CN114958781B

CN114958781B - 一种ndrv弱毒株及其选育方法和应用

Info

Publication number: CN114958781B
Application number: CN202210894644.4A
Authority: CN
Inventors: 李智丽; 黄淑坚
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Foshan University
Priority date: 2022-07-28
Filing date: 2022-07-28
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2042-07-28
Also published as: CN114958781A

Abstract

本发明涉及一种NDRV弱毒株及其选育方法和应用，涉及兽用生物制品学领域。该NDRV弱毒株包括NDRV‑CM弱毒株，所述NDRV‑CM弱毒株的保藏编号为CGMCC NO：45061，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该弱毒株可用于制备NDRV疫苗，为NDRV的防制提供新的方向。

Description

一种NDRV弱毒株及其选育方法和应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品学领域，特别是涉及一种NDRV弱毒株及其选育方法和应用。

背景技术

新型呼肠孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）属于典型的呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属，在电镜下观察，病毒粒子呈球形，二十面体对称，无囊膜，直径70-80nm左右，双层衣壳结构，呈大量散在、成堆和晶格状排列在胞浆中。各种品种鸭（如番鸭、半番鸭、麻鸭、北京鸭等）均可感染NDRV。该病无明显季节性，发病日龄约为6~25日龄，其中以5~10日龄居多；病程5~7天，发病率5%~15%、死亡率2%~13%，日龄愈小或并发感染时其发病率死亡率愈高。

该病毒对雏番鸭致病性极强的传染病，根据发病宿主和症状的不同主要分为两种类型，一种是番鸭“新肝病”，一种是北京鸭、樱桃谷鸭“脾坏死”，番鸭“新肝病”以番鸭肝脾出血点和坏死为主要特征，组织病理观察肝细胞变性、坏死，脾脏淋巴细胞坏死、崩解或出血，多发于5-10日龄雏番鸭，发病率为5%-40%，死亡率为10%-50%。鸭“脾坏死”主要发生在育雏期，以脾脏出现一个或数个较大的坏死斑为特征病变。各种品种鸭（如番鸭、半番鸭、麻鸭、北京鸭等）均可感染NDRV。患病鸭肝脏肿大、出血、有坏死点，脾脏出现严重的坏死灶，胸腺、法氏囊等出现不同程度的萎缩。同时，NDRV感染可引起繁殖鸭的卵巢出血、卵泡萎缩、输卵管出血等病理改变，导致受精率和卵孵化率显著降低，并证实NDRV可通过卵进行垂直传播。NDRV一旦发病，耐过鸭多为僵鸭，饲料利用率极度降低，其防控主要预防为主。

NDRV对雏番鸭机体带来的损伤不可逆，死亡率很高，传统的疫苗已经不能提供足够的保护，目前的措施是使用致病力强的流行毒株制备免疫原性较好的灭活疫苗免疫母鸭，使雏番鸭获得母源抗体保护，以此来预防本病。但灭活疫苗属于死疫苗，缺点为：病原体保留抗原性的同时失去了活力和感染性，接种剂量比较大，产生抗体慢且免疫效果短，不能用于紧急接种，临床上亟需弱毒活疫苗的研制。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种NDRV弱毒株，该弱毒株可用于制备NDRV疫苗，为NDRV的防制提供新的方向。

为了达到上述目的，本发明提供一种NDRV弱毒株，该NDRV弱毒株包括NDRV-CM弱毒株，所述NDRV-CM弱毒株的保藏编号为CGMCC NO：45061，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

可以理解的，上述NDRV弱毒株由临床上发生的新型呼肠孤病毒流行毒株弱化得到。

本发明还提供了所述NDRV弱毒株的选育方法，该选育方法包括以下步骤：将临床分离的亲本株接种至细胞，孵育，采用5-氟尿嘧啶致弱所述亲本株，培养若干代，得到NDRV-CM弱毒株。

