CN102899294B - 一种h1n1型猪流感病毒疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种H1N1型猪流感病毒疫苗株，其分类命名为猪甲型流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011(H1N1)，微生物保藏号为：CCTCC NO：V201218。本发明进行了H1N1猪流感病毒毒株的分离鉴定、全基因序列测定，并用H1N1猪流感病毒毒株制成预防猪流感的灭活疫苗。本发明毒株制备的H1N1猪流感病毒灭活疫苗对同源强毒攻毒的猪可以提供很好的保护，具有良好的免疫原性，不论单苗或联苗，均可有效预防H1N1型猪流感。

Description

一种H1N1型猪流感病毒疫苗株及其应用

技术领域

 本发明涉及动物病毒学领域，具体涉及一种H1N1型猪流感病毒疫苗株及其在制备预防或治疗猪流感药物中的应用。

背景技术

 猪流感病毒（Swine influenza Virus，SIV）属于正粘病毒科A型流感病毒，可引起猪急性、热性、群发性和高度接触性呼吸道疾病，表现为突发高热，精神沉郁，食欲废绝，呼吸困难，阵发性咳嗽等症状。虽然单一的猪流感病死亡率不高，病猪可迅速康复，但其多与其它疫病，如蓝耳病、传染性胸膜肺炎、猪链球菌病等并发或继发感染，使病情复杂化、严重化，导致猪死亡率急剧上升，造成严重的经济损失。另外，猪体可充当人流感和禽流感病毒的“混合器”，是造成流感大流行的潜在因素，因此，及时抑制猪流感病毒的传播具有重要的公共卫生意义。

近年来，国内关于发生猪流感的消息时有报道，2001年7月以来，我国浙江、山东、江苏、安徽、湖北等省市发生了猪的“无名高热病”，最终证实了此次病原含有猪流感病毒（SIV）和猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV），此次猪流感的流行范围广，损失严重。2002年6-10月，安徽省大部分地区暴发了猪流感，全省发病猪达300万头，直接损失达亿元。2009年3月起始于墨西哥的H1N1 亚型流感疫情, 再次证实猪流感病毒在人类流感研究和控制中具有重要地位。现有技术中的猪流感病毒疫苗株的免疫原性和反应原性不能满足要求，采用现有疫苗株制备的疫苗产生的抗体水平不高，抗体持续期不长，不能有效抵抗目前流行的毒株的攻毒。

发明内容

本发明目的是提供一种H1N1型猪流感病毒疫苗株，该疫苗株具有良好的免疫原性和反应原性，采用该毒株制备的疫苗免疫后能够产生较高水平的抗体，抗体持续期长，并且能够抵抗同源毒株的攻毒。

本发明提供一种H1N1型猪流感病毒疫苗株，该疫苗株的分类命名为：猪甲型流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011(H1N1) ，微生物保藏号为：CCTCC NO:V201218，

保藏时间：2012年6月6日

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心 CCTCC

保藏编号：CCTCC NO：V201218

保藏单位地址：中国武汉大学。

本发明目的之二是提供上述H1N1型猪流感病毒疫苗株在制备预防或治疗猪流感药物中的应用，将上述疫苗株应用于预防或治疗H1N1型猪流感。

本发明目的之三是提供一种预防猪流感的疫苗组合物。所述预防猪流感的疫苗组合物由所述H1N1型猪流感病毒疫苗株和药学上可接受的载体或辅料组成。

本H1N1型猪流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011株具有很好的免疫原性和反应原性。采用该毒株制备的疫苗免疫后能够产生较高水平的抗体，抗体持续期长，并且能够抵抗同源毒株的攻毒。本毒株制备的H1N1猪流感病毒灭活疫苗对同源强毒攻毒的猪可以提供很好的保护，具有良好的免疫原性，不论单苗或联苗，均可有效预防H1N1型猪流感。

附图说明

图1为HA基因的系统进化树；

图2为NA基因的系统进化树；

图3为PB2基因的系统进化树；

图4为PB1基因的系统进化树；

图5为PA基因的系统进化树；

图6为NP基因的系统进化树；

图7为M基因的系统进化树；

图8为NS基因的系统进化树；

图9为免疫动物在H1N1亚型强毒攻击后动物体温变化曲线；

图10为疫苗免疫动物后血凝抑制抗体效价增长曲线。

具体实施方式

    下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。

实施例1猪甲型流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011(H1N1)株的分离纯化和鉴定

1. 病毒的分离与鸡胚尿囊液的收获

取感染猪的肺脏组织加入适量的灭菌生理盐水研磨成匀浆，反复冻融3次，8000转/分钟离心10分钟，弃去上层脂肪，吸取中间液体。在中间液体中加入终浓度为1000单位/ml的青霉素和1000单位/ml的链霉素4℃处理1小时，然后8000转/分钟离心10分钟，取上清液。将上清液经尿囊腔接种9-11日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，置孵化器中培养72小时。每天观察两次，去除24小时内的污染胚，收取其余鸡胚的尿囊液。

2. 有限稀释法纯化

将步骤1收获的鸡胚尿囊液以10倍比梯度依次稀释成10^-1～10^-9系列浓度，取各稀释度的尿囊液分别通过尿囊腔接种9-11日龄的SPF鸡胚。接种后鸡胚的培养方法、尿囊液收获方法同步骤1。收获尿囊液通过鸡红细胞凝集(HA)试验检测是否含有SIV。取含有SIV的最高稀释度的鸡胚尿囊液接种SPF鸡胚后收获的尿囊液，按照有限稀释法连续传代3次进行纯化，最终获得纯化的病毒。

鸡红细胞凝集价的测定(HA)试验（参考常规微量法进行）：取洁净的“V”型96孔反应板，每孔加入25μl生理盐水，吸取25μl待检鸡胚尿囊液于第1孔内，充分混匀后吸25μl于第2孔，依次倍比稀释至第11孔，弃去25μl，第12孔作为生理盐水对照孔。然后每孔加入1%鸡红细胞悬液25ul，在微量振荡器上摇匀，室温静置20min后观察结果。

