CN103611156A - 一种禽用五联疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病、病毒性关节炎、鸡减蛋综合症五联灭活疫苗及其生产方法。该五联疫苗的抗原包括新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎病毒K136株、鸡传染性法氏囊病病毒BJQ902株、病毒性关节炎T98株和鸡减蛋综合症病毒京911株，在制备工艺中使用多级连续浓缩工艺和均质机乳化工艺，首次制备出同时防治上述五种鸡流行性疾病的灭活疫苗，免疫动物后抗体产生快，效价高，保护期长，降低了疫病的发生及蔓延。
Description
技术领域
本发明属于畜禽用生物新医药技术领域，尤其是涉及一种禽用五联疫苗及其制备方法。
背景技术
鸡新城疫(Newcastle Disease，ND)是由一种副粘病毒引起的高度接触性传染病，又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟。其病程中常呈现败血症，主要临床特征表现为病鸡呼吸困难，下痢，神经机能紊乱，黏膜和浆膜出血等。各品种鸡和各种年龄的鸡都能感染，幼鸡和中鸡更易感染，死亡率极高，常对禽养殖业造成毁灭性打击。
鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis，IB)是由一种冠状病毒科冠状病毒属病毒引起的鸡急性、高度接触性呼吸道传染病，其临床症状主要表现为病鸡呼吸困难、发出罗音、咳嗽、张口呼吸、打喷嚏等，死亡率一般很低，但对各种日龄、性别的鸡均易感染。幼雏鸡感染后常引起输卵管永久性退化；成年肉鸡感染后通常会引起饲料报酬降低、死淘率上升；产蛋鸡感染后通常表会导致产蛋量降低、蛋的品质下降。另外，该病经常并发或继发大肠杆菌葡萄球菌、或霉形体感染，使死亡率大大增加，对养鸡业造成严重危害。
鸡减蛋综合症(Egg Drop Syndrome，EDS)是由禽腺病毒III群中的病毒引起，以产蛋下降为特征，其主要表现为鸡群产蛋骤然下降，软壳蛋和畸形蛋增多，褐壳蛋蛋壳颜色变浅。目前，这种疾病已经成为世界范围内引起产蛋损失的重要原因之一。
鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease virus，IBD）是由双RNA病毒科中的传染性法氏囊病病毒引起的一种特殊疾病，损害幼鸡法氏囊。特征是患鸡腹泻、衰竭，法氏囊先发生显著炎症和增大，继之以萎缩，最后患鸡死亡，自然条件下，本病只感染鸡且所有品种的鸡均可感染。本病除造成一些雏鸡死亡外，还常引起病愈鸡免疫抑制，导致免疫接种失败，增加雏鸡对鸡新城疫等许多疾病的易感性。
鸡病毒性关节炎(Avian viral arthritis，AVA)是由禽正呼肠孤病毒（Avian orthoreovirus）鸡病毒性关节炎病毒(Avian viralarthritis virus，AVAV)引起的主要发 生于肉用鸡的一种传染病，以侵害胫跖关节、趾关节及其肌腱为特征，故又称传染性腱鞘炎、腱裂综合症或腱滑膜炎等。目前本病分布广泛，世界各地均有发生，在急性发病鸡群中，特别是种鸡群，常因生长缓慢或停滞、体重减轻，饲养利用率低以及死淘率高等，给养鸡业带来巨大的经济损失。
上述疾病在我国养殖鸡群中广泛流行，常出现混合感染态势，随着对这些疾病研究的不断深入，防控措施也得到不断完善，特别是相应疫苗的成功运用，使得这些疾病在一定程度上得到了有效控制。但是，国内外现在上市的商品化产品中大多是传统的单一疫苗，只有少数二联、三联疫苗，虽有大量关于四联疫苗的研究报道，但是其商业化的产品尚未见大范围使用，至今还没有关于畜禽五联疫苗的研究报道和使用。多联灭活疫苗能够对多种流行性多发疾病起到一针多防的作用，既减少了人力劳动又减少了多次注射对鸡群机体的影响，具有很好的市场前景。但是目前在制备多联苗存在最大的问题就是各种抗原的含量能否达到标准，本发明制备的多联苗采用多级连续浓缩法在最大程度上对抗原进行浓缩和纯化，使制得的疫苗抗原含量达到标准。另外灭活疫苗常用的乳化方法是搅拌乳化，搅拌式乳化剪切力有限，这在一定程度上会对疫苗的品质和保存期有一定的影响，市场上常用多联灭活疫苗的保存期最多在18个月，本发明使用均质机进行乳化，进液样品在挤压，强冲击与失压膨胀的三重作用下使液体破碎的更加细小，从而使水相和油相能更均匀的相互混合，从而使整个产品体系更加稳定。本发明制备的疫苗水油平均分散、混合更均匀，得到的油包水剂型更稳定，保存时间达到24个月。
发明内容
本发明的目的是提供一种可预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、鸡传染性法氏囊病和鸡病毒性关节炎的五联疫苗，所述疫苗能够同时预防受免鸡群的鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡减蛋综合症、鸡传染性法氏囊病和鸡病毒性关节炎，达到一针防五病的效果，减少鸡场免疫成本和受免鸡群免疫应激反应的目的。
本发明的目的还在于提供一种可预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、鸡传染性法氏囊病和鸡病毒性关节炎的五联疫苗的制备方法。即将上述疾病的病毒分别扩大培养后进行病毒收获、浓缩、毒价测定以及灭活处理，将灭 活产物进行抗原配比制备成疫苗抗原后，并进一步经均质机乳化后制备成抗体。
为实现本发明的上述目的，所采用的技术方案如下：
一种禽用五联疫苗，疫苗抗原是由鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡减蛋综合症病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和鸡病毒性关节炎病毒组成，所述疫苗通过包括以下步骤的疫苗制备方法制备得到：
1）通过鸡胚扩大培养鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒；
2）通过鸭胚扩大培养鸡减蛋综合症病毒；
3）通过宿主细胞扩大培养鸡传染性法氏囊病病毒、鸡病毒性关节炎病毒；
4）分别收获上述病毒扩大培养产物并进行病毒浓缩；
5）分别对上述浓缩产物进行毒价测定和病毒灭活处理；
6）分别对上述灭活产物进行半成品检验；
7）利用检验合格的灭活产物进行抗原配比制得疫苗抗原；
8）疫苗抗原经乳化后得到疫苗成品；
9）疫苗成品经分装检验后即为商品化疫苗。
组成上述禽用五联疫苗的抗原具体包括：鸡新城疫病毒La Sota株，保藏编号为CCTCC-V201320的鸡肾型传染性支气管炎病毒K136株，鸡减蛋综合症病毒京911株，鸡传染性法氏囊病毒BJQ902株，鸡病毒性关节炎病毒T98株。其中K136株是由发明人自己分离筛选的鸡肾型传染性支气管炎病毒疫苗株，保藏编号为CCTCC-V201320。
上述禽用五联疫苗的病毒浓缩采用物理法和超滤法相结合的多级连续浓缩方式，其具体浓缩过程包括以下步骤：
1）将每组收获的病毒液反复冻融后，离心去除大颗粒杂质，收集上清至无菌罐体中；
2）将上清液经8层纱布过滤，进一步纯化病毒液；
3）取滤液用截留分子量为350KD的Millipore膜包进行至少10倍浓缩，经超滤浓缩的病毒液流入无菌容器中，并反复循环通过超滤装置，待浓缩后体积达到原病毒液体积1/10时，抽样检验病毒含量，直至得到的病毒液达到浓缩要求停止浓缩。
上述禽用五联疫苗的乳化方法是采用高压均质机乳化法，具体用到的均质机 是指AH100D高压均质机。
上述禽用五联疫苗的制备方法具体包括以下步骤：
1.生产用种毒的来源
(1)鸡新城疫病毒La Sota株、效检用鸡新城疫强毒北京株(CVCC AV1611株)，购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所；
(2)鸡传染性支气管炎病毒K136，效检用鸡传染性支气管炎病毒CK/IBV/SD05毒株，均由本实验室自行分离得到；
(3)减蛋综合症病毒京911株，购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所；
