CN108660117B - 一种导致肉鸡关节炎的新型鸡呼肠孤病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株鸡呼肠孤病毒，该病毒已于2018年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，其生物保藏号为：CCTCC NO：V201817。本发明提供的鸡呼肠孤病毒对目前流行的以关节炎为主要病症的鸡呼肠孤病毒具有很好的免疫原性。以本发明的鸡呼肠孤病毒株制备的灭活疫苗安全性好，保护率达100％，能够对新分离的鸡呼肠孤病毒变异株提供完全保护。

Description

一种导致肉鸡关节炎的新型鸡呼肠孤病毒及其应用

技术领域

本发明涉及禽呼肠孤病毒毒株的分离和应用领域，具体涉及一种导致肉鸡关节炎的新型鸡呼肠孤病毒及其应用。

背景技术

禽呼肠孤病毒(Avianreovirus，简称ARV)属于呼肠孤病科(Reovirdae)正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)，可以引起禽类发生多种疾病，其临床表现因病毒毒株、毒力或感染宿主的不同而有差异。目前，控制禽群ARV发病的主要手段是使用减毒活疫苗或灭活全病毒疫苗通过免疫接种来控制典型的禽呼肠孤病毒感染。但由于禽呼肠孤病毒为RNA病毒，有多个分段，不同毒株间在抗原结构、致病性、细胞培养特性以及宿主特异性等方面存在一定的差异。在遗传进化时容易发生变异，导致传统毒株制备的疫苗不能很好的防控当今流行的禽呼肠孤病毒感染。

2016年，我国山东、江苏等地肉种鸡场和商品代肉鸡场相继出现以关节肿胀和跛行为症状的疾病。该病传播速度快、发病范围广，不同日龄、不同品种的鸡都可以感染，但对商品肉鸡的危害尤为严重。发病初期主要表现为体温升高、精神沉郁、食欲废绝及营养吸收不良等，随着病程的发展，感染鸡逐渐出现关节肿胀、发炎，不愿走动，跛行等症状；剖检可见关节腔内纤维素性渗出，腱鞘炎，腓肠腱断裂等病理变化，给我国肉鸡养殖业造成严重的经济损失。采用市售的商品化鸡呼肠孤病毒疫苗已无法有效的防控该病的流行，由此推知该病可能是由新型呼肠孤病毒引起的。因此，从病原入手，进一步研究分子致病机理和病毒变异机理，开发相应疫苗是防控该病的关键。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种导致肉鸡关节炎的新型鸡呼肠孤病毒及其应用。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一方面，提供了一株鸡呼肠孤病毒，该病毒已于2018年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：中国武汉，武汉大学，其保藏编号为：CCTCCNO：V201817。

本发明的第二方面，提供上述鸡呼肠孤病毒在制备预防鸡呼肠孤病的疫苗中的应用；所述鸡呼肠孤病是由保藏编号为CCTCC NO：V201817的鸡呼肠孤病毒引起的。

优选的，所述疫苗为灭活疫苗或减毒活疫苗；更优选的，所述疫苗为灭活疫苗。

本发明的第三方面，提供上述鸡呼肠孤病毒在制备治疗鸡呼肠孤病的卵黄抗体中的应用；所述鸡呼肠孤病是由保藏编号为CCTCC NO：V201817的鸡呼肠孤病毒引起的。

本发明的有益效果：

本发明提供的鸡呼肠孤病毒N-ARV-LY383株，对目前流行的以关节炎为主要病症的鸡呼肠孤病毒具有很好的免疫原性。以鸡呼肠孤病毒N-ARV-LY383株制备的灭活疫苗安全性好，保护率达100％，能够对新分离的鸡呼肠孤病毒变异株提供完全保护。

