CN110354259A - 一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法。本发明采用LMH传代细胞系作为载体细胞进行病毒增殖，采用赖氨酸、重组人胰岛素、人血清白蛋白、鱼精蛋白、生物素、藻酸双酯钠和生长因子组成的培养基A进行培养，收集病毒液，灭活，制备成疫苗。本发明采用LMH传代细胞系进行鸭呼肠孤病毒增殖不需要额外添加胰酶，而且LMH细胞背景清楚，无外源病原，易增殖，可以有效的简化工艺，降低成本。同时，本发明制备得到的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的病毒含量高、稳定性好，安全性高，是一种较为理想的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗。

Description

一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法。
背景技术
鸭呼肠孤病毒是我国近年来新出现的，以肝脏不规则坏死，出血斑和心肌、腔上囊出血为主要特征的新疫病，该病是由一种新的RNA病毒引起，其病原为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属新型鸭呼肠孤病毒。其发病率和死亡率差异较大，但患病鸭日龄愈小，发病率和死亡率越高。据程安春等的报道，感染3～50日龄的鸭，感染鸭品种包括北京鸭、櫻桃谷鸭、天府肉鸭、四川麻鸭等；潜伏期为4～6天；病初精神萎靡，不愿活动，随着病情发展卧地不起，喜饮水，腹泻，呼吸困难，眼睑充血、出血并严重肿胀，病鸭头部明显肿胀；剖检见消化道、呼吸道、肝、脾、心脏、肺、肾、肠和卵巢等出血，头部下有淡黄色透明渗出液(程安春等，2003)。
张宝来于2008年从湖北省某肉鸭场病鸭中亦分离鉴定出一株鸭源禽呼肠孤病毒，患病率和死亡率均较高；临床症状可见腹泻，流泪，生长缓慢；剖检见脾脏表面散布灰白色坏死点；病理组织学检查表明，脾脏内坏死灶较多，且结缔组织包围坏死灶，出现大量吞嚼含铁血黄素的巨暖细胞。肝细胞胞核消失溶解。透射电镜观察显示，脾脏内亦有大量的巨唆细胞和嗜酸性粒细胞(张宝来，2009)。
2010年李爽利用从临床分离出的鸭源呼肠孤病毒感染日龄楼桃谷鸭，感染后精神抑郁，下痢，流泪，釆食量减少，感染7天后，发病率高达100％，病死率占5.56％。剖检病变是肝脾肿大，且有大小不等的坏死灶，此外，胸腺、心肌和法氏囊等出血、肿胀(李爽，2010)。
由于本病毒目前没有相关的药物控制以及有效的疫苗进行预防保护，为此，生产相关有效疫苗尤为必要。专利文献CN108913666A公开了一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒及其灭活疫苗和应用，本发明公开了一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒及其灭活疫苗和应用，该鸭呼肠孤病毒已于2018年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：V201843，以该鸭呼肠孤病毒株制备的灭活疫苗安全性好，保护率达100％，能够对新分离的变异株提供完全保护。
专利文献CN109718370A公开了一种鸭呼肠孤病毒疫苗及其制备方法，该方法是在传代细胞系BHK-21细胞上接种鸭呼肠孤病毒毒种得到的灭活疫苗，利用Reed-Muench方法测定其病毒滴度可以稳定达到107.0-107.5TCID50/0.1mL。抗原的稳定生产和高滴度是制备疫苗最关键因素，用BHK-21细胞进行鸭呼肠孤病毒增殖其病毒滴度是常规鸭胚法及原代细胞法的10倍以上，如采用生物反应器进行病毒增殖，其病毒滴度可以达到100倍水平。制备得到的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗，产量高，品质稳定，免疫鸭能产生高水平血清中和抗体，免疫效果好，具有巨大的应用前景。
然后，目前虽然推出的多种选择的疫苗，但仍然出现控制不住疫情发展的局面，因此研究和开发出抑制效果更好的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗仍是目前亟需解决的难题。
发明内容
为了解决现有技术中的缺陷，本发明提供一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法。本发明是采用动物传代细胞LMH细胞进行病毒增殖，在培养流感病毒时能够在短期内大量增殖病毒，且无外源因子污染，能维持病毒抗原稳定，同时在培养过程中不需要添加胰蛋白酶，培养得到的流感病毒具有病毒含量高，免疫原性好的优点。
本发明提供了一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000～2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2～3天，接着用无血清DMEM/F12培养液清洗细胞2～3次，得细胞载体；
S2病毒的接种：将鸭呼肠孤病毒液按终体积1:1000～1:5000接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养48～72h，出现80％细胞病变，得病变细胞；
S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，收集鸭呼肠孤病毒上清液，接着进行TCID50检测，合格后，将上述上清液超滤浓缩，得鸭呼肠孤病毒液；
S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的鸭呼肠孤病毒液，得鸭呼肠孤病毒疫苗抗原；
S5疫苗配制：
a油相制备：取92～96份白油，1～3份硬脂酸铝，3～5份司班-80，将白油加热到75～85℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；
b水相制备：取95～98份步骤S4得到的鸭呼肠孤病毒疫苗抗原，加入3～5份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；
