CN110760485B - 一株禽呼肠孤病毒毒株及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株禽呼肠孤病毒毒株及应用，涉及病毒毒株筛选领域，该毒株的保藏编号为CCTCC NO:V201971。本发明通过分离鉴定，动物回归以及攻毒保护试验，发现该毒株为强毒株，现有商品化疫苗或临床分离毒株制成的疫苗不能产生有效的保护或保护率较低，且该毒株可以用于禽呼肠孤病毒疫苗的效力检验。

Description

一株禽呼肠孤病毒毒株及应用
技术领域
本发明属于病毒毒株筛选领域，具体涉及一株禽呼肠孤病毒毒株及应用。
背景技术
禽呼肠孤病毒(Avian orthoreovirus,ARV)属于呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属，是一种具有高度传染性的禽类病毒。ARV感染可以导致关节炎、腱鞘炎，慢性吸收不良及吸收障碍综合症等可引起机体免疫系统损害，增加对其他病原微生物的易感性，死亡率升高，饲料转换率下降，产蛋量下降，给养禽业造成巨大的经济损失。
国内外的研究表明，在进行疫苗研发过程中，由于ARV的临床分离株较为单一，往往只使用常见的经典毒株如S1133株进行效力检验，随着ARV感染的增加和病毒的不断变异，ARV的防治难度不断增大，经研究发现，ARV存在多种不同血清型和致病性的毒株，而采用经典毒株制备的疫苗并不能防控所有ARV病毒。而且，S1133株的毒力强度有限，在检测不同疫苗效力时，仅使用ARV病毒S1133株进行效力检验，当疫苗都能产生免疫保护作用时，往往无法判断疫苗对临床毒株实际保护效力的强弱，给疫苗的评价带来困难。
发明内容
本发明的目的是解决目前国内外在ARV疫苗研发过程中，ARV的分离株较为单一的问题，提供一株新型禽呼肠孤病毒毒株。
本发明的另一目的是提供所述新型禽呼肠孤病毒毒株在禽呼肠孤病毒疫苗效力检验中的应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一株禽呼肠孤病毒毒株，保藏编号为CCTCC NO：V201971。
一段的禽呼肠孤病毒毒株S1基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示。
进一步的，核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步的，禽呼肠孤病毒毒株在禽呼肠孤病毒疫苗效力检验中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
1、本发明首次分离出一株新型禽呼肠孤病毒毒株，解决了目前国内外在ARV疫苗研发过程中，ARV的分离株较为单一的问题。
2、该毒株为强毒株，可以用于禽呼肠孤病毒疫苗效力检验。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为新型禽呼肠孤病毒SD0920株琼脂糖凝胶电泳结果
图2a、2b为新型禽呼肠孤病毒SD0920株免疫荧光对比图
图3禽呼肠孤病毒SD0920株基因进化树
具体实施方式
实施例中除特殊注明，其余使用的试剂盒、载体、酶、宿主菌等生物原料均来自商业化产品。
实施例1：禽呼肠孤病毒毒株的分离和鉴定
一、禽呼肠孤病毒毒株的分离
实验用样品采集自山东诸城某规模化养鸡场，发病鸡为30日龄，多发跛行，瘫痪，甚至死亡，鸡腿关节处明显肿大、发黑，剖检现较多关节液，筋腱断裂，疑似发生鸡病毒性关节炎病。取病鸡样品关节液及关节拭子、筋腱研磨后，离心取上清用0.22μm滤器过滤除菌，然后接种在已铺满单层的LMH细胞板上，同时设置阴性对照。置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养，每天观察细胞状态。接种一代后，无典型细胞病变出现，将细胞板冻融3次后，收获病毒液，接种第二代。接种病毒72小时后，与对照相比，接毒孔细胞边缘分解不明显逐渐形成合胞体，96小时后逐渐融合成数个较大细胞团，细胞团周围出现空白；120小时可见细胞团形成数个合胞体悬浮于培养液中。以上病变为呼肠孤典型细胞病变。
将接毒细胞板反复冻融3次后，收获病毒液，经检验，无细菌或其他病毒污染。
二、禽呼肠孤病毒的鉴定
1.RT-PCR鉴定
1.1病毒核酸的提取与反转录
将ARV细胞病毒液离心，取200μL上清用天隆核酸提取仪提取RNA，以总RNA为模板，Random Primer(6mer)为引物，在M-MLV反转录酶作用下合成第一链cDNA。反转录体系：5×M-MLV Buffer 8μL；dNTP Mixture(2.5mM)4μL；Random Primer(6mer)0.15μL；M-MLV反转录酶0.5μL；RRI 0.5μL；Rnase-Free水1.85μL，cDNA模板25μL；Total 40μL。反应程序为30℃10min，42℃1h，72℃15min，冷却至室温，-20℃保存。
1.2PCR扩增
20μL扩增体系：ddH2O 11.6μL；10×Buffer 2μL；dNTP Mixture 1.6μL；PrimerF/R1.0/1.0μL；rTaq DNA酶0.3μL；cDNA模板2.5μL；Total 20μL。反应程序：95℃预变性5min；95℃30s；55℃30s；72℃1min；扩增34个循环；72℃10min；扩增结束后，用2％琼脂糖凝胶电泳观察结果。图1中电泳结果显示扩增出421bp的条带，与预期目的片段大小相符。
