠孤病毒引起的疾病的药物中的应用。
一种新型鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗，是以上述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株为种毒的新型鸭呼肠孤病毒活疫苗。
所述新型鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗，可通过以下方法制备得到：将上述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在鸡胚成纤维细胞上传代培养，病毒滴度达到103.50TCID50/0.1ml以上，加入冻干保护剂制成弱毒疫苗。
一种用于诊断新型鸭呼肠孤病毒的检测抗原，为上述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株的病毒颗粒。
本发明的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株，是在鸡胚成纤维细胞上传代后经克隆纯化而得的自然缺失弱毒株，毒力显著降低，接种雏鸭无不良反应，是具有较高安全性的疫苗候选弱毒株。以该弱毒株研制的疫苗免疫雏鸭可有效抵挡强毒攻击，安全性高，不返强，遗传稳定性好。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
本发明的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株——DE150株，已于2021年05月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202144，保藏地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072。
图1：ED150株的透射电镜照片。
图2：接种后第5、10、15和20日包括脾脏在内的组织器官的示意图。
图3：103.5TCID50/羽、104.0TCID50/羽、104.5TCID50/羽、105.0TCID50/羽免疫组和对照组鸭的脾脏示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1新型鸭呼肠孤病毒DE150弱毒株的培育与鉴定
1.新型鸭呼肠孤病毒DE株的分离鉴定
1.1发病情况 山东东阿地区一家较大规模的樱桃谷肉鸭养殖场，新进的一批雏鸭在9日龄时出现采食下降，精神沉郁，少部分出现死亡。死亡雏鸭剖检发现，脾脏坏死、硬化，取病变明显的脾组织用于病原分离。
1.2病毒分离与RT-PCR鉴定 取病变脾脏加入5倍体积的无菌生理盐水，充分研磨，冻融3次，8000g离心30min，取上清用0.22μm滤器过滤除菌，通过尿囊腔接种9日龄樱桃谷鸭胚，每天观察两次，直至接种后第7天。观察死亡鸭胚的病变情况，并用其尿囊液继续盲传至第3代，标记为DE。按照常规方法提取DE株第3代尿囊液的核酸，利用引物P-F/P-R，通过RT-PCR方法进行新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)核酸检测，预期片段大小为226bp，引物序列为：P-F：5'TCATTCATTTGGGCAGCGG 3'；P-R：5'AGTAGTGTGTAAAGCATGGACT 3'。同时进行番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)、3型鸭甲肝病毒(DHAV-3)、1型鸭星状病毒(DASTV-1)、鸭瘟病毒(DPV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)和新型鸭细小病毒(NDPV)等其他禽病核酸检测。结果显示，将临床采集的坏死脾脏处理后经尿囊腔接种9日龄鸭胚，72h后鸭胚开始出现死亡，死亡鸭胚发育不良，通体出血；提取DE株的DNA和RNA，利用PCR或RT-PCR方法对新型鸭呼肠孤病毒病等9种常见鸭病病原进行核酸检测，发现只有新型鸭呼肠孤病毒为阳性，其他均为阴性。
1.3病毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)上培养 按常规方法制备CEF1细胞，长成单层后倒去培养液，换加含1％DE株鸭胚毒的细胞维持液，置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，每日观察两次。当80％的细胞出现病变时，收集细胞培养物，冻融2次后振摇、分装，并继续传至第5代。结果显示，DE株在CEF细胞上生长良好，前期接种72～84h细胞开始出现病变，后期接种48h细胞即出现病变。病变主要表现为细胞融合、圆缩、拉网，并逐渐聚集成簇，最后脱落。
2.新型鸭呼肠孤病毒DE150弱毒株的培育
2.1病毒纯化培养
