CN108498794B - 一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗及其制备方法，所述灭活疫苗含有预防或治疗上有效量的灭活的鸭呼肠孤病毒株病毒液；所述鸭呼肠孤病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V201818。本发明制备的新型鸭呼肠孤病毒灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，并且各项指标检测均稳定有效，利用本发明的灭活疫苗免疫雏鸭后，雏鸭可以获得较高的抗体水平，持续期长，可以有针对性的防治新型鸭呼肠孤病毒的感染与爆发，对鸭群提供有效的免疫保护；同时简化了疫苗的生产工艺，可以实现规模化生产。

Description

一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

呼肠孤病毒的基因组为双股分节段的RNA，1978年国际病毒分离委员会(ICTV)将其定为呼肠孤病毒科(Reoviridae)，包括呼肠孤病毒属、环状病毒属和轮状病毒属。呼肠孤病毒(Avian reovirus)首次在鸡的呼吸道内分离得到，感染易感鸡后，可表现为肌腱炎、滑膜炎和呼吸道疾病等症状。ARV可感染鸡、火鸡、鸭、鹅、鹦鹉、鸽子等禽类，可引起鸡的病毒性关节炎、腱鞘炎，同时也是其他病的病因，包括心肌炎、心包炎、心包积水、肝炎、胸腺萎缩、呼吸道病以及生长受阻等。

2016年起，我国山东、河北、河南及江苏等地鸭大范围爆发以跗关节肿大为主要症状的传染性疾病，该病主要引起各个年龄阶段鸭跗关节肿胀，跗关节常含有少量黄色或血样渗出物；严重病例，关节腔中有干酪样渗出物，患鸭出现不同程度的跛行。该病主要导致种鸭产蛋和肉鸭体重的下降，料肉比升高，肉鸭出栏合格率显著降低，对肉鸭以及种鸭养殖业造成严重经济损失。

经研究发现，该病的爆发是由一种新型的鸭呼肠孤病毒感染所致，目前尚无疫苗可以进行预防，现有市售的鸭呼肠孤病毒疫苗无法对该病进行有效的防控；常规的抗病毒和抗菌治疗方法无效。而相较于弱毒疫苗，灭活疫苗比较安全、生产简单且易于保存。因此，急需研制一种安全高效能预防该新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗，用于预防鸭群爆发新型呼肠孤病毒感染，从而弥补该疾病造成的严重经济损失。

本发明的另一目的是提供该防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明是基于从具有严重跗关节肿大症状的患鸭肌腱组织中分离得到的一株新型鸭呼肠孤病毒，保藏编号为CCTCC NO：V201818，在该分离株的基础上，研制了能够防治该新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗。

本发明的第一方面，提供一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗，所述灭活疫苗含有预防或治疗上有效量的灭活的鸭呼肠孤病毒株病毒液；所述鸭呼肠孤病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V201818。

优选的，鸭呼肠孤病毒株病毒液由如下方法制备而成：

将保藏编号为CCTCC NO：V201818的鸭呼肠孤病毒株接种到鸡肝癌细胞(LMH)细胞系中，对鸭呼肠孤病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，即得鸭呼肠孤病毒株病毒液。

优选的，鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

进一步的，所述防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗中还含有佐剂。

本发明的第二方面，提供上述灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将保藏编号为CCTCC NO：V201818的鸭呼肠孤病毒接种到LMH细胞系中，对鸭呼肠孤病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，获得鸭呼肠孤病毒株病毒液；

(2)将鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活，加入Tween-80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和Span-80混合作为油相，将油相和水相按1:1混合均匀，乳化，得到防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗。

优选的，步骤(1)中，纯化的具体方法为：将收获的病毒液，5000r/min离心5min以去除细胞碎片等杂质，随后采用60000r/min超速离心2h，离心结束后用DMEM培养基重悬。

