CN102302775B - 鸡新城疫与h9亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了鸡新城疫和H9亚型禽流感二联浓缩灭活疫苗，含灭活的新城疫病毒LaSota株和灭活的H9亚型禽流感病毒HL株及佐剂。本发明还提供二联浓缩灭活疫苗的制备方法。本发明通过提高疫苗单位体积的抗原含量，使疫苗免疫剂量降低到现有疫苗的1/3剂量，即对于1～5周龄鸡，每只0.3ml疫苗降低到0.1ml疫苗，从而减小疫苗免疫对机体的应激反应，而且适用于小日龄鸡群，增大疫苗的适用范围。此外，在降低疫苗剂量的前提下，本发明的疫苗的免疫效果没有降低。因此，本发明提供了一种免疫剂量小、免疫效果更好、成本更低、免疫保护期更长的新城疫、禽流感二联疫苗。

Description

鸡新城疫与H9亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种鸡新城疫与H9亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法，特别是指一种免疫剂量小、免疫效果更好的鸡新城疫与H9亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒属(Paramyxovirus)中的一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。弱毒株仅引起鸡群呼吸道感染和产蛋量下降，但可迅速康复。人类可因接触病禽和活毒疫苗而引起结膜炎或淋巴腺炎，但很快便康复。新城疫病毒被OIE规定为A类疫病，是一种急性、高度接触性传染病，发病率和死亡率都在90％以上，1935年梁英、马闻天等首次证实我国有该病的流行，现在本病被我国列为I类疫病。

禽流感(Avian influenza，AI)是由正粘病毒科流感病毒属的A型流感病毒引起的一种以侵害呼吸系统为主的急性传染病、该病发生于各种家禽和野鸟。至1878年禽流感首发于意大利，目前全球性的禽流感大流行已出现多次，特别是自2003年12月以来，高致病性禽流感横扫亚洲多国家禽养殖业，造成极大的经济损失。禽流感病毒的抗原非常容易变异，这是禽流感反复流行的重要原因，禽流感病毒存在多种亚型，在特种条件下会跨越种属界限而传染到人，2004年初在越南流行感染人的H5N1再一次给人类敲响了警钟。

目前新城疫、禽流感严重危害家禽养殖业的发展，在各种防控措施中，疫苗免疫仍为最重要的措施。针对新城疫、禽流感，现已有相应的单项灭活疫苗及二联灭活苗，现有疫苗免疫剂量大(1～5周龄鸡，每只0.3ml)，免疫应激大，特别不适于对小日龄鸡的免疫。如《鸡新城疫病毒禽流感病毒二联灭活疫苗免疫试验》(中国家禽，2009年)使用鸡新城疫-禽流感二联苗，但其注射剂量仍为0.3ml/只(参见1.2.4节)，免疫效果对禽流感的保护率最高仅为5/10的保护率(参见第50页表3、表4)。又如《鸡新城疫-禽流感二联油乳剂灭活苗的研制及应用效果》(任素芳等，山东农业科学，2002年第6期第38页)一文中公开了一种鸡新城疫-禽流感二联油乳剂灭活苗，即“40只试验鸡注射0.3ml疫苗免疫，从免疫后第2周开始采血检测抗体”。但是该二联疫苗的免疫的剂量偏大，每只鸡为0.3ml。在这种情况下，免疫剂量大，免疫应激大，特别不适于小日龄的鸡。而且，由于油乳剂疫苗的粘连性，给疫苗的接种带来了困难。

因此，当前研制出免疫剂量小、免疫效果更好、成本更低、免疫保护期更长的新城疫、禽流感二联疫苗是一项紧迫的任务。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种预防鸡新城疫和H9亚型禽流感二联浓缩灭活疫苗组合物含有灭活的新城疫病毒LaSota株；灭活的H9亚型禽流感病毒HL株和佐剂。

