CN109439617A

CN109439617A - 一种干细胞无血清培养基及其制作方法

Info

Publication number: CN109439617A
Application number: CN201811590337.7A
Authority: CN
Inventors: 姜和; 张坤; 杨珂
Original assignee: Chengdu Fuzhi Health Technology Co Ltd
Current assignee: Chengdu Fuzhi Future Technology Co ltd
Priority date: 2018-12-25
Filing date: 2018-12-25
Publication date: 2019-03-08

Abstract

一种干细胞无血清培养基及其制备方法，干细胞无血清培养基包括如下体积百分比的物质：低糖型DMEM 85～91%，Ultroser G血清替代物8～12%，透明质酸0.5～1.5%，褐藻多糖硫酸酯0.5～1.5%；还包括L‑谷氨酰胺1.0～1.4mmol/L，β‑巯基乙醇0.1～0.4mmol/L，bFGF4～8mg/L，非必需氨基酸56～84mmol/L；还提供了其制备方法。本发明的有益效果是：干细胞无血清培养基其稳定可靠，可维持细胞形态，保证细胞生物活性；其制作方法操作简单易行，具有较好的实用价值。

Description

一种干细胞无血清培养基及其制作方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种干细胞无血清培养基及其制作方法。

背景技术

干细胞治疗是指自体或异体来源的干细胞经过体外扩增或定向诱导分化，制备成为治疗所需要的特定细胞，通过细胞转移修复机体损伤的治疗方法。目前国内外已开展了多项干细胞临床应用研究，涉及多种干细胞类型及多种疾病类型。其中研究最广泛的成体干细胞类型是人源性间充质干细胞，主要来源于骨髓、脂肪组织以及母胎来源，它们具有一定的多向分化潜能及抗炎和免疫调控等能力。与骨髓和脂肪等来源的人源性间充质干细胞相比，来源于母胎的人源性间充质干细胞具有明显的优势。脐带和胎盘是胎儿生产的附属物，胎儿出生后即成为医疗废弃物，采集对供者不再造成任何痛苦。与其他成体来源的细胞相比，母胎来源的细胞个体差异较小，质量容易控制，而且细胞的干性和功能活性更好，对许多疾病的治疗效果也更明显。作为一种新型的生物治疗产品，生产制备临床研究用干细胞的整个过程的每一阶段，都有可能影响干细胞制剂的质量，需对临床使用的干细胞制剂的细胞质量进行相关的研究和控制，而细胞培养基的质量控制是关键项目之一。

传统的间充质干细胞的培养方法是使用含有动物血清的培养基培养，细胞生长旺盛，形态均一。但是，由于动物血清的成分不确定，对添加有动物血清的培养基构建的人工组织进行体内移植，存在引起强烈的免疫反应和引入不安全因素的风险，而且添加有动物血清的培养基培养的间充质干细胞对细胞生物学、毒理学和病理学的基础研究也会造成一定的干扰。因此，研究和开发出一种无血清培养基是当前函需解决的难题。

根据现行版《中国药典》的规定，生产临床用干细胞制剂的培养基不应使用任何血清，这是因为：1.血清成分复杂，质量不易控制，造成不同厂商、不同批次间的产品差异较大，不利于细胞生产的标准化；2.使用血清容易引入外源微生物污染，如牛源病毒、人源病毒等；3.血清中的外源性蛋白质或其它分子残留有可能会引起患者的过敏反应，甚至会造成休克，为干细胞制剂的临床使用带来隐患。

目前也有一些公司开发出不添加胎牛血清的干细胞培养基，但此类培养基大多存在以下缺点:(1)增殖速率低，干细胞需生长两至三天才传代一次；(2)多次传代后干细胞的干性难以维持，其分化为成骨细胞、成脂细胞、成软骨细胞的能力下降；(3)传代两至三代后，干细胞形态普遍变大边长，细胞老化严重。

因而，现在需要一种干细胞无血清培养基，使整个培养体系没有被外源性微生物感染和过敏风险，且合乎《中国药典》及细胞治疗相关法律法规的规定。

发明内容

本发明的目的是提供一种干细胞无血清培养基，其稳定可靠，可维持细胞形态，保证细胞生物活性。

本发明的目的是提供一种干细胞无血清培养基的制作方法，其操作简单易行，具有较好的实用价值。

本发明的目的是通过这样的技术方案实现的，一种干细胞无血清培养基，包括如下体积百分比的物质：低糖型DMEM 85～91％，Ultroser G血清替代物8～12％，透明质酸0.5～1.5％，褐藻多糖硫酸酯0.5～1.5％；还包括L-谷氨酰胺1.0～1.4mmol/L，β-巯基乙醇0.1～0.4mmol/L，bFGF4～8mg/L，非必需氨基酸56～84mmol/L。

