CN108913666A - 一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒及其灭活疫苗和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒及其灭活疫苗和应用，该鸭呼肠孤病毒已于2018年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：V201843。本发明提供的鸭呼肠孤病毒对目前流行的以脾脏坏死为主要病症的鸭呼肠孤病毒具有很好的免疫原性。以本发明的鸭呼肠孤病毒株制备的灭活疫苗安全性好，保护率达100％，能够对新分离的变异株提供完全保护。

Description

一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒及其灭活疫苗和应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域领域，具体涉及一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒及其灭活疫苗和应用。

背景技术

呼肠孤病毒的基因组为双股分节段的RNA，1978年国际病毒分离委员会(ICTV)将其定为呼肠孤病毒科(Reoviridae)，包括呼肠孤病毒属、环状病毒属和轮状病毒属。呼肠孤病毒(Avian reovirus)首次在鸡的呼吸道内分离得到，感染易感鸡后，可表现为肌腱炎、滑膜炎和呼吸道疾病等症状。ARV可感染鸡、火鸡、鸭、鹅、鹦鹉、鸽子等禽类，可引起鸡的病毒性关节炎、腱鞘炎，同时也是其他病的病因，包括心肌炎、心包炎、心包积水、肝炎、胸腺萎缩、呼吸道病以及生长受阻等。

2017年起，我国山东、河北、河南、安徽及江苏等地鸭大范围爆发以脾脏坏死为主要症状的传染性疾病，该病主要引起各个年龄阶段鸭脾脏肿大、出血和坏死，导致种鸭产蛋和肉鸭体重的下降，料肉比升高，肉鸭出栏合格率显著降低，对肉鸭以及种鸭养殖业造成严重经济损失。

目前对于该传染性疾病的流行尚无有效的预防或治疗措施，常规的抗病毒和抗菌治疗方法无效；使用减毒活疫苗或灭活病毒疫苗通过免疫接种来预防该传染性疾病的发生也是常用的治疗手段之一，但前提是需要分离获得免疫原性良好、效价稳定的病原菌株。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株分离的鸭呼肠孤病毒毒株，采用该毒株制备的灭活疫苗免疫原性好，能够有效防治目前流行的以鸭脾脏坏死为主要症状的传染性疾病。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一方面，提供了一株鸭呼肠孤病毒，该病毒已于2018年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：中国武汉，武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO：V201843，分类命名为新型鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18株。

本发明的第二方面，提供上述鸭呼肠孤病毒在制备预防或治疗鸭脾脏坏死的疫苗中的应用。

进一步的，所述鸭脾脏坏死是由鸭呼肠孤病毒引起的。

本发明的第三方面，提供一种预防或治疗鸭脾脏坏死的疫苗组合物，所述疫苗组合物含有免疫有效量的所述鸭呼肠孤病毒株。

进一步的，所述疫苗组合物中还含有药学上可接受的佐剂。

优选的，所述疫苗组合物为灭活疫苗或减毒活疫苗；更优选的，所述疫苗组合物为灭活疫苗。

本发明的第四方面，提供一种预防或治疗鸭脾脏坏死的灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒接种到鸡肝癌细胞(LMH) 细胞系中，对鸭呼肠孤病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，获得鸭呼肠孤病毒株病毒液；

(2)将鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活，加入Tween-80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和Span-80混合作为油相，将水相和油相混合均匀，乳化，得到预防或治疗鸭脾脏坏死的灭活疫苗。

优选的，步骤(2)中，鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

优选的，步骤(2)中，所述水相中，鸭呼肠孤病毒株病毒液与Tween-80加入的体积比为96:4。

优选的，步骤(2)中，所述油相中，白油、硬脂酸铝和Span-80加入的体积比为94:2:6。

优选的，步骤(2)中，水相和油相按体积比为1:2进行混合。

优选的，步骤(2)中，油相和水相混合的方法为：将水相加入到油相中，6000rpm 混合10min。

优选的，步骤(2)中，所述乳化具体为：8000r/min乳化20min。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18株，对目前流行的以脾脏坏死为主要病症的鸭呼肠孤病毒具有很好的免疫原性。以鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18株制备的灭活疫苗安全性好，保护率达100％，能够对新分离的鸭呼肠孤病毒变异株提供完全保护。