2.1.1初培养 取9～10日龄鸡胚按常规方法制备鸡胚成纤维细胞(CEF)，进行细胞计数，取50×104/ml的细胞悬液6ml加入到25cm2细胞培养瓶中，放37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。CEF细胞长满单层后，弃掉培养基，将DE株第5代细胞毒用PBS做100倍稀释，接种CEF细胞中，0.4ml/瓶，置37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育1h后，弃掉病毒液，加入含1％小牛血清DMEM维持液，6ml/瓶，置37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养，每日观察，当80％以上细胞出现病变时进行收获，将细胞反复冻融2次后振摇，5000g离心20min，取上清用PBS做100倍稀释后，按上述方法继续传代培养，直至第10代。收获第10代细胞毒，标记为DE-CEF10，按常规方法进行TCID50测定。结果显示，第10代细胞毒的毒价为104.7TCID50/0.1ml。
2.1.2蚀斑纯化 将长成单层的CEF细胞(6孔细胞板)弃掉培养基，用DMEM洗涤3次。将DE株第10代细胞毒用DMEM作1000稀释，按0.2ml/孔接种上述细胞，接种5孔，留1孔做阴性对照，37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育1h。小心吸掉DMEM培养液，取含中性红的营养琼脂糖，融化后冷却至43～45℃时，沿孔壁缓慢注入细胞孔中，使营养琼脂糖覆盖在细胞表面，厚度2～3mm，平放30min，待琼脂糖凝固后置37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养。当出现明显的浅色蚀斑时，选取3个细胞孔，每孔分别挑取大、中、小三个蚀斑，共9个，分别加入到0.2ml DMEM中，反复吹打，按1％的比例加入到CEF单层细胞(25cm2)中扩大培养，待细胞出现约80％的病变时，收集病毒，冻融两次，5000g离心10min，收集上清，测定其TCID50，选择病毒含量最高的样品按上述方法继续挑取蚀斑，共进行3轮，选取病毒含量最高的纯培养物，分装冻存。结果显示，第1轮噬斑纯化挑取的9个噬斑经扩大培养后，病毒含量最高为105.8TCID50/0.1ml；第2轮噬斑纯化挑取的9个噬斑经扩大培养后，病毒含量最高为106.5TCID50/0.1ml；第3轮噬斑纯化挑取的9个噬斑经扩大培养后，病毒含量最高也为106.5TCID50/0.1ml，具体数据见表1。
表1筛选噬斑的TCID50
Figure BDA0003383205930000051
2.1.3继续培养与测定 将长成单层的CEF细胞(25cm2)倒去培养基，换加含0.1％经3轮蚀斑纯化获得的病毒含量最高纯培养物的细胞维持液(含1％小牛血清DMEM)，置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，每日观察两次，当80％的细胞出现病变时，将细胞反复冻融2次，5000g离心20min，取上清按上述方法继续传代培养。每隔10代取样测定TCID50，以确定其毒价变化。结果显示，DE株传至40代时，毒价达到峰值，为107.4TCID50/0.1ml，之后维持稳定，均不低于107.2TCID50/0.1ml，见表2。
表2 DE株不同代次的TCID50(lg)
Figure BDA0003383205930000061
2.1.4致病性测定 分别取第40代、60代、80代、100代、120代、140代、150代病毒经颈部皮下接种2日龄SPF雏鸭，接种剂量均为105TCID50/只，实验鸭数量均为10只，每日观察实验鸭的精神状态，接种后第7日进行称重，并处死、剖检、观察内脏器官病变，同时采集所有实验鸭的脾脏制作病理切片进行观察。结果显示，DE株第40代、60代、80代、100代、120代、140代和150代病毒接种2日龄SPF雏鸭后，所有实验鸭精神状态正常，吃料饮水正常；接种后第7日称重发现，第40代和60代病毒组体重略低于对照组，而第80代、100代、120代、140代和150代病毒组体重与对照组相比无明显差异；接种后第7日剖检、观察内脏器官，发现第40代、60代、80代病毒组部分实验鸭脾脏有坏死点，而第100代、120代、140代和150代病毒组实验鸭脾脏外观正常；接种后第7日采集所有实验鸭的脾脏进行病理切片观察，发现第40代、60代、80代、100代、120代病毒组全部或部分实验鸭脾脏有病理变化，而第140代和150代病毒组实验鸭脾脏无病理变化。具体情况见表3。
表3 DE株不同代次病毒的致病性
Figure BDA0003383205930000062
2.2 DE150株鉴定
2.2.1血凝性测定 按常规方法测定DE150株对1％鸡红细胞的血凝性，结果显示，DE150株无血凝性。
2.2.2电镜观察 ED150株经10000g离心30min后，取上清液经2℅磷钨酸负染1～2min，透射电镜下观察，结果显示，该病毒呈球形、无囊膜、直径70nm左右，符合禽呼肠孤病毒特征(图1)。