优选的，步骤(2)中，鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

优选的，步骤(2)中，所述水相中Tween-80的终浓度为2％-4％。

优选的，步骤(2)中，所述白油、硬脂酸铝和Span-80的比例为94:2:6。

优选的，步骤(2)中，油相和水相混合的方法为：将水相加入到油相中，6000rpm混合10min。

优选的，步骤(2)中，所述乳化具体为：8000r/min乳化20min。

本发明的有益效果：

(1)本发明利用从发病雏鸭体内分离得到的一株新型鸭呼肠孤病毒，该新型鸭呼肠孤病毒株具有优异的免疫原性，将该毒株接种到对呼肠孤病毒易感的LMH细胞系中，收获细胞毒液，灭活后乳化，可以得到一种安全、有效、可控的灭活疫苗，有利于当前大范围爆发的以跗关节肿大为主要症状的鸭呼肠孤病毒感染的防控。

(2)本发明制备的新型鸭呼肠孤病毒灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，并且各项指标检测均稳定有效，利用本发明的灭活疫苗免疫雏鸭后，雏鸭可以获得较高的抗体水平，持续期长，可以有针对性的防治新型鸭呼肠孤病毒的感染与爆发，对鸭群提供有效的免疫保护；同时简化了疫苗的生产工艺，可以实现规模化生产，具有很好的商品化开发前景。

附图说明

图1：本发明的病毒分离株在LMH细胞上的细胞病变；其中，A：正常生长状态下的LMH细胞；B：N-DAV-SD16在LMH细胞上出现的CPE。

图2：PCR鉴定结果；其中，M为Marker；泳道1为待测样品；泳道2为空白对照。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所介绍的，2016年起，我国山东、河北、河南及江苏等地鸭大范围爆发以跗关节肿大为主要症状的传染性疾病。该病的症状不同于以往的鸭呼肠孤病毒感染，首次在鸭群中出现了跗关节肿大的症状，由此推知，该传染性疾病可能是由新型呼肠孤病毒所引起的。目前尚无能够有效控制该新型鸭呼肠孤病毒感染的药物和方法。采用鸭呼肠孤病毒灭活疫苗接种是防治该呼肠孤病毒感染与爆发的有效措施，但前提是需要分离获得免疫原性优异的鸭呼肠孤病毒毒株。

由于呼肠孤病毒为RNA病毒，有多个分段，不同毒株间在抗原结构、致病性、细胞培养特性以及宿主特异性上存在一定的差异，在遗传进化时，容易发生变异，导致传统毒株制备的疫苗不能很好的防控当今流行的以跗关节肿大为主要症状的禽呼肠孤病毒感染。

本申请发明人从发病鸭肿胀的肌腱组织中分离出一株鸭呼肠孤病毒N-DAV-SD16，禽类呼肠孤病毒基因由分节段的10个基因片段(包括：L1-L3、M1-M3、S1-S4)组成，本发明对上述新分离的鸭呼肠孤病毒N-DAV-SD16进行了全基因组测序，并分别将10个基因片段与现有报道的禽呼肠孤病毒进行了序列比对和同源性分析，结果发现，新分离毒株N-DAV-SD16的10个基因片段中L1、L2、L3、M1、M2、S3、S4均位于一个相对独立的分支中，且与目前已经上传在Genbank中鸭源呼肠孤病毒同源性较低，说明新分离的毒株N-DAV-SD16不同于其他的禽呼肠孤病毒，可以认定本发明中所发现的鸭呼肠孤病毒与现有已经报道的鸭呼肠孤病毒存在较大变异，为正呼肠孤病毒属的1个单独种。经过进一步比对发现，该新型鸭呼肠孤病毒N-DAV-SD16基因组中重组了部分导致肉鸡跗关节肿胀的肉鸡源呼肠孤病毒的S1基因片段。并将该新型鸭呼肠孤病毒保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201818。利用现有的呼肠孤病毒灭活疫苗进行免疫，对该新型鸭呼肠孤病毒的预防和治疗效果非常不理想。本发明在该分离株的基础上，研制出了能够防治该新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗。

在本发明的一个实施方案中，给出的防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗由如下方法制备而成：

(1)将保藏编号为CCTCC NO：V201818的鸭呼肠孤病毒接种到LMH细胞系中，对鸭呼肠孤病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，获得鸭呼肠孤病毒株病毒液；

(2)将鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活，加入Tween-80混合作为水相，水相中Tween-80的终浓度为2％-4％；以白油、硬脂酸铝和Span-80按质量比为94:2:6混合作为油相，将油相和水相按1:1混合均匀，8000r/min乳化20min，得到防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗。