(4)禽正呼肠孤病毒（Avian orthoreovirus,本发明又称鸡病毒性关节炎病毒）T98株，由内蒙古农业大学提供。
(5)传染性法氏囊病毒BJQ902株由北京农林科学院畜牧兽医研究所提供。
2.生产用种毒的制备：
鸡新城疫病毒La Sota株生产用毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作10-4或10-5倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水），装于灭菌容器内。将检验无菌、对1%鸡红细胞凝集价不低于1:512（微量法）的鸡胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。
鸡传染性支气管炎病毒K136株生产用毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作10-2～10-3稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，收集接种后24～72小时内死亡的鸡胚尿囊液，装于无菌容器内。将检验无菌、病毒含量≥106.0EID50/0.1ml、对1%鸡红细胞凝集试验为阴性的胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。
鸡病毒性关节病毒T98株生产用毒种制备：将毒种T98株用灭菌生理盐水作10-3～10-4倍稀释后，接种单层鸡胚成纤维细胞（CEF）置于37℃，5%CO2条件下培养3～4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液。于-20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，定量分装于无菌安瓿中，-20℃保存。注明收获日期、毒种代次等。
减蛋综合症病毒京911株毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作10-1～10-2倍 稀释，尿囊腔内接种11～12日龄易感鸭胚，每胚0.2ml。选接种后72～120小时内死亡及存活的鸭胚，收获胚液(尿囊液及羊水)，装于无菌容器内。将检验无菌且对1％鸡红细胞凝集价不低于1∶32768(微量法)的鸭胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。
传染性法氏囊病毒BJQ902毒种制备:将毒种BJQ902株用灭菌生理盐水作10-3～10-4倍稀释后，接种单层鸡胚成纤维细胞（CEF）置于37℃，5%CO2条件下培养3～4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液。于-20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，定量分装于无菌安瓿中，-20℃保存。注明收获日期、毒种代次等。
3.制苗用病毒液的制备：
（1）鸡新城疫病毒液的制备
培养：接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作10-4～10-5稀释，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。孵育与观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12～24小时。
收获：将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1:256（微量法）者应弃去。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。
浓缩：将收获的胚液在2～8℃条件下，用多级连续浓缩法，至少浓缩10倍，病毒含量不低于109.5EID50时停止浓缩，按中华人民共和国兽药典（中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版三部.中国农业出版社，2011，本发明以下简称为《中国兽药典》）规定的方法进行无菌检验（可不移植），应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。
灭活将鸡新城疫病毒浓缩液导入灭活罐内，计量加入总体积2‰的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。
（2）鸡传染性支气管炎病毒液的制备
培养：接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作10-2～10-3倍稀释，接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置37℃孵育，不必翻胚。孵育和观察鸡胚接种后24小时照胚1次，弃去死胚。此后每6小时照胚1次，死亡的鸡胚随时取出，直至72小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于4℃中冷却12～24小时。
收获：将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。吸取胚液放于灭菌容器内，抽样检测病毒含量，应≥106.5EID50/0.1ml。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。
浓缩：将收获的胚液在2～8℃条件下，用多级连续浓缩法，至少浓缩10倍，病毒含量不低于108.5EID50。按《中国兽药典》规定的方法进行无菌检验（可不移植），应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。
灭活：将鸡传染性支气管炎病毒浓缩液导入灭活罐内，计量加入总体积2‰的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。
（3）鸡传染性法氏囊病毒液的制备
细胞的制备:取9～10日龄SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，37℃培养，待细胞长成单层后，用质量分数为0.2%的胰酶溶液进行消化，加入原体积2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均匀，再取原体积细胞液至另外细胞培养瓶中培养，直至长成单层，即可使用。
接种:弃掉细胞培养液，取生产用种毒BJQ902株，用灭菌生理盐水作适当10-3～10-4稀释，按培养液体积的1/10接种单层鸡胚成纤维细胞。37℃吸附1小时，加入培养液，并向其添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液，轻轻混匀，37℃培养。
培养:病毒接种24小时后，每6小时向培养液中加入总体积0.2%的0.5mol/LNaHCO3，培养3～4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液。
病毒液收获:将装有病毒液的培养瓶，放入-20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，在-15℃以下保存，应不超过1个月。
浓缩:将病毒含量低于107.0TCID50/0.1ml病毒液在2～8℃条件下，用多级连续浓缩法进行至少10倍浓缩,取样测定毒价，TCID50不低于108.0时停止浓缩，按《中国兽药典》附录进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。浓缩后的病毒液随即进行灭活。
灭活:将传染性法氏囊病毒浓缩液导入灭活罐内，计量加入总体积2‰甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合。然后将病毒液导入另一灭活罐内，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂，37℃灭活16小时(以罐内液体温度达到37℃开始计时)后放2～8℃保存，应不超过30日.