c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在15000～18000rpm的条件下乳化4～6min，按照每瓶250mL进行分装，即得。
进一步地，所述步骤S1中LMH细胞可以替换为BHK-21细胞、DF-1细胞或Duckembroy细胞，其效果与LMH细胞的效果基本一致。
进一步地，所述步骤S2中的培养基A包括DMEM/F12基础培养基，还包括如下组分及其浓度：
赖氨酸2～4mmol/L、重组人胰岛素4～10μg/mL、人血清白蛋白1～3mg/mL、鱼精蛋白4～8μg/mL、生物素2～4μg/mL、藻酸双酯钠1～3mg/L和生长因子10～15mmol/L。
进一步地，所述步骤S2中的培养基A包括DMEM/F12基础培养基，还包括如下组分及其浓度：
赖氨酸3mmol/L、重组人胰岛素8μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、鱼精蛋白6μg/mL、生物素3μg/mL、藻酸双酯钠2mg/L和生长因子12mmol/L。
进一步地，所述生长因子由焦磷酸硫胺素和丹参素钠按质量比(2～4):(1～3)组成。
进一步地，所述生长因子由焦磷酸硫胺素和丹参素钠按质量比3:2组成。
进一步地，所述步骤S1中的LMH细胞放置转瓶内培养。
进一步地，所述步骤S1中的LMH细胞放置微载体反应器内培养，微载体使用量为2～10g/L。
本发明人一直致力于研究生长因子对疫苗病毒含量和疫苗效价的影响，在之前的研究中发现采用由焦磷酸硫胺素和天麻素按特定质量比组成的生长因子可以有效的提高禽流感病毒、禽腺病毒等灭活疫苗的病毒含量，提高疫苗的效果。本发明人将由焦磷酸硫胺素和天麻素按特定质量比组成的生长因子应用于鸭呼肠孤病毒的培养，发现其对鸭呼肠孤病毒的增殖效果不明显，对鸭呼肠孤病毒疫苗的效价影响不大。发明人经过大量的研究发现，丹参素钠可以促进鸭呼肠孤病毒含量的增长，但是效果不明显。将焦磷酸硫胺素与丹参素钠按质量比(4～6):(1～3)组成的生长因子对鸭呼肠孤病毒含量的增长效果与丹参素钠单一成分相比增加幅度不大，接着发明人又经过大量的摸索试验发现，将焦磷酸硫胺素的含量降低，与丹参素钠按质量比(2～4):(1～3)组成的生长因子可以有效的增加鸭呼肠孤病毒含量。
另外，本发明提供的培养基中的添加的藻酸双酯钠可以进一步提高鸭呼肠孤病毒的增殖，增加疫苗的病毒含量。其可能的原因是：藻酸双酯钠可以很好的分散和疏松鸭呼肠孤病毒细胞，从而可以使细胞充分的与培养基中的生长因子或其他营养物质接触，从而可以提高细胞繁殖和鸭呼肠孤病毒增殖的速度，而且藻酸双酯钠还可以促进由焦磷酸硫胺素与丹参素钠按质量比(2～4):(1～3)组成的生长因子对鸭呼肠孤病毒含量的增殖效果。
同时，本发明采用的LMH细胞作为载体细胞，在培养流感病毒时能够在短期内大量增殖病毒，且无外源因子污染，能维持病毒抗原稳定，同时在培养过程中不需要添加胰蛋白酶，培养得到的流感病毒具有病毒含量高，免疫原性好的优点。
经试验发现，本发明制备得到的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗病毒含量高，鸭呼肠孤病毒≥108.3TCID50，而且本发明制备的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗外观为乳白色乳剂，将10ml疫苗加入离心管中，以3000rpm离心15min，管底析出的水相应≤0.4mL，具有较高的稳定性高；吸取1.0mL疫苗，令其垂直自然流出0.4mL，时间低于6s，具有较好的粘度，灭活、甲醛含量和安全性符合国家标准，有利于该鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的推广和应用。
进一步地，经试验发现，采用本专利的LMH细胞载体不仅能培养出病毒滴度高的鸭呼肠孤病毒，并且能完全可以取代采用鸭胚培养鸭呼肠孤病毒；从免疫效力试验可知，采用本发明生产的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗免疫鸭能产生高水平血清中和抗体。
与现有技术相比，本发明提供的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法具有以下优势：
(1)本发明采用LMH传代细胞系进行鸭呼肠孤病毒增殖不需要向细胞培养液中添加额外的胰酶，而且LMH细胞背景清楚，无外源病原，易增殖性，可以有效的简化工艺，降低成本。
(2)本发明制备得到的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的病毒含量高、稳定性好，安全性高，是一种较为理想的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗。
具体实施方式：
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1、一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法
S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5％新生牛血清和1000单位/mL青链霉素双抗的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2天，接着用无血清DMEM/F12培养液清洗细胞2次，得细胞载体；所述LMH细胞放置转瓶内培养或放置微载体反应器内培养，微载体使用量4克/升；
S2病毒的接种：将鸭呼肠孤病毒液按终体积1:1000接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养48h，出现80％细胞病变，得病变细胞；
所述培养基A包括DMEM/F12基础培养基，还包括如下组分及其浓度：
赖氨酸2mmol/L、重组人胰岛素4μg/mL、人血清白蛋白1mg/mL、鱼精蛋白4μg/mL、生物素2μg/mL、藻酸双酯钠1mg/L和生长因子10mmol/L；所述生长因子由焦磷酸硫胺素和丹参素钠按质量比2:3组成；