(2)本发明制备的新型鸭呼肠孤病毒灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，并且各项指标检测均稳定有效，利用本发明的灭活疫苗免疫鸭后，鸭可以获得较高的抗体水平，持续期长，可以有针对性的防治新型鸭呼肠孤病毒的感染与爆发，对鸭群提供有效的免疫保护；同时简化了疫苗的生产工艺，可以实现规模化生产，具有很好的商品化开发前景。

附图说明

图1：本发明的病毒分离株在LMH细胞上的细胞病变。

图2：本发明的病毒分离株N-DRV-XT18病毒基因组中L1基因的同源性比对结果。

图3：本发明的病毒分离株N-DRV-XT18病毒基因组中L2基因的同源性比对结果。

图4：本发明的病毒分离株N-DRV-XT18病毒基因组中L3基因的同源性比对结果。

图5：本发明的病毒分离株N-DRV-XT18病毒基因组中M1基因的同源性比对结果。

图6：本发明的病毒分离株N-DRV-XT18病毒基因组中M2基因的同源性比对结果。

图7：本发明的病毒分离株N-DRV-XT18病毒基因组中M3基因的同源性比对结果。

图8：本发明的病毒分离株N-DRV-XT18病毒基因组中σC蛋白基因的同源性比对结果。

图9：本发明的病毒分离株N-DRV-XT18病毒基因组中S2基因的同源性比对结果。

图10：本发明的病毒分离株N-DRV-XT18病毒基因组中S3基因的同源性比对结果。

图11：本发明的病毒分离株N-DRV-XT18病毒基因组中S4基因的同源性比对结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语“免疫有效量”是指将引发针对鸭呼肠孤病毒的免疫应答的无毒力鸭呼肠孤病毒毒株的量。“免疫有效量”将依赖于受体动物的物种、品种、年龄、健康状况等因素。

正如背景技术部分所介绍的，2017年起，我国山东、河北、河南、安徽及江苏等地鸭大范围爆发以脾脏坏死为主要症状的传染性疾病，对肉鸭以及种鸭养殖业造成严重经济损失。本申请发明人从发病鸭坏死的脾脏组织中分离出一株病毒，并从病原生物学、动物回归试验、基因组特性及分子水平上首次证实了该病原是一种鸭呼肠孤病毒，命名为鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18。

本发明采用市售的商品化鸭呼肠孤病毒疫苗进行防治，但无法对该传染性疾病实现很好的防控。由于禽呼肠孤病毒为RNA病毒，有多个分段，不同毒株间在抗原结构、致病性、细胞培养特性以及宿主特异性等方面存在一定的差异，在遗传进化时容易发生变异，由此推测鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18发生了变异，使之不同于以往分离的鸭呼肠孤病毒、番鸭呼肠孤病毒和禽呼肠孤病毒。

本发明对上述新分离的鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18进行了全基因组测序，并分别将10 个基因片段与现有报道的禽呼肠孤病毒进行了序列比对和同源性分析，结果发现，新分离毒株N-DRV-XT18的10个基因片段中L1、L2、L3、M1、M2、S3、S4均位于一个相对独立的分支中，且与目前已经上传在Genbank中鸭源呼肠孤病毒序列变异性较大，说明新分离的毒株N-DRV-XT18确实不同于其他的禽呼肠孤病毒，可以认定本发明中所发现的鸭呼肠孤病毒与现有已经报道的鸭呼肠孤病毒存在较大变异，为正呼肠孤病毒属的1个新的单独种。因此，本发明将该新型鸭呼肠孤病毒保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：V201843。

进一步的，本发明在该分离株的基础上，研制出了能够预防或治疗鸭脾脏坏死的灭活疫苗。

在本发明的一个实施方案中，给出的预防或治疗鸭脾脏坏死的灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒接种到鸡肝癌细胞(LMH) 细胞系中，对鸭呼肠孤病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，获得鸭呼肠孤病毒株病毒液；

(2)将鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活，加入Tween-80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和Span-80混合作为油相，将水相和油相按体积比1:2混合均匀，乳化，得到预防或治疗鸭脾脏坏死的灭活疫苗。