(4)病毒性关节炎病毒液的制备
细胞的制备:取9～10日龄SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，37℃培养，待细胞长成单层后，用质量分数为0.2%的胰酶溶液进行消化，加入原体积2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均匀，再取原体积细胞液至另外细胞培养瓶中培养，直至长成单层，即可使用。
接种:将制备的CEF，加入适量生长液（含8%犊牛血清和1%双抗），分装到克氏细胞瓶中，37℃、5%CO2培养24小时长成单层，接种ARV T98株，37℃吸附1小时，加入含不同浓度的犊牛血清和青-链霉素双抗的基础培养基，于37℃、5%CO2培养。
培养:病毒接种24小时后，每6小时向培养液中加入总体积0.2%的维持液，培养72～96小时，细胞病变（CPE）达到80%时，收获病毒细胞液.
病毒液收获:将装有病毒液的培养瓶，放入-20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，在-15℃以下保存，应不超过1个月。
浓缩:将病毒含量低于107.5TCID50/0.1ml病毒液在2～8℃条件下，用多级连续浓缩法进行至少10倍浓缩,取样测定毒价，TCID50不低于108.5时停止浓缩，按《中国兽药典》附录进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。浓缩后的病毒液随即进行灭活。
灭活:将病毒性关节炎病毒浓缩液导入灭活罐内，计量加入总体积2‰甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合。然后将病毒液导入另一灭活罐内，以避 免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内液体温度达到37℃开始计时)后放2～8℃保存，应不超过30日.
(5)减蛋综合症病毒液的制备
接种:将生产用毒种，用灭菌生理盐水作10-1～10-2稀释，接种11～12日龄的易感鸭胚(母源抗体滴度不高于1∶4)，每胚尿囊腔内接种0.2ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。
孵育与观察:鸭胚接种后，弃去72小时前的死胚。72小时后，每6小时照胚1次，死亡的鸭胚随时取出，直至120小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于4℃冷却12～24小时。
收获:将冷却的鸭胚取出，用碘酊消毒气室部位(如有凝结水，应擦干后再涂碘酊)，然后以无菌方法剥除气室部卵壳，揭去卵膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液。对每枚鸭胚在吸取胚液前应注意检查，凡胎儿腐败、胚液浑浊及有任何污染可疑者，都弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干枚鸭胚分为一组，吸取胚液放入同一灭菌的容器内，每组抽样测定红细胞凝集价，凝集价低于1∶16384(微量法)者应弃去。同时按《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无细菌生长。收获的胚液浓缩(灭活)前在2～8℃保存，应不超过5日。
浓缩:将收获的血凝效价低于1∶32768(微量法)的鸭胚病毒液在2～8℃条件下，用多级连续浓缩法进行至少10倍浓缩，取样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶370727(微量法)时停止浓缩，按《中国兽药典》附录进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。浓缩后的胚液随即进行灭活。
灭活:将减蛋综合症病毒浓缩胚液导入灭活罐内，计量加入总体积2‰甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合。然后将胚液导入另一灭活罐内，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂，37℃灭活16小时(以罐内液体温度达到37℃开始计时)后放2～8℃保存，应不超过30日。
4、抗原配比
为保证五联苗中各种病毒的含量，选取五种浓缩病毒液按照体积比1:1：1:1:1的比例充分混合于配液罐中。
5、灭活疫苗的制备
利用经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备。
油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司班-802份，先将白油缓慢加温，按6%和2%加入司班-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用。
水相制备：将检验合格的鸡新城疫病毒液、传染性支气管炎病毒液、鸡传染性法氏囊病病毒、病毒性关节炎病毒液和鸡减蛋综合症病毒等量混合，使0.1ml水相中鸡新城疫病毒含量不低于108.3EID50，传染性支气管炎病毒含量不低于107.5EID50；传染性法氏囊病毒含量不低于107.0TCID50；病毒性关节炎病毒含量不低于107.5EID50，鸡减蛋综合症病毒含量不低于15log2。取灭菌后的吐温-804份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，取吐温-804份装入带玻璃珠的瓶中灭菌，冷取至37℃加灭活病毒液96份，充分振摇，开动搅拌电机搅拌20～30分钟，使吐温-80完全溶解为止，制成水相。
6、乳化：利用AH100D高压均质机进行乳化，其乳化过程主要包括以下步骤：
1）在料斗中加入清水，开机；
2）调节均质机压力，现将二级均质阀压固定在25bar，再将一级均质阀调整到400bar；
3）待清水留到料斗底部时，往料斗中泵入混合1小时后的水油混合液，进行浓缩。在机器均质过程中，应随时补料。
抽样乳化的疫苗进行性状检验，以确定乳化是否完全。
7.分装
将制备的疫苗按照每瓶250ml进行分装。
8、成品检验
（1）性状
外观乳白色乳剂。
剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均不扩散。
稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。
黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
（2）装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，测定结果应符合规定。
（3）无菌检验按现行《中国兽药典》进行，无菌生长。
（4）安全检验用7日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，结果试验鸡均健活，无任何局部和全身不良反应。
（5）效力检验
1）鸡新城疫部分效力检验采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。
血清学方法：用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1:16（微量法），未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于1:4（微量法）。