S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融2次，于4℃、5000rpm条件下离心8min后，收集鸭呼肠孤病毒上清液，接着进行TCID50检测，合格后，将上述上清液超滤浓缩，得鸭呼肠孤病毒液；
S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的鸭呼肠孤病毒液，得鸭呼肠孤病毒疫苗抗原；
S5疫苗配制：
a油相制备：取92份白油，1份硬脂酸铝，3份司班-80，将白油加热到75℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；
b水相制备：取95份步骤S4得到的鸭呼肠孤病毒疫苗抗原，加入3份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；
c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在15000的条件下乳化4min，按照每瓶250mL进行分装，即得。
实施例2、一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法
S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含8％新生牛血清和1500单位/mL青链霉素双抗的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2天，接着用无血清DMEM/F12培养液清洗细胞3次，得细胞载体；所述LMH细胞放置微载体反应器内培养，微载体使用量6克/升；
S2病毒的接种：将鸭呼肠孤病毒液按终体积1:2000接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附40min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下56h，出现80％细胞病变，得病变细胞；
所述培养基A包括DMEM/F12基础培养基，还包括如下组分及其浓度：
赖氨酸3mmol/L、重组人胰岛素8μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、鱼精蛋白6μg/mL、生物素3μg/mL、藻酸双酯钠2mg/L和生长因子12mmol/L；所述生长因子由焦磷酸硫胺素和丹参素钠按质量比3:2组成；
S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融3次，于4℃、5000rpm条件下离心10min后，收集鸭呼肠孤病毒上清液，接着进行TCID50检测，合格后，将上述上清液超滤浓缩，得鸭呼肠孤病毒液；
S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的鸭呼肠孤病毒液，得鸭呼肠孤病毒疫苗抗原；
S5疫苗配制：
a油相制备：取94份白油，2份硬脂酸铝，4份司班-80，将白油加热到78℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；
b水相制备：取96份步骤S4得到的鸭呼肠孤病毒疫苗抗原，加入4份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；
c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在16000rpm的条件下乳化5min，按照每瓶250mL进行分装，即得。
实施例3、一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法
S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含10％新生牛血清和2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO2的条件下培养3天，接着用无血清DMEM/F12培养液清洗细胞3次，得细胞载体；所述LMH细胞放置微载体反应器内培养，微载体使用量8克/升；
S2病毒的接种：将鸭呼肠孤病毒液按终体积1:4000接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养72h，出现80％细胞病变，得病变细胞；
所述培养基A包括DMEM/F12基础培养基，还包括如下组分及其浓度：
赖氨酸4mmol/L、重组人胰岛素10μg/mL、人血清白蛋白3mg/mL、鱼精蛋白8μg/mL、生物素4μg/mL、藻酸双酯钠3mg/L和生长因子15mmol/L；所述生长因子由焦磷酸硫胺素和丹参素钠按质量比4:1组成；
S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融3次，于4℃、5000rpm条件下离心12min后，收集鸭呼肠孤病毒上清液，接着进行TCID50检测，合格后，将上述上清液超滤浓缩，得鸭呼肠孤病毒液；
S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的鸭呼肠孤病毒液，得鸭呼肠孤病毒疫苗抗原；
S5疫苗配制：
a油相制备：取96份白油，3份硬脂酸铝，5份司班-80，将白油加热到85℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；
b水相制备：取98份步骤S4得到的鸭呼肠孤病毒疫苗抗原，加入5份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；
c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在18000rpm的条件下乳化6min，按照每瓶250mL进行分装，即得。
对比例1、一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法
与实施例2的区别在于，所述步骤S1中将LMH细胞替换为MDCK细胞作为细胞载体，其余步骤与实施例2类似。
对比例2、一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法