其中，低糖型DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)是一种广泛使用的基础培养基，可用于支持很多种类的哺乳动物细胞生长，低糖型是指葡萄糖浓度较一般的DMEM培养基低，为1g/L，优选美国赛默飞世尔科技公司生产的产品，也可以选用品牌为雷布斯、型号为SH30021.01B的产品。

Ultroser G血清替代物是一种哺乳动物细胞培养基添加物，用于替代血清，这是一种混合物，由于成分的一致性和稳定性，使得培养细胞批次差异小，质量稳定，优选美国颇尔公司生产的产品，其型号为15950-017。

bFGF即重组人碱性成纤维细胞生长因子(又称为碱性FGF、FGF2、FGF-β或者肝素结合生长因子)，是一种适用于细胞培养应用的生物活性蛋白质，优选美国赛默飞世尔科技公司生产的产品。

透明质酸是一种酸性粘多糖，具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。优选中国华熙福瑞达生物医药有限公司生产的产品。

L-谷氨酰胺是细胞培养所需的非必需氨基酸。L-谷氨酰胺参与细胞内嘌呤和嘧啶核苷酸、氨基糖、谷胱甘肽、L-谷氨酸等非必需氨基酸的合成，并参与蛋白质和葡萄糖合成。与大多数其他非必需氨基酸不同，L-谷氨酰胺在溶液中不稳定。优选美国赛默飞世尔科技公司生产的产品。

β-巯基乙醇是一种还原剂，其主要作用是降低氧自由基对细胞的氧化损伤，β-巯基乙醇在溶液中不稳定。优选美国赛默飞世尔科技公司生产的产品。

褐藻多糖硫酸酯是一种海藻提取物，具有一定的保水作用以及类似细胞基质对细胞的支持作用。优选中国台湾的中华海洋生技生产的产品。

非必需氨基酸包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸，每种添加量均为8～12mmol/L。

本发明中，低糖型DMEM作为基础培养基，Ultroser G血清替代物用来保证培养细胞批次差异小，质量稳定，bFGF提供细胞培养所需的生物活性蛋白质；L-谷氨酰胺是细胞培养所需的非必需氨基酸，甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸是细胞代谢所需的基本非必需氨基酸，保证细胞的基本所需。β-巯基乙醇是一种还原剂，其主要作用是降低氧自由基对细胞的氧化损伤，透明质酸是一种酸性粘多糖，具有特殊的保水作用，褐藻多糖硫酸酯是一种海藻提取物，具有一定的保水作用以及类似细胞基质对细胞的支持作用，三种物质相辅相成在起到保水的同时，降低氧自由基对细胞的氧化损伤。

本发明中的另一目的是通过这样的技术方案实现的，一种干细胞无血清培养基的制作方法，将低糖型DMEM、Ultroser G、透明质酸、褐藻多糖硫酸酯和非必需氨基酸按照相应的比例均匀混合，临用前添加相应比例的L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和bFGF即可获得干细胞无血清培养基。

本发明中的制作方法中，L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和bFGF在溶液中不稳定，因而在临用前添加，整个干细胞无血清培养基的制作过程简单易行，具有较强的实用性。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：干细胞无血清培养基其稳定可靠，可维持细胞形态，保证细胞生物活性；其制作方法操作简单易行，具有较好的实用价值。

附图说明

图1为本发明实验一中培养基A接种细胞时的状态；

图2为本发明实验一中培养基B接种细胞时的状态；

图3为本发明实验一中培养基A中细胞扩增培养后的状态；

图4位本发明实验一中培养基B中细胞扩增培养后的状态；

图5为本发明实验二中培养基A养细胞的细胞活率及表面标志检测结果；

图6为本发明实验二中培养基B培养细胞的细胞活率及表面标志检测结果；

图7是本发明实验三中人源性间充质干细胞分化为成骨细胞的染色结果；

图8是本发明实验三中人源性间充质干细胞分化为成脂细胞的染色结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种干细胞无血清培养基，包括如下体积百分比的物质：低糖型DMEM 85～91％，Ultroser G血清替代物8～12％，透明质酸0.5～1.5％，褐藻多糖硫酸酯0.5～1.5％；还包括L-谷氨酰胺1.0～1.4mmol/L，β-巯基乙醇0.1～0.4mmol/L，bFGF4～8mg/L，非必需氨基酸56～84mmol/L。。

其中，非必需氨基酸包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸，每种添加量均为8～12mmol/L。

实施例2

一种干细胞无血清培养基，包括如下体积百分比的物质：低糖型DMEM 85％，Ultroser G血清替代物12％，透明质酸1.5％，褐藻多糖硫酸酯1.5％；还包括L-谷氨酰胺1.4mmol/L，β-巯基乙醇0.4mmol/L，bFGF 8mg/L，非必需氨基酸84mmol/L。

