CN102038949A

CN102038949A - 鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感（h9亚型）四联灭活疫苗的生产方法

Info

Publication number: CN102038949A
Application number: CN 201010611988
Authority: CN
Inventors: 李昌友; 宫晓; 李陆梅; 左青山; 徐宝娟
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2010-12-29
Filing date: 2010-12-29
Publication date: 2011-05-04

Abstract

本发明涉及一种鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感(H9亚型)四联灭活疫苗的生产方法。本发明采用新城疫病毒La Sota株、鸡传染性支气管炎病毒M41株、减蛋综合征病毒NE4株和A型禽流感病毒(H9亚型)YBF003株作为生产菌毒种，超强浓缩工艺和优质佐剂制备成灭活疫苗，免疫动物后抗体产生快，效价高，保护期长，降低了疫病的发生及蔓延。

Description

鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感(H9亚型)四联灭活疫苗的生产方法

技术领域

本发明是一种用于预防鸡的新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、H9亚型禽流感四种疫病油乳剂疫苗制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

鸡新城疫(newcastle disease，ND)具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性打击，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病。(殷震、刘景华，1997.动物病毒学.北京.科学出版社)。

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis，IB)感染可导致雏鸡、肉鸡发育缓慢，产蛋鸡产蛋减少和蛋品质下降等。OIE将其列为B类疫病。(殷震、刘景华，1997.动物病毒学.北京.科学出版社)。

禽流感(H9亚型)(Avain Influenza H9 subtype，AI)是由禽流感病毒(Avain Influenza virus)引起的、主要流行于动物和人类中的一种传染性、死亡率高的急性、高度传染性疾病，广泛发生于世界各地，对人类和养禽业危害很大。(殷震、刘景华，1997.动物病毒学.北京.科学出版社)。

鸡减蛋综合征(Egg Drop Syndrome，EDS)是由禽腺病毒III群中的病毒引起，以产蛋下降为特征，其主要表现为鸡群产蛋骤然下降，软壳蛋和畸形蛋增多，褐壳蛋蛋壳颜色变浅。目前，这种疾病已经成为世界范围内引起产蛋损失的重要原因之一。(殷震、刘景华，1997.动物病毒学.北京.科学出版社)。

现在市场上针对以上四种疫病的商品化产品品种很多，大多是很单一的传统疫苗，需要多次使用，不仅增加鸡场人力和物力负担，同时多次抓鸡的注射应激，还会影响生产性能，致使鸡群对疾病的易感性增大。

发明内容

本发明的目的是制备鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、H9亚型禽流感四种抗原，并进行合理复配制成含鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、H9亚型禽流感四种抗原的油乳剂疫苗，可以有效预防鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、H9亚型禽流感的发生，同时也可以大大注射次数过多对鸡群的应激，降低防疫人员的劳动强度，而且保证了公众健康。

该四联苗技术的主要相关内容和所采用的技术手段：

(1)减蛋综合征病毒NE4株由农业部动物疫病诊断及免疫重点开放实验室引进(陈傅言教授惠赠)，该毒株是从南京某鸡场患病的褐壳蛋鸡海赛克斯父母代种鸡中分离到的一株减蛋综合征病毒(李刚、郑明球.产蛋减少综合征(EDS₇₆)病毒的分离与初步鉴定.《畜牧与兽医》.1992(1)10～12)。该毒株已经过严格的毒种鉴定，其成果已荣获江苏省科技进步二等奖(成果编号为(92)苏科鉴字523号)。我们对该毒株用敏感鸭胚进行增殖，梯度离心纯化，再经过血清学、分子生物学等试验对各子代作了系统鉴定。

(2)禽流感(H9亚型)选育的新毒株要经过血清学、分子生物学等试验进行大量的临床病料分析鉴定工作，最后选出HA效价高、免疫原性好并能抵御H9亚型各地方流行毒攻击的一株较理想的制苗用毒株。

(3)利用美国进口的Millipore浓缩机将抗原经过超虑浓缩提纯，保证各单一病毒在联苗中均有和单苗一样的效果，且抗体产生快，效价高，保护期长，降低疫病的发生及蔓延。(浓缩机的生产厂家：美国密理博，型号为CUP50)。

(4)疫苗生产的主要步骤为：

(1)生产用菌毒种为La Sota株鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病M41株、鸡减蛋综合征病毒NE4株和YBF003株禽流感病毒H9亚型；