1.3免疫荧光(FA)
吸取1ml病变细胞液到1.5ml离心管中，8000rpm离心10min，弃掉上清液1.25ml，将剩余细胞液重悬，吸取重悬液滴载玻片上，另设阴性对照。
将载玻片置于生物安全柜中充分晾干，用冷冻丙酮室温固定10min，室温晾干。
用呼肠孤酶标抗体1:100稀释液滴到玻片上，37℃避光孵育40min。用PBS冲洗2-3min，50％缓冲甘油封固，在荧光显微镜下观察结果。结果显示：病毒接毒孔出现大量明显荧光着染见图2a，细胞阴性对照孔无荧光出现，见图2b，结果表明试验中分离到了禽呼肠孤病毒，并将其命名为将禽呼肠孤病毒SD0920株。
利用RT-PCR和PCR对AIV、NDV、IBV、IBDV、FAV、CIAV、REV和ALV等常见外源病毒进行检测，证明禽呼肠孤病毒中不含有其它外源病毒污染。
1.4基因测序、同源性及进化树分析
用禽呼肠孤病毒的S1基因测序引物进行RT-PCR扩增出目的片段，将目的片段用T4连接酶与PMD-18T质粒4℃过夜连接，将连接产物进行化学转化，转入Trans-5α感受态细胞中，进行蓝白斑筛选。筛选阳性菌株进行测序。
将测序结果用SeqMan进行拼接，并与GenBank下载已公布的禽呼肠孤病毒的S1基因序列用MegAlign 5.01进行核苷酸与氨基酸序列同源性比对。通过MEGA 6.0构建进化树。决定禽呼肠孤病毒抗原性的主要抗原基因S1及其编码的σC蛋白，其核苷酸序列SEQ ID NO:1，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
从同源性分析结果可以看出，该禽呼肠孤病毒SD0920株与常见经典呼肠孤病毒差异较大，同源性较低，基因进化树结果显示(见图3)，SD0920株与常见经典呼肠孤病毒处于不同的分支，与临床流行的禽呼肠孤病毒属于同个分支，属于新型呼肠孤病毒，并于2019年10月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201971。
1.5动物回归实验
选择30只21日龄SPF鸡，随机分为3组，每组10只，其中一组作为实验组每只脚垫攻毒0.1ml病毒液(10^6.5TCID50)，阳性对照组每只脚垫注射0.1ml禽呼肠孤经典强毒株S1133(CVCC AV2311株)病毒液(10^6.5TCID50)，阴性对照组每只脚垫注射0.1ml无菌PBS，攻毒后每天观察试验结果，观察10日，攻毒期间实验组与阳性对照组所有鸡均出现鸡病毒性关节炎临床症状(跗关节、趾关节红肿，爪垫肿大等特异性病变)，阴性对照组则全部未出现鸡病毒性关节炎临床症状，且实验组较阳性对照组症状出现早，持续时间长，症状严重，具体情况见表1。动物回归实验结果表明，该禽呼肠孤病毒SD0920株是一株禽呼肠孤强毒株，毒力高于S1133株，SD0920株可以在禽呼肠孤病毒疫苗效力检验中用于攻毒。
表1动物回归实验观察结果汇总
Figure BDA0002308896240000041
实施例2.攻毒保护试验
1.采用S1133株进行攻毒
选择70只14日龄SPF鸡随机分为7组，每组10只。实验前，将所有鸡只采血分离血清，采用ELISA法测定REOV抗体值，结果显示全部REOV抗体阴性。其中第1-5组为实验免疫组，第6组为阳性对照组，第7组为阴性对照组，实验免疫组1-5分别免疫青岛易邦鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病、病毒性关节炎四联灭活疫苗(AV2311 S1133株)、瑞普生物关炎妥(ZJS株)疫苗、默沙东鸡病毒性关节炎灭活疫苗(1733+2408株)、临床分离株REOV-74和SD0920制备的灭活苗，1-3组免疫方式按照说明书进行，4-5组肌肉注射0.2ml/只，6-7组不免疫。
首免2周后进行二次免疫，第二次免疫2周后进行攻毒实验。
实验免疫组与阳性对照组均用S1133株进行攻毒，脚垫注射0.1ml S1133株病毒液(10^5.52TCID50)，阴性对照组脚垫注射0.1ml无菌PBS。攻毒后每天观察所有鸡只的发病情况，连续观察10天。结果显示实验免疫组1-5组以及阳性对照组全部保护，阴性对照组全部健康未发病。
2.采用SD0920株进行攻毒
选择70只14日龄SPF鸡随机分为7组，每组10只。实验前，将所有鸡只采血分离血清，采用ELISA法测定REOV抗体值，结果显示全部REOV抗体阴性。其中第1-5组为实验免疫组，第6组为阳性对照组，第7组为阴性对照组，实验免疫组1-5分别青岛易邦鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病、病毒性关节炎四联灭活疫苗(AV2311 S1133株)、瑞普生物关炎妥(ZJS株)疫苗、免疫默沙东鸡病毒性关节炎灭活疫苗(1733+2408株)、临床分离株REOV-74和SD0920制备的灭活苗，1-3组免疫方式按照说明书进行，4-5组肌肉注射0.2ml/只，6-7组不免疫。
首免2周后进行二次免疫，第二次免疫2周后进行攻毒实验。
实验免疫组与阳性对照组均用SD0920株进行攻毒，脚垫注射0.1ml SD0920株病毒液(10^5.17TCID50)，阴性对照组脚垫注射0.1ml无菌PBS。攻毒后每天观察所有鸡只的发病情况，连续观察10天。结果显示实验免疫组组1-2组与阳性对照组全部发病，3组3/10只发病，4组5/10只发病，5组全部保护，阴性对照组全部健康未发病。