附图说明

图1：本发明的病毒分离株在LMH细胞上的细胞病变；其中，A：正常生长状态下的LMH细胞；B：N-ARV-LY383在LMH细胞上出现的CPE。

图2：PCR鉴定结果；其中，M为Marker；泳道1为待测样品；泳道2为空白对照。

图3：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中L1基因的遗传进化分析结果。

图4：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中L1基因的同源性比对结果。

图5：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中L2基因的遗传进化分析结果。

图6：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中L2基因的同源性比对结果。

图7：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中L3基因的遗传进化分析结果。

图8：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中L3基因的同源性比对结果。

图9：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中M1基因的遗传进化分析结果。

图10：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中M1基因的同源性比对结果。

图11：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中M2基因的遗传进化分析结果。

图12：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中M2基因的同源性比对结果。

图13：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中M3基因的遗传进化分析结果。

图14：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中M3基因的同源性比对结果。

图15：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中S1基因的遗传进化分析结果。

图16：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中S1基因的同源性比对结果。

图17：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中S2基因的遗传进化分析结果。

图18：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中S2基因的同源性比对结果。

图19：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中S3基因的遗传进化分析结果。

图20：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中S3基因的同源性比对结果。

图21：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中S4基因的遗传进化分析结果。

图22：本发明的病毒分离株N-ARV-LY383病毒基因组中S4基因的同源性比对结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，由于禽呼肠孤病毒为RNA病毒，有多个分段，不同毒株间在抗原结构、致病性、细胞培养特性以及宿主特异性等方面存在一定的差异。在遗传进化时容易发生变异，导致传统毒株制备的疫苗不能很好的防控当今流行的禽呼肠孤病毒感染。2016年，我国山东、江苏等地肉种鸡场和商品代肉鸡场相继以关节肿胀和跛行为症状的疾病。该病传播速度快、发病范围广，不同日龄、不同品种的鸡都可以感染，但对商品肉鸡的危害尤为严重。发病初期主要表现为体温升高、精神沉郁、食欲废绝及营养吸收不良等，随着病程的发展，感染鸡逐渐出现关节肿胀、发炎，不愿走动，跛行等症状；剖检可见关节腔内纤维素性渗出，腱鞘炎，腓肠腱断裂等病理变化，给我国肉鸡养殖业造成严重的经济损失。采用市售的商品化鸡呼肠孤病毒疫苗已无法有效的防控该病的流行，由此推知该病可能是由新型呼肠孤病毒引起的。

本申请发明人从发病鸡肿胀的肌腱组织中分离出一株鸡呼肠孤病毒N-ARV-LY383，禽类呼肠孤病毒基因由分节段的10个基因片段(包括：L1-L3、M1-M3、S1-S4)组成，本发明对上述新分离的鸡呼肠孤病毒N-ARV-LY383进行了全基因组测序，并分别将10个基因片段与现有报道的禽呼肠孤病毒进行了序列比对和同源性分析，结果发现，新分离毒株N-ARV-LY383的10个基因片段多位于一个相对独立的分支中，说明新分离的毒株N-ARV-LY383不同于其他的禽呼肠孤病毒，为正呼肠孤病毒属的1个单独种。

与现有的禽呼肠孤病毒相比，本发明的鸡呼肠孤病毒N-ARV-LY383全基因组中的10个基因片段均发生了基因重组和突变，增强了本发明的鸡呼肠孤病毒N-ARV-LY383的免疫原性，将其制成疫苗能够实现对目前流行的鸡呼肠孤病的有效防治。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

其中，RNA提取试剂盒购于北京康为世纪有限公司，普通琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京全式金公司，反转录试剂盒购于宝生物(大连)有限公司，2×Es Taq MasterMix购于北京康为世纪有限公司，DL2000Marker购于宝生物(大连)有限公司，胎牛血清、DMEM培养基购于以色列BI公司，PBS购于北京索莱宝公司。

实施例1：鸡呼肠孤病毒毒株的分离和鉴定

1.病毒分离：

(1)临床上经PCR反应鉴定为阳性的关节炎发病雏鸡，剖检采集其肿胀的肌腱组织置于15mL离心管中，加入5倍体积的无血清的DMEM培养基，匀浆后反复冻融3次，每次解冻后在振荡器上震荡1-2min后在进行下一次冻融；冻融后将装有样品的15mL离心管于离心机中4000rpm离心5min；取上清，0.22μm微孔滤膜过滤后，备用；

(2)根据呼肠孤病的增殖特性，选用鸡肝癌细胞(LMH)进行病毒分离。按照常规细胞培养方法，待25cm²细胞瓶中的细胞铺满单层时，吸弃瓶中培养基并用PBS荡洗细胞2次，加入0.5毫升已滤过的样品冻融上清，将细胞置于37℃，5％CO₂浓度的培养箱中感作30min，感作结束后加入含2％胎牛血清的DMEM培养基，观察并记录出现细胞病变的时间。如第1代无细胞病变出现，则冻融后以第1代收获的培养物按照步骤(1)方法继续分离，直至获得稳定毒株；如传至第5代仍无细胞病变，则视为病毒分离阴性。最终得到一株稳定的毒株，其在接种LMH细胞后3天出现了较为明显的细胞病变，即表现为细胞变圆、融合，呈现团块脱落病变(图1)，同批次空白对照细胞正常，将该毒株命名为N-ARV-LY383。