上述灭活疫苗的制备方法中，采用LMH细胞系对病毒进行培养，该细胞系对本发明的新型鸭呼肠孤病毒具有非常好的易感性，可连续传代，生长状态好，有利于病毒的增殖及疫苗生产。

佐剂是指加入到疫苗制剂后能有效促进、增强或延长机体对抗原特异性免疫应答的物质。佐剂的选择是疫苗乳化工艺的基础，稳定的疫苗乳剂能有效提高动物抵抗疫病的能力。因此，选择合适的佐剂，确定最佳的水相与油相比例，对于疫苗的稳定性具有重要意义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。

实施例1：新型鸭呼肠孤病毒的发现和鉴定

1.病毒分离：

(1)临床上经PCR反应鉴定为阳性的关节炎发病鸭，剖检采集其肿胀的肌腱组织置于15mL离心管中，加入5倍体积的无血清的DMEM培养基，匀浆后反复冻融3次，每次解冻后在振荡器上震荡1-2min后在进行下一次冻融；冻融后将装有样品的15mL离心管于离心机中4000r/min离心5min；取上清，0.22μm微孔滤膜过滤后，备用；

(2)根据呼肠孤病的增殖特性，选用鸡肝癌细胞(LMH)进行病毒分离。按照常规细胞培养方法，待25cm²细胞瓶中的细胞铺满单层时，吸弃瓶中培养基并用PBS荡洗细胞2次，加入0.5毫升步骤(1)已滤过的样品冻融上清，将细胞置于37℃，5％CO₂浓度的培养箱中感作30min，感作结束后加入含2％胎牛血清的DMEM培养基，观察并记录出现细胞病变的时间。如第1代无细胞病变出现，则冻融后以第1代收获的培养物按照步骤(1)方法继续分离，直至获得稳定毒株；如传至第5代仍无细胞病变，则视为病毒分离阴性。最终得到一株稳定的毒株，其在接种LMH细胞后3天出现了较为明显的细胞病变，即表现为细胞变圆、融合，呈现团块脱落病变(图1)，同批次空白对照细胞正常，将该毒株命名为N-DAV-SD16。

2.病毒鉴定：

(1)PCR鉴定

1)RNA提取：

将毒株N-DAV-SD16的病毒液按照RNA提取试剂盒说明书要求，提取病毒RNA，置于-20℃保存备用；

2)反转录获得cDNA：

所用反转录试剂盒采用来自宝生物(大连)有限公司的货号为RR036A的PrimeScript^TMRT Master Mix，在200μLPCR反应管中依次加入5×PrimeScript RT MasterMix×2μL，步骤1)中提取的待测样品Total RNA～2μL，使用RNase Free dH₂O补充至10μl体系。置于PCR仪中进行反应，反应条件为37℃15min；85℃5s之后4℃保存。

3)PCR扩增：

采用20μL体系进行扩增：模板cDNA×2μL，上、下游引物各×1μL，2×Es TaqMasterMix×10μL，采用ddH₂O补充至20μL体系。混匀并瞬离后置于PCR仪进行反应，反应条件为95℃，5min，之后95℃，45s，56℃，30s，72℃，30s进行30个循环，72℃，10min之后4℃保存备用。

上游引物：5′-TGA GAC GCC TGA CTA CGA TT-3′(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5′-ATG CTT GGA GTG AGA CGA CT-3′(SEQ ID NO.2)。

4)PCR鉴定结果：

用引物进行PCR扩增后的产物在1％琼脂糖凝胶中电泳后出现了与预期值513bp大小相符的特异性条带(图2)。表明各分离株的细胞培养物中存在新型呼肠孤病毒。另外对分离株进行的常规鸭源病毒检测，并未检测到其他病毒污染。

(2)序列测定：

采用二代测序技术对毒株N-DAV-SD16进行全基因组序列测定，全基因组序列中L1、L2、L3、M1、M2、M3、S1、S2、S3、S4这10个基因片段的序列分别如SEQ ID NO.3-SEQ IDNO.12所示。然后与现有技术中已公布的禽呼肠孤病毒序列进行同源性比对，结果发现，毒株N-DAV-SD16的10个基因片段中L1、L2、L3、M1、M2、S3、S4均位于一个相对独立的分支中，且与目前已经上传在Genbank中鸭源呼肠孤病毒同源性较低，说明新分离的毒株N-DAV-SD16不同于其他的禽呼肠孤病毒，可以认定本发明中所发现的鸭呼肠孤病毒与现有已经报道的鸭呼肠孤病毒存在较大变异，为正呼肠孤病毒属的1个单独种。