上述灭活疫苗的制备方法中，采用LMH细胞系对病毒进行培养，该细胞系对本发明的新型鸭呼肠孤病毒具有非常好的易感性，可连续传代，生长状态好，有利于病毒的增殖及疫苗生产。

佐剂是指加入到疫苗制剂后能有效促进、增强或延长机体对抗原特异性免疫应答的物质。佐剂的选择是疫苗乳化工艺的基础，稳定的疫苗乳剂能有效提高动物抵抗疫病的能力。因此，选择合适的佐剂，确定最佳的水相与油相比例，对于疫苗的稳定性具有重要意义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

其中，RNA提取试剂盒购于北京康为世纪有限公司，普通琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京全式金公司，反转录试剂盒购于宝生物(大连)有限公司，2×Es Taq MasterMix 购于北京康为世纪有限公司，DL2000Marker购于宝生物(大连)有限公司，胎牛血清、 DMEM培养基购于以色列BI公司，PBS购于北京索莱宝公司。

实施例1：鸭呼肠孤病毒毒株的分离和鉴定

1.病毒分离：

(1)剖检山东泰安市某养鸭场中发病鸭坏死的脾脏组织置于15mL离心管中，加入5倍体积的无血清的DMEM培养基，匀浆后反复冻融3次，每次解冻后在振荡器上震荡 1-2min后在进行下一次冻融；冻融后将装有样品的15mL离心管于离心机中4000rpm离心 5min；取上清，0.22μm微孔滤膜过滤后，备用；

(2)根据呼肠孤病的增殖特性，选用鸡肝癌细胞(LMH)进行病毒分离。按照常规细胞培养方法，待25cm²细胞瓶中的细胞铺满单层时，吸弃瓶中培养基并用PBS荡洗细胞2次，加入0.5毫升步骤(1)已滤过的样品冻融上清，将细胞置于37℃，5％CO₂浓度的培养箱中感作30min，感作结束后加入含2％胎牛血清的DMEM培养基，观察并记录出现细胞病变的时间。如第1代无细胞病变出现，则冻融后以第1代收获的培养物按照步骤 (1)方法继续分离，直至获得稳定毒株；如传至第5代仍无细胞病变，则视为病毒分离阴性。最终得到一株稳定的毒株，其在接种LMH细胞后3天出现了较为明显的细胞病变，即表现为细胞变圆、融合(图1)，同批次空白对照细胞正常，将该毒株命名为N-DRV-XT18。

2.病毒鉴定：

采用二代测序技术对毒株N-DRV-XT18进行全基因组序列测定，全基因组序列中L1、 L2、L3、M1、M2、M3、S1、S2、S3、S4这10个基因片段的序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.10所示。然后与现有技术中已公布的禽呼肠孤病毒序列进行同源性比对，毒株 N-DRV-XT18的10个基因片段的同源性比对结果分别如图2-图11所示(其中，S1基因主要编码σC蛋白，因此，以σC蛋白基因进行了同源性比对，见图8)。

由图可以看出，毒株N-DRV-XT18的10个基因片段中L1、L2、L3、M1、M2、S3、 S4均位于一个相对独立的分支中，说明新分离的毒株N-DRV-XT18不同于其他的禽呼肠孤病毒，为正呼肠孤病毒属的1个单独种。

将分离得到的毒株N-DRV-XT18鉴定为鸭呼肠孤病毒。并对该毒株进行生物保藏，保藏信息如下：

菌种名称：鸭呼肠孤病毒

分类命名：新型鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18株

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：CCTCC

地址：中国武汉武汉大学

保藏日期：2018.07.18

保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：V201843。

实施例2：动物回归试验

取经过病原及抗体检测，不携带新型呼肠孤病毒及病毒抗体的健康1日龄雏鸭40只，随机均分为2组，每组20只。其中第1组为实验组，实验组采用毒株N-DRV-XT18第5 代细胞培养物经爪垫接种，0.5mL/只，第2组为对照组，每只爪垫接种DMEM培养基作为对照，隔离饲养。接种后每日观察各组动物的精神状态，以及脾脏病变情况并做记录。

实验组在接种病毒后4天开始出现脾脏坏死病变，在接种后第7天，20只实验组均出现脾脏坏死病变，与自然感染病例症状相同，对照组健康状况良好。取实验组病变脾脏按照上述病原分离操作进行病原重分离，能够分离得到新型呼肠孤病毒。

