KR100913425B1

KR100913425B1 - 인플루엔자 바이러스 및 그를 포함하는 면역원성 조성물

Info

Publication number: KR100913425B1
Application number: KR1020070046573A
Authority: KR
Inventors: 송대섭; 강보규; 이철승; 박봉균
Original assignee: 녹십자수의약품(주)
Priority date: 2007-05-14
Filing date: 2007-05-14
Publication date: 2009-08-21
Also published as: KR20080100632A

Abstract

본 발명은 A/Swine/Korea/GC0503/2005(H1N1)(KCTC-11078BP), A/Swine/Korea/GC0502/2005(H1N2)(KCTC-11080BP) 및 A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2)(KCTC-11079BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스 및 이의 사균 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 신종의 돼지 인플루엔자 바이러스를 제공하여, 돼지를 인플루엔자 바이러스에 대한 면역을 효과적으로 형성시킬 수 있으며, 따라서 돼지 농장에서의 인플루엔자 바이러스에 의한 질환 발병을 현저히 감소시켜 경제적인 손실을 방지할 수 있다.

인플루엔자 바이러스, H1N1, H1N2, H3N2, 서브타입, 유전자 규명

Description

인플루엔자 바이러스 및 그를 포함하는 면역원성 조성물{Influenza virus and immunogenic composition comprising the same}

도 1은 A/Swine/Korea/GC0503/2005의 HA(도 1a), NA(도 1b), M(도 1c), NP(도 1d), NS(도 1e), PA(도 1f), PB1(도 1g) 및 PB2(도 1h) 유전자의 뉴클레오티드 서열의 계통발생학적 트리를 보여준다.

도 2는 각 그룹의 돼지 인플루엔자 바이러스 (Swine influenza virus: SIV)의 접종 후 시간에 따른 병원성의 변화를 폐 스코어링 값으로 나타낸 도면이다.

본 발명은 A/Swine/Korea/GC0503/2005(H1N1)(KCTC-11078BP), A/Swine/Korea/GC0502/2005(H1N2)(KCTC-11080BP) 및 A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2)(KCTC-11079BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스 및 이의 사균 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 면역원성 조성물에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 오쏘믹소바이러스 속, 오쏘믹소비리대 과의 멤버이며, 네거티브 센스 단일 가닥 RNA를 포함한다 (Lamb, R.A. and Krug, R. 1996. In Field Virology. 3^rd Edn. Eds B.N. Field, D.M. Knipe, P.M. Howley. Philadelphia, Lippincott-Raven. p.1353-1395). 항원으로 및 유전적으로 구분될 수 있는 16가지 상이한 서브타입의 적혈구응집소 (HA) 및 9가지 상이한 서브타입의 뉴라미니다제 (NA)가 존재한다 (Choi et al., 2004. Vet. Rec. 154, 274-275; Fouchier et al., 2005. J. Virol. 79, 2814-2822).

현재로, 3가지 주요한 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스가 전세계를 통해 상이한 돼지 집단에서 퍼져 있다: H1N1, H1N2, 및 H3N2 (Jung, K. Chae, C. 2004. Arch. Virol. 149, 1415-1422). 돼지로부터 분리된 첫번째 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1 서브타입이며, 상기 서브타입의 관련된 바이러스는 많은 나라에서 돼지를 감염시키는 것으로 보고되었다. H1N2 바이러스는 1999년에 미국에서, 1987년에 프랑스에서, 1978~1980년에 일본에서, 1994년에 미국에서 이전에 분리되었다. 더욱이, 1998년 이후로, H3N2 바이러스는 호흡기 질환의 만연된 발병을 야기하였으며, 특정 경우에는 미국에서 돼지 사이에 낙태까지 야기하였다 (Webby et al., 2000. J. Virol. 74, 8243-8251). 한국에서, H3N2 및 H1N2 돼지 인플루엔자 바이러스는 1998년 및 2003년에 분리된 반면, H1N1 바이러스는 2004년에 돼지로부터 분리되었다 (Choi et al., 2004. Vet. Rec. 154, 274-275). 인플루엔자 A 바이러스 감염이 한국 돼지에서 보고되었지만, H1N1 돼지 인플루엔자 바이러스 분리주의 계통발생학적 분석은 없었다.

한국공개특허 제2006-0089390호에는 돼지 인플루엔자 바이러스 A/SWINE/KOREA/S10/2004 (H1N1) 및 이의 백신이 기재되어 있으나, 본 발명의 바이러스와는 상이하다.

본 발명에서는 한국에서 돼지로부터 인플루엔자 바이러스 서브타입 H1N1, H1N2 및 H3N2의 분리 및 상기 인플루엔자 바이러스의 계통발생학적 분석을 제공함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 인플루엔자 바이러스 A/Swine/Korea/GC0503/2005(H1N1), A/Swine/Korea/GC0502/2005(H1N2) 또는 A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이러스의 사균 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 A/Swine/Korea/GC0503/2005(H1N1)(KCTC-11078BP), A/Swine/Korea/GC0502/2005(H1N2)(KCTC-11080BP) 및 A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2)(KCTC-11079BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스를 제공한다.