3. 病毒的鉴定

(1)鸡胚半数感染量（EID₅₀）的测定

取步骤2得到的纯化病毒接种SPF鸡胚后获得的尿囊液，分别用灭菌生理盐水作10^-3～10^-8的10倍比稀释，每个稀释度接种SPF鸡胚5枚，0.1ml/胚；同时设空白对照胚3枚，每枚鸡胚接种生理盐水0.1ml。接种后，置35～37℃孵育96h，收集尿囊液，死胚及时置4℃冰箱保存。逐枚测定对0.5% 鸡红细胞的凝集价, 有效价者判为感染, 无效价者判为阴性。最后按照Reed-Muench法计算病毒的EID₅₀＝高于50%感染病毒稀释度的对数+(高于50%感染百分数-50)/(高于50%感染百分数-低于 50%感染百分数)。

结果显示：纯化病毒在SPF鸡胚中生长良好，对0.5%的鸡红血球具有血凝性，经5次传代培养，血凝效价最终稳定在8㏒2，72h内不引起鸡胚死亡。

EID₅₀测定结果见表1，通过计算得到病毒的EID₅₀为10^-6.32/0.1ml。

 (2) 纯化病毒对小鼠的感染实验

取纯化病毒接种后获得的鸡胚尿囊液，经滴鼻、点眼的途径感染ICR小鼠，接种病毒量为每只10^5.32 EID₅₀。共接种15只, 另设3只对照。每天观察小鼠并记录死亡情况，观察14d, 剖杀所有试验小鼠, 检查病理变化。

实验结果显示，纯化病毒感染15-20g小白鼠(ICR系) 后，可引起精神不振、不愿运动、嗜睡, 部分皮毛松乱等临床症状。感染后5-8天，有5只小鼠死亡。14d后剖检所有小鼠均可见肺炎病变。取其肺组织按常规处理后接种9日龄鸡胚, 能重新分离到H1N1亚型流感病毒。而对照组的小鼠没有任何临床症状。

(3) 纯化病毒对猪的感染实验

将10头4-5周龄猪流感H1N1亚型抗体阴性健康断奶仔猪分为二组：一组为攻毒组，5头猪，气管注射接种纯化病毒，接种病毒量为3×10^7.32 EID₅₀/头；另一组为对照组，5头猪，气管注射PBS缓冲液。从攻毒后当天起5天内，每头猪每天下午定时测直肠温度，观察临床症状，填写《日观察记录表》，直肠温度≥40℃视为发烧。攻毒后5天剖杀所有实验猪，观察肺部病变。

猪经纯化病毒感染试验后，2-3天出现体温升高(体温为40.0℃-40.7℃), 部分猪出现轻微减食,偶尔咳嗽和轻微气喘现象；4-5天体温恢复正常。感染后5天后剖杀所有试验猪, 所有感染猪的肺部均有程度不一的病理变化, 病变区域为深紫色牛肉样实变, 呈斑块状或点状。

以上对小鼠和猪的感染实验说明了该毒株具有较强的致病力，预示着以其作为抗原制备的疫苗具有较好的免疫原性和反应原性。

实施例2  纯化病毒全基因组序列的测定

1. RT-PCR引物的合成

参考Genbank上已发表的SIV序列资料，设计并合成了随机引物Unil2和SIV基因组8个基因片段（PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、NS、M）的RT-PCR引物（见表2），均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。其中上游引物PB2-F和下游引物PB2-R用于扩增PB2片段；上游引物PB1-F和下游引物 PB1-R用于扩增PB1片段；上游引物PA-F和下游引物PA-R用于扩增PA-R片段；上游引物NP-F和下游引物NP-R用于扩增NP片段；上游引物NS-F和下游引物NS-R用于扩增NS片段；上游引物M-F和下游引物M-R用于扩增M片段；上游引物HA-F和下游引物HA-R用于扩增HA片段；上游引物NA-F和下游引物NA-R用于扩增NA片段。

2. 纯化病毒RNA的提取

以含纯化病毒的鸡胚尿囊液为RNA提取的材料，按照Trizol试剂盒（购自Invetragen）说明书提取纯化病毒的RNA。

3. 八个基因片段的RT-PCR

反转录体系：2μl随机引物Unil2, 5μl M-MLV Buffer，0.5μl M-MLV Reverase（购自TAKARA公司），2μl dNTP(10mMol/L) （购自TAKARA公司），0.5μl RNase inhibitor（购自TAKARA公司），15μl RNA。反应条件：42℃反应60min；95℃反应5min。

PCR反应体系：5μl 10×buffer，2μl dNTP(2.5mMol/L)，2μl MgCl₂，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，0.5μl EX Taq，10μl DEPC水，5μl cDNA。反应条件： 95℃预变性5min； 30个循环：95℃ 1min，52℃ 1min, 72℃延伸1-4min（各片段延伸时间见表3）；最后72℃延伸10min。dNTP(2.5mMol/L)、 MgCl₂和EX Taq均购自TAKARA公司。

4. 扩增产物的回收纯化

将步骤3得到的RT-PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，按Gel Extraction Kit的说明回收和纯化扩增产物。

5. 基因的克隆及酶切鉴定

RT-PCR产物经回收纯化后与pMD18-T 载体(TAKARA公司) 按照试剂盒说明书连接并转化到Trans 5α感受态细胞(TAKARA公司)。挑取在含有300 μg /ml氨苄的LB培养基上生长的白色菌落，37℃摇床过夜培养，提取质粒。将提取的质粒通过电泳与空质粒的大小相比较初步鉴定，阳性者用限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切鉴定（均购自TAKARA公司）。酶切体系为20μl：质粒8μl，DEPC水8μl，10×Buffer T 2μl，HindⅢ和XbaⅠ各1μl，37℃水浴2h。