2.病毒鉴定：

(1)PCR鉴定

1)RNA提取：

将毒株N-ARV-LY383的病毒液按照RNA提取试剂盒说明书要求，提取病毒RNA，置于-20℃保存备用；

2)反转录获得cDNA：

所用反转录试剂盒采用来自宝生物(大连)有限公司的货号为RR036A的PrimeScript^TM RT Master Mix，在200μLPCR反应管中依次加入5×PrimeScript RT MasterMix×2μL，提取的待测样品Total RNA～2μL，使用RNase Free dH₂O补充至10μl体系。置于PCR仪中进行反应，反应条件为37℃15min；85℃5s之后4℃保存。

3)PCR扩增：

采用20μL体系进行扩增：模板cDNA×2μL，上、下游引物各×1μL，2×Es TaqMasterMix×10μL，采用ddH₂O补充至20μL体系。混匀并瞬离后置于PCR仪进行反应，反应条件为95℃，5min，之后95℃，45s，56℃，30s，72℃，45s进行30个循环，72℃，10min之后4℃保存备用。

上游引物：5′-GGT GCG ACT GCT GTA TTT GGT AAC-3′(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5′-AAT GGA ACG ATA GCG TGT GGG-3′(SEQ ID NO.2)。

4)PCR鉴定结果：

用引物进行PCR扩增后的产物在1％琼脂糖凝胶中电泳后出现了与预期值513bp大小相符的特异性条带(图2)。表明各分离株的细胞培养物中存在新型鸡呼肠孤病毒。另外对分离株进行的常规鸡源病毒检测，并未检测到其他病毒污染。

(2)序列测定：

采用二代测序技术对毒株N-ARV-LY383进行全基因组序列测定，然后与现有技术中已公布的禽呼肠孤病毒序列进行遗传进化分析和同源性分析。其中，将LY383株L1基因与GenBank上发表的11株分离株基因进行序列比对。遗传进化分析结果(图3)显示，LY383分离株处于一个独立的小分支。同源性分析结果(图4)显示，LY383分离株与S1133、1733和176分离株的同源性最高，核苷酸同源性均为91.1％；与其余分离株的同源性均较低。将LY383株L2基因与GenBank上发表的11株分离株基因进行序列比对。遗传进化分析结果(图5)显示，LY383分离株处于一个独立的小分支。同源性分析结果(图6)显示，LY383分离株与S1133、1733分离株的同源性最高，核苷酸同源性均为90.6％；与其余分离株的同源性较低。将LY383株L3基因与GenBank上发表的11株分离株基因进行序列比对。遗传进化分析结果(图7)显示，LY383分离株处于一个独立的小分支。同源性分析结果(图8)显示，LY383分离株与1733和176分离株的同源性最高，核苷酸同源性均为81.6％；与S1133分离株的同源性次之，核苷酸同源性为81.5％；与Reo/PA/Broiler/15511/13同源性较低，核苷酸同源性为73.3％；与其余分离株的同源性均较低。将LY383株M1基因与GenBank上发表的11株分离株基因进行序列比对。遗传进化分析结果(图9)显示，LY383分离株处于一个独立的小分支。同源性分析结果(图10)显示，LY383分离株与176分离株的同源性最高，核苷酸同源性均为89.5％；与GX/2020/1分离株的同源性次之，核苷酸同源性为89.3％；与标准株S1133及1733的核苷酸同源性均为89.1％；与Reo/PA/Broiler/15511/13核苷酸同源性为73.3％；与其余分离株的同源性均较低。将LY383株M2基因与GenBank上发表的11株分离株基因进行序列比对。遗传进化分析结果(图11)显示，LY383分离株与Reo/PA/Broiler/15511/13分离株处于同一进化分支，遗传关系较近；与其余分离株遗传距离较远。同源性分析结果(图12)显示，LY383分离株与Reo/PA/Broiler/15511/13分离株的同源性最高，核苷酸同源性为91.8％；与138分离株的同源性次之，核苷酸同源性为90.9％；与S1133和1733的核苷酸同源性均为85.5％。将LY383株M3基因与GenBank上发表的11株分离株基因进行序列比对。遗传进化分析结果(图13)显示，LY383分离株与Reo/PA/Broiler/15511/13分离株处于同一进化分支，遗传关系较近；与其余分离株遗传距离较远。同源性分析结果(图14)显示，LY383分离株与Reo/PA/Broiler/15511/13分离株的同源性最高，核苷酸同源性为95.7％；与S1133、1733和138分离株的同源性次之，核苷酸同源性均为81.3％。将LY383株S1基因与GenBank上发表的8株分离株基因进行序列比对。遗传进化分析结果(图15)显示，LY383分离株与Reo/PA/Broiler/15511/13分离株处于同一进化分支，遗传关系较近；与其余分离株遗传距离较远。同源性分析结果(图16)显示，LY383分离株与Reo/PA/Broiler/15511/13分离株的同源性最高，核苷酸同源性为96.4％；与S1133、1733等其余分离株的同源性均较低，核苷酸同源性均低于61.2％。将LY383株S2基因与GenBank上发表的9株分离株基因进行序列比对。遗传进化分析结果(图17)显示，LY383分离株处于一个独立的小分支。同源性分析结果(图18)显示，LY383分离株与S1133分离株的同源性最高，核苷酸同源性为91.7％；与S1133和176分离株的同源性次之，核苷酸同源性均为91.6％；而与Reo/PA/Broiler/15511/13分离株的核苷酸同源性为91.0％。将LY383株S3基因与GenBank上发表的9株分离株基因进行序列比对。遗传进化分析结果(图19)显示，LY383分离株处于一个独立的小分支。同源性分析结果(图20)显示，LY383分离株与1733分离株的同源性最高，核苷酸同源性为88.9％；与S1133和176分离株的同源性次之，核苷酸同源性均为88.8％；与Reo/PA/Broiler/15511/13分离株的核苷酸同源性为84.2％。将LY383株S4基因与GenBank上发表的9株分离株基因进行序列比对。遗传进化分析结果(图21)显示，LY383分离株与Reo/PA/Broiler/15511/13分离株处于同一进化分支，遗传关系较近；与其余分离株遗传距离较远。同源性分析结果(图22)显示，LY383分离株与Reo/PA/Broiler/15511/13分离株的同源性最高，核苷酸同源性为92.5％；与138分离株的同源性次之，核苷酸同源性为89.3％；与S1133和1733的核苷酸同源性分别为83.3％和83.2％