免疫攻毒法：用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒（CVCC AV1611株）105.0ELD50，观察14日。对照组应全部死亡，免疫组应保护至少7只。
2）鸡传染性支气管炎部分：用14日龄SPF鸡25只，其中20只各点眼、滴鼻接种103.68EID50的分离强毒株1羽份（0.05ml），另5只不接种作为对照。接种后21日，分别采血，分离血清，同时免疫鸡再分别肌肉接种五联灭活疫苗0.4ml，二免后21日再将免疫鸡和对照鸡分别采血，分离血清。将两次血清分别测HI抗体效价。免疫组二免血清HI抗体效价的几何平均值应比首免血清高4倍以上，未免疫对照组血清HI抗体效价的几何平均值应不高于1:8（微量法）。
3）鸡减蛋综合症部分：用21日龄SPF鸡10只，每只肌肉或皮下注射疫苗1羽份(0.5ml)，另取条件相同的对照鸡5只，同群饲养。接种后21日，采血，测定HI抗体效价。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1∶128(微量法)，未免疫对照组每只鸡血清HI抗体效价均应不高于1∶4(微量法)。
4）病毒性关节炎部分效力检验以下方法任择其一。
血清学方法：取21日龄SPF鸡15只，其中10各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另外5只不免疫作为对照，同群饲养。21日后，每只鸡分别采血、分离血清，做琼脂免疫扩散试验，免疫鸡抗体阳性数应不少于9只，对照鸡应全部阴性。
免疫攻毒法：取21日龄SPF鸡20只，其中10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另外5只不免疫作为对照，同群饲养。21日后，每只鸡经脚垫接种鸡病毒关节炎病毒S1133株强毒0.2ml（含2×104ELD50）/只，观察120小时，检查趾、跗关节病变。对照组应至少有9只鸡发病，免疫组应全部保护。
5）鸡传染性法氏囊病部分效力检验以下方法任择其一。
血清学方法：取21日龄SPF鸡20只，其中10只各肌肉或颈部皮下注射疫苗0.2ml，另外10只不免疫作为对照，同群饲养。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，做琼脂免疫扩散试验。免疫鸡应至少有8只琼扩效价不低于1:8，对照鸡应全部阴性。
免疫攻毒法：取21日龄SPF鸡20只，其中10只各肌肉或颈部皮下注射疫苗0.2ml，另外10只不免疫作为对照，同条件下隔离饲养。接种后21日，所有免疫鸡和对照鸡，每只点眼途径接种10倍稀释的鸡传染性法氏囊病BJQ902株毒液0.1ml。攻毒后，每天观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至72～96小时，扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病变。免疫鸡应至少8只正常，不出现法氏囊病变；对照鸡应至少4只发病，出现明显的法氏囊病变（如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变）
9.甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》进行测定，结果应符合规定。
本发明的积极意义:
本发明涉及一种鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病、病毒性关节炎、鸡减蛋综合症五联灭活疫苗的生产方法。本发明采用新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎病毒K136株、鸡传染性法氏囊病病毒BJQ902株、病毒性关节炎T98株和鸡减蛋综合症病毒京911株作为生产菌毒种，使用多级连续浓缩工艺和均质机乳化工艺首次制备出同时防治五种鸡流行性疾病的灭活疫苗，免疫动物后抗体产生快，效价高，保护期长，降低了疫病的发生及蔓延。
附图说明
图1是本发明一种禽用五联疫苗的工艺流程图
具体实施方式
为能进一步说明本发明的内容、特点及功效，兹例举以下实施例进一步描述本发明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
实施例1：禽用五联疫苗抗原的制备以及半成品检验
（一）抗原制备
1.鸡新城疫病毒液的制备
（1）接种：取生产用毒种，用灭菌生理盐水作10-4倍稀释，接种10日龄易感鸡胚400枚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育，期间不翻胚。
（2）培养：孵育与观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚18枚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，全部取出，气室向上，置于4℃冷却12小时。
（3）收获：将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。共收鸡胚382枚，约4200ml尿囊液，抽样测定红细胞凝集价,凝集价为1:256（微量法）。按现行《中国兽药典》进行无菌检验。收获的胚液灭活前在4℃保存。
（4）浓缩：将收获的胚液在4℃条件下，用多级连续浓缩法，浓缩至400ml，抽样测定，病毒含量达到109.5EID50，按《中国兽药典》进行无菌检验，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。
（5）灭活：将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内，加入2‰甲醛溶液0.8ml，开启搅拌机搅拌，使其充分混合。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂，37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放4℃保存。
2.鸡传染性支气管炎病毒液的制备
（1）接种：取生产用毒种，用灭菌生理盐水作10-3稀释，接种10日龄SPF鸡胚450枚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。
（2）培养：孵育和观察鸡胚接种后24小时照胚1次，弃去14枚死胚。此后每6小时照胚1次，死亡的鸡胚随时取出，直至48小时，共死亡421枚，全部取出，气室向上直立，置于4℃中冷却16小时。
（3）收获：将冷却的鸡胚取出，收获436枚鸡胚，鸡胚尿囊液约2600ml（先收活胚后收死胚）。抽样检测病毒含量。按《中国兽药典》的规定进行无菌检验（可不移植），应无菌生长。收获的胚液灭活前在4℃保存，应不超过5日。
（4）浓缩：将收获的胚液在4℃条件下，用多级连续浓缩法至400ml，按《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），并取样备测毒价108.4EID50。浓缩后的胚液随即进行灭活。
（5）灭活：将传染性支气管炎病毒浓缩液导入灭活罐内，加入2‰甲醛溶液0.8ml，开启搅拌机搅拌，使其充分混合。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放4℃保存
3.减蛋综合症京911株病毒液的制备