将该病毒进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：V201818。

实施例2：灭活疫苗的制备

(1)病毒的增殖与收获：

将分离鉴定后的新型鸭呼肠孤病毒接种到生长良好的LMH细胞系中，对该病毒进行大量增殖，获取足够的病毒液。将获得的足量细胞病毒液置于-20℃冷冻，经两次冻融后，收取细胞病毒液。

(2)病毒的纯化：

用已建立的PCR、RT-PCR等检测方法，检测获取的病毒液中是否含其他常见病毒。检测项目包括禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸭细小病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)等，并对种毒采用超速离心法进行纯化。首先将种毒5000r/min离心5min以去除细胞碎片等杂质，随后采用60000r/min超速离心2h，离心结束后用DMEM培养基重悬。

(3)病毒液的灭活：

菌检合格的病毒液用甲醛进行灭活，其最佳的灭活条件为加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

(4)疫苗的制备：

①油相的准备：取10号药用白油加入2％硬脂酸铝(Aluminum tristearate)、6％司班-80(Span-80)，分装到500ml瓶中，搅拌混匀后，高温高压灭菌。

②水相的准备：将灭活的抗原液加入4％吐温-80(Tween-80)，振荡混匀，使Tween-80彻底溶解。

③乳化：油相和水相按1：1的比例混合，在超净台内将2份油相加入组织匀浆机，缓慢地将1份水相，期间不断搅拌，水相全部加入后6000rpm混合10min，再8000r/min乳化20min，分装备用，即制备得到灭活疫苗

实施例3：灭活疫苗的质量检验

将实施例2制备的灭活疫苗进行包括：剂型、离心稳定性、粘度、无菌和保存期的质量检验，具体方法参考《中华人民共和国兽药典》(2015版)。

结果为：本发明制备的灭活疫苗的剂型为油包水型(W/O)；离心稳定性、粘度和无菌检查符合《中华人民共和国兽药典》(2015版)的规定。

实施例4：灭活疫苗的安全性检验

取1日龄雏鸭20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为实验组，腿部肌肉注射实施例2制备的灭活疫苗，0.5mL/只，第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂，接种后每日观察各组动物的精神状态，以及注射部位是否出现红肿热痛等局部炎症反应，持续观察2周，2周后对试验动物进行解剖，观察注射部位疫苗吸收情况。

结果：实验组出现短暂的精神沉郁，但很快恢复，持续观察两周，试验组和对照组生长发育均正常，精神状态良好，剖检试验组发现注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。结果证明试制疫苗安全无害，对动物生长无影响。

实施例5：灭活疫苗的保护性检验

取1日龄雏鸭60只，随机均分为2组，每组30只。其中第1组为免疫组，腿部肌肉注射实施例2制备的灭活疫苗，0.5mL/只，第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂，在免疫后10日，对两组雏鸭腿部注射0.2mL新型鸭呼肠孤病毒液，并分组隔离饲养，观察两组雏鸭的精神状况及死亡情况。

结果：免疫组出现短暂的精神沉郁，但未表现出鸭呼肠孤病毒病的临床症状，未出现死亡；对照组的雏鸭在攻毒后出现明显的临床症状(跗关节肿胀)，死亡只数为8只，结果显示，该灭活疫苗的免疫保护率能达到100％。

实施例6：灭活疫苗的免疫持续期测定

取1日龄雏鸭20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为免疫组，每只腿部肌肉注射实施例2制备的灭活疫苗，0.5mL/只；第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂；免疫后每隔两天采集血清采用间接ELISA检测抗体。

结果发现，免疫组的抗体水平在第4天的时候开始显著升高，第10天达到高峰，此后30天内稍有下降但仍维持较高水平；而对照组的抗体水平在整个实验中均为阴性。说明本发明的灭活疫苗能够在短时间内快速达到高浓度的抗体水平，且免疫持续期长，能够为雏鸭提供快速、长期的免疫保护。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗及其制备方法

<130> 2018

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgagacgcct gactacgatt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 3928