与实施例2的区别在于，所述步骤S2中培养基A包括DMEM/F12基础培养基，还包括如下组分及其浓度：赖氨酸3mmol/L、重组人胰岛素8μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、鱼精蛋白6μg/mL、生物素3μg/mL、藻酸双酯钠2mg/L和新生牛血清12mmol/L；其余步骤与实施例2类似。
对比例3、一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法
与实施例2的区别在于，所述步骤S2中培养基A包括DMEM/F12基础培养基，还包括如下组分及其浓度：赖氨酸3mmol/L、重组人胰岛素8μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、鱼精蛋白6μg/mL、生物素3μg/mL和生长因子12mmol/L；所述生长因子由焦磷酸硫胺素和丹参素钠按质量比3:2组成；其余步骤与实施例2类似。
对比例4、一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法
与实施例2的区别在于，所述步骤S2中培养基A包括DMEM/F12基础培养基，还包括如下组分及其浓度：赖氨酸3mmol/L、重组人胰岛素8μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、鱼精蛋白6μg/mL、生物素3μg/mL、藻酸双酯钠2mg/L和焦磷酸硫胺素12mmol/L；其余步骤与实施例2类似。
对比例5、一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法
与实施例2的区别在于，所述步骤S2中培养基A包括DMEM/F12基础培养基，还包括如下组分及其浓度：赖氨酸3mmol/L、重组人胰岛素8μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、鱼精蛋白6μg/mL、生物素3μg/mL、藻酸双酯钠2mg/L和生长因子12mmol/L；所述生长因子由焦磷酸硫胺素和丹参素钠按质量比1:1组成；其余步骤与实施例2类似。
试验例一、鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的病毒含量检测
1、试验材料：
实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5的步骤S3制备的鸭呼肠孤病毒上清液。
2、试验方法：
分别检测实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5的步骤S3制备的鸭呼肠孤病毒上清液的TCID50。
其中：TCID50的检测方法：
将收集的鸭呼肠孤病毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，分别取离心后上清液用于超滤浓缩；将上述离心后的上清液用50K中空纤维柱将其浓缩10倍后，取浓缩后的病毒液用DMEM/F12细胞培养液做10倍系列稀释，取10-4、10-4、10-6、10-7、10- 85个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞，每孔0.1mL，37℃吸附30min后，补加含1～2％新生牛血清、适量双抗和2mM谷氨酰胺的DMEM/F12培养液0.3mL于37℃、5％CO2培养120小时，观察细胞病变(CPE)，利用Reed-Muench方法计算TCID50。
3、试验结果：
试验结果如表1所示。
表1鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的病毒含量检测表
由表1可知，本发明制备得到的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗病毒含量高，鸭呼肠孤病毒≥108.3TCID50，可以有效的提高鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的疫苗效果。说明本发明采用的LMH细胞作为载体细胞和含有特定成分的培养基可以有效提高病毒的增殖，增加疫苗的病毒含量，提高疫苗的疫苗效果。
试验例二、鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的产品质量检测
1、试验材料：
实施例1、实施例2和实施例3制备的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗。
2、试验方法：
对实施例1、实施例2和实施例3制备的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗进行外观，稳定性，粘度，无菌检验，灭活检验，安全检验和甲醛含量测定。
2.1、外观观察：直接观察实施例1、实施例2和实施例3制备的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的外观情况。
2.2、稳定性测定：各吸取实施例1、实施例2和实施例3制备的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗10毫升加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5mL。
2.3、粘度测定：用出口内径为1.2mm的1.0mL吸管，在25℃左右吸取实施例1、实施例2和实施例3制备的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗1.0mL，令其垂直自然流出，记录流出0.4mL所需的时间，应不超过8秒。
2.4、无菌检验：取实施例1、实施例2和实施例3制备的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗接种硫乙醇酸盐培养基小管和酪胨琼脂各两支，每支0.2mL，一支置37℃培养，一支置25℃培养，观察3～5日，应纯粹，无菌生长。