(2)分别按常规方法用鸡胚繁殖La Sota株鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病M41株和YBF003株禽流感病毒H9亚型、用鸭胚繁殖鸡减蛋综合征病毒NE4株，收获病毒液后经浓缩和灭活工艺制备成灭活病毒液；

(3)将以上制备的四种灭活抗原混合后按常规方法制备灭活佐剂疫苗。

本发明的详细描述

1.生产用种毒的来源

(1)鸡新城疫病毒La Sota株、效检用鸡新城疫强毒北京株(CVCC AV1611株)，购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所；

(2)鸡传染性支气管炎病毒M41，购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所；

(3)禽流感病毒(H9亚型)(本发明又统称为称禽流感病毒，Avian influenza virus)A/Chicken/shandong/11/05(H9N2)株(简称YBF003株)，该毒株已于2010年12月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4503。

(4)减蛋综合征病毒NE4株由农业部动物疫病诊断及免疫重点开放实验室引进(陈傅言教授惠赠)，该毒株是从南京某鸡场患病的褐壳蛋鸡海赛克斯父母代种鸡中分离到的一株减蛋综合征病毒(李刚、郑明球.产蛋减少综合征(EDS₇₆)病毒的分离与初步鉴定.《畜牧与兽医》.1992(1)10～12)。

2.生产用种毒的制备

鸡新城疫病毒La Sota株生产用毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-4或10^-5)，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水)，装于灭菌容器内。将检验无菌、对1％鸡红细胞凝集价不低于1∶512(微量法)的鸡胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

鸡传染性支气管炎病毒M41株生产用毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-2～10^-3)，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后30～48小时内死亡的鸡胚及48小时存活的鸡胚胚液(尿囊液及羊水)，装于无菌容器内。将检验无菌、病毒含量≥10^6.0EID₅₀/0.1ml、对1％鸡红细胞凝集试验为阴性的胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

减蛋综合征病毒NE4株毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-1～10^-2)，尿囊腔内接种11～12日龄易感鸭胚，每胚0.2ml。选接种后72～120小时内死亡及存活的鸭胚，收获胚液(尿囊液及羊水)，装于无菌容器内。将检验无菌且对1％鸡红细胞凝集价不低于1∶32768(微量法)的鸭胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

禽流感病毒YBF003株毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-3或10^-4)，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水)，装于灭菌容器内。将检验无菌、对1％鸡红细胞凝集价不低于1∶256(微量法)的鸡胚液混合，定量分装于安瓿中，冷冻保存，注明收获日期、毒种代次等。

3.制苗用病毒液的制备

(1)鸡新城疫病毒液的制备

接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-4或10^-5)，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

孵育与观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12～24小时。

收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1∶256(微量法)者应弃去。同时按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五年版三部.中国农业出版社，2005，本发明简称《中国兽药典》)规定的方法进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶2048(微量法)时停止浓缩，按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将浓缩的鸡新城疫病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过30日。

(2)鸡传染性支气管炎病毒液的制备

接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-2或10^-3)，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

孵育和观察鸡胚接种后24小时照胚1次，弃去死胚。此后每4小时照胚1次，死亡的鸡胚随时取出，直至48小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃中冷却12～24小时。

收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样检测病毒含量，应≥10^6.0EID₅₀/0.1ml。同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将浓缩的传染性支气管炎病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过30日。

(3)减蛋综合征病毒液的制备

接种将生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-1～10^-2)，按《全自动接种机使用说明》要求，接种11～12日龄的易感鸭胚(母源抗体滴度不高于1∶4)，每胚尿囊腔内接种0.2ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

孵育与观察鸭胚接种后，弃去72小时前的死胚。72小时后，每4～6小时照胚1次，死亡的鸭胚随时取出，直至120小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。

收获将冷却的鸭胚取出，用碘酊消毒气室部位(如有凝结水，应擦干后再涂碘酊)，然后以无菌方法剥除气室部卵壳，揭去卵膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液。对每枚鸭胚在吸取胚液前应注意检查，凡胎儿腐败、胚液浑浊及有任何污染可疑者，都弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干枚鸭胚分为一组，吸取胚液放入同一灭菌的容器内，每组抽样测定红细胞凝集价，凝集价低于1∶16384(微量法)者应弃去。同时按《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无细菌生长。收获的胚液浓缩(灭活)前在2～8℃保存，应不超过5日。