<212> DNA

<213> L1基因片段

<400> 3

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<400> 4

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ggtgcggagt gggagccacg agtggaagcg ttgaatcaag agttggctaa ggcgcgtatt 1680

gagcaacaag atatgatgac tcagtcctta cagtacctga atgaacgtga tgaactgctg 1740

cgcgaggtgg atgagctcaa acgcgaactg gctaccctac ggtttgctaa tgtgagacta 1800

aatgccgata accaccgcat gagtcgtgcg acccgtgttg gagatgtatt cgtcagtgat 1860

gttgatccct taccacccgg tcttcctggt gaatcgaaac catccattga agaactggta 1920

gatgatctgt gagctttgcc ttgtgactcg acttctctct gattccatgt acccacggcg 1980

gactcggcta ttcatc 1996

<210> 9

<211> 1644

<212> DNA

<213> S1基因片段

<400> 9

gctttttcag tctcttgtat cgatgttccg tatgtcttcc ggttcatgca acggcgcgac 60

gtcaatattt ggtaacgtgc attgtcaagc ggcccaaaat accgcaggcg gagatcttca 120

agctacctcg tcattaattg cttattggcc ttatctcgct gctggtggtg gtctcattat 180

aattttaatt attgttatag gtataatctg ttgttgtaag gccaaagtta aggctgacgc 240

taccagaagt gtgttctatc gggagttgct tgctctgaac tcgggcaagt gtaatgcagc 300

acctccgtca tacgacgttt gatgtgcggc ggtttgagtt ttctccgacg gtgtttgaag 360

agtgtttgac tccatctttt accgctgtga ctgacactga ccctgtgagg tactttaata 420

ttgagcttcc gtcaactcac cgtctcctcc cttggcttcc cgttcttctg ttccaatcct 480

gtaaagtgca tgtttcttta gtacgtagat tctctttatg ctcgacttta tctgatattt 540

gtgagtacga ttgcaaattg cttccgtcta ttaacgctat tgtgtcgaat ccagtgtcga 600

gcgcggtttc atctatcgtc gttcactggg atggacggat taactcaaca gcagcgaaga 660

gaagtcgtgg ggttgatact gtcgttgact tcgagcgtga gtataagttc tggcgatttg 720

acgcaaattc gtgagcgtct ttccgctttg gaatctgcga ctgcgtcgct gaacgaatcc 780

gttaatacag ctttgtctag gttagtggat ttgtctgcat cgcttgataa cgtggcggcc 840

tcgttagcgg agacgaaagt ggaaatgaac tcactagttt ctgacgttca gggtttgcga 900

gcttcccttg actcttctgc ttcagagctg gcttctctat cttcattggt gcgtgatcac 960

ggctcttcga ttgctggcct acagagagaa gtaagtgcct tatcgagtga ggtaggcaac 1020

cttaaaacct cggtatcatc gcagggcctt cctatcacta gccttgagaa acgagtgcaa 1080

gctttagaag gtggttctag tacgactctg tcatttgctg atcctcttaa gttagaggct 1140

gggaccgtgt cactcgaggt agatccgtat ttctgctctg tgaatcgtaa tctgacgtcg 1200

tattctgctg atgctcagtt gatgcaattt cagtggtctg tgaaagggga agatggcgcg 1260

gccaactcta ttgatatgga cgtgaacgct cactctcatg gttcacgcac tgattatctg 1320

atgtcaacca agcaatcatt gactgttaca acgtctcccg ctactcttgt ctttgaactg 1380

gataggatta ttgctcttcc ctccgacctt tctcgcctaa ttccatgtta tggttttcag 1440

caagccactt ttcccgttga tatctccttc cagcgagatg gcgtttcgca tacgtatcaa 1500

gtctatggga agtacacatc ttctcgcgtc ttcaagacta cgttctcgcc tggctcctca 1560

ggtcccgcag tgattaagtt tttgaccgtg cgtacgggca tcgataccta aggtgtggcg 1620

ccgtacgggg gctggttatt catc 1644

<210> 10

<211> 1322

<212> DNA

<213> S2基因片段

<400> 10

gggcgcgtgc cgtgtacgac ttcttttcta cgcctttcgg gaatcgtggt ctagcgacga 60

atcgtactca actatcatca ctactatcaa gctcgaattc cccatggcaa cgttttctat 120

catcaatgac tccattgaca gcgccgggca tcgtttcgac acctgaagca ccctatccag 180