2.5、灭活检验：取实施例1、实施例2和实施例3制备的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗，用DMEM/F12营养液以10-1、10-2、10-3三个比例稀释待检样品，同时设立同样稀释比例的灭活前病毒样品用于阳性对照，分别接种于48孔LMH细胞单层细胞，每组重复接种5孔，每孔0.4mL37℃、5％CO2培养96小时。灭活样品各组稀释度孔中均没有出现细胞病变，阳性对照组各稀释度孔中细胞病变均明显，达80％以上，判定为灭活检验合格。
2.6、安全检验：用7日龄健康易感鸭10只，每只肌肉或颈部皮下注射实施例1、实施例2和实施例3制备的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗1mL，观察14日，结果试验鸭均健活，无任何局部和全身不良反应。
2.7、甲醛含量测定：
ⅰ、对照品溶液的制备：取已标定的甲醛溶液适量，配成每1.0mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5.0mL置50mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得；
ⅱ、被测样本的制备：用5.0mL刻度吸管量取实施例1、实施例2和实施例3制备的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗5.0mL，置50mL量瓶中，用20％吐温-80乙醇溶液10mL，分次洗涤吸管，洗液并入50mL量瓶中，摇匀，加水稀释至刻度，强烈振摇，静止分层，下层液如果不澄清，滤过，弃去初滤液，取澄清续滤液，即得；
ⅲ、测定法：精密吸取对照品溶液和被检品溶液各0.5mL，分别加醋酸-醋酸铵缓冲液10mL，乙酰丙酮试液10mL，置60℃恒温水浴15分钟，冷水冷却5分钟，放置20分钟后，按紫外-可见分光光度计法，在410nm的波长处测定吸收度，计算即得。甲醛含量符合国家标准，即检验合格。
3、试验结果：
试验结果如表2所示。
表2鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的产品质量检测
实施例1 实施例2 实施例3
外观 乳白色乳剂 乳白色乳剂 乳白色乳剂
稳定性(析出的水，ml) 0.3 0.2 0.3
粘度(液体流出时间，s) 5 4 6
无菌检验 合格 合格 合格
灭活检验 合格 合格 合格
安全检验定 合格 合格 合格
甲醛含量测定 合格 合格 合格
由表2可知，本发明实施例1、实施例2和实施例3制备的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗外观为乳白色乳剂，将10ml疫苗加入离心管中，以3000rpm离心15min，管底析出的水相应≤0.4mL，具有较高的稳定性高；吸取1.0mL疫苗，令其垂直自然流出0.4mL，时间低于6s，具有较好的粘度，灭活、甲醛含量和安全性符合国家标准，有利于该鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的推广和应用。
实施例三、鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的效力检测
1、试验材料：
实施例2制备的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗。
2、试验方法：
取7日龄健康易感鸭45只，将四批鸭呼肠孤病毒灭活疫苗分别以0.3mL/只胸肌注射，每批灭活疫苗10只健康易感鸭。免疫后14、28、35、42、49天，连同对照组5只健康易感鸭分别采血，测定其血清中和抗体效价。
3、试验结果：
试验结果如表3所示。
表3鸭呼肠孤病毒抗体效价表
由表3可知，采用本专利的LMH细胞载体不仅能培养出病毒滴度高的鸭呼肠孤病毒，并且能完全可以取代采用鸭胚培养鸭呼肠孤病毒；从免疫效力试验可知，采用本发明生产的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗免疫鸭能产生高水平血清中和抗体。

Claims (8)

1.一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000～2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2～3天，接着用无血清DMEM/F12培养液清洗细胞2～3次，得细胞载体；
S2病毒的接种：将鸭呼肠孤病毒液按终体积1:1000～1:5000接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养48～72h，出现80％细胞病变，得病变细胞；
S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，收集鸭呼肠孤病毒上清液，接着进行TCID50检测，合格后，将上述上清液超滤浓缩，得鸭呼肠孤病毒液；
S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的鸭呼肠孤病毒液，得鸭呼肠孤病毒疫苗抗原；
S5疫苗配制：
a油相制备：取92～96份白油，1～3份硬脂酸铝，3～5份司班-80，将白油加热到75～85℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；
b水相制备：取95～98份步骤S4得到的鸭呼肠孤病毒疫苗抗原，加入3～5份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；
c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在15000～18000rpm的条件下乳化4～6min，按照每瓶250mL进行分装，即得。
2.如权利要求1所述的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中LMH细胞可以替换为BHK-21细胞、DF-1细胞或Duck embroy细胞。
3.如权利要求1所述的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的培养基A包括DMEM/F12基础培养基，还包括如下组分及其浓度：