2.2.3特异性检验 将DE150株用细胞维持液稀释至100TCID50/0.1ml，与等量抗新型鸭呼肠孤病毒(DE株)特异性血清混合，置37℃中和1小时后，接种生长良好的CEF细胞单层(96孔板)6孔，每孔0.1ml；同时设未中和的病毒液6孔作阳性对照，正常细胞6孔作阴性对照，置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，观察至120h判定结果。结果显示，DE150株病毒特异性良好，血清中和组和正常细胞对照组细胞生长良好，120小时内未出现病变，病毒对照组细胞接种48h开始出现圆缩、拉网、脱落等典型病变。
2.2.4病毒含量测定 将DE150株用细胞维持液进行10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 5个稀释度，分别接种生长良好的CEF细胞单层(96孔板)，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml。同时设细胞空白对照孔6孔，置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，观察至120h，出现CPE者判为感染，计算TCID50。结果显示，DE150株在CEF细胞上的毒价为107.3TCID50/0.1ml
2.2.5纯净性检验 按2015年版《中国兽药典》附录进行。结果显示，DE150株无细菌、支原体、外源病毒污染。
2.2.6致病性检验 45只2日龄SPF雏鸭随机分为3组，15只/组，第一组和第二组颈部皮下接种DE150株，接种剂量均为105TCID50/只，第三组颈部皮下接种相同体积的生理盐水，每日观察实验鸭的精神状态。第一组于接种后第5、10、15和20日各取3只实验鸭处死、剖检、观察内脏器官病变，并采集脾脏制备病理切片进行观察；第二组和第三组分别于接种前与接种后第7、14、21、28日进行称重，以确定DE150株接种对实验鸭体重的影响。结果显示，接种后实验鸭的精神状态正常，接种后第5、10、15和20日各取3只实验鸭处死剖检，发现包括脾脏在内的组织器官正常(图2)，脾脏通过病理切片观察也无异常；接种后第7、14、21、28日进行称重，发现接种组实验鸭与对照组相比，体重无明显差异(表4)。
表4 DE150株接种后实验鸭的均重(g)
Figure BDA0003383205930000071
实施例2新型鸭呼肠孤病毒DE150株基因序列分析
1.试验方法
1.1σC基因测序分析 取DE株第2代鸭胚毒和DE150株细胞毒，按照常规方法提取病毒的核酸，利用引物P1/P2，通过RT-PCR方法进行σC基因扩增，预期片段大小为1541bp，引物序列为：P1：5'TGCCCATGGCTGACGGTG 3'；P2：5'TCTCATCGCGCGCCACAG 3'，将扩增的片段克隆到pMD18-T载体中，鉴定正确后送北京擎科生物科技有限公司青岛分公司进行测序，并利用MEGA软件进行分析比对，找出σC基因的突变情况。
1.2基因组测序分析
按常规方法提取DE株第2代鸭胚毒和DE150株细胞毒的RNA，利用基因组扩增的13对引物(见表5)对10个基因片段进行扩增。每个片段的5’和3’末端利用
Figure BDA0003383205930000083
RACE5’/3’Kit进行扩增，将获得的每一个扩增产物克隆到pMD18-T载体中，鉴定正确后送北京擎科生物科技有限公司青岛分公司进行测序，并进行同源性分析。
表5基因组测序引物
Figure BDA0003383205930000081
2.结果
2.1σC基因测序分析 对DE株第2代鸭胚毒和DE150株细胞毒的σC基因进行测序发现，σC基因大小均为966bp，其中第41、201、218、851和924位共5个核苷酸位点发生突变；而σC蛋白的氨基酸均为321aa，其中第14、73、284和308位共4个氨基酸位点发生突变(表6)。
表6 DE株不同代次病毒σC基因的突变情况
Figure BDA0003383205930000082
2.2基因组测序分析
弱毒株DE150株与强毒株DE株的全基因组10个基因片段的同源性在99.4～99.9％之间，其中L2和M3基因同源性最高，均为99.9％，S1基因同源性最低，为99.4％(表7)。
表7 DE150株与DE株全基因组的同源性(％)
基因 L1 L2 L3 M1 M2 M3 S1 S2 S3 S4
同源性 99.8 99.9 99.7 99.8 99.8 99.9 99.4 99.8 99.8 99.8
实施例3新型鸭呼肠孤病毒DE150弱毒株安全性及排毒规律
1.方法
将新型鸭呼肠孤病毒DE150株基础种子最低代次C4代经颈部皮下注射70只1日龄健康易感鸭，每只0.2ml(含106.0TCID50)，相同条件下饲养管理。记录试验鸭精神、采食、粪便、行为等临床表现，观察21日。于接种后1、3、5、7、10、14和21日，随机取10只试验鸭采集喉拭子和泄殖腔拭子，剖检采集心、肝、脾、肺、肾、脑、气管、十二指肠、胸腺、法氏囊等脏器组织，利用实时荧光定量PCR检测排毒情况和各脏器组织的带毒情况；取接种后3、7、14和21日荧光定量PCR检测阳性的脏器组织样品进行组织病理学检查。