其中新城疫(LaSota株)抗原，疫苗中优选含灭活的鸡新城疫病毒(LaSota株)病毒含量每0.1ml≥4×10^8.0EID50，灭活浓缩后HA价≥10log2；H9亚型禽流感HL株灭活前病毒含量每0.1ml≥4×10^8.0EID50，灭活浓缩后HA价≥10log2。最优选病毒含量每0.1ml≥4×10^8.5EID50。

本发明的免疫佐剂为白油，最优选法国美孚公司白油。

本发明的另一目的在于提供一种治疗和预防鸡新城疫和H9亚型禽流感二联浓缩灭活疫苗的制备方法，其步骤如下：

1)生产用毒种的制备：H9亚型禽流感病毒HL株和新城疫LaSota株毒种繁殖、毒种鉴定(病毒含量、纯净性、特异性)、毒种保存、毒种继代；

2)制苗病毒液的制备：接种、孵育与观察、收获、检验；

3)制苗病毒液的浓缩：浓缩装置的灭菌、病毒液浓缩、浓缩检验；

4)制苗病毒液的灭活：甲醛灭活；

5)半成品检验：无菌检验、灭活检验、病毒含量测定；

6)油乳剂灭活苗的制备：油相制备、水相制备、乳化制苗；

7)成品检验：物理性状、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛硫柳汞残留量测定。

由本发明下面的实施例可以看出，本发明通过提高疫苗单位体积的抗原含量，使疫苗免疫剂量降低到现有疫苗的1/3剂量，即对于1～5周龄鸡，每只0.3ml疫苗降低到0.1ml疫苗，从而减小疫苗免疫对机体的应激反应，而且适用于小日龄鸡群，增大疫苗的适用范围。此外，在降低疫苗剂量的前提下，本发明的疫苗的免疫效果没有降低。即，本发明提供了一种免疫剂量小、免疫效果更好、成本更低、免疫保护期更长的新城疫、禽流感二联疫苗。

具体实施方式

本发明实施例的禽流感病毒A/Chicken/Henan/Luoyang/HL/2001(H9N2)(简称HL株)。已于文献《鸡新城疫病毒禽流感病毒二联灭活疫苗免疫试验》(中国家禽，2007年第29卷第16期，49-52)中公开，并在普莱柯生物股份有限公司保藏。鸡新城疫病毒Lasota株，购自中国兽医药品监察所。

实施例1鸡新城疫和H9亚型禽流感二联浓缩灭活疫苗的制备

1生产用毒种的制备

1.1H9HL株毒种繁殖及鉴定

1.1.1毒种繁殖禽流感病毒A/Chicken/Henan/Luoyang/HL/2001(H9N2)(简称HL株)。将HL株冻干毒用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-3～10^-4)，0.1ml/枚尿囊腔接种10日龄SPF胚，于37℃孵育96h，期间48h以前的死胚弃去，48h后每隔4～6小时照胚1次，及时取出死亡的胚。至96h全部取出，放2～8℃冰箱冷藏12h以上，分别收获鸡胚液，装入灭菌容器中，将检验无菌且HA≥1∶512的鸡胚液混合，定量分装，每瓶2ml，冷冻保存。注明收获日期、毒种代数等。

1.1.2病毒含量测定将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-9倍稀释毒种。

上述三个稀释度经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各5枚，每胚0.1ml，37℃继续孵育，24h前死去的胚弃去不计，在24～120h死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的鸡胚液等体积量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120h，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1∶16者判为感染，计算EID50。EID50≥10^-8.0/0.1ml。

1.1.3特异性HI试验毒种对抗H9亚型禽流感病毒特异性血清应为阳性反应，

对抗H5亚型禽流感病毒特异性血清、抗新城疫特异性血清、抗减蛋综合症病毒特异性血清均应为阴性反应。

鸡胚中和试验将毒种用灭菌生理盐水1000倍稀释，与等量抗AIV H9亚型特异性血清混合，室温中和1h，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml；同时SPF胚5枚为对照，尿囊腔接种1000倍稀释的毒种，每胚0.1ml，同条件培养，观察至120h，记录观察结果。中和组鸡胚应至少有4枚健活，对照组应至少4枚感染，感染判定标准是鸡胚死亡或存活的鸡胚测定其鸡胚液血凝价≥1∶16。