본 발명의 돼지 인플루엔자 바이러스는 A/Swine/Korea/GC0503/2005(H1N1), A/Swine/Korea/GC0502/2005(H1N2) 또는 A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2)이다.

A/Swine/Korea/GC0503/2005(H1N1) 인플루엔자 바이러스의 HA(Hemagglutinin) 유전자는 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하며, NA(Neuraminidase) 유전자는 서열번호 2에 기재된 염기서열을 포함하며, M(matrix) 유전자는 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하며, NP(nucleoprotein) 유전자는 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하며, NS (nonstructural) 유전자는 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하며, PA(Polymerase) 유전자는 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하며, PB1(Polymerase basic protein 1) 유전자는 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하며, PB2(Polymerase basic protein 2) 유전자는 서열번호 8에 기재된 염기서열을 포함한다.

A/Swine/Korea/GC0502/2005(H1N2) 인플루엔자 바이러스의 HA(Hemagglutinin) 유전자는 서열번호 9에 기재된 염기서열을 포함하며, NA(Neuraminidase) 유전자는 서열번호 10에 기재된 염기서열을 포함하며, NS (nonstructural) 유전자는 서열번호 11에 기재된 염기서열을 포함하며, PB1(Polymerase basic protein 1) 유전자는 서열번호 12에 기재된 염기서열을 포함하며, PB2(Polymerase basic protein 2) 유전자는 서열번호 13에 기재된 염기서열을 포함한다.

A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2) 인플루엔자 바이러스의 HA(Hemagglutinin) 유전자는 서열번호 14에 기재된 염기서열을 포함하며, NA(Neuraminidase) 유전자는 서열번호 15에 기재된 염기서열을 포함하며, M(matrix) 유전자는 서열번호 16에 기재된 염기서열을 포함하며, NS (nonstructural) 유전자는 서열번호 17에 기재된 염기서열을 포함하며, PA(Polymerase) 유전자는 서열번호 18에 기재된 염기서열을 포함하며, PB1(Polymerase basic protein 1) 유전자는 서열번호 19에 기재된 염기서 열을 포함하며, PB2(Polymerase basic protein 2) 유전자는 서열번호 20에 기재된 염기서열을 포함한다.

상기 A/Swine/Korea/GC0503/2005(H1N1) 인플루엔자 바이러스는 HA(Hemagglutinin) 유전자는 A/Swine/Iowa/17672/88(H1N1)와 유사하고, NA(Neuraminidase) 유전자는 A/Wisconsin /4754/94(H1N1)와 유사하고, M(matrix) 유전자는 A/Wisconsin/4755/94 (H1N1)와 유사하고, NP(nucleoprotein) 유전자는 A/Wisconsin/3523/1988(H1N1)와 유사하고, NS (nonstructural) 유전자는 A/Swine/Iowa/17672/88(H1N1)와 유사하고, PA(Polymerase) 유전자는 A/Swine/Wisconsin/238/97 (H1N1)와 유사하고, PB1(Polymerase basic protein 1) 유전자는 A/Wisconsin/3523/88 (H1N1)와 유사하고, PB2(Polymerase basic protein 2) 유전자는 A/Swine/Zhejiang/1/2004(H1N2)와 유사하다.

본 발명에 따른 돼지 인플루엔자 바이러스 H1N1은 한국 돼지의 비강에서 직접 분리한 것으로, 상기 바이러스는 도 1a 내지 1h에 도시한 계통발생학적 연관성을 갖는다. 도 1a 내지 도 1h 는 A/Swine/Korea/GC0503/2005(H1N1) 인플루엔자 바이러스의 계통발생학적 관련성을 각각 HA, NA, M, NP, NS, PA, PB1 및 PB2를 이용하여 분석한 것이다. 상기 계통발생학적 분석으로 상기 한국 H1N1 분리주 및 미국 유래의 H1N1 분리주가 유사하게 관련되어 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명에서 분리한 돼지 인플루엔자 바이러스는 한국 돼지에서 유행하는 바이러스 종이므로, 본 발명의 돼지 인플루엔자 바이러스에 대한 면역원성 조성물을 제조함으로써, 대부분의 돼지에서 인플루엔자 바이러스에 대한 면역을 형성시킬 수 있거나 또는 돼지를 통한 바이러스 전파 및 신종의 인플루엔자 바이러스의 생성을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 A/Swine/Korea/GC0503/2005(H1N1)(KCTC-11078BP), A/Swine/Korea/GC0502/2005(H1N2)(KCTC-11080BP) 및 A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2)(KCTC-11079BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스의 사균 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 면역원성 조성물을 제공한다.

본 발명의 면역원성 조성물은 돼지 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함한다. 본원에서 사용된, 용어 "면역원성 조성물"은 대상에게 투여된 후, 상기 대상의 면역 반응에 긍정적으로 영향을 주는 조성물을 의미하는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 면역원성 조성물은 대상에게 세포성 면역 반응, 예를들어 CTL 또는 체액성 면역 반응, 예를 들어 항체의 유발의 향상된 전신적 또는 국소적 면역 반응을 제공한다.