通过5-氟尿嘧啶构建NDRV毒株的化学诱导致弱系统，该致弱系统简单

易行。

在其中一个实施例中，所述5-氟尿嘧啶的浓度为10-100 ug/mL。

在其中一个实施例中，所述5-氟尿嘧啶的浓度为50 ug/mL。

在其中一个实施例中，所述NDRV弱毒株的选育方法包括以下步骤：接种亲本株，孵育，采用5-氟尿嘧啶致弱所述亲本株，培养10-40代，得到NDRV-CM弱毒株。

采用上述选育方法培养10-40代，得到的弱毒株的致病性得到减弱。

在其中一个实施例中，所述NDRV弱毒株的选育方法包括以下步骤：接

种亲本株，孵育，采用5-氟尿嘧啶致弱所述亲本株，培养25代，得到NDRV-CM

弱毒株。

采用上述选育方法培养25代，得到的弱毒株的致病性已充分减弱，且能很好地保护雏鸭不受NDRV毒株感染，细胞适应性好，安全性高，免疫原性好，可用作制备NDRV疫苗。

本发明还提供了一种NDRV疫苗，该疫苗包括所述NDRV弱毒株。

本发明还提供了所述NDRV疫苗的制备方法，包括以下步骤：将所述NDRV弱毒株接种至基础细胞，培养，冻融，得到所述NDRV弱毒株的细胞病毒液，冷冻，真空干燥，得到NDRV疫苗。

在其中一个实施例中，所述制备方法包括以下步骤：将所述NDRV弱毒

株接种至基础细胞，培养至病变细胞占细胞总量的75％-80％，冻融，得到所述

NDRV弱毒株的细胞病毒液，将所述细胞病毒液与冻干保护剂混合，冷冻，真

空干燥，得到NDRV疫苗。

在其中一个实施例中，所述基础细胞包括以下细胞中的至少1种：Vero、BHK-21、DF-1、LMH鸭胚成纤维细胞、番鸭胚成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞、Marc145、VERO、ST、MDCK。

在其中一个实施例中，所述冻干保护剂为7％蔗糖脱脂乳。

在其中一个实施例中，所述NDRV疫苗的制备方法还包括在所述细胞病毒液与冻干保护剂混合后，加入青霉素和链霉素，然后冷冻，真空干燥，得到NDRV疫苗。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种NDRV弱毒株及其选育方法和应用，该NDRV弱毒株可用于制备NDRV疫苗，为NDRV的防制提供新的方向。该弱毒株的致病性已充分减弱，且能很好地保护鸭不受NDRV毒株感染，细胞适应性好，安全性高，免疫原性好。

附图说明

图1为实施例中 S1、S2、S3和S4基因的RT-PCR产物电泳结果图，其中

1-4:S1-S4 5:空白M:Marker；

图2为实施例中致病试验的剖检病变观察，其中A1:空白组肝脏；A2:空白组脾脏；A3:攻毒组肝脏；A4:攻毒组脾脏；

图3为实施例中致病试验的病理切片观察（200×），其中B1:空白组肝脏；B2:空白组脾脏；B3:攻毒组肝脏；B4:攻毒组脾脏；

图4为实施例中亲本毒株进行病毒分离培养的接种48h之后NDRV分离株病变，其中A1、B1、C1、D1分别为Vero、BHK-21、DF-1、LMH空白组；A2、B2、C2、D2分别为Vero、BHK-21、DF-1、LMH接毒组；