(1)接种:取生产用毒种，用灭菌生理盐水作50倍稀释，接种800枚12日龄的易感鸭胚，每胚尿囊腔内接种0.2ml，接种后密封针孔，置36℃继续孵育，不必翻胚。
(2)培养：孵育与观察鸭胚接种后，每日照胚1次，弃去72小时前的死胚9枚，72小时后，每6小时照胚1次，死亡的鸭胚随时取出，直至120小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于4℃冷却24小时。
(3)收获：将冷却的鸭胚取出，用碘酊消毒气室部位(如有凝结水，应擦干后再涂碘酊)，然后以无菌方法剥除气室部卵壳，揭去卵膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液。对每个鸭胚在吸取胚液前注意检查，凡胎儿腐败、胚液浑浊及有任何污染可疑者，都弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干个鸭胚分为一组，吸取胚液放入同一灭菌的容器内，每组抽样测定血凝价。血凝价低于14log2者弃去。收获的4100mL合格胚液同时按《中国兽药典》附录进行无菌检验。收获的胚液灭活前在4℃保存。
(4)浓缩：将收获的血凝效价低于15log2的鸭胚病毒液在4℃条件下，用多级连续浓缩法至400ml，吸取数毫升样品测血凝价达到18.6log2。按《中国兽药典》附录进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。浓缩后的胚液随即进行灭活。
(5)灭活：将浓缩病毒胚液加入2‰甲醛溶液0.8ml，开启搅拌机搅拌，使其 充分混合。加甲醛溶液后倒于另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后放37℃灭活16小时(以瓶内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放4℃保存。
4.鸡传染性法氏囊病毒液的制备
细胞的制备:取9～10日龄SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，37℃培养，待细胞长成单层后，用质量分数为0.2%的胰酶溶液进行消化，加入原体积2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均匀，再取原体积细胞液至另外细胞培养瓶中培养，直至长成单层，即可使用。
接种:弃掉细胞培养液，取生产用种毒BJQ902株，用灭菌生理盐水作适当10-3稀释，按培养液体积的1/10接种单层鸡胚成纤维细胞。37℃吸附1小时，加入培养液，并向其添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液，轻轻混匀，37℃培养。
培养:病毒接种24小时后，每6小时向培养液中加入总体积0.2%的0.5mol/LNaHCO3，培养3～4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液。
病毒液收获:将装有病毒液的培养瓶，放入-20℃冰柜中反复冻融3次，收获病毒液4000ml于灭菌容器内，在-15℃以下保存，应不超过1个月。
浓缩:将收获病毒液在4℃条件下，用多级连续浓缩法进行浓缩体积至400ml，TCID50达到108.0时。按《中国兽药典》附录进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。浓缩后的病毒液随即进行灭活。
灭活:将传染性法氏囊病毒浓缩液导入灭活罐内，加入2‰甲醛溶液0.8ml，开启搅拌机搅拌，使其充分混合。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放4℃保存，不超过30日。
5.病毒性关节炎病毒液的制备
细胞的制备:取9～10日龄SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，37℃培养，待细胞长成单层后，用质量分数为0.2%的胰酶溶液进行消化，加入原体积2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均匀，再取原体积细胞液至另外细胞培养瓶中培养，直至长成单层，即可使用。
接种:将制备的CEF，加入适量生长液（含8%犊牛血清和1%双抗），分装到克氏细胞瓶中，37℃、5%CO2培养24小时长成单层，接种ARV T98株，37℃吸附 1小时，加入含不同浓度的犊牛血清和青-链霉素双抗的基础培养基，于37℃、5%CO2培养。
培养:病毒接种24小时后，每6小时向培养液中加入总体积0.2%的维持液，培养72～96小时，细胞病变（CPE）达到80%时，收获病毒细胞液。
病毒液收获:将装有病毒液的培养瓶，放入-20℃冰柜中反复冻融3次，收获病毒液4000ml于灭菌容器内，在-15℃以下保存，应不超过1个月。
浓缩:将病毒含量低于107.5TCID50/0.1ml病毒液在2～8℃条件下，用多级连续浓缩法进行浓缩体积至400ml，取样测定TCID50达到108.0。按《中国兽药典》附录进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。浓缩后的病毒液随即进行灭活。
灭活:将病毒性关节炎病毒浓缩液导入灭活罐内，加入2‰甲醛溶液0.8ml，开启搅拌机搅拌，使其充分混合。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放4℃保存，不超过30日。
(二)半成品检验
1.鸡新城疫病毒液
(1)病毒含量测定：将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶128(微量法)者，判为感染，计算EID50，每0.1ml病毒含量109.4EID50的胚液。
(2)红细胞凝集价测定：取浓缩后灭活前的胚液，按《中国兽药典》进行测定，其凝集价不低于1∶2064(微量法)者。
(3)灭活检验：取10日龄SPF鸡胚5个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置36℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异死亡应不超过1个。对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价，灭活完全。
(4)无菌检验：取灭活的胚液按《中国兽药典》进行检验，无菌生长。
2.传染性支气管炎病毒液
(1)病毒含量测定：将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10-5、 10-6和10-73个稀释度，分别尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，每日照胚2次，观察6日。6日后收取鸡胚，无论死胚、活胚(接种后24小时内死亡者除外)均称重观察鸡胚病变，其胎儿具有失水、卷缩、发育小(接种胎儿重量比对照胚最轻胎儿重量少2克以上)等特异性病痕者，判为感染，计算EID50。每0.1ml病毒含量108.5EID50。
(2)无菌检验：取灭活的病毒液，按《中国兽药典》进行检验，无菌生长。
(3)灭活检验：取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置36℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚无死亡。对所有鸡胚进行检验，均不出现失水、卷缩、发育小等现象。将胚液收获再盲传一代，仍不出现失水、蜷缩、发育小等现象，灭活完全。