상기 면역원성 조성물은 사균 면역원성 조성물, 생균 면역원성 조성물, 특이 항원 추출 면역원성 조성물, 합성 면역원성 조성물 또는 유전공학 면역원성 조성물일 수 있으나, 생균 면역원성 조성물의 경우 바이러스가 독성이 있는 균주로 환원되어 증식될 수 있으므로 인플루엔자 바이러스에 대한 면역원성 조성물은 사균 면역원성 조성물 특이 항원 추출 면역원성 조성물, 합성 면역원성 조성물 또는 유전공학 면역원성 조성물이 바람직하다.

사균 면역원성 조성물은 불활화 면역원성 조성물 또는 사독 면역원성 조성물이라고도 하며, 죽은 바이러스를 포함한 면역원성 조성물이다. 이의 예로는 전 바이러스 면역원성 조성물과 분할 면역원성 조성물이 있으며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 제조가능하다. 예컨대 전 바이러스 면역원성 조성물은 바이러스 전체에 포르말린을 처리하여 제조할 수 있으며, 분할 면역원성 조성물은 바이러스에 에테르를 처리하여 외피만을 분쇄, 수득하여 제조할 수 있다.

특이항원 추출 면역원성 조성물은 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 항원 성분만을 추출하여 제조한 면역원성 조성물로, 바이러스 방어에 필요한 항원 부위에 대해서만 면역형성을 유도함으로써 부작용을 최소화할 수 있다. 예를 들면, 돼지 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 및/또는 NA 단백질을 추출하여 사용할 수 있다.

합성 면역원성 조성물은 바이러스의 항원 또는 항원결정기만을 화학적으로 합성하거나 또는 재조합 DNA 기술로 생산한 펩티드를 포함한 면역원성 조성물로, 예를 들면 돼지 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 및/또는 NA 단백질을 합성하여 사용할 수 있다.

유전공학 면역원성 조성물은 바이러스의 병원성을 일으키는 특이 유전자를 변형하거나 제거한 것일 수 있다.

본 발명의 돼지 인플루엔자 바이러스 면역원성 조성물은, 일예로 (a) 돼지 인플루엔자 바이러스를 산란계 유정란에 주입하여 증식시키고, (b) 상기 유정란으로부터 요막유강을 수득하여 여기에 포르말린, BPL(betapropiolactone) 또는 BEI(BINARYETHILIMINE)를 처리하고 및 (c) 상기 포르말린이 처리된 요막유강으로부터 사독화된 바이러스를 수득하고 이를 가금 바이러스 면역원성 조성물로 제조하는 단계를 통하여 제조될 수 있다. 각 단계의 상세 방법은 하기와 같다.

상기 (a) 단계는, 가금 인플루엔자 바이러스는 5 내지 15일령의 유정란에 주입하고, 유정란은 30 내지 40℃에서 24 내지 72시간 방치하여 바이러스의 증식을 유도한다.

상기 (b) 단계에서는 통상의 방법으로 요막유강을 수득하여 여기에 최종농도 0.005 내지 0.1 (v/w)%의 포르말린, BEI 또는 BPL을 가하고 저온에 방치하여 바이러스를 사독화시킨다.

상기 (c) 단계에서는 포르말린, BEI 또는 BPL이 처리된 요막유강을 원심분리 또는 여과를 통하여 사독화된 바이러스를 수득한다. 수득된 바이러스는 수산화알루미나 겔에 흡착시킨다.

상기한, 면역원성 조성물 제조방법은, 공지의 방법을 채택하거나 또는 일부 수정을 가하여 용이하게 실시가능하다.

또한 본 발명의 면역원성 조성물은 추가적으로 용매, 면역증강제 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 또한 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 면역증강제로는 프로인트 불완전체 또는 완전체 어드쥬번트가 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 히드록시드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트(alum)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 공지의 물질이 모두 포함될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 돼지 인플루엔자 바이러스를 375 HA 내지 1000 HA 혈구응집 단위로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 면역원성 조성물의 혈구응집 단위가 375 HA 미만인 경우, 돼지에 효과적으로 항체형성을 유도하지 못할 수 있으며, 1000 HA를 초과하는 경우, 효율 대비 비경제적일 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 비강 또는 경막외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 A/Swine/Korea/GC0503/2005(H1N1), A/Swine/Korea/GC0502/2005(H1N2) 또는 A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2)에 감염될 수 있으며, 상기 인플루엔자 바이러스를 다른 개체에 전파시킬 수 있는 모든 종류의 가금, 조류 및 사람에 사용가능하다. 그 예로는, 돼지, 닭, 오리 또는 칠면조가 있다.

면역원성 조성물의 투여량은 적용 대상의 종류, 성장 정도, 타 약물의 투여 여부 및 건강 상태에 따라 적절히 조절하여 결정할 수 있으며, 예컨대 체중 1 kg 당 15 HA 유닛 내지 60 HA 유닛으로 접종할 수 있으며 1차 접종 후 2 내지 1달 경과 후 2차 접종을 추가로 실시할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의 해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예

실시예 1: 본 발명의 돼지 인플루엔자 바이러스의 분리

2005년 1월에, 급성 호흡기 질환의 발병이 경기도에서 300 마리의 모유돈에 대해 상업적인 돼지 농장에서 발생하였다. 젖뗀 및 성장 돼지의 대부분은 전형적인 인플루엔자 임상 신호 (재치기, 기침, 및 복식 호흡)를 보여주었다. 상기 발병은 2주 내에 전체 시설에 걸쳐 진행되었다. 상기 돼지는 통상적으로 수의사의 추천에 따라 위축비염 및 마이코플라즈마 폐렴에 대해 예방접종하였다. 심한 호흡기 질환을 갖는 3마리의 45일령 돼지를 해부하였다. 전체적인 병터는 3마리 돼지에서 유사하였다.