2.结果
2.1临床观察 观察21日，未见因接种病毒引起的不良临床反应，鸭健活，精神、采食、粪便、行为等均无异常，具体见表8。
表8接种1日龄健康易感鸭临床观察结果
Figure BDA0003383205930000091
2.2排毒检测 接种后1、3、5、7、10、14和21日，各随机取10只鸭采集喉拭子和泄殖腔拭子，NDRV实时荧光定量PCR均未检出排毒情况，见表9。
表9喉拭子和泄殖腔拭子病毒检测结果
Figure BDA0003383205930000092
Figure BDA0003383205930000101
2.3带毒检测 DE150株基础种子最低代次C4代接种健康易感鸭后仅脾脏检出病毒，持续至接种后7日，接种后3日病毒检出率最高，详见表10；接种后3日脾脏病毒量最高，阳性脾脏NDRV实时荧光定量PCR检测结果见表11。
表10脏器组织病毒检测结果
Figure BDA0003383205930000102
表11阳性脾脏NDRV实时荧光定量PCR检测结果
Figure BDA0003383205930000103
2.4组织病理学检查 接种后3、7、14和21日剖检的脾脏均无异常。脾脏经福尔马林溶液固定后进行组织病理学检查。切片结果显示，接种后不同时间点采集脾脏的结构清晰，均未见病理变化。
实施例4新型鸭呼肠孤病毒DE150弱毒株毒力返强试验
1.方法
1.1试验设计 1日龄健康易感鸭20只，每只颈部皮下注射DE150株基础种子最低代次C4代10倍浓缩病毒0.2ml(含108.17TCID50/0.1ml)，每日观察。接种后3日随机取10只剖检，观察各脏器组织有无异常，同时进行组织病理学检查。将阳性样品混合适当浓缩，记为1代病毒液。剩余10只鸭其中5只观察至接种后7日，另5只观察至接种后21日。将1代病毒液接种1日龄健康易感鸭20只传第2代，每只皮下注射0.2ml，接种鸭置新的隔离器中饲养，观察及检测项目同1代鸭。同样方式将病毒连续继代至第5代。
1.2检测项目
1.2.1临床观察 观察每代次病毒接种鸭的精神、采食、粪便、行为及发病与死亡情况。
1.2.2系统剖检 每代次于接种后3、7、21日，剖检观察心、肝、脾、肺、肾、气管、十二指肠、胸腺、法氏囊等脏器组织的病变情况。
1.2.3组织病理学检查每代次于接种后3、7、21日取脾脏，用组织固定液固定，制作病理组织切片，观测病理变化。
2.结果
DE150株基础种子最低代次C4代10倍浓缩后皮下接种1日龄健康易感鸭，连续传5代，结果发现，不同代次的接种鸭精神、采食、粪便、行为等均未见异常，剖检可见心、肝、脾、肺、肾、气管、十二指肠、胸腺、法氏囊均无异常，脾脏组织病理学检查均无病理变化。
实施例5新型鸭呼肠孤病毒DE150弱毒株免疫原性试验
1.方法
试验设计取1日龄健康易感鸭50只，随机分为5组，每组10只。将新型鸭呼肠孤病毒DE150株进行4个稀释度稀释，免疫组各颈部皮下接种0.2ml(分别含103.5TCID50、104.0TCID50、104.5TCID50、105.0TCID50)，另取10只注射0.2ml生理盐水作为对照；免疫后7日均经腿部肌肉注射检验用强毒DE株，每只0.2ml(含103.50TCID50/0.1ml)。攻毒后第7日全部剖杀，检查脾脏，以脾脏出现肿大、出血或坏死判为发病，统计每组鸭的攻毒保护情况。
2.结果
攻毒后7日剖检，103.5TCID50/羽、104.0TCID50/羽、104.5TCID50/羽、105.0TCID50/羽免疫组和对照组鸭的脾脏分别7/10、2/10、0/10、0/10、10/10出现肿大、出血或坏死，详见表12、图3。
表12攻毒保护情况
Figure BDA0003383205930000111
实施例6新型鸭呼肠孤病毒DE150弱毒株传代及稳定性试验
1.方法
1.1 DE150株传代 取9～10日龄SPF鸡胚，按常规方法制备SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)，CEF长满单层后，弃掉培养基，换加含0.1％(v/v)DE150株C0代病毒和1％新生牛血清的乳汉液，置37℃、5％CO2培养箱，继续培养3～5日，当80％以上细胞出现病变时收获，冻融1次，5000r/min离心20分钟，取上清，按上述方法继续传代培养，直至15代。
1.2σC基因测序 将DE150株传代第3、6、9、12和15代病毒，按常规方法提取核酸，利用引物P1/P2，经RT-PCR方法扩增σC基因，引物序列为：P1:5’-CGAGTATCTTTGTACGCTACGC-3’；P2:5’-TCATCGCGCGCCACAGC-3’，PCR产物克隆至pMD18-T载体，由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，分析是否产生突变。