图5为实施例中NDRV-CM-GD20在4种细胞上的一步生长曲线图；

图6为实施例中诱导条件下不同浓度病毒对BHK-21的致病性结果图；其中A:空白B: 10^-1病毒稀释液；C:10^-2病毒稀释液；D:10^-3病毒稀释液；

图7为实施例中不同代次毒株接种于BHK-21 60h病变的结果图；

图8为实施例中7个代次S1、S2、S3、S4基因扩增电泳图，其中M：DNA MarkerDL2000；1：空白；2-8：各代次S1基因；

图9为实施例中各诱导毒株代次攻毒7天后雏番鸭体重变化结果图；

图10为实施例中各诱导毒株代次攻毒7天后各代次排毒检测结果图；

图11为实施例中不同代次毒株攻毒7天后肝脏结果图；

图12为实施例中不同代次毒株攻毒7天后脾脏结果图；

图13为实施例中不同代次毒株攻毒7天后肝脏的病理观察结果图；

图14为实施例中不同代次毒株攻毒7天后脾脏的病理观察结果图；

图15为实施例中攻毒7天后番鸭体重变化结果图；

图16为实施例中攻毒7天后番鸭肝脏剖检症状结果图；

图17为实施例中攻毒7天后番鸭脾脏剖检症状结果图；

图18为实施例中攻毒7d后各免疫组肝脏的病例观察结果图；

图19为实施例中攻毒7d后各免疫组脾脏的病例观察结果图；

图20为实施例中NDRV-CM免疫后三株毒株攻毒7d后各免疫组肝脏、脾脏病理观察结果图；

图21为实施例中NDRV-CM株编码蛋白δC遗传进化树结果图；

图22为实施例中NDRV-CM株编码蛋白δB遗传进化树结果图；

图23为NDRV-CM株透射电镜图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领

域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语

只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

定义：

本发明中的NDRV-CM：即指实施例中根据亲本毒株NDRV-CM-GD20诱导致弱培养至第25代的F25代次诱导株。

来源：

本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如

无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。

保藏说明：

病毒名称：新型鸭呼肠孤病毒：NDRV-CM株

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2021年12月13日

保藏中心登记入册编号：CGMCC：45061。

NDRV-CM株的序列信息如下表所示。

实施例

一、病毒分离鉴定。

本发明人对于5起肝脏不规则坏死、出血斑/点，脾脏肿大坏死，耐过鸭生长迟缓的病例进行鉴定，剖检肝脏或脾脏出现白色坏死点。在江西、福建、广东三地采集5 份病料样品，将5份病料样品接种Vero 细胞，在极限稀释法下连续接种5代，具体操作如下：

取适量肝脏和脾脏样品，按照1:3比例加入PBS进行研磨，反复冻融3次，12000 r/min离心15分钟后，取上清液经0.22uL的滤膜过滤后，将其接种于单层的BHK-21细胞上，于37℃5% CO₂条件下培养，吸附1h后弃去病毒液，加入含1% FBS的DMEM，继续培养5-7d，每天观察细胞状态。

将收获的细胞毒反复冻融3次，12000 rpm/min，4℃离心2 min，取上清。参照美基病毒核酸提取试剂盒说明书，提取病毒RNA进行RT-PCR检测。通过PCR或者RT-PCR鉴定新型呼肠孤病毒（NDRV）、鸭瘟病毒（DPV）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、番鸭细小病毒（MPV）、坦布苏病毒（TMUV）等病毒的感染情况。

将能引起BHK-21出现CPE的细胞毒进行10^-1-10^-8系列稀释，接种于96孔培养板中单层的BHK-21细胞上, 每孔100uL，每个稀释度重复8孔，同时设立空白对照孔。5%的CO₂培养箱中37℃孵育1h后，加入含1%FBS的DMEM，继续培养，连续观察5-7天记录病变孔，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。

鉴定结果：5份样品3-5天内均能出现明显的细胞病变，细胞发生融合，形成合胞体。对5株细胞毒PCR或RT-PCR鉴定发现，NDRV为阳性，DPV、MDRV、MPV和TMUV均为阴性。通过极限稀释法将各株病毒传至第5代进行病毒纯化，共分离5株NDRV毒株，分别命名为NDRV-CM-GD20、NDRV-FJ19、NDRV-ZSS-FJ20、NDRV-LRS-GD20和NDRV-CS-JX20。

5株病毒在Vero细胞上的TCID₅₀在10^-3.67-10^-4.8，各毒株的基本信息如下表所示。

二、NDRV S基因组测序。

1、基因序列测定。

通过一步法RT-PCR分别扩增NDRV-CM-GD20、NDRV-FJ19、NDRV-ZSS-FJ20、NDRV-LRS-GD20和NDRV-CS-JX20 5株病毒，具体操作如下：参照美基核酸提取试剂盒说明书，将能引起BHK-21 CPE的毒株细胞液提取病毒核酸。按照PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit使用说明书操作，进行RT-PCR，反应体系如下表所示。反应程序为：50℃30 min；94℃3min；94℃30 s，50～60℃30s，72℃1 min/kb做30～35个循环；72℃再延伸10 min。反应结束后，将50 µL产物在2 %琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像分析仪下观察记录结果。参照E.Z.N.AGel Extraction Kit说明书，将电泳后的目的条带进行回收，置于-20℃备用。