3마리의 45일령 돼지를 돼지 인플루엔자 감염의 진단을 위해 녹십자 수의약품 연구소 (한국)로 옮기고, 비강용 면봉을 이용하여 인플루엔자 A 바이러스를 분리하여 11일령 병아리 알에 접종하였다. 요막강액을 저속 원심분리에 의해 제거하고, 3~4일 인큐베이션 후에 -70℃에 저장하였다. 인플루엔자 A 바이러스를 H1 및 H3 단특이성 항혈청 및 RT-PCR 분석 (Song et al, 2003. J. Vet. Diagn. Invest. 15, 30-34; Choi et al., 2002a. J. Vet. Diagn. Invest. 14, 62-65)을 이용한 적혈구응집억제 (HI) 시험에 의해 서브타입하였다. HI 시험을 기준 돼지 항혈청 (Iowa State University, Ames, IA의 수의 진단 실험에서 친절하게 제공)을 이용하여 수행하였다. 상기 항혈청은 H1N1 돼지 인플루엔자 바이러스 (A/Sw/IA/1979) 또 는 최근의 미국 H3N2 돼지 인플루엔자 바이러스 분리주 (A/Sw/IA/41305/1998)에 단특이적이었다. 상기 분리주에 대한 항혈청은 돼지 유래이었다. 시험을 alphamethod (즉, 가변적인 바이러스 농도 및 일정한 항체 역가) (Carbrey et al,, 1973. In: Serologic microtiter techniques for diagnostic virology, ed. Veterinary Service Diagnostic Laboratory, p.14-18. USDA/AHPIS, Ames, IA)를 이용하여 수행하였다. 상기 분리된 바이러스는 각각 A/Swine/Korea/GC0503/2005(H1N1), A/Swine/Korea/GC0502/2005(H1N2) 및 A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2)로서 명명하였으며, 이를 각각 2007년 3월 2일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자 은행에 기탁하였으며, 이의 수탁번호는 각각 KCTC-11078BP, KCTC-11080BP 및 KCTC-11079BP이다.

실시예 2: 본 발명의 인플루엔자 바이러스의 유전자 서열 분석

바이러스 RNA를 제조자의 지시에 따라 Trizol LS를 이용하여 요막강액으로부터 추출하였다. RT 및 PCR을 랜덤 헥사머 프라이머를 이용하여 표준 조건하에 수행하였다. 적혈구응집소 (HA), 뉴라미니다제 (NA), PA, PB1 및 PB2 중합효소 유전자의 증폭을 H1F (서열번호 21) 및 H1R (서열번호 22), N1F (서열번호 23) 및 N1R (서열번호 24), PAF (서열번호 25) 및 PAR (서열번호 26), PB1F (서열번호 27) 및 PB1R (서열번호 28), PB2F (서열번호 29) 및 PB2R (서열번호 30)을 이용하여 수행하였다. A/Swine/Korea/GC0503/2005의 유전자형 분석 (genotyping)을 위해, 핵단백질 (NP), 기질 (M) 및 비구조체 (NS) 유전자의 증폭 및 서열결정을 이전에 기재한 바와 같이 수행하였다 (Young Ki Choi. 2002. Virus Research 87. 173??179, Zou S. 1997. J. Clin. Microbiol. 2623-2627).

분리된 바이러스의 서열을 PAUP 규칙에 따라, 갭은 "결실된" 것으로 처리하면서 기준 바이러스의 진뱅크 서열과 비교하였다. 기준 바이러스에 대한 서열 비교를 Bioedit 소프트웨어(v.7.0; Tom Hall Ibis Therapeutics)를 이용하여 수행하였다. 개개의 인플루엔자 바이러스 서열의 정렬을 ClustalX 프로그램 (v. 1.82; Tompson)을 이용하여 생성하였다. H1N1 분리주 및 선택된 기준 바이러스 사이의 계통발생학적 관계를 tree-bisection-reconnection branch swapping 알고리즘 및 MULTITREES 옵션을 이용하는 최대 파시모니 (maximum parsimony) 방법 (PAUP 소프트웨어, v.4.0b2; David Swofford, Smithsonian Institution)을 이용함으로써 이의 뉴클레오티드 서열로부터 평가하였다.

11일령 배아 난으로부터 분리된 바이러스는 수탉 적혈구세포(RBC)를 효과적으로 응집하였다. 시료의 평균 적혈구응집 활성 역가는 1/2,048이었다. HI 시험에서, H1N1 SIV (A/Sw/IA/1979)에 단특이적인 항체는 분리주의 HA 활성을 완전히 저해한 반면, H3N2 SIV 항혈청 (A/Sw/IA/41305/1998에 대한 것)은 효과가 없었다. 이는 상기 분리주가 H1 서브타입이라는 것을 제시한다.