1.3病毒含量测定 取DE150株传代第3、6、9、12和15代病毒，用含1％新生牛血清的乳汉液作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8 3个稀释度，每个稀释度接种已长成单层SPF鸡胚成纤维细胞的96孔培养板5孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照。置37℃、含5％CO2培养箱中培养3～5日。正常细胞对照孔应无细胞病变(CPE)，记录各稀释度出现CPE的孔数，按Reed-Muench法计算TCID50。
1.4免疫原性 将DE150株传代第3、6、9、12和15代病毒各经颈部皮下免疫2日龄健康易感鸭10只，每只0.2ml(含104.5TCID50)，另取10只不接种设为对照。接种后7日，用新型鸭呼肠孤病毒强毒DE株攻击，每只肌肉注射0.2ml(含103.50TCID50/0.1ml)，攻毒后7日全部剖杀，检查脾脏。
1.5纯净 取DE150株传代第3、6、9、12和15代病毒按现行《中国兽药典》附录分别进行无菌、支原体及外源病毒检验。其中，外源病毒采用鸭胚和鸭胚成纤维细胞检查法进行检验，采用鸡胚成纤维细胞检查法进行禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒检验。
1.6特异性将DE150株传代第3、6、9、12和15代病毒用含1％新生牛血清的乳汉液稀释至200TCID50/0.1ml，与等量抗新型鸭呼肠孤病毒特异性血清混合，同时设阴性血清对照(病毒液与阴性血清等量混合)、病毒对照(病毒液与含1％新生牛血清的乳汉液等量混合)和正常细胞对照(含1％新生牛血清的乳汉液)，置于37℃作用60分钟，分别接种已长成单层SPF鸡胚成纤维细胞的6孔培养板2孔，每孔1.0ml，置37℃、含5％CO2培养箱中培养3～5日。正常细胞对照和中和组应无细胞病变(CPE)，病毒对照和阴性血清对照组应出现CPE。
2.结果
2.1 DE150株传代 将DE150株在CEF上连续传15代，各代次病毒接种细胞均出现融合、圆缩、拉网、聚集成簇等特征性病变，第3、6、9、12和15代病毒出现病变和收获的时间详见表13。
表13 DE150株不同代次出现病变和收获时间
Figure BDA0003383205930000131
2.2σC基因测序分析 经测序分析，DE150株传代第3、6、9、12和15代病毒的σC基因与C0代σC基因同源性均为100％，遗传稳定。
2.3病毒含量测定 DE150株在CEF上传代的过程中，取第3、6、9、12和15代病毒检测病毒含量，结果显示，DE150株的病毒含量15代内均不低于107.0TCID50/0.1ml，含量稳定，详见表14。
表14 DE150株不同代次的病毒含量(TCID50/0.1ml)
Figure BDA0003383205930000132
2.4免疫原性 将DE150株传代第3、6、9、12和15代病毒进行免疫攻毒试验，结果，均可产生至少9/10免疫保护，攻毒对照组10/10发病，详见表15。结果表明，DE150株在15代内可保持良好的免疫原性。
表15 DE150株不同代次的免疫原性检测结果
Figure BDA0003383205930000133
2.5纯净
2.5.1无菌检验 经检验，DE150株传代第3、6、9、12和15代病毒均无菌生长，检验结果见表16。
表16无菌检测结果
Figure BDA0003383205930000141
注：“-”表示无菌生长。
2.5.2支原体检验 阳性对照液体培养基颜色变黄，固体培养基出现“煎蛋”状支原体菌落；阴性对照液体培养基未出现pH值/颜色变化、固体培养基无支原体菌落。DE150株传代第3、6、9、12和15代病毒均无支原体污染，详见表17。
表17支原体检测结果
Figure BDA0003383205930000142
2.5.3外源病毒检验 采用鸭胚和鸭胚成纤维细胞检查法进行外源病毒检验，采用鸡胚成纤维细胞检查法进行禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒检验。DE150株传代第3、6、9、12和15代病毒均无外源病毒污染，详见表18。
表18外源病毒检验结果
Figure BDA0003383205930000143
Figure BDA0003383205930000151
注：9/9*表示24小时内出现1只非特异性死亡。
2.6特异性 DE150株传代第3、6、9、12和15代病毒中和组与正常细胞对照组均未出现细胞病变，阴性血清对照组和病毒对照组均出现CPE。经检验，DE150株传代细胞毒均能被抗新型鸭呼肠孤病毒特异性血清中和，结果详见表19。
表19特异性试验结果
Figure BDA0003383205930000152
实施例7新型鸭呼肠孤病毒DE150弱毒株最小免疫剂量
1.方法