综上可以看出，毒株N-ARV-LY383的10个基因片段多位于一个相对独立的分支中，说明新分离的毒株N-ARV-LY383不同于其他的禽呼肠孤病毒，为正呼肠孤病毒属的1个单独种。将分离得到的毒株N-ARV-LY383鉴定为鸡呼肠孤病毒。并对该毒株进行生物保藏，保藏信息如下：

菌种名称：鸡呼肠孤病毒

分类命名：鸡源呼肠孤病毒N-ARV-LY383株

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：CCTCC

地址：中国武汉，武汉大学

保藏日期：2018.4.26

保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：V201817。

实施例2：TCID₅₀效价测定：

1.试验方法：

将毒株N-ARV-LY383第5代细胞培养物(含2％胎牛血清的DMEM培养基)做倍比稀释(10^-1-10^-6)。待96孔细胞培养板的LMH细胞铺满每个孔后，按顺序依次加入25μL各个稀释梯度的病毒液，最后两个孔加入25μL含2％胎牛血清的DMEM培养基做空白对照，同一细胞版上做8次重复，置于37℃，含5％CO₂的培养箱中感作30min后，每孔加入100μL含2％胎牛血清的DMEM培养基继续培养观察，每天观察记录出现细胞病变的情况，至第5天判读结果。以Reed-Muench法计算分离株TCID₅₀效价。

2.试验结果：

经测定，毒株N-ARV-LY383的TCID₅₀效价测定结果为：10^-5/0.2mL。

实施例3：动物回归试验

取1日龄健康罗斯308肉雏鸡10只，随机分为两组，一组7只经脚垫注射途径接种0.1mL病毒液(TCID₅₀为10^-5/0.2mL)，二组3只以同样的接种方式和剂量注射灭菌生理盐水，观察试验雏鸡感染后的临床症状及剖检变化。

结果人工感染N-ARV-LY383株后，肉雏鸡主要临床表现为：精神沉郁，卧地倦动，渴欲增加，感染24h后雏鸡脚垫红肿(7/7)，48h波及踝关节(6/7)，腿部血管有明显突起红肿。感染后11d脚垫肿胀且完全上行至跗关节，关节肿胀变形，有积液。剖检可见腿部关节出血积液，肠道出血。通过RT-PCR方法可在关节处检测到ARV。对照组无变化。

实施例4：灭活疫苗的制备

(1)病毒的增殖与收获：

将分离鉴定后的新型鸡呼肠孤病毒N-ARV-LY383接种到生长良好的LMH细胞系中，对该病毒进行大量增殖，获取足够的病毒液。将获得的足量细胞病毒液置于-20℃冷冻，经两次冻融后，收取细胞病毒液。