实施例3：灭活疫苗的制备

(1)病毒的增殖与收获：

将分离鉴定后的新型鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18接种到生长良好的LMH细胞系中，对该病毒进行大量增殖，获取足够的病毒液。将获得的足量细胞病毒液置于-20℃冷冻，经两次冻融后，收取细胞病毒液。

(2)病毒的纯化：

用已建立的PCR、RT-PCR等检测方法，检测获取的病毒液中是否含其他常见病毒。检测项目包括禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸭细小病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)等，并对种毒进行纯化。

(3)病毒液的灭活：

菌检合格的病毒液用甲醛进行灭活，其最佳的灭活条件为加入终浓度0.2％的甲醛， 37℃搅拌灭活16h。

(4)疫苗的制备：

①油相的准备：取10号药用白油、硬脂酸铝(Aluminum tristearate)、司班-80(Span-80) 按94：2：6混合，搅拌混匀后，高温高压灭菌。

②水相的准备：将灭活的抗原液、吐温-80(Tween-80)按体积比为96：4加入，振荡混匀，使Tween-80彻底溶解。

③乳化：油相和水相按2：1的比例混合，在超净台内将2份油相加入组织匀浆机，缓慢地将1份水相，期间不断搅拌，水相全部加入后6000rpm混合10min，再8000r/min 乳化20min，分装备用，即制备得到灭活疫苗。

实施例4：灭活疫苗的质量检验

将实施例3制备的灭活疫苗进行包括：剂型、离心稳定性、粘度、无菌和保存期的质量检验，具体方法参考《中华人民共和国兽药典》(2015版)。

结果为：本发明制备的灭活疫苗的剂型为油包水型(W/O)；离心稳定性、粘度和无菌检查符合《中华人民共和国兽药典》(2015版)的规定。

实施例5：灭活疫苗的安全性检验

取1日龄雏鸭40只，随机均分为2组，每组20只。其中第1组为实验组，腿部肌肉注射实施例3制备的灭活疫苗，0.5mL/只；第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂，接种后每日观察各组动物的精神状态，以及注射部位是否出现红肿热痛等局部炎症反应，持续观察2周，2周后对试验动物进行解剖，观察注射部位疫苗吸收情况。

结果：实验组出现短暂的精神沉郁，但很快恢复，持续观察两周，试验组和对照组生长发育均正常，精神状态良好，剖检试验组发现注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。结果证明试制疫苗安全无害，对动物生长无影响。

实施例6：灭活疫苗的保护性检验

取1日龄雏鸭60只，随机均分为2组，每组30只。其中第1组为免疫组，腿部肌肉注射实施例3制备的灭活疫苗，0.5mL/只；第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂，在免疫后10日，对两组雏鸭腿部注射0.2mL新型鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18病毒液，并分组隔离饲养，观察两组雏鸭的精神状况及死亡情况。

结果：免疫组出现短暂的精神沉郁，但未表现出鸭呼肠孤病毒病的临床症状，未出现死亡；对照组的雏鸭在攻毒后出现明显的临床症状(脾脏坏死)，死亡只数为21只，结果显示，本发明制备的灭活疫苗的免疫保护率能达到100％。

实施例7：灭活疫苗的免疫持续期测定

取1日龄雏鸭20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为免疫组，每只腿部肌肉注射实施例3制备的灭活疫苗，0.5mL/只；第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂。

分别于免疫后7天、14天、28天、42天和63天，随机取免疫组和对照组的鸭只，测定血清中的鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18株的中和抗体效价。血清中和抗体效价检测方法如下：

(1)于鸭颈部静脉采血0.8ml，37℃放置半小时后，5000rmp离心收集血清；将收集的血清置于56℃水浴锅中，灭活30min。

(2)将灭活后的血清用无菌生理盐水2倍倍比稀释，于每个稀释度中加入等量体积的N-DRV-XT18株病毒液(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)，混合后于37℃放置1小时.