浓缩将收获的血凝效价低于1∶32768(微量法)的鸭胚病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶32768(微量法)时停止浓缩，按《中国兽药典》附录进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将红细胞凝集价不低于1∶32768(微量法)减蛋综合征病毒胚液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。然后将胚液导入另一灭活罐内，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内液体温度达到37℃开始计时)后放2～8℃保存，应不超过30日。

(4)H9亚型禽流感病毒液的制备

接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-3或10^-4)，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

孵育和观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将48小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。

收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml 灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1∶256(微量法)者应弃去。同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

浓缩将收获的鸡胚病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶1024(微量法)时停止浓缩。按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将浓缩的H9亚型禽流感病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过30日。

4.灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备。

油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-80 6份，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。

水相制备将检验合格的鸡新城疫病毒胚液、传染性支气管炎病毒胚液、减蛋综合征病毒胚液、H9亚型禽流感病毒胚液以适当比例混合，使水相中鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀/0.1ml、鸡传染性支气管炎病毒含量不低于10^6.0EID₅₀/0.1ml、鸡减蛋综合征病毒不低于8192个HA单位、H9亚型禽流感病毒含量不低于10^7.0EID₅₀/0.1ml。取混合抗原液96份，灭菌的吐温-80 4份，导入配液罐中，开启搅拌电机充分搅拌20～30分钟，使吐温-80完全溶解。

乳化取油相3份放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以4000r/min搅拌30～40分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

5.本发明技术与现有技术的区别

(1)我们所采用的减蛋综合征病毒NE4株(由南京农业大学陈傅言教授1995年惠赠)是从南京某鸡场患病的褐壳蛋鸡海赛克斯父母代种鸡中分离到的一株减蛋综合征病毒。该毒株已经过严格的毒种鉴定。本发明人对该毒株用敏感鸭胚进行增殖，梯度离心纯化，再经过血清学、分子生物学等试验对各子代作了系统鉴定。

(2)我们所采用的A型禽流感病毒(H9亚型)毒株YBF003株是在全国各地经过血清学、分子生物学等试验进行大量的临床病料分析鉴定的新毒株，它是一株HA效价高、免疫原性好并能抵御H9亚型各地方流行毒攻击的一株较理想的制苗用毒株。

(3)本发明所采用的浓缩工艺是利用美国进口的Millipore浓缩机浓缩，虽然目前国内外的一些厂家都采用此类浓缩技术，但是我们在本产品的浓缩工艺环节中加大了抗原浓缩倍数，经过超强浓缩后的抗原，制备疫苗后抗体产生快，效价高，保护期长，降低了疫病的发生及蔓延。

本发明的积极意义

附图说明

图1本发明的工艺流程图，其中：

NDV、IBV、AIV接种鸡胚：指鸡胚在孵化至10～11日龄时接种鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感病毒在鸡胚内进行繁殖；EDSV接种鸭胚：指鸭胚在孵化至11～12日龄时接种减蛋综合征病毒在鸭胚内进行繁殖。

收获：在培养到规定的时期，将鸡(鸭)胚中繁殖的鸡(鸭)胚液病毒进行收获。

病毒浓缩：将收获的含毒胚液在2～8℃条件下采用美国Millipore超滤浓缩机进行抗原的浓缩，使其提高抗原含量，并同时对抗原做了进一步的纯化。

测毒价：测其抗原的血凝价。

灭活：将抗原液都用适量的甲醛溶液进行灭活，灭活掉抗原活性及外毒素。

半成品检验：是指要进行灭活检验、无菌检验等，使其各个指标在半成品时合格，才能进行下一步。

水相制备：指以上检验合格的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、H9亚型禽流感半成品等量混合再加入吐温-80混合。

乳化：指将含有抗原的水相和油相按照一定的配比方法充分的混合在一起，即成为成品的疫苗状态。

最佳实施方式

实施例1

(一)抗原制备以及半成品检验

1.鸡新城疫病毒液的制备

(1)接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-4或10^-5)，接种4997枚10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

(2)孵育与观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12～24小时。

(3)收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1∶256(微量法)者应弃去。收获的62800mL合格胚液，同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

(4)浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶2048(微量法)时停止浓缩，浓缩后16000mL胚液，按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

(5)灭活将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

2.鸡传染性支气管炎病毒液的制备

(1)接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-2或10^-3)，接种6213枚10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