gttcgttaat gtatcaagag tctatgctcc acagtgctac cgtccctgga gtacttggca 240

atcgcgacgc ttggcgtacg ttcaatgtct tcggactttc atggactgac gaaggactgt 300

caggactagt ggctacccaa gatcctcctc ccgccgcccc gtatcagcca gcctctgctc 360

agtggtcgga tcttctcaac taccccagat gggcaaacag acgtcgtgag ctgcaatcta 420

agtacccgct tctgcttcgc tccactctgc tctctgccat gcgagctggt cctgttctat 480

atgttgagac gtggccgaat atgatttctg gacgattagc tgattggttt atgtcccaat 540

atggcaataa tttcgttgac atgtgtgcta ggttgaccca gtcttgttcg aacatgcctg 600

ttgaacctga tgggaattat gatcaacaga tgcgtgcttt aattagtttg tggcttctgt 660

catacattgg ggtaatcaac caaaccaaca ccatcagcgg tttctacttc tcctcaaaga 720

ctcggggtca agcgttggac agttggactt tgttctatac cacgaatact aatcgtgtcc 780

aaattacgca gagacatttt gcttatgtgt gcgcccgatc tcctgattgg aacgtggaca 840

aatcatggat cgctgctgcg aacttaaccg ccattgttat ggcttgccgt caaccgccga 900

tgtttgctaa tcaaggcgtc attaatcagg cgcagaaccg acccggattc tccatgaatg 960

gggggacgcc cgtccacgag ctcaacttac ttactactgc gcaagagtgc atcaggcagt 1020

gggtggtagc aggcttggtg tcggcagcaa aggggcaagc actaacgcag gaagctaatg 1080

acttctcaaa cctcatccag gcggatctag gccagatcaa ggcgcaggac gacgctttgt 1140

acaatcagca gccgggatac gcgaggagaa taaaaccttt cgttaatggt gactggacac 1200

caggtatgac cgctcaagct ctggccgttc tagccacttt taccgcctag gcgtagggtc 1260

gtacgctgcc cgagtccagc cctccggcag cccgtggaga tcggacgagc gtcgtgtagg 1320

ga 1322

<210> 11

<211> 1202

<212> DNA

<213> S3基因片段

<400> 11

gctttttgag tccttagcgt gcaagccgca atggaggtac gtgtgccaaa ctttcactcg 60

ttcgttgaag gaataacatc tagctacttg aagactcctg cttgctggaa tgcacaaaca 120

gcttgggata ctgtgacctt tcacgtccct gatgtaatta gagttggtaa cgcctactgt 180

tgttctcaat gttgtggtgt actctactac gggactctgc cctcggacgg taattatttc 240

cctcatcaca agtgtcatca gcaacagttt aggactgata ctccactgct tcgatacgtg 300

cgcattggta gaaccactga gcatctgatg gatcaatatg ctgtcgctct ggagtccatt 360

gctgaacact atgacgagat tagtcaacgt atggtcgatg agccagagaa tgacgaggtt 420

acacctcttg atatcgttac gcgtaccgaa tctatcagga gtgacaaggc agtcgaccca 480

gacttttgga catacccact tgagcggcgt tctgatgatt ctcgtagaga catcgcctca 540

gcatgctgga aaatgattga cgcgtcggcg cgtagtctca ctcttccaaa ttgcctcgtc 600

tccccctctt tgcactctcg ctccgtcttt ggtcagatgc aaacgaccac cactatatac 660

gatgttgcgg catcgggaaa ggccgttaag ttttcaccaa tggttgctac actagcgcaa 720

cgtgatgctg gccctgtaat gcttgcgaat gctgacccgg cggaaggcgt gtactctttc 780

tggacgtcgc acttcgcttt ctcaccgctc atcggcggag ttggaattac gggacagtac 840

gctcgtgagt cgtaccatca agtgggtcat ccagtgattg ggagtggtaa gaaggcatcg 900

cattacagga atctgttcat ggaagcgtgg cgcgggtggt cgaagtcagc tttcgcatgt 960

gctactggaa tggagccagc tgaatgtgaa tctcgtctga gaggacacgc tcgtactatg 1020

ctcggacgct ctctgccgcc cgtttgtgac gatgatgttg ctcagcagtc tggcgcggta 1080

ctgacttcgc tgcagaaaac gaacaagttc accgttgtgg agtgtggttg gtaagtacct 1140

ccgggtcaaa atgcacatag gctcccacct atgtgacggt tagcgggact cgcctattca 1200