실시예 3: 본 발명의 인플루엔자 바이러스의 계통발생학적 특성 규명

모든 8가지 A/Swine/Korea/GC0503/2005 분리주 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대한 계통발생학적 트리를 작성하였다. 도 1은 A/Swine/Korea/GC0503/2005의 HA, NA, M, NP, NS, PA, PB1 및 PB2 유전자의 뉴클레오티드 서열의 계통발생학적 트리를 보여준다. 바이러스 사이의 진화적인 관계를 최대 파시모니 방법 (PAUP 소 프트웨어, v.4.0b2; David Swofford, Smithsonian Institution)을 이용하여 평가하였다. 수평선 거리는 분기점 사이의 뉴클레오티드 치환 수에 비례한다. HA 트리는 A/Wahan/359/95 (H3N2)에 뿌리가 있으며, NA 유전자 트리는 B/Beijing/184/93에 뿌리가 있으며, M 유전자 트리는 B/Lusuka/432/99에 뿌리가 있으며, NS 유전자 트리는 B/Beijing/184/93에 뿌리가 있다. NP, PA, PB1 및 PB2 유전자 트리는 B/Yamagata/16/88에 뿌리가 있다.

상기 계통발생학적 분석은 본원의 신규 한국 H1N1 분리주 및 미국 유래의 H1N1 분리주가 유사하게 관련되어 있다는 것을 강하게 제시한다. 하기 표 1은 A/Swine/Korea/GC0503/2005 및 진뱅크에서 유용한 기준 균주 사이의 유전적 유사성을 보여준다.

유전자 단편	Accession NO	영역	가장 높은 동일성을 갖는 바이러스	뉴클레오티드 서열 동일성 (%)	인플루엔자 바이러스 혈통
HA	U47304	345-1351	A/Swine/Iowa/17672/88(H1N1)	98.3	돼지
NA	U53166	324-1078	A/Wisconsin /4754/94(H1N1)	98.0	돼지
M	U53169	61-849	A/Wisconsin/4755/94 (H1N1)	98.9	돼지
NP	M63755	1310-1530	A/Wisconsin/3523/1988(H1N1)	97.7	돼지
NS	U49485	56-829	A/Swine/Iowa/17672/88(H1N1)	98.3	돼지
PA	DQ280258	247-773	A/Swine/Wisconsin/238/97 (H1N1)	97.2	돼지
PB1	M25934	251-628	A/Wisconsin/3523/88 (H1N1)	96.8	돼지
PB2	DQ139325	317-1086	A/Swine/Zhejiang/1/2004(H1N2)	95.5	돼지

중요하게, 한국에서 분리된 상기 H1N1 바이러스는 이의 초기 유래 농장을 벗어나 전파되지는 않는 것 같다.

같은 방식으로 H1N2와 H3N2에 대해서 계통발생학적 분석을 실시한 결과, 본발명의 한국 H1N2와 H3N2 분리주 및 미국 유래의 분리주가 유사하게 관련되어 있다는 것을 강하게 제시한다. 하기 표 2는 A/Swine/Korea/GC0502/2005(H1N2) 및 A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2) 및 진뱅크에서 유용한 기준 균주 사이의 유전적 유사성을 보여준다.

바이러스 분리주	유전자 단편	가장 높은 동일성을 갖는 바이러스	뉴클레오티드 서열 동일성(%)	Accession NO
GCVP H1N2	HA	A/SW/MN/16419/01(H1N2)	98.2	AY060050
	NA	A/SW/Korea/CY02/02(H1N2)	99.8	AY129157
	PB1	A/SW/Korea/CY02/02(H1N2)	96.0	AY129162
	PB2	A/SW/Korea/CY02/02(H1N2)	99.0	AY129163
	M	A/SW/Korea/CY02/02(H1N2)	99.5	DQ150436
	NS	A/SW/IN/14810-S/01(H1N2)	98.9	AY060136
GCVP H3N2	NA	A/SW/OK/18089/99(H3N2)	97.8	AF268140
	PB1	A/SW/IL/100085A/01 (H1N2)	99.1	AF455729
	PB2	A/WI/10/98 (H1N1)	98.9	AF342824
	PA	ASW/NC/98225/01(H1N2)	99.2	AF455716
	M	A/WI/10/98 (H1N1)	99.4	AF342818
	NS	A/SW/MN/3128/00(H1N2)	99.4	AY060132

실시예 4: 본 발명의 인플루엔자 바이러스로 감염된 돼지에서 발병 기전 및 바이러스 분포

1. 재료 및 방법

돼지 인플루엔자 바이러스:

돼지 인플루엔자 바이러스 A/Swine/Korea/GC0503/2005(H1N1), A/Swine/Korea/GC0502/2005(H1N2) 및 A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2)를 한국에서 호흡기 질환의 심각한 발병 동안 돼지로부터 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 분리하였다.