(2)孵育和观察鸡胚接种后24小时照胚1次，弃去死胚。此后每4小时照胚1次，死亡的鸡胚随时取出，直至48小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃中冷却12～24小时。

(3)收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样检测病毒含量，应≥10^6.0EID₅₀/0.1ml。收获的64000mL合格胚液同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

(4)浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，浓缩后16000mL的胚液同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

(5)灭活将传染性支气管炎病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

3.减蛋综合征NE4株病毒液的制备

(1)接种将生产用毒种，用灭菌生理盐水作50倍稀释，接种4120枚11～12日龄的易感鸭胚，每胚尿囊腔内接种0.2ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

(2)孵育与观察鸭胚接种后，每日照胚1次，弃去72小时前的死胚。72小时后，每4～6小时照胚1次，死亡的鸭胚随时取出，直至120小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。

(3)收获将冷却的鸭胚取出，用碘酊消毒气室部位(如有凝结水，应擦干后再涂碘酊)，然后以无菌方法剥除气室部卵壳，揭去卵膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液。对每个鸭胚在吸取胚液前注意检查，凡胎儿腐败、胚液浑浊及有任何污染可疑者，都弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干个鸭胚分为一组，吸取胚液放入同一灭菌的容器内，每组抽样测定血凝价。血凝价低于14log₂者弃去。收获的21000mL合格胚液同时按《中国兽药典》附录进行无菌检验。收获的胚液灭活前在2～8℃保存。

(4)浓缩将收获的血凝效价低于15log₂的鸭胚病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，抽样测定红细胞凝集价，凝集价≥15log₂时停止浓缩，按《中国兽药典》附录进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。浓缩后的胚液随即进行灭活。

(5)灭活将血凝效价不低于15log₂的无菌胚液混合于灭活罐内，吸取数毫升样品备测毒价，其余胚液计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后倒于另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后放37℃灭活16小时(以瓶内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存。

4.H9亚型禽流感病毒液的制备

(1)接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-3或10^-4)，接种5800枚10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

(2)孵育和观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将48小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。

(3)收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1∶256(微量法)者应弃去。收获的71000mL胚液同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

(4)浓缩将收获的鸡胚病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶1024(微量法)时停止浓缩。浓缩后18000ml的胚液按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

(5)灭活将H9亚型禽流感病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

(二)半成品检验

1.鸡新城疫病毒液

(1)病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，各尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶128(微量法)者，判为感染，计算EID50，每0.1ml病毒含量≥10^8.7EID₅₀的胚液，方可用于制苗。

(2)红细胞凝集价测定取浓缩后灭活前的胚液，按《中国兽药典》进行测定，其凝集价不低于1∶2048(微量法)者，方可用于制苗。

(3)灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异死亡应不超过1个。对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价时，认为灭活完全。

(4)无菌检验取灭活的胚液按《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

2.传染性支气管炎病毒液

(1)病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10^-5、10^-6和10^-73个稀释度，分别尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，每日照胚2次，观察6日。6日后收取鸡胚，无论死胚、活胚(接种后24小时内死亡者除外)均称重观察鸡胚病变，其胎儿具有失水、卷缩、发育小(接种胎儿重量比对照胚最轻胎儿重量少2克以上)等特异性病痕者，判为感染，计算EID₅₀。每0.1ml病毒含量≥10^6.7EID₅₀，方可用于制苗。

(2)无菌检验取灭活的病毒液，按《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

(3)灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1个。对所有鸡胚进行检验，应均不出现失水、卷缩、发育小等现象。将胚液收获再盲传一代，仍不出现失水、蜷缩、发育小等现象时，认为灭活完全。

3.减蛋综合征病毒液

(1)无菌检验取灭活的鸡减蛋综合征胚液，按《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无细菌生长。

(2)灭活检验取11～12日龄易感鸭胚6枚，尿囊腔内接种灭活后的胚液，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸭胚非特异死亡应不超过1枚。对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现凝集。将胚液收获再盲传一代，然后测定红细胞凝集价，仍无凝集价时认为灭活完全。

(3)毒价测定将灭活前取出的鸭胚液，测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶32768(微量法)者，方可用于制苗。

4.H9亚型禽流感病毒液

(1)病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-8 3个稀释度，各尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶16(微量法)者，判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^7.7EID₅₀时，方可用于制苗。