(3)将步骤(2)的病毒血清混合液接种11日龄鸭胚，每个稀释度接种3枚鸭胚。 24h后每隔12h照胚一次(弃去24h内死亡鸭胚)，记录死亡鸭胚个数，按照Reed-Muench 法计算中和效价。

结果发现，用实施例3制备的疫苗免疫雏鸭后，第7天、14天，所有待检鸭血清对鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18株的中和抗体效价均>1:32；第28天，所有待检鸭血清对鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18株的中和抗体效价均>1:64；第42天和第63天，所有待检鸭血清对鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18株的中和抗体效价均>1:32。而对照组的抗体水平在整个实验中均为阴性。说明本发明的灭活疫苗能够在短时间内快速达到高浓度的抗体水平，且免疫持续期为60天以上，能够为雏鸭提供快速、长期的免疫保护。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒及其灭活疫苗和应用

<130> 2018

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3959

<212> DNA

<213> 毒株N-DAV-XT18的L1基因

<400> 1

gctttttctc cgaacgccga aatgagttcg cgcaaagtgg ctagacgtcg tcataaggat 60

gctaccgaca ctaaagattc taagtacact gataaagata agtcctcagc cacaactact 120

gaaacgaagt ccgtcgactc cactaacaag agtgtaagcg ctccaaaatc tgatactcca 180

gcagcatcaa caccatcctc tacagatggc gcttctcagg ttgcagtcgc taaacaaacc 240

aatgataatg acgcttcttc taaagattct tcccctaaac caactgtcac tcccgacgga 300

aaggatggaa tgcatggtgc ggttaaatct caagacgcta aagctaccat tgctgttgat 360

gataacaagg acagggacgt ggtcttcggt ggcaagggtt caggtgataa aaatgctatt 420

acaaagactg ggtccgtgga taatgatggt ggtgttaaaa cgataccggc taaggatact 480

actatcgcat ccgctaaagc catgatggaa cagaaacagt tagttgcggg tcttccgaag 540

cagccaaaac ctgccagcca tctatgcact gtttgcatgg ctcaattcgc ttcagctgat 600

gcattgacta tacaccaaac aactcattcg attggatcca acgctgcact gactagcttt 660

tcgatctcta ccgccgttga ggagttcatt caatcttggg cctcggctac ttccactgct 720

aatactaaaa cagcactaac tgtggcggac gttgattctt taatgatgac tgaagggata 780

cgtttaatca cttgggattc cggactctgt acctcctttg agcttgtgcc gatagtgcag 840

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ttggattccc catcttcctc tcgtgaatgc gatcttcggc ttgctcctcc gacagaaagt 1020

aatgcacgtt cttttgctat gctcctcaac actggtgcta ctcctgaagg tacatttaat 1080

cctaacactc tccgtatgaa cgtcttgcag atgtgcctcc agtatgtgtt agctaacctc 1140

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agcgccgatt acatccagcc aattctatct gcgttcgctc gcactctctc gcgtgtttca 1680

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ttctcagact tccgtctcgc atgtgctgct tggctgtata atggttgtgt ccagacgtac 1860

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gatatgtttg tctgtctctt ggctctcccg cttgtcactg atcctaatgc gccttgtcaa 1980

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ctgcttggta gatgggtgat gcccctacag ctactgatgg tgaacattgg cgtgttccct 3420

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gagcagtgga tgtcgaaagt gtcgcccatg ggcataccac ccgttccgtt cctgatgcca 3600

caatctgaag gtcataacat tacttctggc atggtgaccc actacatttg gtccactgag 3660

tataacgatg gctccctttt cgccacaaac acagacttgc ctgttactgt cttcggtcca 3720

gaccgcacta tccctattga gagataccgt gctttggtcg atccgggcgc tctgccagcc 3780

acaaaccaac tcccccacac tatcgatctc tactgttcgt tgagacgcta ctacttggaa 3840

acacctccga ttacagcgac ggtgacaact tatggtgatg gtctcccagc gttgaaccat 3900

tagagcggcg aggctagacg cgagctgatc gcgtcgactc tcgttggagg ttactcatc 3959

<210> 2

<211> 3830

<212> DNA

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gtgccagcct ctcaccctcc accctgcgct aagtgcccgg agcttagaga acaaatcacg 1320