3.减蛋综合症病毒液
(1)无菌检验：取灭活的鸡减蛋综合症胚液，按《中国兽药典》附录进行无菌检验，无细菌生长。
(2)灭活检验：取12日龄易感鸭胚6枚，尿囊腔内接种灭活后的胚液，每胚0.2ml，置36℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸭胚无死亡。对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均不出现凝集。将胚液收获再盲传一代，然后测定红细胞凝集价，仍无凝集价，灭活完全。
(3)毒价测定：将灭活前取出的鸭胚液，测定红细胞凝集价，凝集价1∶370727(微量法)。
4.病毒性关节炎病毒液
(1)无菌检验取灭活的病毒液按《中国兽药典》的规定进行检验，结果无菌生长。
(2)灭活检验:取灭活检验的样品，用维持液以10-1、10-2、10-3三个比例稀释待检样品，同时设立同样稀释比例的灭活前病毒样品阳性对照，分别接种于96孔CEF单层细胞，每组重复接种5孔，每孔0.2ml，5%CO2、37℃培养96小时。灭活样品组各稀释度孔中均没有出现细胞病变，阳性对照组各稀释度孔中细胞病变均明显，达80%以上，灭活合格，可以作为配苗使用。
(3)病毒含量测定:将浓缩后灭活前的病毒用细胞维持液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-84个稀释度接种96孔培养板CEF细胞单层，每个稀释度 重复5孔，每孔0.1ml，5%CO2、37℃培养96小时，观察细胞病变（CPE），计算TCID50,每0.1ml病毒含量108.5TCID50。
5.传染性法氏囊病毒液
(1)无菌检验:取灭活的病毒液按《中国兽药典》的规定进行检验，结果无菌生长。
(2)灭活检验:取灭活检验的样品，用维持液以10-1、10-2、10-3三个比例稀释待检样品，同时设立同样稀释比例的灭活前病毒样品阳性对照，分别接种于96孔CEF单层细胞，每组重复接种5孔，每孔0.2ml，5%CO2、37℃培养96小时。灭活样品组各稀释度孔中均没有出现细胞病变，阳性对照组各稀释度孔中细胞病变均明显，达80%以上，,判定为灭活合格，可以作为配苗使用。
(3)病毒含量测定:将浓缩后灭活前的病毒用细胞维持液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-73个稀释度接种96孔培养板CEF细胞单层，每个稀释度重复5孔，每孔0.1ml，5%CO2、37℃培养120小时，观察细胞病变（CPE），计算TCID50,每0.1ml病毒含量108.0TCID50，可用于制苗。
实施例2：疫苗的制备
1.油相制备取优质注射用白油3840ml，硬脂酸铝80ml，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-8080ml，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。
2水相制备：将检验合格的鸡新城疫病毒液、传染性支气管炎病毒液、传染性法氏囊病病毒液、病毒性关节炎病毒液、鸡减蛋综合症病毒液各400ml混合（使混合后使0.1ml水相中鸡新城疫病毒含量不低于108.5EID50，传染性支气管炎病毒含量不低于107.5EID50；传染性法氏囊病毒含量不低于107.0TCID50；病毒性关节炎病毒含量不低于107.5EID50，鸡减蛋综合症病毒含量不低于15log2）。取灭菌后的吐温-8080ml，加入配液罐中，同时加混合抗原液2000ml，充分振摇，开动搅拌电机搅拌30分钟，使吐温-80完全溶解。
3.乳化:油相4000ml、水相2000ml加入磁力搅拌罐中，开动电机，慢速转动搅30分钟，在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液60ml。然后采用ATS工业系统有限公司的AH100D型均质机调整二级阀压力为25bar、一级阀压力为400bar对 该混合物乳化2次，即得到所制备的油包水型灭活疫苗。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底无析出的水相。
4.分装:分装250ml/瓶，共24瓶，加盖密封。
实施例3:成品检验
实验室按照上述制备方法试制一批禽用五联疫苗疫苗约6000ml，批号为2011001。
1.性状
外观：乳白色乳剂。
剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均不扩散。
稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相为0.1ml，符合规定。
粘度：用1ml吸管（下口内径1.2mm，上口内径2.7mm）吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间在8秒以内。
2.装量检查按《中国兽药典》规定方法进行，测定3瓶结果为251.2ml、251.7ml、252.1ml，符合规定。
3.无菌检验按《中国兽药典》的规定进行，无菌生长。
4.安全检验用7日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，结果试验鸡均健活，无任何局部和全身不良反应。
5.效力检验
(1)鸡新城疫部分效力检验
采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。
1）血清学方法:用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，按《中国兽药典》规定方法进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值为1:24（微量法），未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值为1:2（微量法）。
2）免疫攻毒法:用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株 强毒（CVCC AV1611株）105.0ELD50，观察14日。对照组5只应全部死亡，免疫组10只全保护。
(2)鸡传染性支气管炎部分效力检验
用14日龄SPF鸡25只，其中20只各点眼、滴鼻接103.68EID50的分离强毒株1羽份（0.05ml），另5只不接种作为对照。接种后21日，分别采血，分离血清，同时免疫鸡再分别肌肉接种五联灭活疫苗0.4ml，二免后21日再将免疫鸡和对照鸡分别采血，分离血清。将两次血清分别测HI抗体效价。免疫组二免血清HI抗体效价的几何平均值比首免血清高7.1倍（首免为1:20，二免为1:142），未免疫对照组血清HI抗体效价的几何平均值为1:8（微量法）。
(3)鸡传染性法氏囊病部分效力检验
以下方法任择其一。
1）血清学方法:取21日龄SPF鸡20只，其中10只各肌肉或颈部皮下注射疫苗0.2ml，另外10只不免疫作为对照，同群饲养。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，做琼脂免疫扩散试验。免疫鸡10只琼扩效价为1:28，对照鸡应全部阴性。