실험 설계:

HI 시험에 의해 돼지 인플루엔자 바이러스 (SIV)에 대한 혈청 음성으로서 확인된 3주된 60마리의 돼지를 H1N1, H1N2, H3N2 또는 대조군으로 동일 수로 무작위로 분배하였다. 감염군에서 15마리의 각각을 돼지 인플루엔자 바이러스 (2^nd 계대; 10⁶ TCID₅₀/ml)를 포함하는 3 ml의 배지 (DMEM, Mediatech)을 이용하여 3000rpm에 10분간 원심분리하여 상층액을 비강으로 접종하였다. 대조군의 15마리는 동일한 방식으로 비감염 세포 배양 상층액에 노출하였다.

접종 후 매일 간격으로, 동물을 임상적으로 평가하고, 비강 면봉 시료를 각 동물로부터 수득하였다. 각 그룹으로부터 3마리의 돼지를 접종 후 2, 4, 7, 14 및 21일에 죽였다. 해부하여 조직을 각 돼지로부터 수집하였다. 모든 이용된 방법은 서울대학교 실험동물관리위원회에 의해 이전에 승인을 받았다.

폐 스코어링 (Lung scoring):

폐 스코어를 형태계측학적 분석에 의해 평가하였다 (심함: 3, 적당함: 2 순함: 1, 정상: 0).

혈청학:

각 그룹의 3마리의 돼지의 혈액 시료를 0, 2, 4, 7, 14 및 21 dpi(접종 후 일수)에서 수집하였다. 혈청을 병아리 적혈구 상에 흡착하여 적혈구응집의 비특이적 저해제를 제거하였다. 혈청을 A/Swine/Korea/GC0503/2005 및 A/Swine/Korea/GC0407/2005에 대한 HI 시험에서 조사하였다. HI 시험은 표준 절차에 따라 수행하였다.

2. 결과

H1N1 그룹은 형태계측학적 분석에서 가장 높은 스코어를 나타내었다. H1N2 및 H3N2 그룹도 또한 폐에서 명백한 병원성 신호가 있었다 (도 2 참고). 도 2는 각 그룹의 돼지 인플루엔자 바이러스 (Swine influenza virus: SIV)의 접종 후 시간에 따른 병원성의 변화를 폐 스코어링 값으로 나타낸 도면이다.

돼지 인플루엔자 바이러스 (SIV) 배출은 DPI 2에서 DPI 5 까지 계속되었다 (표 3 참고). 표 3은 비강 면봉으로 채취된 시료를 주형으로 한 RT-PCR을 통하여, 돼지 인플루엔자 바이러스가 배출되는지를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

비강 면봉에 대한 RT-PCR 결과

DPI	대조군	H1N1	H1N2	H3N2
1	0/5	0/5	0/5	0/5
2	0/5	0/5	1/5	1/5
3	0/3	3/5	4/5	1/5
4	0/5	2/5	2/5	2/5
5	0/5	4/5	4/5	3/5
6	0/5	0/5	0/5	0/5
7	0/5	0/5	0/5	0/5

본원에서 분리된 돼지 인플루엔자 바이러스에 대하여 HI 실험을 수행하였다, 그 결과 측정된 평균 HI 역가는 하기 표 4 및 표 5에 나타낸 바와 같다.

H3 항원을 이용한 HI 시험

DPI	대조군	H1N1 그룹	H1N2 그룹	H3N2 그룹
0	10×2³	10×2³	10×2³	10×2³
2	10×2²	10×2^2.41	10×2²	10×2²
4	10×2^1.42	10×2^1.74	10×2^1.42	10×2^2.41
7	10×2^1.74	10×2^2.41	10×2^1.74	10×2²
14	10×2^1.74	10×2³	10×2²	10×2^3.42
21	10×2¹	10×2¹	10×2¹	10×2⁴

H1 항원을 이용한 HI 시험

DPI	대조군	H1N1 그룹	H1N2 그룹	H3N2 그룹
0	10×2^2.49	10×2^2.49	10×2^2.49	10×2^2.49
2	10×2²	10×2^1.74	10×2^1.42	10×2^1.42
4	10×2^1.42	10×2^0.41	10×2^0.41	10×2²
7	10×2^1.42	10×2¹	10×2^0.41	10×2^1.74
14	10×2¹	10×2^2.22	10×2^1.42	10×2^2.41
21	0	10×2^2.87	0	10×2^-0.58

표 4 및 표 5에 나타낸 바와 같이, H1N1 그룹은 H1형 항원에 대한 항체를 형성하였고, H3N2 그룹은 H3형 항원에 대한 항체를 형성하였다.

상기 결과로부터 한국에서 분리된 돼지 인플루엔자 바이러스 서브타입 H1N1, H1N2 및 H3N2가 심각한 폐렴을 야기하는 독성 병원균이라는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 한국에서 3가지 서브타입 돼지 인플루엔자 바이러스는 상기 바이러스에 대한 감염의 제어 및 예방을 위한 면역원성 조성물을 제조하는데 사용될 수있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 신종의 돼지 인플루엔자 바이러스를 제공하여, 돼지를 인플루엔자 바이러스에 대한 면역을 효과적으로 형성시킬 수 있으며, 따라서 돼지 농장에서의 인플루엔자 바이러스에 의한 질환 발병을 현저히 감소시켜 경제적인 손실을 방지할 수 있다.