aggctatctt ctcaacccgt cgccaattca caacctctgg ccggtccagc tgctctgctg 1380

tcgaagatct ctgaattgca acgcctcaac cgggaattgt ctctgaagtt ggcagatgtt 1440

caaccggcac gtgaagacca tctcctagcg tatttgaacg agcatgtgtg cgtgaacgcc 1500

aaggatcatg agaaggacct ccttgcccgt tgcaatgtgt ctggtgactc agtcaatacc 1560

gtcgtcgccc agagagctaa gaatcgtgac aggtttgagg cccgcttgcg tcaggaagcc 1620

aacgctgaat gggagccccg catggctgca ctaaatcaag agctcacaca atcacgcgct 1680

gaacagcagg agatgatgac gcaggcgctg caatacctca acgagcgtga cgaattggct 1740

caagagttgg atgagttgaa acgggagatc actactctga gatctgcgaa cgtgaggttg 1800

aatgctgaga accaccgaat gagtcgagcg accagagtgg gtgattcttt tgtcagtgat 1860

gtcctctcga cgccttccga cgttccacga acttctgcac cttccatgga tgacctggtg 1920

gacgacctgt gagctttgac ctgtgactcg gtttctctct gactccatga ccccacggcg 1980

gactcggtta tccatc 1996

<210> 7

<211> 1568

<212> DNA

<213> 毒株N-DAV-XT18的S1基因

<400> 7

gcttttttct tctctgccca tggctgacgg tgcatgcaat cacgctactt ctatttttgg 60

agccgtatat tgtcaaatat cacagaatat tgcacacgga aatattgatt cttacacctc 120

ttggacttct tatttacctc ctattctagg cggtggtttt ggtcttattg ttcttctcgt 180

gcttgtggtt ttgatcgtgt attgttgtaa gcattcaaaa attctttctg ccgttaaggc 240

gactgattct gccgtgacaa ctttgcttcg tgatgtcact cccgccaacc ccgatcctgt 300

tcaagtcgtt taaagtccac tcgtggcgtc ttttgtccca atccccgttc cacgttcagt 360

tctgcgacgc aggactccaa tcctacgacg tctattcacg tttcccttct gtgtgtgacc 420

tttcgctctg ttattatctt aatacacctt tcgagtttgg aattgctgct atagaggggc 480

gtcccggtga ctattatttg ctgttcgctg gcaagtccag tgactctaac tcacgagtat 540

ctttgtacgc tacgcggcaa gccggtgacg atggatcgca acgaggtgat acgcctgata 600

ctttccctcc tcccctacca gtcaagcgac gtcgatcatt tgacgacaca gatcaaatcc 660

ctccaaagcg ccgtcgactc actgaaagaa tcacaagtgg tagtgttgag acgcctgact 720

acgattacgt cgacggtggc ggatctacaa tcaacaactg aattgttgac ctcacaggtg 780

gcaggactta gttcccgtgt ggcttcagtg actgatgagg tagtccgtgt aaattcagtg 840

attggaacta cgatcactaa tcttgacaat gtccggtccg agctatcctc tctctcctcc 900

caagtctcgt cgcagacgtc cactctaacg aatcttacat caaccgtttc atcccagtct 960

cttgcgattt ctgatctcca gcgacgagtt acggccttag aacgatcggg tggtgcgccg 1020

acacaatttg aagctccctt gcacctacaa aacggagtcg tctcactcca agcatctccc 1080

tctttctgtt ctttgtctcc gatcctctcc ggacctgctg atgctgctgt tttcaaggtt 1140

ggtgagtggc tgggaactgt catatctggt caaagtcagt catctgcaat catgaacgtg 1200

cggattcatt catttgggca gcggaccatg ttgcttatgt cttcgcaaaa tgtattcact 1260

attccgccag gttcgggtgc gtctttgcag ctagatgtga atcgtataac gacccctgcc 1320

attgacgctg ctatggtaac tccttccgct gcttttgctt ctgcttcctt tatggctgac 1380

atagctttca aagactctaa gacaggagaa gtccatgctt tacacactac tggctctttt 1440

cgatcacctt ctttctctat cgtttgggtc ccggttgctt cggaaactcg taattatcaa 1500

ataatggcgt tacgcttcac cgtcgccacg ggctaggctg tggcgcgcaa tgagaagagc 1560

tattcatc 1568

<210> 8

<211> 1324

<212> DNA

<213> 毒株N-DAV-XT18的S2基因

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1323)..(1324)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