6. 八个基因片段的序列测定及分析

每个片段取经质粒双酶切鉴定为阳性的克隆菌，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。使用DNAstar软件包进行序列的分析。使用MegAlign程序中的Clustal W方法比较序列的同源性并绘制系统进化树。各结果如下：

（1） 各基因的长度、蛋白编码情况以及系统进化分析所使用的核酸范围见表4。

(2) 实验毒株全基因的进化树

在GenBank中检索具有代表性的14株A 型流感病毒H1N1亚型已知的序列,通过MegAlign程序中的Clustal W方法与该猪流感毒株的全基因序列进行同源性比较，绘制出的系统进化树（图1-图8）表明，该猪流感毒株的8个基因片段均与09年的H1N1型猪流感病毒A/California/04/2009(H1N1)株高度同源，处在同一分支，而与人流感标准株A/Puerto_Rico/8/34(H1N1)和禽流感标准株A/duck/Australia/749/1980(H1N1)的亲缘性较远。其中HA基因的核苷酸和氨基酸与09年的H1N1型猪流感病毒A/California/04/2009(H1N1)株的核苷酸和氨基酸同源性分别为 98.9%和 97.9%。因此，本发明纯化病毒为H1N1型猪流感毒，命名为猪甲型流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011(H1N1)，并提交保藏。

实施例3  H1N1猪流感病毒灭活疫苗的制备及其保护效力实验

1. 材料与方法

（1）主要试剂

埃索白油Marcol 52购自南京天邦生物科技有限公司，批号：vg4552975P。

Tween-80 CRILLET 4，购自新加坡CRODA公司，批号：15448

Span-80 CRILL 4，购自新加坡CRODA公司，批号：15438

（2）试验猪

十头H1N1亚型猪流感抗体阴性（HI）健康的30-40日龄断奶仔猪，由江苏洪泽某猪场提供。

（3）抗原制备

将含有H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011株的鸡胚尿囊液稀释1000倍后按0.1ml/枚接种9-11日龄SPF或非免鸡胚，弃去24小时内死亡鸡胚，72-96h后置4℃过夜，无菌收获尿囊液，按《中华人民共和国兽药典》（2005年版，三部）附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长，每毫升尿囊液病毒含量不低于106 EID50。在尿囊液中加入分析纯甲醛，甲醛终浓度为0.1%（体积浓度），经37℃灭活16 h，获得灭活病毒液。灭活病毒液接种SPF鸡胚进行HA、EID₅₀测定。同时作无菌检验。

（4）灭活疫苗制备

灭活病毒液按照《中华人民共和国兽药典》（2005年版，三部）附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。符合要求后，将96体积份数的灭活病毒液与4体积份数的Tween-80混合作为水相，将94体积份数的埃索白油Marcol 52与6体积份数的Span-80混合均匀作为油相。将3体积份数的油相与1体积份数的水相混合，高速乳化3min后，分装、加塞、压盖，置2-8℃冰箱保存备用。  

（5）免疫接种与攻毒

将10头30-40日龄猪流感H1N1亚型抗体阴性健康断奶仔猪分为二组：一组为免疫组，5头猪，颈部肌肉接种以上制备的H1N1型猪流感灭活疫苗，2ml/头（10^7.32EID₅₀/头），首免后4周后进行二免，2ml/头（10^7.32EID₅₀/头）。另一组设5头猪，不免，作为对照组。免疫组二免后3周，用H1N1型猪流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011株（本发明分离的）含量为10^6.4EID₅₀毒液气管注射进行攻击，对照组按照同样方法进行攻毒。

（6）体温测定

从攻毒当天开始到攻毒后第5天每天记录实验猪的直肠体温，直肠温度≥40℃视为发烧。

（7）抗体检测与剖检

从首免开始每周对所有实验猪进行前腔静脉采血，分离血清，按胰酶－加热－高碘酸钾法处理后，测定HI抗体变化。攻毒后5天每组随机剖杀2头猪进行剖检。

血清处理：胰酶－加热－高碘酸钾法处理：加1/2体积胰酶溶液于１体积的血清中，56℃灭活30min，冷却至室温，加3倍体积0.011mol/L高碘酸钾混匀，室温孵育15min，加3倍体积1%丙三醇盐溶液，室温孵育15min，加2.5倍体积0.85%生理盐水并混合（血清终浓度为1:10）。

HI测定方法：按常规微量法进行，根据血凝(HA)价配制8个HA单位和4个HA单位的病毒稀释液 （H1型猪流感标准抗原购自哈尔滨兽医研究所）。在微量反应板的第1孔加入25μl 8单位抗原，第2-11孔加入25μl 4单位抗原，第12孔加入25μl生理盐水。吸取25μl待检血清于第1孔内，充分混匀后吸25μl于第2孔，稀释至第10孔，弃去25μl，第11孔为抗原(病毒)对照孔，第12孔作为生理盐水对照孔，37℃下作用30min，每孔加入1%鸡红细胞悬液25μl，在微量振荡器上摇匀，室温静置30min后观察结果。以出现50%抑制红细胞凝聚的血清最大稀释度作为该血清的HI价。若抗体滴度超过10孔后，按相同方法继续稀释测定

２. 结果与分析

从图9曲线可看出，免疫猪在H1N1亚型强毒攻击后的第1、4天，对照组实验猪的直肠温度均在40℃以上，而免疫组只有1头实验猪的直肠温度在攻毒当天上升到40.0℃，随即下降到39.4℃，其余免疫组实验猪的直肠温度在实验期间均未达到40℃。

从图10曲线可看出，A/Swine/Nanjing/50/2011（H1N1）灭活疫苗首免14天后可检测到HI抗体，均值为1.0log2，二免后14d抗体水平最高，均值达7.6log2，随后抗体维持在较高水平缓慢下降。免疫组经二次免疫后，攻毒时血凝抗体效价可达到7.3log2，并在攻毒后仍保持在较高水平。