试验设计 2日龄健康易感鸭130只，随机分为13组，10只/组。3批活疫苗均设103.5TCID50/羽、104.0TCID50/羽、104.5TCID50/羽、105.0TCID50/羽4个不同剂量组，各颈部皮下接种10只雏鸭；另取10只不接种疫苗，设为攻毒对照。各组在相同条件下隔离饲养。接种后7日，连同对照鸭10只，用新型鸭呼肠孤病毒强毒DE株攻击，每只腿部肌肉注射0.2ml(含103.50TCID50/0.1ml)，攻毒后7日全部剖杀，检查脾脏，以剖检出现脾脏肿大、出血或坏死判为发病，统计各免疫组的攻毒保护情况。试验分组情况见下表20。
表20试验分组情况
Figure BDA0003383205930000153
Figure BDA0003383205930000161
2.结果
2.1攻毒保护情况 攻毒后7日剖检，103.5TCID50/羽和104.0TCID50/羽剂量组脾脏分别4/10～5/10和1/10～2/10肿大；104.5TCID50/羽和105.0TCID50/羽剂量组脾脏均无异常，攻毒对照组鸭脾脏10/10出现肿大、出血或坏死，结果见表21。新型鸭呼肠孤病毒病活疫苗(DE150株)的最小免疫剂量为104.0TCID50/羽。进一步验证所确定的疫苗免疫剂量105.0TCID50/羽，可10/10抵抗强毒攻击。
表21攻毒保护情况
Figure BDA0003383205930000162
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

Claims (9)

1.一株新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株，已于2021年05月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202144，保藏地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072。
2.根据权利要求1所述的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株，其特征在于：是由强毒株DE株突变而得，突变至少包括以下5个σC基因上的核苷酸突变位点和4个氨基酸突变位点：
核苷酸突变位点：第41位C突变为T，第201位C突变为T，第218位T突变为G，第851位T突变为C，第924位T突变为G；
氨基酸突变位点：第14位P突变为L，第73位L突变为R，第284位L突变为S，第308位N突变为K。
3.权利要求1或2所述的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在防治新型鸭呼肠孤病毒中的应用。
4.权利要求1或2所述的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在制备新型鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗中的应用。
5.权利要求1或2所述的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在制备防治新型鸭呼肠孤病毒的药物中的应用。
6.权利要求1或2所述的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在制备防治由新型鸭呼肠孤病毒引起的疾病的药物中的应用。
7.一种新型鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗，是以权利要求1或2所述的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株为种毒的新型鸭呼肠孤病毒活疫苗。
8.根据权利要求7所述的新型鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗，其特征在于：通过以下方法制备得到：将上述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在鸡胚成纤维细胞上传代培养，病毒滴度达到103.50TCID50/0.1ml以上，加入冻干保护剂制成弱毒疫苗。
9.一种用于诊断新型鸭呼肠孤病毒的检测抗原，为权利要求1或2所述的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株的病毒颗粒。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116478937A (zh) * 2023-06-12 2023-07-25 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 基因iii型禽呼肠孤病毒变异株及其在制备疫苗中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102352346A (zh) * 2011-10-24 2012-02-15 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种鸭新致病型呼肠孤病毒及其弱毒疫苗