1.1.4纯净按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000版)附录448-451页方法进行，无细菌、支原体、外源病毒污染。

1.1.5毒种保存-15℃以下保存，保存期应不超过6个月即可。

1.1.6毒种继代应不超过3代即可。

1.2新城疫病毒(下简称NDV)Lasota株毒种繁殖及鉴定

1.2.1毒种繁殖鸡新城疫病毒Lasota株，购自中国兽医药品监察所。将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-3～10^-4)，按0.1ml/枚尿囊腔接种10日龄SPF胚，培养120h，每隔4～6小时照胚1次，及时取出死亡的胚，选接种后72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液，装于灭菌容器中。将检验无菌且HA≥1∶512的鸡胚液混合，定量分装，每瓶2ml，冷冻保存。注明收获日期、毒种代数等。

1.2.2病毒含量测定将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-9稀释毒种。

上述三个稀释度经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各5枚，每胚0.1ml，37℃继续孵育，48h前死去的胚弃去不计，在48～120h死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的鸡胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120h，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1∶128者判为感染，计算EID50。EID50≥10^8.0/0.1ml。

1.2.3纯净按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000版)附录448-452页方法进行，无细菌、支原体、外源病毒污染。

1.2.4特异性将毒种用灭菌生理盐水稀释至10^5.0EID50/0.1mL倍稀释，与等量抗NDV特异性血清混合，室温中和1h后，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，观察至120h，在24～120h内应不引起特异性死亡，且至少存活8枚，测定血凝性，应为阴性。

1.2.5毒种保存-15℃以下保存，不超过6个月。

1.2.6毒种继代不超过3代。

2.制苗病毒液的制备

2.1鸡新城疫病毒(下简称NDV)LaSota株制苗用病毒液制备取生产用NDV La Sota株毒种，用灭菌生理盐水作200倍稀释，经尿囊腔接种10日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml。置36～37℃孵育，每4小时照蛋1次，随时取出死亡鸡胚，，直至96小时全部取出，置2～8℃冷却12～24小时后收取尿囊液，死胚和活胚分别收获，置-20℃保存。抽样测定HA效价及EID₅₀的测定，HA效价低于1∶128者弃去，同时每0.1ml病毒液的病毒含量≥10^8.0EID₅₀。

2.2禽流感病毒(下简称AIV)HL株病毒液的制备取生产用AIV HL株毒种，用无菌生理盐水作50万倍稀释，分别经尿囊腔内接种10日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml。置36～37℃孵育，每4小时照蛋1次，随时取出死亡鸡胚，直至96小时全部取出，置2～8℃冷却12～24小时后收取尿囊液，死胚和活胚分别收获，置-20℃保存。抽样测定HA效价及EID₅₀的测定，每0.1ml病毒液含量≥10^8.0EID₅₀。

3制苗病毒液的浓缩

3.1浓缩装置的灭菌预过滤柱、容器、管道等采用高压蒸汽121℃灭菌40min。超滤膜包清洗后排净膜包内水分，用2％v/v甲醛溶液循环5～10min，关闭循环泵，使甲醛溶液在膜包内保持24h以上。使用前放掉甲醛溶液，用灭菌注射用水反复冲洗至PH7.0～7.2。

3.2浓缩先将病毒液在无菌条件下用灭菌的二级预过滤柱滤过，除去病毒液中的残渣和其它杂质。再用上述超滤浓缩装置，将病毒液连续循环，水分不断渗出，完成病毒浓缩过程，分别将NDV和AIV病毒液按4倍体积比例进行浓缩。浓缩结束后，用蒸馏水将超滤膜包的残留物冲洗出来，然后用0.1M NaOH溶液反复循环冲洗30min，停止循环，使NaOH溶液在膜包内保持10h以上，再用蒸馏水将NaOH洗净，用甲醛溶液浸泡消毒。