2）免疫攻毒法:取21日龄SPF鸡20只，其中10只各肌肉或颈部皮下注射疫苗0.2ml，另外10只不免疫作为对照，同条件下隔离饲养。接种后21日，所有免疫鸡和对照鸡，每只点眼途径接种10倍稀释的鸡传染性法氏囊病毒BJQ902株毒液0.1ml。攻毒后，每天观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至96小时，扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病变。免疫鸡10只全部正常，不出现法氏囊病变；对照鸡10只全发病，出现明显的法氏囊病变（如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变）。
(4)病毒性关节炎部分效力检验
以下方法任择其一。
1）血清学方法取21日龄SPF鸡15只，其中10只颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另外5只不免疫作为对照，同群饲养。21日后，每只鸡分别采血、分离血清，做琼脂免疫扩散试验，免疫鸡10只抗体全部阳性，对照鸡5只全部阴性。
2）免疫攻毒法取21日龄SPF鸡15只，其中10只颈部皮下或肌肉注射疫苗 0.2ml，另外5只不免疫作为对照，同群饲养。21日后，每只鸡经脚垫接种鸡病毒关节炎病毒S1133株强毒，0.2ml（含2×104ELD50）/只，观察120小时，检查趾、跗关节病变。对照组5只鸡全发病，免疫组10只鸡全部保护。
(5)鸡减蛋综合症部分效力检验
用21日龄SPF鸡10只，每只肌肉或皮下注射疫苗1羽份(0.5ml)，另取条件相同的对照鸡10只，同群饲养。接种后21日，采血，测定HI抗体效价。免疫组HI抗体效价的几何平均值1∶181(微量法)，未免疫对照组每只鸡血清HI抗体效价均应1∶4(微量法)。
2011001批疫苗的效检试验结果见表1：
表1五联苗效力试验
表1五联苗效力试验
实施例4：抗原的浓缩工艺
本发明中一种禽用五联疫苗的病毒浓缩采用物理法和超滤法相结合的多级连续浓缩方式，其具体浓缩过程包括以下步骤：
1.将每组收获的病毒液反复冻融3次，管式离心机（GF105机型）5000rpm离心10分钟，去除大颗粒杂质，收集上清至无菌罐体中；
2.将上清液经8层纱布过滤，进一步对病毒液进行纯化，防止后续多次超滤对柱子的损害；
3.取滤液用截留分子量为350KD的Millipore膜包进行至少10倍浓缩，经超滤浓缩的病毒液流入无菌容器中，并反复循环通过超滤装置，待浓缩后体积达到原病毒液体积1/10时，抽样检验病毒含量，直至得到的病毒液达到浓缩要求停止浓缩。
实施例5：疫苗制备中的乳化工艺及乳化结果检测
本发明中一种禽用五联疫苗的乳化过程是采用高压均质机乳化法，其具体包括以下操作步骤：
1.在料斗中加入清水，开机。
2.调节均质机压力，现将二级均质阀压固定在25bar，再将一级均质阀调整到400bar。
3.待清水留到料斗底部时，往料斗中泵入混合1小时后的水油混合液，进行浓缩。在机器均质过程中，应随时补料。
抽样乳化的疫苗进行性状检验，以确定乳化是否完全，其主要检测标准为：
1.外观：乳白色乳剂。
2.剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均不扩散。
3.稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相为0.1ml，符合规定。
4.粘度：用1ml吸管（下口内径1.2mm，上口内径2.7mm）吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间在8秒以内。
实施例6：保存期实验
将实验室试制备的批号为2011001五联灭活疫苗4℃保存两年，第一年每三个月抽检一次，第二年每6个月抽检一次，前一年半抽检结果均达到标准，此次为两年后抽样取出用于以下实验。
1.性状
外观：乳白色乳剂。
剂型：油包水型，未出现分层。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均不扩散。
稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相为0.1ml，符合规定。
粘度：用1ml吸管（下口内径1.2mm，上口内径2.7mm）吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间在8秒以内。
2.无菌检验按《中国兽药典》的规定进行，无菌生长。
3.安全检验用7日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，结果试验鸡均健活，无任何局部和全身不良反应。
4.效力检验
（1）鸡新城疫部分效力检验采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。
1）血清学方法用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，按《中国兽药典》规定方法进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值为1:24（微量法），未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值为1:2（微量法）。
2）免疫攻毒法用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒（CVCC AV1611株）105.0ELD50，观察14日。对照组5只应全部死亡，免疫组10只全保护。
（2）鸡传染性支气管炎部分效力检验
用14日龄SPF鸡25只，其中20只各点眼、滴鼻接103.68EID50的分离强毒株1羽份（0.05ml），另5只不接种作为对照。接种后21日，分别采血，分离血清，同时免疫鸡再分别肌肉接种五联灭活疫苗0.4ml，二免后21日再将免疫鸡和对照鸡分别采血，分离血清。将两次血清分别测HI抗体效价。免疫组二免血清HI抗体效价的几何平均值比首免血清高6.7倍（首免为1:20，二免为1:134），未免疫对照组血清HI抗体效价的几何平均值为1:8（微量法）。
（3）鸡传染性法氏囊病部分效力检验
以下方法任择其一:
1）血清学方法取21日龄SPF鸡15只，其中10只各肌肉或颈部皮下注射疫苗0.2ml，另外10只不免疫作为对照，同群饲养。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，做琼脂免疫扩散试验。免疫鸡10只琼扩效价为1:26，对照鸡应全部阴性。
2）免疫攻毒法取21日龄SPF鸡15只，其中10只各肌肉或颈部皮下注射疫苗0.2ml，另外10只不免疫作为对照，同条件下隔离饲养。接种后21日，所有免疫鸡和对照鸡，每只点眼途径接种10倍稀释的鸡传染性法氏囊病毒BJQ902 株毒液0.1ml。攻毒后，每天观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至96小时，扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病变。免疫鸡10只正常，不出现法氏囊病变；对照鸡10只全发病，出现明显的法氏囊病变（如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变）。
（4）病毒性关节炎部分效力检验
以下方法任择其一:
1）血清学方法:取21日龄SPF鸡15只，其中10只颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另外5只不免疫作为对照，同群饲养。21日后，每只鸡分别采血、分离血清，做琼脂免疫扩散试验，免疫鸡10只抗体全部阳性，对照鸡5只全部阴性。
2）免疫攻毒法:取21日龄SPF鸡15只，其中10只颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另外5只不免疫作为对照，同群饲养。21日后，每只鸡经脚垫接种鸡病毒关节炎病毒S1133株强毒，0.2ml（含2×104ELD50）/只，观察120小时，检查趾、跗关节病变。对照组5只鸡全发病，免疫组10只鸡全部保护。
（5）鸡减蛋综合症部分效力检验
用21日龄SPF鸡10只，每只肌肉或皮下注射疫苗1羽份(0.5ml)，另取条件相同的对照鸡10只，同群饲养。接种后21日，采血，测定HI抗体效价。免疫组HI抗体效价的几何平均值1∶180(微量法)，未免疫对照组每只鸡血清HI抗体效价均应1∶4(微量法)。
实施例7：鸡传染性支气管炎肾型株K136株的筛选
CK/IBV/SD05毒株为我公司在山东某鸡场分离的疑似鸡传染性支气管炎病毒的毒株，分离病鸡主要表现为精神不振、咳嗽，常听到呼噜声，病理剖检发现除气管环有小出血点外肾脏还有明显病变，经鉴定为鸡传染性支气管炎病毒肾型流行毒株。使用10日龄SPF鸡胚对CK/IBV/SD05毒株进行连续传代致弱，每代通过尿囊腔接种4枚鸡胚，37℃孵育，接种后36h冻死鸡胚，收获尿囊液用于下一代接种，连传至136代，进行致弱评价。取第2、20、40、50、60、70、80、90、100、110、120、124、128、132、134、136代的毒株感染1日龄雏鸡。结 果从第80代病毒株开始受试鸡无死亡，第100代病毒株开始受试鸡无眼观病变，第120代病毒株开始受试鸡无组织学病变。说明CK/IBV/SD05于第120代已完全致弱，对受试鸡具有良好的安全性。同时用第124、128、132、134、136代毒分别免疫3日龄SPF鸡,免疫后14天用同源强度攻击，免疫组分毒率为0/10，对照组分毒率为10/10，说明本发明毒株具有良好的免疫保护性，为便于同以前毒株区分，将传代至136代弱化的CK/IBV/SD05毒株定为原始种毒E1代，命名为冠状病毒属鸡传染性支气管炎病毒科鸡传染性支气管炎病毒K136株，作为本发明中疫苗制备的候选毒株。本发明的鸡传染性支气管炎病毒K136株于2013年6月28日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：V201320。
实施例8：K136株安全性检测
1、不同代次K136株在鸡胚上的毒价测定
取K136株的E2、E4、E7、E10、E15代毒种，作适当倍数稀释，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，37℃孵育。对未死鸡胚，孵育144h后取出观察鸡胚发育情况，并做生理盐水接种鸡胚的空白对照。按照Reed-Muench方法计算EID50。
2、不同代次K136株在雏鸡上的致病性试验
选取10日龄SPF雏鸡，随机分为6组，每组10只鸡，分别以105。0EID50滴鼻接种取K136株的E2、E4、E7、E10、E15代毒种0.1ml，最后一组以生理盐水滴鼻0.1ml作为空白对照组，各组受试鸡均分开隔离饲养，连续观察20日后，扑杀、剖检各组受试鸡是否出现气管出血、分泌物增多、肾肿大、尿酸盐沉积等病变特征。结果表明，试验结束后各组受试鸡均健活，无任何异常反应，剖检结构无异常，结果见表1。
表1不同代次K136株在雏鸡上的致病性试验结果
实施例9：不同代次K136株免疫效力评价
用E2、E4、E7、E10、E15代次K136株毒种鸡胚尿囊液，以5×102.0EID50剂量，对1日龄SPF鸡滴鼻，免疫后14日，连同对照鸡，每只鸡用103.68EID50/0.1ml的分离株强毒CK/IBV/SD05株点眼、滴鼻各0.05ml，攻毒后第5日，采集每只鸡的气管拭子，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1ml/胚，孵育观察至144小时。结果显示，免疫组分毒率在0/10-1/10之间，保护率在9/10-10/10之间；对照组分毒率为10/10。说明IBV-K136株毒种在15代以内其免疫原性基本一致，均具有良好免疫原性，说明IBV-K136株具有良好的免疫保护性。
Claims (7)
1.一种禽用五联疫苗，疫苗抗原是由鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡减蛋综合症病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和鸡病毒性关节炎病毒组成，所述疫苗通过包括以下步骤的疫苗制备方法制备得到：
1）通过鸡胚扩大培养鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒；
2）通过鸭胚扩大培养鸡减蛋综合征病毒；
3）通过宿主细胞扩大培养鸡传染性法氏囊病病毒、鸡病毒性关节炎病毒；
4）分别收获上述病毒扩大培养产物并进行病毒浓缩；
5）分别对上述浓缩产物进行毒价测定和病毒灭活处理；
6）分别对上述灭活产物进行半成品检验；
7）利用检验合格的灭活产物进行抗原配比制得疫苗抗原；
8）疫苗抗原经乳化后得到疫苗成品；
9）疫苗成品经分装检验后即为商品化疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种禽用五联疫苗，其特征在于病毒浓缩采用的是物理法和超滤法相结合的多级连续浓缩方法。
3.根据权利要求1或2所述的一种禽用五联疫苗，其特征在于所述的多级连续浓缩方法包含以下浓缩步骤：
1）将每组收获的病毒液反复冻融后，离心去除大颗粒杂质，收集上清至无菌罐体中；
2）将上清液经8层纱布过滤，进一步纯化病毒液；
3）取滤液用截留分子量为350KD的Millipore膜包进行至少10倍浓缩，经超滤浓缩的病毒液流入无菌容器中，并反复循环通过超滤装置，待浓缩后体积达到原病毒液体积1/10时，抽样检验病毒含量，直至得到的病毒液达到浓缩要求停止浓缩。
4.根据权利要求1所述的一种禽用五联疫苗，其特征在于乳化方法是采用高压均质机乳化法。
5.根据权利要求1或4所述的一种禽用五联疫苗，其特征在于所述高压均质机是指AH100D高压均质机。
6.根据权利要求1所述的一种禽用五联疫苗，其特征在于所述疫苗抗原具体包括：鸡新城疫病毒La Sota株，保藏编号为CCTCC-V201320的鸡肾型传染性支气管炎病毒K136株，鸡减蛋综合症病毒京911株，鸡传染性法氏囊病毒BJQ902株，鸡病毒性关节炎病毒T98株。
7.一种禽用五联疫苗的制备方法，其特征在于其制备过程包括以下步骤：
1）通过鸡胚扩大培养鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒；
2）通过鸭胚扩大培养鸡减蛋综合症病毒；
3）通过宿主细胞扩大培养鸡传染性法氏囊病病毒、鸡病毒性关节炎病毒；
4）分别收获上述病毒扩大培养产物并进行病毒浓缩；
5）分别对上述浓缩产物进行毒价测定和病毒灭活处理；
6）分别对上述灭活产物进行半成品检验；
7）利用检验合格的灭活产物进行抗原配比制得疫苗抗原；
8）疫苗抗原经乳化后得到疫苗成品；
9）疫苗成品经分装检验后即为商品化疫苗。
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