<110> Green Cross Verterinary Products Co., Ltd <120> Influenza virus and immunogenic composition comprising the same <130> PN073935 <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 665 <212> DNA <213> A/Swine/Korea/GC0503/2005(H1N1) <400> 1 gctcagtgtc atcatttgaa agatttgaga tattccccaa ggcaagttcc tggcccaatc 60 atgaaacgaa cagaggtgtg acggcagcat gtccttatgc tggagcaaac agcttctaca 120 gaaatttaat atggctggta aaaaaagaga attcataccc aaagctcagc aaatcctata 180 ttaacaataa ggagaaggaa gtcctcgtgc tatggggcat tcaccatcca cctaccagta 240 ctgaccaaca aagtctctac cagaatgcag atgcctatgt ttttgtgggg tcatcaaaat 300 acaacaagaa attcaagcca gaaatagcaa caagacccaa ggtgaggggt caagcaggga 360 gaatgaacta ttactggaca ctagtagagc ctggagacac aataacattc gaagcaactg 420 gaaatctagt ggtaccaaga tatgccttcg caatgaaaag aggttctgga tccggtatta 480 tcatttcaga tacatcagtc cacgattgta atgcgacttg tcaaacaccc aaaggtgcta 540 taaacaccag ccttccattt cagaatatac atccagtcac aattggagaa tgtccaaaat 600 atgtcaaaag cacaaaattg agaatggcta caggattaag gaatatcccg 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cagagacttg aagacgtttt 60 tgcagggaaa aacaccgatc ttgaggcact catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 120 gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 180 aggactgcag cgtagacgct ttgtccagaa tgccctcaat gggaatggtg acccgaacaa 240 catggacaaa gcggtcaaac tgtacaggaa acttaaaagg gaaataacat tccatggggc 300 caaagaagta tcgctcagtt actctgctgg tgcacttgcc agttgcatgg gcctcatata 360 caacagaatg gggactgtca ccactgaggt ggcctttggt ctagtatgtg caacctgtga 420 acagattgct gattcccagc atcgatctca tagacaaatg gtgacaacaa ccaatccact 480 aatcaggcat gagaacagaa tggtattagc cagcacaaca gctaaagcca tggaacaaat 540 ggctggatca agcgaacaag cagcagaggc tatggaggtt gccagccagg ctagacaaat 600 ggtacaggca atgagaacaa ttgggactca ccctagttcc agcgctggtc taaaagatga 660 tcttcttgaa aatttacagg cctatcagaa acgaatggga gtgcaaatgc aacgattcaa 720 gtgatcctct aattgctgcc gcaagcatca ttgggatttt gcacctgata ttgtggattc 780 ttgatcgtc 789 <210> 4 <211> 221 <212> DNA <213> A/Swine/Korea/GC0503/2005(H1N1) <400> 4 gagcatccgt tatggcagct ttcagcggga acaatgaggg 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tgtccacttc agaaatcaag 120 ttaaaataag aaggagagtt gacacaaacc ctggtcacgc agatctcagt gccaaggagg 180 cacaggatgt gatcatggaa gttgttttcc caaatgaagt gggggcaaga atactgacat 240 cagagtcaca gctgacaata acaaaggaga agaaagaaga gctccaggat tgtaaaattg 300 ctcccttgat ggtggcatac atgctagaaa gagagttggt ccgtaaaacg aggtttctcc 360 cggtggctgg tggaacaggc agtatttata ttgaggtgct gcacttaact caggggacat 420 gctgggagca aatgtacact ccaggaggag aagtgagaaa tgatgatgtt gaccaaagtt 480 tgattatcgc tgctagaaac atagtaagaa gagcagcagt gtcagcagac ccattagcat 540 ctctcttgga aatgtgccac agcacacaga ttggaggaat aaggatggta gacatcctta 600 gacagaatcc aacggaggaa caagccgtag acatatgcaa ggcagcaatg gggctgagga 660 ttagctcctc tttcagcttt ggtgggttca ctttcaaaag aacaagcgga tcatcagtta 720 agaaagaaga agaagtgctc acgggcaacc tccaaacact gaaaataaga gtacatgaag 780 gatatgaaga a 791 <210> 14 <211> 206 <212> DNA <213> A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2) <400> 14 gctcactaat gaggtcggat gcacccattg acaactgcaa ttctgaatgc attactccaa 60 gtggaagcat tcccaatgac aaaccttttc aaaatgtaaa caggatcaca tatggggcct 120 gtcccagata tgttaagcaa aacactctga aattggcaac agggatgcgg aatgtaccag 180 agaaacaaac tagaggccat attcgg 206 <210> 15 <211> 457 <212> DNA <213> A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2) <400> 15 aggaagtgct cagcatgtcg aggagtgctc ttgttatcct agatatcccg gtgtcagatg 60 tgtctgcaga gacaactgga aaggctccaa taggcccatt gtagatataa atgtaaagga 120 ttatagcatt gtttccagtt atgtgtgctc aggacttgtt ggagacacac ccagaaaaaa 180 agacagatcc agcagtagca attgcctgaa tcctaacaat gaggaagggg gtcatggagt 240 gaaaggctgg gcctttgatg atggaaatga cgtgtggatg gggagaacga tcaacgagaa 300 gttacgctca ggttatgaaa ccttcagagt cattgatggc tggtccaaac ctaactccaa 360 attgcagata aataggcaag tcatagttga cagagatgat aggtccggtt attctggtat 