3.3浓缩效果测定2种病毒浓缩前和浓缩后，用测血凝价HA方法进行检查，并确定浓缩终点，进行4倍浓缩前后HA关系为：浓缩后HA＝2+浓缩前HA。

2种病毒液按上述浓缩终点进行浓缩，浓缩后的病毒应达到浓缩终点的要求，同时对浓缩过程中的废弃液应随时抽样进行检查，检查其HA为零，符合要求。

4制苗病毒液的灭活

将无菌的两种病毒液分别以4层纱布及一层细铜纱网滤过，混合于一个大玻璃瓶内，吸出数毫升样品备测毒价用。其余的病毒液分别加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的终浓度为0.1％。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37℃灭活16h(以瓶内温度达到37℃开始计时)期间振摇3～4次。灭活后置2～8℃保存，保藏时间不超过1个月。

5半成品检验

5.1无菌检验取灭活的病毒液按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000版)附录448页方法进行，无菌生长，符合要求。

5.2灭活检验

5.2.1NDV灭活检验取10日龄无新城疫病毒抗体的鸡胚6枚，每个接种灭活胚液0.2ml，置36～37℃孵育，每日照蛋2次，弃去24h死亡的鸡胚，观察120h，鸡胚非特异性死亡不超过1枚。对所有的胚液测定血凝价，应不出现血凝，并盲传1代，测定血凝价，均不出现血凝，判为灭活完全。

5.2.2AIV灭活检验取10日龄无禽流感病毒抗体的鸡胚6枚，每个接种灭活胚液0.2ml，置36～37℃孵育，每日照蛋2次，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1个。对所有的胚液测定血凝价，不出现血凝，并盲传1代，测定血凝价，均不出现血凝，判为灭活完全。

6油乳剂灭活苗的制备

6.1水相制备将上述灭活的抗原液，以NDV浓缩液：AIV浓缩液按一定比例混合后，按抗原混合液的4％加体积吐温-80，充分摇匀，使吐温-80完全溶解，即为水相。

6.2油相制备白油94份、司本-806份，混合后加硬脂酸铝1.5份，将3种成分混合加热完全溶解后，121℃高压灭菌40min，冷却后备用，即为油相。

6.3乳化按水相∶油相＝1∶2的比例乳化。将乳化机的转子在75体积％酒精中浸泡过夜后备用。先加油相2份于灭菌容器中，开动电机慢慢搅拌，然后徐徐加入水相1份，加完后再以2800rpm乳化4分钟。在终止乳化前加入1体积％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01体积％。乳化后取10ml以3000rpm离心15min，不出现分层现象。

6.4疫苗制备配方按下表配制不同抗原含量的鸡新城疫和H9亚型禽流感二联浓缩灭活疫苗。通过对抗原的浓缩分别制备鸡新城疫和H9亚型禽流感二联浓缩疫苗，疫苗1、2、3组分别含有不同的抗原含量。

实施例二、鸡新城疫和H9亚型禽流感二联浓缩灭活疫苗的效果测定

1物理性状

外观肉眼观察成品制剂为白色均匀乳剂。

剂型呈油包水型。取一支清洁的吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，呈油滴状，不扩散。

稳定性将疫苗置10ml离心管中，3000rpm离心15min，管底析出水相≤0.5ml。

粘度用出口内径为1.2mm的1ml吸管，吸取25℃左右的疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，在8s以内，检验合格。

2无菌检验按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000版)P448方法进行检验，无细菌生长，结果见表2。