攻毒感染后第5天剖杀部分试验猪, 对照组实验猪的肺部均有程度不一的病理变化, 病变区

域为深紫色牛肉样实变斑块或出血点,气管中粘性液体较多，腹股沟淋巴结轻度水肿；免疫组未发现肺部有明显病变。

采用本实施例制备的灭活疫苗，按照4ml/头的剂量免疫猪只进行安全性实验，未见发生全身不良反应或明显的局部反应。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏省农业科学院

 

<120>  一种H1N1型猪流感病毒疫苗株及其应用

 

<130>  20120813

 

<160>  25   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  14

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  HA-F

 

<400>  1

agcaaaagca gggg                                                       14

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  HA-R

 

<400>  2

agtagaaaca agggtgtttt                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  15

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  M-F

 

<400>  3

agcaaaagca ggtag                                                      15

 

 

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  M-R

 

<400>  4

agtagaaaca aggtagtttt t                                               21

 

 

<210>  5

<211>  15

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  NA-F

 

<400>  5

agcaaaagca ggagt                                                      15

 

 

<210>  6

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  NA-R

 

<400>  6

agtagaaaca aggagttttt t                                               21

 

 

<210>  7

<211>  15

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  NP-F

 

<400>  7

agcaaaagca gggta                                                      15

 

 

<210>  8

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  NP-R

 

<400>  8

agtagaaaca agggtatttt t                                               21

 

 

<210>  9

<211>  15

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  NS-F

 

<400>  9

agcaaaagca gggtg                                                      15

 

 

<210>  10

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  NS-R

 

<400>  10

agtagaaaca agggtgtttt                                                 20

 

 

<210>  11

<211>  15

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  PA-F

 

<400>  11

agcgaaagca ggtac                                                      15

 

 

<210>  12

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  PA-R

 

<400>  12

agtagaaaca aggtactt                                                   18

 

 

<210>  13

<211>  14

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  PB1-F

 

<400>  13

agcgaaagca ggca                                                       14

 

 

<210>  14

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  PB1-R

 

<400>  14

agtagaaaca aggcattt                                                   18

 

 

<210>  15

<211>  14

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  PB2-F

 

<400>  15

agcgaaagca ggtc                                                       14

 

 

<210>  16

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  PB2-R

 

<400>  16

agtagaaaca aggtcgttt                                                  19

 

 

<210>  17

<211>  12

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  Unil2

 

<400>  17

agcaaaagca gg                                                         12

 

 

<210>  18

<211>  1777

<212>  DNA

<213>  H1N1型猪流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011株

 

<400>  18

agcaaaagca ggggaaaaca aaagcaacaa aaatgaaggc aatactagta gttctgctat     60

 

atacatttgc aaccgcaaat gcagacacat tatgtatagg ttatcatgcg aacaattcaa    120

 

cagacactgt agacacagta ctagaaaaga atgtaacagt gacacactct gttaaccttc    180

 

tagaagacaa gcataacggg aaactatgca aactaagagg ggtagcccca ttgcatttgg    240

 

gtaaatgtaa cattgctggc tggatcctgg gaaatccaga gtgtgaatca ctctccacag    300

 

caagctcatg gtcctacatt gtggaaacat ctagttcaga caatggagcg tgttacccag    360

 

gagatttcat tgattatgag gagctaagag agcaattgag ctcagtgtca tcatttgaaa    420

 

ggtttgagat attccccaag acaagttcat ggcccaatca tgacccgaac aaaggtgtaa    480

 

cggcagcatg tcctcatgct ggagcaaaaa gcttctacaa aaatttaata tggctagtta    540

 

aaaaagaaaa ttcataccca aagctcagca aatcctacat taatgataaa gggaaagaag    600

 

tcctcgtgct atggggcatt caccatccat ctactagtgc tgaccaacaa agtatctatc    660

 

agaatgcaga tgcatatgtt tttgtgggga catcaagata cagcaagaag ttcaagccgg    720

 

aaatagcaag aagacccaaa gtgagggatc aagaagggag aatgaactat tactggacac    780

 

tagtagagcc gggaggcaaa ataacattcg aagcaactgg aaatctagtg gtaccgagat    840

 

atgcattcgc aatggaaaga aatgctggat ctggtattat catttcagat acaccagtcc    900

 

acgattgcaa tacaacttgt cagacaacca agggtgctat aaacaccagc ctcccatttc    960

 

agaatataca tccgatcaca attggaaaat gtccaaaata tgtaaaaagc acaaaattga   1020

 

gactggccac aggattgagg aatgtcccgt ctattcaatc tagaggccta tttggggcca   1080

 

ttgccggttt cattgaaggg gggtggacag ggatggtaga tggatggtac ggttatcacc   1140

 

atcaaaatga acaggggtca ggatatgcag ccgacctgaa gagcacacag aatgccattg   1200

 

acgagattac taacaaagta aattctgtta ttgaaaagat gaatacacag ttcacagcag   1260

 

taggtaaaga gttcaaccac ctggaaaaaa gaatagagaa tttaaataaa aaagttgatg   1320

 

atggtttcct ggacatttgg acttacaatg ccgaactgtt ggttctattg gaaaatgaaa   1380

 

gaactttgga ctaccacgat tcaaatgtga agaacttata tgaaaaggta agaagccagt   1440

 

taaaaaacaa tgccaaggaa attggaaatg gctgcttcga attttaccac aaatgcgata   1500

 

acacgtgcat ggaaagtgtc aaaaatggga cttatgacta cccaaaatac tcagaggaag   1560

 

caaaattaaa cagagaagaa atagatgggg taaagctgga atcaacaagg atttaccaga   1620

 

ttttggcgat ctattcaact gtcgccagtt cattggtact agtagtctcc ctgggggcaa   1680

 

tcagtttctg gatgtgctct aatgggtctc tacagtgtag aatatgtatt taacattagg   1740

 

atttcagaag catgagaaaa acacccttgt ttctact                            1777

 

 

<210>  19

<211>  1027

<212>  DNA

<213>  H1N1型猪流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011株

 