CN103468827A (zh) * 2013-08-29 2013-12-25 山东省农业科学院家禽研究所 一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒
WO2017206773A1 (zh) * 2016-06-01 2017-12-07 苏州金唯智生物科技有限公司 一种发掘特异性功能抗体的方法
CN109295007A (zh) * 2018-09-19 2019-02-01 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 Ndrv弱毒株的选育方法及其在制备ndrv活疫苗中的应用
CN110628944A (zh) * 2019-08-07 2019-12-31 山东省农业科学院家禽研究所 鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒
CN116286670A (zh) * 2021-12-21 2023-06-23 青岛动保国家工程技术研究中心有限公司 一种新型鸭呼肠孤病毒及其在灭活疫苗和卵黄抗体制备中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102352346A (zh) * 2011-10-24 2012-02-15 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种鸭新致病型呼肠孤病毒及其弱毒疫苗
CN103468827A (zh) * 2013-08-29 2013-12-25 山东省农业科学院家禽研究所 一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒
WO2017206773A1 (zh) * 2016-06-01 2017-12-07 苏州金唯智生物科技有限公司 一种发掘特异性功能抗体的方法
CN109295007A (zh) * 2018-09-19 2019-02-01 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 Ndrv弱毒株的选育方法及其在制备ndrv活疫苗中的应用
CN110628944A (zh) * 2019-08-07 2019-12-31 山东省农业科学院家禽研究所 鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒
CN116286670A (zh) * 2021-12-21 2023-06-23 青岛动保国家工程技术研究中心有限公司 一种新型鸭呼肠孤病毒及其在灭活疫苗和卵黄抗体制备中的应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUI YAN等: "Isolation and characterization of a naturally attenuated novel duck reovirus strain as a live vaccine candidate", 《VETERINARY MICROBIOLOGY》, 25 August 2021 (2021-08-25) *
YINGQI ZHU等: "Protective immune responses in ducklings induced by a suicidal DNA vaccine of the sigma C gene of novel duck reovirus", 《VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY》, 15 May 2015 (2015-05-15) *
任斌斌;于可响;黄兵;: "鸭坦布苏病毒的研究进展", 家禽科学, no. 04, 10 April 2019 (2019-04-10) *
欧阳岁东;林锋强;王劭;陈仕龙;程晓霞;朱小丽;胡奇林;陈少莺;: "番鸭呼肠孤病毒MW9710株δC蛋白基因在毕赤酵母中表达", 福建农业学报, no. 03 *
陈少莺;胡奇林;程晓霞;陈仕龙;程由铨;林天龙;江斌;林锋强;朱小丽;李怡英;: "番鸭呼肠孤病毒弱毒株选育研究", 福建农业学报, no. 04 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116478937A (zh) * 2023-06-12 2023-07-25 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 基因iii型禽呼肠孤病毒变异株及其在制备疫苗中的应用
CN116478937B (zh) * 2023-06-12 2023-08-18 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 基因iii型禽呼肠孤病毒变异株及其在制备疫苗中的应用

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