实施例3

一种干细胞无血清培养基，包括如下体积百分比的物质：低糖型DMEM 91％，Ultroser G血清替代物8％，透明质酸0.5％，褐藻多糖硫酸酯0.5％；还包括L-谷氨酰胺1.0mmol/L，β-巯基乙醇0.1mmol/L，bFGF 4mg/L，非必需氨基酸56mmol/L。

实施例4

一种干细胞无血清培养基，包括如下体积百分比的物质：低糖型DMEM 88％，Ultroser G血清替代物10％，透明质酸1％，褐藻多糖硫酸酯1％；还包括L-谷氨酰胺1.2mmol/L，β-巯基乙醇0.3mmol/L，bFGF 6mg/L，非必需氨基酸75mmol/L。

实施例5

一种干细胞无血清培养基的制作方法，将低糖型DMEM、Ultroser G、透明质酸、褐藻多糖硫酸酯和非必需氨基酸按照相应的比例均匀混合，临用前添加相应比例的L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和bFGF即可获得干细胞冻存液。

实验检测：

选取两组培养基作为实验对象，具体如下：

培养基一：市售某品牌无血清人源性间充质干细胞培养基(以下称培养基A)培养基二：本发明中实施例1至4按照实施例5制作的干细胞培养基(以下称培养基B)

鉴别标准：国际细胞治疗协会(The International Society for Cell Therapy，ISCT)推荐的人源性间充质干细胞鉴别标准：

1.细胞应贴壁生长。

2.流式细胞术检测细胞表型为阴性标志：CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR应≤2％；阳性标志：CD73、CD90、CD105应≥95％。

3.在体外可以诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞。

实验一两种培养基的支持细胞增殖能力对比

1.取人脐带间充质干细胞若干，分别用二种培养基配制的培养液连续传三代后，取对数生长期的细胞用于试验。

2细胞倍增时间的测定

按生长曲线计算细胞的倍增时间，取细胞峰值前一天的细胞计数(Y)、接种细胞数(X)及生长时间(T)计算。倍增时间＝T/A，A＝log₂Y/X。

细胞培养结果：两种培养基的细胞群体倍增时间分别为

培养基	Y	X	T(h)	log<sub>2</sub>Y/X	T/A
						培养基A	1.90*10<sup>4</sup>	1*10<sup>4</sup>	144	0.926	155
培养基A	1.98*10<sup>4</sup>	1*10<sup>4</sup>	144	0.986	146
						培养基B	2.01*10<sup>4</sup>	1*10<sup>4</sup>	144	1.01	143
培养基B	2.18*10<sup>4</sup>	1*10<sup>4</sup>	144	1.12	128

两种培养基细胞群体倍增时间相近，且本发明中制作的培养基(培养基B)所培养的细胞群体倍增时间小于对照培养基(培养基B)。结合图1培养基A接种细胞时的状态、图2培养基B接种细胞时的状态、图3培养基A中细胞扩增培养后的状态和图4培养基B中细胞扩增培养后的状态可知，细胞形态无异常变化。

实验二、两种培养基培养细胞的细胞活率及表面标志检测

1.取人脐带间充质干细胞若干，分别用两种培养基配制的培养液连续传三代后，取对数生长期的细胞用于试验。

2.取A、B两种培养基，按10⁴/mL的细胞浓度接种细胞，每种培养基分别做5组平行实验。

3.当细胞浓度达到10⁸/mL时，收集细胞。离心后加入0.5mL鞘液重悬。准备5支1.5mL的试管，每支加入100μL样本细胞悬液，然后给每一支试管依次编号①②③④。

4.抗体孵育

⑴向①试管加入抗CD14和CD73抗体；

⑵向②试管加入抗CD34和CD90抗体；

⑶向③试管加入抗CD45和CD105抗体；

⑷向④试管加入抗CD79a和HLA-DR抗体；

⑸所有试管用漩涡混匀仪vortex-genie2混匀后4℃避光孵育15分钟。

5.离心

每支试管中加入1mL鞘液，用漩涡混匀仪vortex-genie2混匀后用ThermoScientific Sorvall ST16R离心机以300g加速度4℃离心5分钟。

6.鉴别细胞活率

用移液器移除上清液，每支离心管中加入150～300μL鞘液后混匀重悬，加入7-氨基-放射菌素D溶液，使其终浓度为2.5μM/mL，常温下避光孵育3～5分钟，再次进行重悬操作，得到重悬液；

7.检测

用微量移液器小心移除上清液，每支试管中加入200μL鞘液用漩涡混匀仪vortex-genie2混匀重悬，用Beckman临床型流式细胞仪DxFLEX上机检测。

6.检测数据分析

用流式数据分析软件打开数据文件，区分出死细胞群和活细胞群，并统计活细胞百分比，在活细胞群中统计各标志物百分比。其中阴性标志CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR应≤2％，阳性标志CD73、CD90、CD105应≥95％。