<400>  19

agcaaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct     60

 

ttctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgcg cagagactgg aaagtgtctt    120

 

tgcaggaaag aacacagatc ttgaggctct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatctt    180

 

gtcacctctg actaagggaa ttttaggatt tgtgtttacg ctcaccgtgc ccagtgagcg    240

 

aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgccctaaat gggaatgggg acccgaacaa    300

 

catggataga gcagttaaac tatacaagaa gctcaaaaga gaaataacgt tccatggggc    360

 

caaggaggtg tcactaagct attcaactgg tgcacttgcc agttgcatgg gcctcatata    420

 

caacaggatg ggaacagtga ccacagaagc tgcttttggt ctagtgtgtg ccacttgtga    480

 

acagattgct gattcacagc atcggtctca cagacaaatg gctactacca ccaatccact    540

 

aatcaggcat gaaaacagaa tggtgctggc tagcactacg gcaaaggcta tggaacagat    600

 

ggctggatcg agtgaacagg cagcagaggc catggaggtt gctaatcaga ctaggcagat    660

 

ggtacatgca atgagaacta ttgggactca tcctagttcc agtgctggtc tgaaagatga    720

 

ccttcttgaa aatttgcagg cctaccagaa gcgaatggga gtgcagatgc agcgattcaa    780

 

gtgatcctct cgtcattgca gcaaatatca ttgggatctt gcacttgata ttgtggatta    840

 

ctgatcgtct ttttttcaaa tgtatttatc gtcgctttaa atacggtttg aaaaaagggc    900

 

cttctacgga aggagtgcct gagtccatga gggaagaata tcaacaggaa cagcagagtg    960

 

ctgtggatgt tgacgatggt cattttgtca acatagagct agagtaaaaa actaccttgt   1020

 

ttctact                                                             1027

 

 

<210>  20

<211>  1458

<212>  DNA

<213>  H1N1型猪流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011株

 

<400>  20

agcaaaagca ggagttcaaa atgaatccaa accaaaagat aataaccatt ggttcggtct     60

 

gtatgacaat tggaatggct aacttaatat tacaatttgg aaacataatc tcaatatgga    120

 

ttagccactc aattcaactt gggaatcaaa atcagattga aacatgcaat caaagcgtca    180

 

ttacttatga aaacaacact tgggtaaatc agacatatgt taacatcagc aacaccaact    240

 

ttgctgctgg acagtcagtg gttcccgtga aattagcggg caattcctct ctctgccctg    300

 

ttagtggatg ggctatatac agtaaagaca acagtataag aatcggttcc aagggggatg    360

 

tgtttgtcat aagggaacca ttcatatcat gctccccctt ggaatgcaga accttcttct    420

 

tgactcaagg ggccctgcta aatgacaaac attccaatgg aaccattaaa gacaggagcc    480

 

catatcgaac cctaatgagc tgtcctattg gtgaagttcc ctctccatac aactcaagat    540

 

ttgagtcagt cgcttggtca gcaagtgctt gtcatgatgg catcaattgg ctaacaattg    600

 

gaatttctgg cccagacaat ggggcagtgg ctgtgttaaa gtacaacggc ataataacag    660

 

acaccatcaa gagttggaga aacaatatat tgagaacaca agagtctgaa tgtgcatgtg    720

 

taaatggttc ttgctttact gtaatgaccg atggaccaag tgatggacag gcctcataca    780

 

agatcttcag aatagaaaag ggaaagatag tcaaatcagt cgaaatgaat gcccctaatt    840

 

atcactatga ggaatgctcc tgctatcctg attctagtga aatcacatgt gtgtgcaggg    900

 

ataactggca tggctcgaat cgaccttggg tgtctttcaa ccagaatctg gaatatcaga    960

 

tagggtacat atgcagtggg attttcggag acaatccacg ccctaatgat aagacaggca   1020

 

gttgtggtcc agtatcgtct aatggagcaa atggagtaaa aggattttca ttcaaatacg   1080

 

gcaatggtgt ttggataggg agaactaaaa gcattagttc aagaaacggt tttgagatga   1140

 

tttgggatcc gaacggatgg actgggacag acaataactt ctcaataaag caagatatcg   1200

 

taggaataaa tgagtggtca ggatatagcg ggagttttgt tcagcatcca gaactaacag   1260

 

ggctggattg tataagacct tgtttctggg ttgaactaat cagagggcga cccaaagaaa   1320

 

acacaatctg gactagcggg agcagcatat ccttttgcgg tgtaaacagt gacactgtgg   1380

 

gttggtcttg gccagacggt gctgagttgc catttaccat tgacaagtaa tttgttcaaa   1440

 

aaactccttg tttctact                                                 1458

 

 

<210>  21

<211>  1565

<212>  DNA

<213>  H1N1型猪流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011株

 

<400>  21

agcaaaagca gggtagataa tcactcactg agtgacattc acatcatggc gtctcaaggc     60

 

accaaacgat catatgaaca aatggagact ggtggggagc gccaggatgc cacagaaatc    120

 

agagcatctg tcggaagaat gattgctgga atcgggagat tctacatcca aatgtgcact    180

 

gaactcaaac tcagtgatta tgatggacga ctaatccaga atagcataac aatagagagg    240

 

atggtgcttt ctgcttttga tgagagaaga aataaatacc tagaagagaa tcccagtgct    300

 

gggaaagacc ctaagaaaac aggaggaccc atatatagaa gaatagacgg aaagtggatg    360

 

agaaaactca tcctttatga caaagaagaa ataaggagag tttggcgcca agcaaacaat    420

 

ggcgaagatg caaaagcagg tcttactcat attatgattt ggcattccaa cctgaatgat    480

 

gccacatatc agagaacaag agcgcttgtt cgcaccggaa tggaccccag aatgtgctct    540

 

ctaatgcaag gttcaacact tcccagaagg tctggtgccg caggtgctgc ggtgaaagga    600

 