表2二联苗中试物理性状检验及无菌检验

3安全检验取3～6周龄SPF鸡10只，每只肌肉分点注射二联苗1.0ml，连续观察14天，应不发生因注射疫苗而出现的任何局部及全身反应，结过见表2。

表2二联苗中试安全检验

4免疫效力检验

4.1新城疫部分30～60日龄SPF鸡，每组10只，皮下或肌肉注射苗7ul，设对照组10只不免疫。接种后21日后采血，分离血清，用鸡新城疫抗原测定HI抗体效价。免疫组NDV的HI抗体效价的几何平均值应≥4log2，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应≤2log2。结果见表3。

4.2禽流感(H9亚型)部分3～4周龄SPF鸡或健康鸡(HI≤4)，每组10只，鸡肌肉注射苗0.1ml，另外10只不免疫作为对照。接种后21日后采血，分离血清，用H9亚型抗原测定HI抗体效价。免疫鸡HI抗体几何平均滴度应≥6.5log2，对照鸡应为阴性。结果见表3。

4.3效力检验结果分析第1、2、3组疫苗都能达到效检标准，提高疫苗抗原含量能够减少免疫剂量，但抗原含量与免疫剂量并非正相关，通过本试验证明免疫剂量减少到原剂量的1/3，抗原含量为原来的2倍即能达到效力检验标准。

表3二联苗的效力检验

5.甲醛、硫柳汞残留量测定按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000版)P456-457方法进行，兽用生物制品通则的规定。

实施例3鸡新城疫和H9亚型禽流感二联浓缩灭活疫苗与鸡新城疫(LaSota株)和H9亚型禽流感(HL株)二联灭活疫苗的免疫效果比较试验

1.小日龄鸡全身及局部免疫反应取1～10日龄SPF鸡20只，分为两组，一组用实施例一中疫苗制备配方1所配制的疫苗免疫，每只肌肉注射0.1ml；另一组用市场购买疫苗免疫(鸡新城疫、禽流感H9亚型二联灭活疫苗；齐鲁动物保健品公司，批号20110230)，每只肌肉分点注射二联苗0.3ml，注射后连续14天观察全身反应和局部反应，具体情况见表4。

表4小日龄鸡免疫观察结果

小日龄鸡免疫效力检验取1～10日龄SPF鸡20只，分为两组，一组用实施例一中疫苗制备配方1所配制的疫苗免疫，另一组用市场购买疫苗免疫(鸡新城疫、禽流感H9亚型二联灭活疫苗；齐鲁动物保健品公司，批号20110230)，按照效力检验标准进行免疫，21天后采血测HI，具体结果见表5。

表5小日龄鸡免疫观察结果

通过上述试验，所制备的三组鸡新城疫(LaSota株)和H9亚型禽流感(HL株)二联浓缩灭活疫苗都能达到《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000版)所规定的质量标准。在满足质量标准的前提下，优先选择第一组疫苗的配比方法。

通过免疫效力检验证明，本方法所制备的疫苗抗体水平检测符合免疫效力检验标准，而免疫剂量是目前市场上销售同类疫苗的1/3剂量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种治疗和预防鸡新城疫和H9亚型禽流感的二联浓缩灭活疫苗，其特征在于，含有灭活的新城疫病毒LaSota株，灭活的H9亚型禽流感病毒HL株和佐剂，其中，所述新城疫病毒LaSota株的含量为每0.1ml≥4×10^8.0EID50，灭活浓缩后HA价≥10log2；所述的H9亚型禽流感HL株病毒含量每0.1ml≥4×10^8.0EID50，灭活浓缩后HA价≥10log2。

2.根据权利要求1所述的二联浓缩灭活疫苗，其特征在于，所述的新城疫病毒LaSota株的含量为每0.1ml≥4×10^8.5EID50，所述的H9亚型禽流感HL株病毒的含量为每0.1ml≥4×10^8.5EID50。

3.根据权利要求1所述的二联浓缩灭活疫苗，其特征在于，所述的免疫佐剂为白油。