赖氨酸2～4mmol/L、重组人胰岛素4～10μg/mL、人血清白蛋白1～3mg/mL、鱼精蛋白4～8μg/mL、生物素2～4μg/mL、藻酸双酯钠1～3mg/L和生长因子10～15mmol/L。
4.如权利要求3所述的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的培养基A包括DMEM/F12基础培养基，还包括如下组分及其浓度：
赖氨酸3mmol/L、重组人胰岛素8μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、鱼精蛋白6μg/mL、生物素3μg/mL、藻酸双酯钠2mg/L和生长因子12mmol/L。
5.如权利要求3或4所述的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述生长因子由焦磷酸硫胺素和丹参素钠按质量比(2～4):(1～3)组成。
6.如权利要求5所述的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述生长因子由焦磷酸硫胺素和丹参素钠按质量比3:2组成。
7.如权利要求1或2所述的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的LMH细胞放置转瓶内培养。
8.如权利要求1或2所述的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的LMH细胞放置微载体反应器内培养，微载体使用量为2～10g/L。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111000992A (zh) * 2019-12-19 2020-04-14 广州渔跃生物技术有限公司 一种鸭呼肠孤病毒、鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗及其制备方法
CN111053897A (zh) * 2019-12-19 2020-04-24 广州渔跃生物技术有限公司 一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗及其制备方法
CN111088223A (zh) * 2019-12-27 2020-05-01 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种df-1细胞的微载体悬浮培养方法及应用
CN111184859A (zh) * 2019-12-19 2020-05-22 广州渔跃生物技术有限公司 一种鸭呼肠孤病毒和鸭坦布苏病毒二联灭活疫苗及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107050448A (zh) * 2017-04-26 2017-08-18 广州博恒生物科技有限公司 一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法
CN108913666A (zh) * 2018-08-10 2018-11-30 山东农业大学 一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒及其灭活疫苗和应用
CN109439617A (zh) * 2018-12-25 2019-03-08 成都赋智健康科技有限公司 一种干细胞无血清培养基及其制作方法
CN109718370A (zh) * 2019-02-27 2019-05-07 广东渔跃生物技术有限公司 一种鸭呼肠孤病毒疫苗及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107050448A (zh) * 2017-04-26 2017-08-18 广州博恒生物科技有限公司 一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法
CN108913666A (zh) * 2018-08-10 2018-11-30 山东农业大学 一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒及其灭活疫苗和应用
CN109439617A (zh) * 2018-12-25 2019-03-08 成都赋智健康科技有限公司 一种干细胞无血清培养基及其制作方法
CN109718370A (zh) * 2019-02-27 2019-05-07 广东渔跃生物技术有限公司 一种鸭呼肠孤病毒疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李跃华等: "丹参素增强肝细胞生长及其在药物性肝细胞损伤中的保护作用", 《南京医科大学学报（中文版）》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111000992A (zh) * 2019-12-19 2020-04-14 广州渔跃生物技术有限公司 一种鸭呼肠孤病毒、鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒三联灭活疫苗及其制备方法
CN111053897A (zh) * 2019-12-19 2020-04-24 广州渔跃生物技术有限公司 一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗及其制备方法
CN111184859A (zh) * 2019-12-19 2020-05-22 广州渔跃生物技术有限公司 一种鸭呼肠孤病毒和鸭坦布苏病毒二联灭活疫苗及其制备方法
CN111088223A (zh) * 2019-12-27 2020-05-01 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种df-1细胞的微载体悬浮培养方法及应用

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