gttggaacaa tagcaatgga gctaatcaga atgatcaaac gtggaatcaa tgaccgaaat    660

 

ttctggaggg gtgaaaatgg acgaaggaca agggttgctt atgaaagaat gtgcaatatc    720

 

ctcaaaggaa aatttcaaac agctgcccag agggcaatga tggatcaagt aagagaaagt    780

 

cgaaacccag gaaacgctga gattgaagac ctcattttcc tggcacggtc agcactcatt    840

 

ctgaggggat cagttgcaca taaatcctgc ctgcctgctt gtgtgtatgg gcttgcagta    900

 

gcaagtgggc ttgactttga aagggaaggg tactcactgg tcgggataga cccattcaaa    960

 

ttactccaaa acagccaagt ggtcagcctg atgagaccaa atgaaaaccc agcccacaag   1020

 

agtcaattgg tgtggatggc atgccactct ggtgcatttg aagatttaag agtatcaagt   1080

 

ttcataagag gaaagaaagt gattccaaga ggaaagcttt ccacaagagg ggtccagatt   1140

 

gattcaaatg agaatgtgga aaccatggac tccaataccc tggaagtaag aagcagatac   1200

 

tgggccataa ggaccaggag tggaggaaat accaatcaac aaaaggcatc cgcaggccag   1260

 

atcagtgtgc agcctacatt ctcagtgcag agaaatctcc cttttgaaag agcaaccgtt   1320

 

atggcagcat tcagcgggaa caatgaagga aggacatccg acatgcgaac agaagttata   1380

 

agaatgatgg aaagtgcaaa gcccgaagat ttgtccttcc aggggcgggg agtcttcgag   1440

 

ctctcggatg aaaaggcaac gaacccgatc gtgccttcct ttgacatgag taatgaaggg   1500

 

tcttatttct tcggagacaa tgcagaggag tatgacagtt gaagaaaaat acccttgttt   1560

 

ctact                                                               1565

 

 

<210>  22

<211>  894

<212>  DNA

<213>  H1N1型猪流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011株

 

<400>  22

agcaaaagca gggtgacaaa aacataatgg actccaacac catgtcaagc tttcaggtag     60

 

actgtttcct ttggcatatc cgcaagcgat ttgcagacaa tggattgggt gatgccccat    120

 

tccttgatcg gctccgccga gatcaaaagt ccttaaaagg aagaggcaac acccttggcc    180

 

tcgatatcga aacagccact cttgttggga aacaaatcgt ggaatggatc ttgaaagagg    240

 

aatccagcga gacacgtaga atgacaattg catctgtacc tacttcgcgc tacctttctg    300

 

aaatgaccct cgaggaaatg tcacgagact ggttcatgct catgcctagg caaaagataa    360

 

taggccctct ttgcgtgcga ttggaccagg cggtcatgga aaagaacata gtactgaaag    420

 

cgaacttcag tgtaatcttt aaccgattag agaccttgat actactaagg gctttcactg    480

 

aggagggaac aatagttgga gaaatttcac cattaccttc tcttccagga catacttatg    540

 

aggatgtcaa aaatgcagtt ggggtcctca tcggaggact tgaatggaat ggtaacacgg    600

 

ttcgagtctc tgaaaatata cagagattcg cttggagaaa ctgtgatgag aatgggagac    660

 

cttcactacc tccagagcag aaatgaaaag tggcgagagc aattgggaca gaaatttgag    720

 

gaaataaggt ggttaattga agaaatgcgg cacagattga aagcgacaga gaatagtttc    780

 

gaacaaataa catttatgca agccttacaa ctactgcttg aagtagaaca agagataaga    840

 

gctttctcgt ttcagcttat ttaatgataa aaaacaccct tgtttctact aata          894

 

 

<210>  23

<211>  2233

<212>  DNA

<213>  H1N1型猪流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011株

 

<400>  23

agcgaaagca ggtactgatt caaaatggaa gactttgtgc gacaatgctt caatccaatg     60

 

atcgtcgagc ttgcggaaaa gacaatgaaa gaatatgggg aagatccgaa aatcgaaact    120

 

aacaagtttg ctgcaatatg cacacatttg gaagtttgtt tcatgtattc ggatttccat    180

 

ttcatcgacg aacggggtga atcaataatt gtagaatctg gtgacccgaa tgtactattg    240

 

aagcaccgat ttgagataat tgaaggaaga gaccgaatca tggcctggac agtggtgaac    300

 

agtatatgta acacaacagg ggtagagaag cctaaatttc ttcctgattt gtatgattac    360

 

aaagagaacc ggttcattga aattggagta acacggaggg aagtccacat atattaccta    420

 

gagaaagcca acaaaataaa atctgagaag acacacattc acatcttttc attcactgga    480

 

gaggagatgg ccaccaaagc ggactacacc cttgacgaag agagcagggc aagaatcaaa    540

 

actaggcttt tcactataag acaagaaatg gccagtagga gtctatggga ttcctttcgt    600

 

cagtccgaaa gaggcgaaga aacaaatgaa gaaaaatttg agattacagg aactatgcgc    660

 

aagcttgccg accaaagtct cccaccgaac ttctccagcc ttgaaaactt cagagcctat    720

 

gtagatggat tcgagccgaa cggctgcatt gagggcaagc tttcccaaat gtcaaaagaa    780

 

gtgaacgcca aaattgaacc attcttgagg acgacaccac gccccctcag attgcctgat    840

 

gggcctcttt gccatcagcg gtcaaagttc ctgctgatgg atgctctgaa attaagtatt    900

 

gaagacccga gtcacgaggg ggagggaata ccattatatg atgcaatcaa atgcatgaaa    960

 

acattctttg gctggaaaga gcctaacata gtcaaaccac atgagaaagg cataaatccc   1020

 

aattacctca tggcttggaa gcaggtgcta gcagagctac aggacattga aaatgaagag   1080

 

aagatcccaa ggacaaagaa catgaagaga acaagccaat tgaagtgggc acttggtgaa   1140

 