配置10µL连接体系：纯化产物4µL，SolutionI5µL，pMD18-T载体1µL。16℃

作用4h或4℃静置过夜。连接产物与50µLDH5α感受态细胞混匀，冰浴30 min，

42℃水浴热激90s，迅速冷却10min。加入200µL新鲜LB液体培养基混匀后，

37℃220 r/min振荡培养45 min，吸取50µl菌液在LA琼脂平板上涂布均匀后，

37℃倒置培养14h。挑取可疑白色单菌落，接种于LA液体培养基中，37℃180r/min

振荡培养10h，利用特异性引物进行常规菌液PCR鉴定。

S1、S2、S3和S4基因的RT-PCR产物电泳结果如图1所示，结果表明S1

基因条带在1568bp左右，S2基因条带在1324bp左右，S3基因条带在1202bp

左右，S4基因条带在1191bp左右，与预期基本相符。将其纯化回收后克隆测序。

2、基因序列测定及分析。

（1）S基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列比较分析。

将测序结果利用DNAStar对测序结果进行拼接，具体操作如下：经PCR鉴定为阳性的菌液，送往华大基因测序。利用生物信息学分析软件DNAstar对核苷酸序列拼接分析，与GenBank中已发表的正呼肠孤病毒成员全基因序列进行比对分析。参考正呼肠孤病毒的基因序列，用MEGA5.0的邻位相连法（Neighbor-Joining）绘制系统进化树，并根据自引分析法（Bootstrap，n=1000）进行检验。

获得NDRV-CM-GD20、NDRV-ZSS、NDRV-FJ、NDRV-CS和NDRV-LRS-GD20基因序列，使用Meglign和MEGA7.0将5株毒株与Genbank上已发表的17个禽呼肠孤病毒参考毒株序列进行比对分析。结果表明，5株病毒相似性较高，S基因核苷酸同源性为87.5%-99.3%，氨基酸同源性为90.6%-100%，与当前流行的NDRV流行毒株核苷酸同源性为87.3%-100%，氨基酸同源性为85%-100%，同处于水禽呼肠孤病毒基因2型分支。NDRV-CM-GD20与新近报道的新型呼肠孤病毒在同一分支。

三、NDRV弱毒株选育。

1、动物模型构建。

根据病毒分离鉴定，毒力测定及遗传进化分析，选择广东分离株NDRV-CM-GD20作为疫苗致弱的亲本株。

选用 NDRV-CM-GD20株进行致病试验，具体操作如下：将20只健康1 d龄母番鸭，随机分为攻毒组和对照组，每组各10只，颈部皮下注射2×10⁵TCID₅₀病毒液，对照组接种同等剂量生理盐水。每日观察并记录发病死亡情况。于7日后进行剖检，无菌采集肝脏、脾脏经研磨处理后用于接种细胞，采集肝脏、脾脏的一部分组织使用10%福尔马林固定，用于病理切片观察。

结果显示攻毒组番鸭精神萎靡，采食量减少，第3天出现死亡，第4-5天为死亡高峰，死亡率为40%。将死亡鸭剖检，发现肝脏表面大量出血斑，脾脏出血。对攻毒7日后番鸭剖检，发现肝脏表面有白色坏死点，脾脏肿大、出血或变硬、不同程度白色坏死。病理切片观察显示攻毒组脾脏坏死、肝细胞变性坏死淋巴细胞增生浸润；空白组肝脏和脾脏组织结构正常未见明显病理变化，如图2、图3所示，其中A1：空白组肝脏；A2：空白组脾脏；A3：攻毒组肝脏；A4：攻毒组脾脏；B1：空白组肝脏；B2：空白组脾脏；B3：攻毒组肝脏；B4：攻毒组脾脏。无菌采集病死鸭肝脏、脾脏接种细胞能回收到病毒，提取病毒核酸使用特异性引物经RT-PCR检测均为阳性。

2、NDRV 繁殖系统构建。

将亲本毒株进行病毒分离培养，接种Vero、BHK-21、DF-1、LMH四种细胞上，每日观察其病变情况，每隔12h收细胞培养物，使用RT-qPCR方法测定每个时间点的细胞毒拷贝数。对数据进行分析，绘制一步生长曲线，48h后，Vero和LMH上表现出细胞巨融合现象，在BHK-21细胞上病变为圆缩脱落，而在DF-1细胞上无明显病变，如图4所示，其中A1、B1、C1、D1分别为Vero、BHK-21、DF-1、LMH空白组；A2、B2、C2、D2分别为Vero、BHK-21、DF-1、LMH接毒组。