420 tttctctgtt gaaggtaaaa gctgcatcaa tcggtgc 457 <210> 16 <211> 830 <212> DNA <213> A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2) <400> 16 ttgaggctct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct gtcacctctg actaagggga 60 ttttagggtt tgtgtttacg ctcaccgtgc ccagtgagcg aggactgcag cgtagacgtt 120 ttgtccagaa tgccctcaat gggaatggtg 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aggaagaggc 120 aacacccttg gcctcgacat cgaaacagcc actcttgttg ggaaacaaat tgtggagtgg 180 a 181 <210> 18 <211> 827 <212> DNA <213> A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2) <400> 18 agaatcaaaa ccaggctttt caccataagg caagaaatgg ccagtagggg tctatgggat 60 tcctttcgtc aatccgagag aggcgaagag acaattgaag aaagatttga aattacagga 120 accatgcgca ggcttgccga ccaaagtctc ccaccgaatt tctccagcct tgaaaacttt 180 agagcctatg tagatggatt cgaaccgaac ggctgcattg agggcaagct ttctcaaatg 240 tcaaaagaag tgagcgccaa aattgaacca ttcttgaaga caacaccacg ccccctcaga 300 ttgcctgatg ggcctccttg ctctcagcgg tcaaagttct tgctgatgga tgctctgaaa 360 ctaagtattg aagacccgag tcatgagggg gaagggatac cactatatga tgcaatcaaa 420 tgcataaaga cattttttgg ctggaaagag cctaacataa tcaaaccaca tgagaaaggc 480 ataaacccca attacctcct ggcttggaag caggtgctag cagagctcca agacattgaa 540 aatggagaga agatcccaaa aacaaagaac atgaagagaa caagccaatt gaagtgggca 600 ctcggtgaga atatggcacc agagaaagta gactttgatg actgcaaaga tgttggtgat 660 cttaaacagt atgacagcga tgagccagag cccagatctc tagcaagctg ggtccaaaat 720 gaattcaata aggcatgtga attgaccgat tcaagctgga tagaacttga tgagatagga 780 gaagatgttg ccccgattga accacatcgc aagcatgagg aggaatt 827 <210> 19 <211> 597 <212> DNA <213> A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2) <400> 19 acagtgggtt gccaacagac tgtgttctgg aggccatggc tttccttgaa gaatcccacc 60 cagggatatt tgagaattca tgccttgaaa caatggaagt tgttcaacaa acaagggtgg 120 ataaactaac tcaaggtcgc cagacttatg attggacatt aaacagaaat caaccggcag 180 caactgcatt ggccaacacc atagaagttt ttagatcaaa tggtctaaca gctaatgagt 240 caggaaggct aatagatttc ctaaaggatg taatggaatc aatggataaa gaggaaatag 300 agataacaac acactttcaa agaaaaagga gagtaagaga caacatgacc aagaagatgg 360 tcacacaaag aacaataggg aagaaaaaac aaagagtgac taagagaggt tatctaataa 420 gagcactgac attgaatacg atgaccaaag atgcagagag aggcaaatta aaaagaaggg 480 ctatcgcaac acctgggatg caaattagag ggttcgtgta ctttgttgaa actttagcta 540 ggagcatttg cgaaaagctt gagcagtctg gactcccagt agggggcaat gaaagaa 597 <210> 20 <211> 350 <212> DNA <213> A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2) <400> 20 ggatgttatc atggaagttg ttttcccaaa tgaagtgggg gcaagaatac tgacatcaga 60 gtcacagctg acaataacaa gagagaagaa agaagagctc caggattgta aaattgctcc 120 tttgatggtg gcatacatgc tagaaagaga gttggtccgt aaaacgaggt ttctcccggt 180 ggctggtgga acaggcagtg tttatattga ggtgctgcac ttaacccagg ggacatgctg 240 ggagcagatg tacactccag gaggagaagt gagaaatgat gatcttgacc aaagtttgat 300 tatcgctgct agaaacatag taagaagagc agcagtgtca gcagacccat 350 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for HA <400> 21 gggacatgtt acccaggaga t 21 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for HA <400> 22 gcattgtatg tccaaatatc ca 22 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for NA <400> 23 cttggtcagc aagtgcat 18 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for NA <400> 24 cattaggatc ccaaatcatc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PA <400> 25 agcggactac 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Claims

인플루엔자 바이러스 A/Swine/Korea/GC0502/2005(H1N2)(KCTC-11080BP) 및 A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2)(KCTC-11079BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스.
인플루엔자 바이러스 A/Swine/Korea/GC0502/2005(H1N2)(KCTC-11080BP) 및 A/Swine/Korea/GC0407/2005(H3N2)(KCTC-11079BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스의 사균 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 면역원성 조성물.
제2항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 돼지 또는 사람에 적용되는 것인 면역원성 조성물.