aatatggcac cagaaaaagt agactttgat gactgcaaag atgttggaga ccttaaacag   1200

 

tatgacagtg atgagcccga gcccagatct ctagcaagct gggtccaaaa tgaattcaat   1260

 

aaggcatgtg aattgactga ttcaagctgg atagaacttg atgaaatagg agaagatgtt   1320

 

gccccgattg aacatattgc aagcatgaga aggaactatt ttacagcaga agtgtcccac   1380

 

tgcagggcta ctgaatacat aatgaaggga gtgtacataa atacggcctt gctcaatgca   1440

 

tcctgtgcag ccatggatga ctttcagttg atcccaatga taagcaaatg taggaccaaa   1500

 

gaaggaagac ggaaaacaaa cctgtatggg ttcattataa aaggaaggtc tcatttgaga   1560

 

aatgatactg atgtggtgaa ctttgtaagt atggagttct cactcactga cccgagactg   1620

 

gagccacaca aatgggaaaa atactgtgtt cttgaaatag gagaaatgct cttgaggact   1680

 

gcgataggcc aagtgtcgag gcccatgttc ctatatgtga gaaccaatgg aacctccaag   1740

 

atcaagatga aatggggcat ggaaatgagg cgctgccttc ttcagtctct tcagcagatt   1800

 

gagagcatga ttgaggccga gtcttctatc aaagagaaag acatgaccaa ggaattcttt   1860

 

gaaaacaaat cggaaacatg gccaatcgga gagtcaccca ggggagtgga ggaaggctct   1920

 

attgggaaag tgtgcaggac cttactggca aaatctgtat tcaacagtct atatgcgtct   1980

 

ccacaacttg aggggttttc ggctgaatcg agaaaattgc ttctcattgt tcaggcactt   2040

 

agggacaacc tggaacctgg aaccttcgat cttggggggc tatatgaagc aatcgaggag   2100

 

tgcctgatta atgatccctg ggttttgctt aatgcatctt ggttcaactc cttcctcaca   2160

 

catgcactga agtagttgtg gcaatgctac tatttgttat ccatactgtc caaaaaagta   2220

 

ccttgtttct act                                                      2233

 

 

<210>  24

<211>  2341

<212>  DNA

<213>  H1N1型猪流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011株

 

<400>  24

agcgaaagca ggcaaaccat ttgaatggat gtcaatccga ctctactttt cctaaaaatt     60

 

ccagcgcaaa atgccataag caccacattc ccttatactg gagatcctcc atacagccat    120

 

ggaacaggaa caggatacac catggacaca gtaaacagaa cacaccaata ctcagaaaag    180

 

gggaagtgga cgacaaacac ggagactggt gcagcccagc tcaacccgat tgatggacca    240

 

ctacctgagg ataatgaacc aagtgggtat gcacaaacag actgtgttct agaggctatg    300

 

gctttccttg aagaatccca cccaggaata tttgagaatt catgtcttga aacaatggaa    360

 

gttgttcaac aaacaagggt agataaacta actcaaggtc gccagactta tgattggaca    420

 

ttaaacagaa atcaaccggc agcaactgca ttggccaaca ccatagaagt ctttagatcg    480

 

aatggcctaa cagctaatga gtcaggaagg ctaatagatt tcttaaagga tgtaatggaa    540

 

tcaatgaaca aagaggaaat agagataaca acccactttc aaagaaaaag gagagtaaga    600

 

gacaacatga ccaagaagat ggtcacgcaa agaacaatag ggaagaaaaa acaaagactg    660

 

aataagagag gctatctaat aagagcactg acattaaata cgatgaccaa agatgcagag    720

 

agaggcaagt taaaaagaag agctatcgca acacctggga tgcagattag aggtttcgta    780

 

tactttgttg aaactttagc taggagcatt tgcgaaaagc ttgaacagtc tgggctccca    840

 

gtagggggca atgaaaagaa ggccaaactg gcaaatgttg tgaggaagat gatgactaat    900

 

tcacaagaca cagagatttc tttcacaatc actggggaca acactaagtg gaatgaaaat    960

 

caaaatcctc gaatgttcct ggcgatgatt acatatatca ccagaaatca acccgagtgg   1020

 

ttcagaaaca tcctgagcat ggcacccata atgttctcaa acaaaatggc aagactaggg   1080

 

aaagggtaca tgttcgagag taaaagaatg aagattcgaa cacaaatacc agcagaaatg   1140

 

ctagcaagca ttgacctgaa gtacttcaat gaatcaacaa agaagaaaat tgagaaaata   1200

 

aggcctcttc taatagatgg cacagcatca ctgagtcctg ggatgatgat gggcatgttc   1260

 

aacatgctaa gtacggtctt gggagtctcg atactgaatc ttggacaaaa gaaatacacc   1320

 

aagacaatat actggtggga tgggctccaa tcatccgacg attttgctct catagtgaat   1380

 

gcaccaaacc atgagggaat acaagcagga gtggacagat tctacaggac ctgcaagtta   1440

 

gtgggaatca acatgagcaa aaagaagtcc tatataaata agacagggac atttgaattc   1500

 

acaagctttt tttatcgcta tggatttgtg gctaatttta gcatggagct acccagcttt   1560

 

ggagtgtctg gagtaaatga atcagctgac atgagtattg gagtaacagt gataaagaac   1620

 

aacatgataa acaatgatct tggacctgca acggcccaga tggctcttca atttttcatc   1680

 

aaagactaca gatacacata taggtgccat aggggagaca cacaaattca gacgagaaga   1740

 

tcatttgagt taaagaagct gtgggatcaa acccaatcaa aggtagggct attagtatca   1800

 

gatggaggac caaacttata caatatacgg aatcttcaca ttcctgaagt ctgcttaaaa   1860

 

tgggagctaa tggatgatga ttatcgggga agactttgta atcccctgaa tccctttgtc   1920

 

agtcataaag agattgattc tgtaaacaat gctgtggtaa tgccagccca tggtccagcc   1980

 

aaaagcatgg aatatgatgc cgttgcaact acacattcct ggattcccaa gaggaatcgt   2040

 

tctattctca acacaagcca aaggggaatt cttgaggatg aacagatgta ccagaagtgc   2100

 

tgcaatctat tcgagaaatt tttccctagc agttcatata ggagaccggt tggaatttct   2160

 

agcatggtgg aggccatggt gtctagggcc cggattgatg ccagggtcga cttcgagtct   2220

 

ggacggatca agaaagaaga gttctctgag atcatgaaga tctgttccac cattgaagaa   2280

 

ctcagacggc aaaaataatg aatttagctt gtccttcatg aaaaaatgcc ttgtttctac   2340

 

t                                                                   2341

 