(2)病毒的纯化：

用已建立的PCR、RT-PCR等检测方法，检测获取的病毒液中是否含其他常见病毒。检测项目包括禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、禽痘病毒(APV)、滑液囊支原体(MS)、传染性支气管炎病毒(IBV)及传染性法氏囊病毒(IBDV)等。

(3)病毒液的灭活：

菌检合格的纯净病毒液用甲醛进行灭活，其最佳的灭活条件为加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

(4)疫苗的制备：

①油相的准备：取10号药用白油、硬脂酸铝(Aluminum tristearate)、司班-80(Span-80)按94：2：6混合，搅拌混匀后，高温高压灭菌。

②水相的准备：将灭活的抗原液加入2％～4％的吐温-80(Tween-80)，振荡混匀，使Tween-80彻底溶解。

③乳化：油相和水相按2：1的比例混合，在超净台内将2份油相加入组织匀浆机，缓慢地加入1份水相，期间不断搅拌，水相全部加入后6000r/min混合10min，再8000r/min乳化20min，分装备用。

实施例5：灭活疫苗的质量检验

将实施例4制备的灭活疫苗进行包括：剂型、离心稳定性、粘度、无菌和保存期的质量检验，具体方法参考《中华人民共和国兽药典》(2015版)。

结果为：本发明制备的灭活疫苗的剂型为油包水型(W/O)；离心稳定性、粘度和无菌检查符合《中华人民共和国兽药典》(2015版)的规定。

实施例6：灭活疫苗的安全性检验

取1日龄健康罗斯肉鸡20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为实验组，腿部肌肉注射实施例4制备的灭活疫苗，0.4mL/只，第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂，接种后每日观察各组动物的精神状态，以及注射部位是否出现红肿热痛等局部炎症反应，持续观察2周，2周后对试验动物进行解剖，观察注射部位疫苗吸收情况。

结果：试验组出现短暂的精神沉郁，但很快恢复，持续观察2周，试验组和对照组生长发育均正常，精神状态良好，剖检试验组发现注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。结果证明试制疫苗安全无害，对动物生长无影响。

实施例7：灭活疫苗的保护性检验

将长势均匀、健康良好的种鸡随机分为a，b两组；其中a组试验组免疫实施例4制备的灭活疫苗，剂量0.4ml/只，b组对照组免疫1133+1733商品疫苗，剂量0.4ml/只。分别于免疫接种后第五、六、七、八周各收取两组种鸡蛋50枚，置孵化箱孵化。将孵化的ab两组各20只雏鸡于1日龄经点眼滴鼻接种途径接种N-ARV-LY383毒株，接种剂量为0.1mL/只(ELD₅₀为10^-5.53)。观察试验鸡腿部关节的肿胀情况，对疫苗的效果进行评价。

结果a组种鸡蛋孵化后的雏鸡出现短暂的精神沉郁，但未表现出鸡呼肠孤病毒病的临床症状，未出现死亡；b的组种鸡蛋孵化后的雏鸡全部出现关节肿胀、跛行症状，剖检可见关节腔内有纤维素性渗出，结果显示，实施例4制备的灭活疫苗的免疫保护率能达到100％；与市售商品疫苗相比，具有更好的免疫保护力。

实施例8：灭活疫苗的免疫持续期测定

取5日龄雏鸡20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为免疫组，每只腿部肌肉注射实施例4制备的灭活疫苗，0.4mL/只；第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂；免疫后每隔两天采集血清采用间接ELISA检测抗体。

结果发现，免疫组的抗体水平在第4天的时候开始显著升高，第10天达到高峰，此后30天内稍有下降但仍维持较高水平；而对照组的抗体水平在整个实验中均为阴性。说明本发明的灭活疫苗能够在短时间内快速达到高浓度的抗体水平，且免疫持续期长，能够为肉鸡提供快速、长期的免疫保护。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种导致肉鸡关节炎的新型鸡呼肠孤病毒及其应用

<130> 2018

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtgcgactg ctgtatttgg taac 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aatggaacga tagcgtgtgg g 21

Claims (4)

1.一株鸡呼肠孤病毒，其生物保藏号为：CCTCC NO：V201817。

2.权利要求1所述的鸡呼肠孤病毒在制备预防鸡呼肠孤病的疫苗中的应用；所述鸡呼肠孤病是由生物保藏号为CCTCC NO：V201817的鸡呼肠孤病毒感染引起的。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗或减毒活疫苗。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗。

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