nctttttctt ccacgatggc gcgtgccgtg tacgactttt tatctacgcc tttcggtaac 60

cgtggtctag caactaaccg tactcaactg tcgtcactac tgtcaagttc aaattcgcca 120

tggcaacgct ttttgtccgc cttaactcca ctgaccgctc caggcattgt ttcaacccct 180

gaggcaccct acccgggttc atcgttatac caggagtcca tgcttcacag cgctactatc 240

cctgggattc taggtaatag agacgcgtgg cgcaatttca acgtattcgg cttttcatgg 300

acagatgaag gtttgtcagg acttgtcgct gctcaggacc ctcctccagc tccaccgtac 360

caaccagctt cgggacagtg gtctgatctg cttcagtatc ctcgatgggc taatcgtcaa 420

cgtgagttgc agtctaaata tcccattctg ttgagatcta ctttgctttc agctatgcgc 480

gctggaccgg tgttgtacgt tgagacttgg cccaacatga tttctggtcg acttgctgac 540

tggttcatgt cgcagtatgg aaacaacttc gttgacatgt gtgcacgatt aactcagtcc 600

tgcatgaaca tgccagttga gccggatggt aattatgacc agcagatgcg agcattaatt 660

agtctgtggc tcctctcgta tattggcgtt gtgaatcaat ctaacactat taacggcttc 720

tactttgctt ccaagacgcg tgggcaggct atggataact ggacgctgtt ctatgctacc 780

aacaccaatc gggtgcagat tactcagcgc cactttgcct acgtttgcgc tcgctccccc 840

gactggaatg tcgataagtc ctggatcagc gctgccaatt tgactgccat tatcatggct 900

tgccgccagc cgccagcctt tgccaaccag ggggtaatca accaggccca gaatcgaccc 960

ggattctcga tgaatggtgg aacgcctgtg cacgagctga acctgctgac taccgctcaa 1020

gcttgtatcc agcagtgggt cgtagctggt ttgatctcag cagctaaggg tcagtccatg 1080

acgcaggagg cgaatgactt ctcgaacctc atccaagccg atcttgggcg gatcaaagcg 1140

caagatgacg cgttgtacaa ccaacaacct ggttacgctc gtcgcattaa gccgtttgcc 1200

aacggagatt ggacgcctgg aatgactgcg caagcattag ctctactagc cacttttacc 1260

gtctaggcgt agggtcgtac gctgcctgag tccagccctc cggcagcacg tggacgtact 1320

cann 1324

<210> 9

<211> 1202

<212> DNA

<213> 毒株N-DAV-XT18的S3基因

<400> 9

gctttttgag tccttagcgt gcaagccgca atggaggtgc gtgtgccaaa ctttcactcc 60

tttatcgaag gtattactac tagttacttg tgttctcctg cgtgctggaa ttcgaagacg 120

ttatgggata ttgaagaatt tcacacacct gacgttatca gggtcggcaa cgcttattgt 180

tgcactcagt gctgtggtgt tctgtactat ggtgcccctc cctctgatgg aaactgtttt 240

ccacatcaca agtgtcatca acagcaatat cgtactgaga ctccgctcat gagatatatt 300

aaggtgggtc gcactacaga gcaactgctt gatcaatatg ccattgctct gcatgtcatt 360

gcagattact atgatgaggc gagtaagcaa cctcatgata ttgctgaagc tgagtcaatc 420

gcaccatttg atatcgtaac caggactgaa tctattcgca gtgaccgtgc cgttgacccg 480

gaattctgga cttatccgtt agagaggcga ggatacgacg cgcgacatga gattgctaga 540

gcgggttgga agatgatcga tgcttcatcg cgaagtcaca ctcttcctga atgtctggtg 600

tcaaatatgc tacatactag gcatgtcttc agccaaatgt tgaccacgac aaccatctat 660

gatgtcgctg tcacgggtaa ggccgttaaa ttcagtccga tggtagcaac catgccaact 720

cgaggagatg gtgctgtggc tctgtcaaga ggtaacttgg atcatgatgt cgaggactgt 780

tggatggatg gttttgcatt ctcccccctc atcggcggtg ttggcatcac tggtcaattt 840

gagcgtggtt cctgccataa ttttgggcac cccatgattg ggagcggtaa gaaagcttct 900

cactaccgca atttgttcat ggaatcctgg cgtggatggt caaagtcgtg ctttacatgt 960