对4种细胞0-96 h每隔12h收集样品进行定量RT-PCR检测，绘制一步生长曲线，如图5所示，可以看出该毒株在BHK细胞上12-60h为快速繁殖期，60h病毒含量达到峰值；在Vero和LMH细胞上96 h时病毒含量最高；而在DF-1细胞上，病毒繁殖能力极弱，0-96h病毒含量几乎没有增加。结果表明，NDRV-CM-GD20适合在BHK-21、Vero、LMH细胞上生长，参考初始病毒含量与病毒峰值含量的差值，可推测病毒在Vero细胞和LMH细胞繁殖力更强。

在含50ug/mL 5-FU的病毒维持液培养下，不同稀释度的NDRV-CM-GD20在 BHK-21细胞上的病变状态如图6所示，其中A:空白B: 10-1病毒稀释液；C:10-2病毒稀释液；D:10-3病毒稀释液，病毒稀释10倍、100倍均能使BHK-21产生明显病变，稀释1000倍病变不明显。

综上，NDRV-CM-GD20稀释成10-1浓度，在BHK-21细胞上诱导，维持液中的5-FU含量为50ug/mL，在60 h时病毒含量可达最高。

3、诱导致弱。

将NDRV-CM-GD20作为亲本毒株接种于单层BHK-21细胞上，在二氧化碳培养箱中37℃孵育1h，按照50ug/mL的浓度的5-FU加含1%的FBS维持液，培养3-5d，收取病毒，培养至40代，得到F10、F15、F20、F25（即NDRV-CM）、F30、F35、F40共7个代次诱导株。病毒培养60h，不同代次的病变特征相似，BHK-21均表现细胞圆缩脱落，如图7所示。测得各代次病毒滴度，随着诱导毒株在BHK-21细胞上诱导代次的增加，对细胞的适应性越来越强，病毒滴度越来越高，如下表所示。

4、不同代次诱导株的编码关键蛋白基因测序。

使用S基因测序引物对F10、F15、F20、F25（即NDRV-CM）、F30、F35、F40的S基因通过RT-PCR扩增后，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得4个片段，S1基因在1568bp，S2基因在1324bp，S3基因在1202bp，S4基因在1191bp，片段大小与预期一致，如图8所示，其中M：DNAMarker DL2000；1：空白；2-8：各代次S1基因。将目的片段回收后制备克隆测序菌株送华大基因测序。

使用生物软件对测序数据进行拼接处理并进行突变分析，结果可知：与亲本毒株相比，F40编码δC、δA、δB、δNS的基因共有30个碱基突变位点，导致13个氨基酸位点突变（见表5）。在这13个突变的氨基酸位点中，δC蛋白6个氨基酸突变（T55M、A57T、S148G、N161D、M223L、D234G），δA蛋白1个氨基酸突变（L130p），δ B蛋白3个氨基酸突变（P131S，H132L，A245T），δNS蛋白3个氨基酸突变（L236P、V338A，C389S）。如下表所示。

5、不同诱导代次的安全性评估。

为了确定不同代次诱导株的安全性，在雏番鸭上进行动物实验评估。免疫和攻毒均采用颈部皮下注射方式，剂量为2×10⁵ TCID₅₀或同体积生理盐水。90只番鸭随机分为9组，每组10只，1-8组分别为F0、F10、F15、F20、F25（即NDRV-CM）、F30、F35、F40的攻毒组，9组设为对照组。（病变评分规则：无明显病变为0分, 有轻微病变记1～3分, 中等程度的病变记4～6分, 严重病变记7～10分, 计算各脏器病变平均分值）

1日龄时，称量各番鸭初始体重，各组接种病毒液或生理盐水，每天观察雏番鸭发病及死亡情况。攻毒后的第 6天对各组进行体重称量，比较各代次诱导株对雏番鸭发育的影响；采集肛咽混合拭子，进行RT-qPCR检测攻毒6天后各代次的排毒情况。攻毒后第7天剖杀各组番鸭，观察肝脏脾脏病变情况，并做病变评分统计。取一部分肝脏、脾脏使用10%福尔马林固定，病理切片观察组织结构损伤情况。