tc 1202

<210> 12

<211> 1192

<212> DNA

<213> S4基因片段

<400> 12

gctttttgag tccttgcgca gccatggaca acaccgtgcg tgttggagtt tcccgcaaca 60

catccggcgc agctggtcag actgttttta gaaactttta cttactacga tgcaatatct 120

cagctgacgg tcgtaatgca acaaaagctg tgcaatccca ttttccattc ctttctcgtg 180

ctgtccgttg cctatctcct ctagccgctc attgtgctga taggactctt cgtcgtgaca 240

atgtgaaaca aattcttact cgtgagctgc catttccatc ggatttaatc aattacgcac 300

atcatgtgaa ctcatcctcc cttactactt ctcagggtgt cgaggcggca cgtctagtgg 360

cccaagtcta tggagaacag ctatcgtttg atcacattta tcccactggt tccgcaactt 420

actgccctgg agcgattgct aatgcgattt cccgtatcat ggctggtttt gtgccccacg 480

aaggtgacaa ctttaccccg gacggttcta ttgactatct cgccgccgac ctggtcgcgt 540

ataagttcgt gctcccttac atgctagata ttgtggacgg acgtccgcag attgttcttc 600

catcacacac tgttgaggag atgctgtcca acacgagttt gcttaattcg attgacgctt 660

catttggtat tgaatcgaag agcgatcaac gcatgacccg tgacgcggct gaaatgagtt 720

ctcgctcact taatgagctt gaggatcatg agcagagggg tcgaatgcct tggaaaatca 780

tgacggcaat gttcgcggcg caattgaagg tggagttgga cgccctagct gatgagcgcg 840

ttgaatctca ggctaacgct catgtgacat cttttgggtc tcgtctgttc aaccaaatgt 900

ctgcttttgt cccaattgat cgtgagttga tggagctggc tctactcatc aaagagcagg 960

gtttcgcaat gaatccaggg caagtcgcat ctaaatggtc gctgatacga cgatctggcc 1020

ccactcgccc gctatcaggc gcacgccttg agatcaggaa tggcaactgg acaattcgtg 1080

aaggtgacca gacgcttctg tctgtctccc cagctaggat ggcgtaaacg ggacccatgg 1140

tgcgggtgag gggccgccac accctctgcc gcgacctgga ctcttattca tc 1192

Claims (10)

1.一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗含有预防或治疗上有效量的灭活的鸭呼肠孤病毒株病毒液；所述鸭呼肠孤病毒株的保藏编号为CCTCCNO：V201818。

2.根据权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述鸭呼肠孤病毒株病毒液由如下方法制备而成：

将保藏编号为CCTCC NO：V201818的鸭呼肠孤病毒株接种到LMH细胞系中，对鸭呼肠孤病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，即得鸭呼肠孤病毒株病毒液。

3.根据权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2%的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

4.根据权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗中还含有佐剂。

5.权利要求1-4任一项所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将保藏编号为CCTCC NO：V201818的鸭呼肠孤病毒接种到LMH细胞系中，对鸭呼肠孤病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，获得鸭呼肠孤病毒株病毒液；

（2）将鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活，加入Tween- 80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和Span-80混合作为油相，将油相和水相按1:1混合均匀，乳化，得到防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗；

步骤（2）中，所述水相中Tween- 80的终浓度为2%-4%。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2%的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述白油、硬脂酸铝和Span-80的比例为94:2:6。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，油相和水相混合的方法为：将水相加入到油相中，6000rpm混合10min。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乳化具体为：8000r/min乳化20min。

10.保藏编号为CCTCC NO：V201818的鸭呼肠孤病毒在制备预防或治疗鸭跗关节肿胀的灭活疫苗中的应用；所述鸭跗关节肿胀是由鸭呼肠孤病毒引起的。

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