gctgcaggga tggagcccgc ggagtgcgaa tctaggctgc gaggccacgc cagaactatg 1020

ttcggacgtt ctcttccgga tatctgtgac ttcgaggaga ctacccacgt tggccagtcg 1080

tccgcgccat taaagaaggc cacgaaattg tccttcctgg agtgtaggtg gtaagcacct 1140

ctgggtcaaa atgcacatag gctcccacct atgtgacggt tagcgggact cacctattca 1200

tc 1202

<210> 10

<211> 1191

<212> DNA

<213> 毒株N-DAV-XT18的S4基因

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(4)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 10

nnnntttgag tccttgttca gccatggaca acaccgtgcg tgttggagtt tcccgcaaca 60

catccgtcgc cgctggtcag actgttttca agaacttcta cttactccga tgcaacattt 120

cagctgacgg tcgaaatgcc acgaaagcgg tccagtctca cttcccatac ttgtctcgcg 180

ctgtccgttg cttgtccccg cttgctgctc actgtgctga tagaactctt cgtcgtgata 240

acgtcaagaa cattttgacg cgtgatctgc cctttccatc cgatctcatt aactacgctc 300

accacgtgaa ctcgtcctcc ctcaccactt cccaaggcgt tgaagccgct cgtctcgtgt 360

cccaggttta cggggagcaa gttcctttcg accacgttta tccatctggt tcagcaacct 420

actgtcccgg tgccgtcgcc aacgctatct ctcggcttat ggcaggtttt gtgcctcagg 480

aaggtgacga tttcatgccg actggtccaa tcgattatct cgcagctgat cttgtggcgt 540

acaagtttgt tttaccgtat atgttagata tggtggatgg acgtccccaa attgtgctac 600

cctctcacac cgttgaggaa atgttgactg acactggcct gctgaatgct attgatgcct 660

catttggcat tgagtctaaa agtgatcaac gcatgacgcg tgatgctgct gagatgagct 720

ctcgttcgct caatgagtta gagaaccatg aacatcgcgg gcgcatgccg tggaagatta 780

tgcttgctat gatggccgcg caactgaagc ttgaactgga cgcattagca gacgaacgca 840

ctgagtctca ggctaacgct catgttacat ccttcggctc acgtctattc aatcagatgt 900

cagcctttgt gcctatcgat cgtgagttga tggagcttgc tctcctaatc aaagaacaag 960

gctttgccat gaatcctggt caggttgcgg ccaaatggtc gtctattagg aggtccagtg 1020

cagtacgttc cctggcgagt gcgcgtcttg agattcgaaa tgggaactgg atgatccgcg 1080

aaggcgacca gacgctgctg tctgtctctc cagctaggat ggcgtagacg ggacccatgg 1140

tgtgggtgag gggggccacg acctctgcca cgacttggac tcttattcat c 1191

Claims (10)

1.一株鸭呼肠孤病毒，其保藏编号为：CCTCC NO：V201843。

2.权利要求1所述的鸭呼肠孤病毒在制备预防或治疗鸭脾脏坏死的疫苗中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鸭脾脏坏死是由鸭呼肠孤病毒引起的。

4.一种预防或治疗鸭脾脏坏死的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物含有免疫有效量的权利要求1所述鸭呼肠孤病毒株。

5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中还含有药学上可接受的佐剂。

6.根据权利要求4或5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为灭活疫苗或减毒活疫苗；优选的，所述疫苗组合物为灭活疫苗。

7.一种预防或治疗鸭脾脏坏死的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒接种到鸡肝癌细胞(LMH)细胞系中，对鸭呼肠孤病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，获得鸭呼肠孤病毒株病毒液；

(2)将鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活，加入Tween-80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和Span-80混合作为油相，将水相和油相混合均匀，乳化，得到预防或治疗鸭脾脏坏死的灭活疫苗。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述水相中，鸭呼肠孤病毒株病毒液与Tween-80加入的体积比为96:4；

所述油相中，白油、硬脂酸铝和Span-80加入的体积比为94:2:6。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，水相和油相按体积比为1:2进行混合。