F0（即NDRV-CM-GD20亲本毒株）、以及各诱导毒株代次F10、F15、F20、F25（即NDRV-CM）、F30、F35、F40安全性实验显示，攻毒7天后，与空白组相比，F0攻毒组体重变化显著降低（P<0.001），如图9所示，F0的肛、咽拭子排毒量显著高于空白组和各诱导毒株代次F10、F15、F20、F25（即NDRV-CM）、F30、F35、F40（P<0.0001），如图10所示，其余组体重和拭子载量无明显差异；剖检观察，F0攻毒组肝脏或脾脏出现出血坏死，发病率为100%，病死率为50%，F10发病率70%，病死率14%，F15发病率为30%，病死率33%，F20发病率20%，无死亡，其余各组无明显病变；病理切片观察，F0攻毒组肝脏或脾脏坏死，其余各组肝脏、脾脏组织结构正常，无明显病理变化，如图11、图12、图13、图14所示。结果表明，诱导代次F25（即NDRV-CM）、F30、F35、F40毒株已完全致弱。各诱导代次病毒攻毒7天后剖检病变情况如下表所示。

6、不同诱导代次的攻毒保护实验。

为了确定不同代次诱导株的攻毒保护效果，在雏番鸭上进行动物实验评估。

免疫和攻毒均采用颈部皮下注射方式，剂量为 2×10^‐5TCID₅₀或同体积生理盐

水。90 只番鸭随机分为 9 组，每组 10 只，第 1‐7 组分别免疫 F10、F15、

F20、F25（即NDRV‐CM）、F30、F35、F40，第 8 组设为对照组，第 9 组作

为 7 天后攻毒对照。

1日龄时对第1-7组分别注射各代次病毒液，第8组注射生理盐水，每天观

察雏番鸭发病及死亡情况；免疫后的第 6天对各组进行体重称量；第7天对1-8组攻亲本毒F0，第9组为空白对照，每天观察雏番鸭发病及死亡情况；攻毒6天后记录各组番鸭体重，感染后7天各组体重变化不明显，如图15所示，攻毒第7天剖检观察各组病变情况并记分，取一部分肝脏、脾脏使用10%福尔马林固定，进行切片观察组织结构损伤情况，剖检观察阳性对照组发病率100%，病死率10%，F10组发病率30%，病死率33%，F20组、F30组发病率为10%，F35组发病率50%，F40组发病率100%，F25（即NDRV-CM）组无明显病变，如图16、下表所示。病理观察，阳性对照组与F15组肝脏见炎性细胞增生灶，大面积坏死，脾脏淋巴细胞缺失，内皮细胞裸露，变性坏死，如图17所示。结果表明与其他代次诱导株相比，F25代病毒株（即NDRV-CM）能很好地保护雏番鸭不受亲本毒感染。图18为攻毒7d后各免疫组肝脏的病例观察结果图，图19为攻毒7d后各免疫组脾脏的病例观察结果图。

7、候选株 F25（即 NDRV‐CM）效力试验。

（1）F25 代（即 NDRV‐CM）传代稳定性实验。

将 F25 代次毒株（即 NDRV‐CM）常规接种于铺满 80% BHK‐21 细胞上，不加诱导剂的维持液培养 3‐5 天收取病毒，连续培养 20 代。对 F25‐20 的 S 基因克隆测序，监测毒株基因突变稳定与否，对 F25‐20 S 基因测序发现，与 F25 相比，F25‐20有3个氨基酸位点突变，其中δA1个突变位点（S353P），δB1个突变位点（N347D），δNS1 个突变位点（H375R），如下表所示。

（2）毒力返强试验。

将F25（即NDRV-CM）在雏番鸭上连续传代至P5，具体操作如下：10只1日龄番鸭，按2×10^-5TCID⁵⁰/只剂量颈部皮下注射F25（即NDRV-CM），每天观察攻毒后雏番鸭发病情况；雏番鸭感染3天后，剖检观察肝脏、脾脏病变情况，收集肝脏脾脏，按照常规方法处理成无菌病料研磨上清液，命名为P1。将P1按以上方式对1日龄番鸭攻毒得到P2，依次类推，使病毒在雏番鸭体内连续传代5个代次。期间番鸭无明显症状，各代次解剖雏番鸭肝脏、脾脏均无明显病理变化，将病料研磨液进行RT-PCR检测发现，F25代毒株（即NDRV-CM）于P3时已经检测阴性。将P2组织液抽取RNA，通过克隆测序获得S基因核苷酸序列，进行比对发现与F25代（即NDRV-CM）相比，P2的S基因在δB上有1个氨基酸突变位点，如下表所示。