 

<210>  25

<211>  2341

<212>  DNA

<213>  H1N1型猪流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011株

 

<400>  25

agcgaaagca ggtcaaatat attcaatatg gagagaataa aagaactgag agatctaatg     60

 

tcgcagtccc gcactcgcga gatactcact aagaccactg tggaccatat ggccataatc    120

 

aaaaagtaca catcaggaag gcaagagaag aaccccgcac tcagaatgaa gtggatgatg    180

 

gcaatgagat acccaattac agcagacaag agaataatgg acatgattcc agagaggaat    240

 

gaacaaggac aaaccctctg gagcaaaaca aacgatgctg gatcagaccg agtgatggta    300

 

tcacctctag ccgtaacatg gtggaatagg aatggcccaa caacaagtac agttcattac    360

 

cctaaggtat ataaaactta tttcgaaaag gtcgaaaggt tgaaacatgg taccttcggc    420

 

cctgtccact tcagaaatca agttaaaata aggaggagag ttgatacaaa ccctggccat    480

 

gcagatctca gtgccaagga ggcacaggat gtgattatgg aagttgtttt cccaaatgaa    540

 

gtgggggcaa gaatactgac atcagagtca cagctggcaa taacaaaaga gaagaaagaa    600

 

gagctccagg attgtaaaat tgctcccttg atggtggcgt acatgctaga aagagaattg    660

 

gtccgtaaaa caaggtttct cccagtagcc ggcggaacag gcagtgttta tattgaagtg    720

 

ttgcacttaa cccaagggac gtgctgggag cagatgtaca ctccaggagg agaagtgaga    780

 

aatgatgatg ttgaccaaag tttgattatc gctgctagaa acatagtaag aagagcagca    840

 

gtgtcagcag acccattagc atctctcttg gaaatgtgcc acagcacaca gattggagga    900

 

gtaaggatgg tggacatcct tagacagaat ccaactgagg aacaagccgt agacatatgc    960

 

aaggcagcaa tagggttgag gattagctca tctttcagtt ttggtgggtt cactttcaaa   1020

 

aggacaagcg gatcatcagt caagaaagaa gaagaagtgc taacgggcaa cctccaaaca   1080

 

ctgagaataa gagtacatga agggtatgaa gaattcacaa tggttgggag aagagcaaca   1140

 

gctattctca gaaaggcaac caggagattg atccagttga tagtaagcgg gagagacgag   1200

 

cagtcaattg ctgaggcaat aattgtggcc atggtattct cacaagagga ttgcatgatc   1260

 

aaggcagtta ggggcgatct gaactttgtc aatagggcaa accagcgact gaaccccatg   1320

 

caccaactct tgaggcattt ccaaaaagat gcaaaagtgc ttttccagaa ctggggaatt   1380

 

gaatccatcg acaatgtgat gggaatgatc ggaatactgc ccgacatgac cccaagcacg   1440

 

gagatgtcgc tgagagggat aagagtcagc aaaatgggag tagatgaata ctccagcacg   1500

 

gagagagtgg tagtgagtat tgaccgattt ttaagggtta gagatcaaag agggaacgta   1560

 

ctattgtctc ccgaagaagt cagtgaaacg caaggaactg agaagttgac aataacttat   1620

 

tcgtcatcaa tgatgtggga gatcaatggc cctgagtcag tgctagtcaa cacttatcaa   1680

 

tggataatca ggaactggga aattgtgaaa attcaatggt cacaagatcc cacaatgtta   1740

 

tacaacaaaa tggaatttga accatttcag tctcttgtcc ctaaggcaac cagaagccgg   1800

 

tacagtggat tcgtaaggac actgttccag caaatgcggg atgtgcttgg gacatttgac   1860

 

actgtccaaa taataaaact tctccccttt gctgctgctc caccagaaca gagtaggatg   1920

 

caattttcct cattgactgt gaatgtgaga ggatcagggt tgagaatact ggtaagaggc   1980

 

aattctccag tattcaatta caacaaggca accaaacgac ttacagttct tggaaaggat   2040

 

gcaggtgcat tgactgaaga tccagatgaa ggcacatctg gggtggagtc tgctgtcctg   2100

 

agaggatttc tcattttggg caaagaagac aagagatatg gcccagcatt aagcatcaat   2160

 

gaactgagca atcttgcaaa aggagagaaa gctaatgtgc taattgggca aggggacgta   2220

 

gtgttggtaa tgaaacgaaa acgggactct agcatactta ctgacagcca gacagcgacc   2280

 

aaaagaattc ggatggccat caattagtgt cgaattattt aaaaacgacc ttgtttctac   2340

 

t                                                                   2341

 

 

Claims (3)

1.一种H1N1型猪流感病毒疫苗株，其分类命名为：猪甲型流感病毒A/Swine/Nanjing/50/2011(H1N1) ，微生物保藏号为：CCTCC NO:V201218。

2.一种权利要求1所述H1N1型猪流感病毒疫苗株在制备预防猪流感药物中的应用。

3.一种预防猪流感的疫苗组合物，其特征在于该疫苗组合物由权利要求1所述H1N1型猪流感病毒疫苗株和药学上可接受的载体或辅料组成。

Images