细胞活率及表面标志检测结果：

由图3为培养基A养细胞的细胞活率及表面标志检测结果可知，活细胞百分比93.71％，表面标志物中的阴性标志CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR均小于2％，阳性标志CD73、CD90、CD105应均大于95％。

由图4为培养基B培养细胞的细胞活率及表面标志检测结果可知，活细胞百分比95.57％，表面标志物中的阴性标志CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR均小于2％，阳性标志CD73、CD90、CD105应均大于95％。

可见，A、B两种培养基培养细胞的细胞活率及表面标志检测结果均符合国际标准规定，本专利培养基结果优于对照培养基。

实验三、两种培养基培养细胞的干细胞分化能力检测

1.成骨诱导分化

①取脐带间充质干细胞若干，分别用两种培养基配制的培养液连续传三代后，取对数生长期的细胞用于试验。

②配制成骨诱导培养基

10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，10nmol/L地塞米松，50mg/L维生素C加入两种基础培养基。

③取两种培养基，细胞以2*10³/cm²密度接种于6孔培养板，每种培养基分别做5组平行实验。细胞生长至80％融合度后，更换为成骨诱导培养基，每两天换液1次。

④茜素红染色

于诱导1、2、3周后，去培养基，PBS洗2次；70％乙醇固定，4℃1小时；去离子水洗2次；40mmol/L茜素红溶液(pH4.2)室温染色1-10分钟；显微镜下观察并拍照。

培养基B培养的人源性间充质细胞的干细胞成骨分化：由图5是人源性间充质干细胞分化为成脂细胞的染色结果可知，培养基B培养的人源性间充质干细胞经诱导后可见脂滴，表明此细胞具有分化为成脂细胞的能力。

2.成脂诱导分化

②配制成脂诱导培养基

0.5mmol/L异丁基-甲基黄嘌呤，60μmol/L吲哚美辛，0.5μmol/L氢化可的松，10μg/L胰岛素加入两种基础培养基。

③取两种诱导培养基，细胞以2*10³/cm²密度接种于6孔培养板，每种培养基分别做5组平行实验，诱导4周后检测。

④染色检测

去培养基，用PBS洗2次；甲醛-钙室温固定15分钟；PBS洗2次；60％异丙醇媒染1分钟；去异丙醇，油红O工作液室温染色30分钟；60％异丙醇浸洗1次；PBS洗2次；显微镜下观察并拍照。

培养基B培养的人源性间充质细胞的干细胞成脂分化结果：由图6是人源性间充质干细胞分化为成骨细胞的染色结果可知，培养基B培养的人源性间充质干细胞经诱导后可见钙结节，表明此细胞具有分化为成骨细胞的能力。

Claims

1.一种干细胞无血清培养基，其特征在于，包括如下体积百分比的物质：低糖型DMEM85～91%，Ultroser G血清替代物8～12%，透明质酸0.5～1.5%，褐藻多糖硫酸酯0.5～1.5%；还包括L-谷氨酰胺1.0～1.4mmol/L，β-巯基乙醇0.1～0.4mmol/L，bFGF4～8mg/L，非必需氨基酸56～84mmol/L。

2.根据权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，包括如下体积百分比的物质：低糖型DMEM 85%，Ultroser G血清替代物12%，透明质酸1.5%，褐藻多糖硫酸酯1.5%；还包括L-谷氨酰胺1.4mmol/L，β-巯基乙醇0.4mmol/L， bFGF 8mg/L，非必需氨基酸84mmol/L。

3.根据权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，包括如下体积百分比的物质：包括如下体积百分比的物质：低糖型DMEM 91%，Ultroser G血清替代物8%，透明质酸0.5%，褐藻多糖硫酸酯0.5%；还包括L-谷氨酰胺1.0mmol/L，β-巯基乙醇0.1mmol/L，bFGF4mg/L，非必需氨基酸56mmol/L。

4.根据权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，包括如下体积百分比的物质：包括如下体积百分比的物质：低糖型DMEM 88%，Ultroser G血清替代物10%，透明质酸1%，褐藻多糖硫酸酯1%；还包括L-谷氨酰胺1.2mmol/L ，β-巯基乙醇0.3mmol/L，bFGF 6mg/L，非必需氨基酸75mmol/L。

5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的干细胞无血清培养基的制作方法，其特征在于：非必需氨基酸包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸，每种添加量均为8～12 mmol /L。

6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的干细胞无血清培养基的制作方法，其特征在于：将低糖型DMEM、Ultroser G、透明质酸、褐藻多糖硫酸酯和非必需氨基酸按照相应的比例均匀混合，临用前添加相应比例的L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和bFGF即可获得干细胞无血清培养基。