（3）疫苗候选株F25（即NDRV-CM）对不同NDRV野毒的免疫保护效果。

为评估疫苗候选株F25（即NDRV-CM）对广东、福建、江西不同省区分

离株的保护情况，以剂量2×10⁵TCID₅₀ F25（即NDRV-CM）对雏番鸭进行皮下注射，7日后，以2×10⁵TCID₅₀剂量人工感染NDRV-ZSS-FJ20、NDRV-LRS-GD20、NDRV-CS-JX20 3株病毒，评估疫苗候选株F25（即NDRV-CM）对野毒的保护情况，具体操作如下：将70只1日龄雏番鸭随机分为1-8组，每组10只，免疫或攻毒剂量为2×10⁵ TCID₅₀。1日龄时对2、4、6、8组进行F25（即NDRV-CM）免疫，每天观察番鸭临床情况；免疫7日后，3、4两组攻毒NDRV-ZSS-FJ20，5、6两组攻毒NDRV-CS-JX20，7、8两组攻毒NDRV-FJ19，1组为空白对照，2组为免疫空白对照。攻毒后第6日采集肛咽混合拭子进行RT-qPCR鉴定，第7日进行剖检，观察病变并记录病变得分，分析疫苗候选株F25（即NDRV-CM）对野毒株感染的保护情况。

3株毒株的免疫攻毒实验结果为，7日后剖检各组，3组免疫组肝脏、脾脏均无明显病理变化，而3组无免疫攻毒组肝脏表面出现黑色出血点/斑，脾脏暗红色肿大或大小不一的白色坏死点。结果显示疫苗候选株F25（即NDRV-CM）免疫后三株毒株攻毒番鸭脾脏/肝脏无明显病变，如图20所示，其中A1、A2组为空白对照；A3、A4组：F25（即NDRV-CM）攻毒；B1、B2：NDRV-ZSS-FJ20；B3、B4：F25+ NDRV-ZSS-FJ20（1、2为）；C组B1、B2：NDRV-CS-JX20；B3、B4：F25+ NDRV-CS-JX20；B1、B2：NDRV-FJ19；B3、B4：F25+ NDRV-FJ19。对各组进行RT-qPCR结果均为阴性，这表明F25代毒株（即NDRV-CM）可以对这三株不同地区分离的毒株提供完全保护，故F25（即NDRV-CM）可作为NDRV的弱毒疫苗候选株。本发明人将F25命名为NDRV-CM，并将其进行保藏。对NDRV-CM进行遗传进化分析，用生物信息学软件MEGA7.0的Clustal W和邻位相邻法（Neighber-Join）绘制系统进化树，并根据自引分析法(Booststrap, N=1000)进行检验，结果如图21、图22所示；并对NDRV-CM进行透射电镜检测，结果如图23所示。

将上述方法获得的新型鸭呼肠孤病毒弱毒株接种至基础细胞中进行培养，当基础细胞病变达到75％-80％时，冻融，收获细胞病毒液；将细胞病毒液与冻干保护剂混匀，冷冻，真空干燥，制成疫苗。基础细胞可为Vero、BHK-21、DF-1、LMH鸭胚成纤维细胞(DEF)、番鸭胚成纤维细胞(MDEF)、鸡胚成纤维细胞(CEF)等原代细胞，也可为Marc145、VERO、ST、MDCK等传代单层细胞。在本发明中，上述基础细胞为BHK-21。上述冻干保护剂也可为常规的用于病毒液冻干的保护剂，如7％蔗糖脱脂乳等。本领域技术人员还可在细胞病毒液与冻干保护剂混匀后加入青霉素和链霉素。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种NDRV弱毒株，其特征在于，该NDRV弱毒株包括NDRV-CM弱毒株，所述NDRV-CM弱毒株的保藏编号为CGMCC NO：45061，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种NDRV疫苗，其特征在于，该疫苗包括权利要求1所述的NDRV弱毒株。

3.权利要求2所述的NDRV疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的NDRV弱毒株接种至基础细胞，培养，冻融，得到所述NDRV弱毒株的细胞病毒液，冷冻，真空干燥，得到NDRV疫苗。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将权利要求1所述的NDRV弱毒株接种至基础细胞，培养至病变细胞占细胞总量的75％-80％，冻融，得到所述NDRV弱毒株的细胞病毒液，将所述细胞病毒液与冻干保护剂混合，冷冻，真空干燥，得到NDRV疫苗。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述基础细胞包括以下细胞中的至少1种：Vero、BHK-21、DF-1、LMH鸭胚成纤维细胞、番鸭胚成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞、Marc145、VERO、ST、MDCK。