(2)红细胞凝集价测定将浓缩后灭活前的胚液测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶1024(微量法)者，方可用于制苗。

(3)无菌检验取灭活的胚液按《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

(4)灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活浓缩胚液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价时，认为灭活完全。

(三)疫苗制备：

1.油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-80 6份，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。

2.水相制备将检验合格的鸡新城疫病毒液、传染性支气管炎病毒液、减蛋综合征病毒液、H9亚型禽流感病毒液按等量混合，使水相中鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀/0.1ml、鸡传染性支气管炎病毒含量不低于10^6.0EID₅₀/0.1ml、鸡减蛋综合征病毒不低于8192个HA单位、H9亚型禽流感病毒含量不低于10^7.0EID₅₀/0.1ml。取混合抗原液96份，灭菌的吐温-80 4份，导入配液罐中，开启搅拌电机充分搅拌20～30分钟，使吐温-80完全溶解。水相总量共计64000mL。

3.乳化取油相3份(192000mL)放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以4000r/min搅拌30～40分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。成品疫苗共计256000mL。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

4.分装定量分装，加盖密封。

实施例2

成品检验

1.性状

外观乳白色乳剂。

剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

粘度用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)，吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，在6秒内为合格。

2.无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

3.安全检验用21～35日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

4.效力检验

(1)鸡新城疫部分采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。

1)血清学方法用21～35日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，按《中国兽药典》附录进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1∶16(微量法)，未免疫对照组每只鸡血清HI抗体效价均应不高于1∶4(微量法)。

2)免疫攻毒法用21～35日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5 只作对照。接种后21～28日，每只鸡分别肌肉注射鸡新城疫病毒强毒北京株(CVCC AV1611株)10^5.0ELD₅₀，观察14日。未免疫对照组应全部死亡，免疫组应保护至少7只。

(2)鸡传染性支气管炎部分用21～35日龄SPF鸡25只，20只各点眼接种传染性支气管炎活疫苗(H120株，市售商品疫苗)1羽份(0.05ml)，另5只作对照。接种后21～28日分别采血，分离血清，同时免疫鸡再各接种四联灭活疫苗0.3ml，二次接种后21～28日再分别采血，分离血清。将两次血清按《中国兽药典》方法分别测定HI价。免疫组二免血清的HI抗体效价的几何平均值应至少是首免血清的4倍，未免疫对照组每只鸡血清HI抗体效价均应不高于1∶8(微量法)。

(3)鸡减蛋综合征部分用21～35日龄SPF鸡10只，每只肌肉或皮下注射疫苗0.5ml，另取条件相同的对照鸡10只，同群饲养。接种后21～35日，采血，测定HI抗体效价。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1∶128(微量法)，未免疫对照组每只鸡血清HI抗体效价均应不高于1∶4(微量法)。

(4)H9亚型禽流感部分

1)血清学方法用21～35日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，按《中国兽药典》方法进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1∶128(微量法)，未免疫对照组每只鸡血清HI抗体效价均应不高于1∶4(微量法)。

2)免疫攻毒法用21～35日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡翅静脉注射10倍稀释的YBF003株毒液，每只0.2ml，于攻毒后3～5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5枚，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚液的凝集价不低于1∶16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组应至少9只鸡病毒分离为阴性；对照组应至少4只鸡病毒分离为阳性。

5.甲醛、汞类防腐剂残留量测定分别按《中国兽药典》规定的方法进行测定，符合兽用生物制品通则的规定。

Claims

1.一种鸡新城疫、传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、禽流感H9亚型四联灭活疫苗，其特征在于该疫苗主要成分是灭活的La Sota株鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病M41株、鸡减蛋综合征病毒NE4株和YBF003株禽流感病毒H9亚型和疫苗佐剂，其中YBF003株禽流感病毒H9亚型毒株已于2010年12月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4503。

2.一种鸡新城疫、传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、禽流感H9亚型四联灭活疫苗的生产方法，其特征在于：

3.如权利要求2所述一种鸡新城疫、传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、禽流感H9亚型四联灭活疫苗的生产方法，其特征在于四种灭活抗原混合的比例是：使水相中鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀/0.1ml、鸡传染性支气管炎病毒含量不低于10^6.0EID₅₀/0.1ml、鸡减蛋综合征病毒不低于8192个HA单位、H9亚型禽流感病毒含量不低于10^7.0EID₅₀/0.1ml。