Claims (2)

1.一株禽呼肠孤病毒毒株，其特征在于：所述禽呼肠孤病毒毒株的保藏编号为CCTCCNO：V201971。
2.如权利要求1所述的禽呼肠孤病毒毒株在禽呼肠孤病毒疫苗效力检验中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108660117A (zh) * 2018-05-22 2018-10-16 山东农业大学 一种导致肉鸡关节炎的新型鸡呼肠孤病毒及其应用
CN109837252A (zh) * 2019-04-09 2019-06-04 青岛易邦生物工程有限公司 一种鸡呼肠孤病毒变异毒株HeB18株
CN109897833A (zh) * 2019-04-09 2019-06-18 青岛易邦生物工程有限公司 一种新型的鸡呼肠孤病毒株

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2708316C2 (ru) * 2014-01-29 2019-12-05 Дзе Юниверсити Оф Джорджиа Рисерч Фаундейшн, Инк. Вакцины на основе реовирусов птиц

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108660117A (zh) * 2018-05-22 2018-10-16 山东农业大学 一种导致肉鸡关节炎的新型鸡呼肠孤病毒及其应用
CN109837252A (zh) * 2019-04-09 2019-06-04 青岛易邦生物工程有限公司 一种鸡呼肠孤病毒变异毒株HeB18株
CN109897833A (zh) * 2019-04-09 2019-06-18 青岛易邦生物工程有限公司 一种新型的鸡呼肠孤病毒株

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一株肉鸡呼肠孤病毒变异株的分离鉴定;于可响等;《畜牧兽医学报》;20190516(第05期);第144-152页 *

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