CN101716342B - 鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗及其制造方法，本发明所涉及的疫苗含有经灭活的鸡新城疫病毒ZM10株、传染性支气管炎病毒M41株病毒液和常规油佐剂。用本发明的疫苗接种鸡能安全有效的预防鸡新城疫和鸡传染性支气管炎；本发明是用鸡新城疫病毒ZM10株、传染性支气管炎病毒M41株分别接种鸡胚培养，收获感染胚液，经浓缩后，用甲醛溶液灭活、混合，加常规油佐剂乳化制成。

Description

鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗及其制造方法

技术领域

本发明涉及一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗及其制造方法，属于动物用生物制品技术的领域。

背景技术

新城疫是由新城疫病毒引起的鸡、鸽和火鸡急性高度接触性传染病，在未经疫苗预防的鸡群，常呈败血经过。主要是呼吸困难，下痢，神经紊乱，黏膜和浆膜出血。近年来发现，鸭、鹅等水禽感染该病后也会造成严重病理变化。

本病1926年首次发现于印尼，同年发现于英国新城，根据发现地名而命名为新城疫。本病分布于世界各地，在没有免疫的易感鸡群，发病率和死亡率都很高，是严重危害养鸡业的重要疾病之一，造成很大经济损失。

鸡新城疫病毒在分类上是属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亚科，腮腺炎病毒属。新城疫病毒与从火鸡和其他鸟类分离的病毒PMV-3有交叉反应。目前未发现新城疫有不同血清型。但不同地区病毒的抗原性是有差异的。

近年来，在我国屡有发现新城疫免疫鸡群仍发生新城疫的流行。发病率高达85％，最低为15％；病死率高者可达80％，最低为15％；其主要原因是疫苗接种时母源抗体过高；疫苗质量和保存不当；免疫接种的程序不合理；其他疫病的干扰以及新城疫强毒株毒力不同，因而造成鸡群免疫状态的差异，低抗体水平的免疫鸡不能抵抗强毒的侵袭，引起本病的传播。

鸡传染性支气管炎(IB)是鸡的一种急性、高度接触传染的病毒性呼吸道和泌尿生殖道疾病。其特征是咳嗽、喷嚏、气管啰音和呼吸道黏膜呈浆液性卡他性炎症。雏鸡发病后通常表现流鼻液、呼吸困难等呼吸道症状，有时会发生死亡；产蛋鸡则以产蛋量减少和蛋白品质下降较为常见。如发生肾病变型传染性支气管炎还会出现病鸡肾肿大、肾小管和输尿管内有尿酸盐沉积等病理变化。鸡传染性支气管炎病于1930年春在美国北达科他州首先发现。1962年Winterfield和Hitchner发现了肾病变型传染性支气管炎(IB-nephrosisform)。目前，该病在世界上大多数养鸡地区都有发现。我国于1972年由邝荣禄教授在广东首先报道了IB的存在。此后北京、上海等地相继有报道，现该病已蔓延至全国大部分地区，给养鸡业造成了巨大的经济损失。鉴于鸡新城疫、鸡传染性支气管炎对养禽业的重大危害，现虽已有鸡新城疫、传染性法支气管炎二联活疫苗和灭活疫苗，用于防控此两种疫病的发生和流行。

发明内容

现有的鸡新城疫、传染性法支气管炎疫苗，其新城疫部分的生产毒株均为NDV-LaSota毒株。本发明的目的是利用本发明人自己分离的一株减毒株新城疫病毒与经典的鸡传染性支气管炎病毒制备出一种联合灭活疫苗用于鸡预防鸡新城疫与鸡传染性支气管炎。

本品系用鸡新城疫病毒(NDV)ZM10株、传染性支气管炎病毒(IBV)M41株分别接种鸡胚，收获感染胚液，经浓缩后，用甲醛溶液灭活，然后按一定比例混合，加油佐剂乳化制成。用于预防鸡新城疫和传染性支气管炎。

本发明的详细描述

1毒种

制造本品用NDV毒种为ZM10株，效检用强毒为NDV北京株；制苗及效检用IBV毒种为IBV M41株(由国家兽医微生物菌种中心提供)。

(1)NDV ZM10弱毒株特性

1)对鸡脑内致病指数(ICPI)按《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五年版(三部)，中国农业出版社，2006，以下称《中国兽药典》)方法检验小于0.4(NDV ZM10的ICPI比La Sota低，最小致死量为10-3(La Sota为10-5)，说明其毒力比La Sota弱)。。

2)对鸡静脉致病指数(IVPI)按《中国兽药典》方法进行，等于0。

3)对鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD)用灭菌生理盐水将NDV ZM10毒种作10倍系列稀释，每个稀释度分别接种10日龄无特异性病原(SPF)鸡胚，每胚0.1ml。每日在接种的相应时间照蛋，记录每一鸡胚的死亡时间(无新城疫胎儿病痕或尿囊液无红细胞凝集试验(HA)凝集价的为非特异性死亡，不计算在内)。观察7日，鸡胚全部死亡的最高稀释度即为最小致死量，计算最小致死量的平均死亡时间。最小致死量为10-3，最小致死量的平均死亡时间为110～120h。

4)对鸡胚的毒力将毒种用灭菌生理盐水作100倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.1ml，置36℃～37℃继续孵育，鸡胚应于接种后24～120h死亡70％以上，胎儿须有明显充血、出血病痕。

5)红细胞凝集试验(HA)按《中国兽药典》规定方法进行，含毒鸡胚液对鸡红细胞凝集价应≥1∶512(微量法)。

6)病毒含量按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个稀释度各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48～120h死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120h，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1∶128(微量法)者判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量应≥10^8.0EID₅₀。

7)安全性用1日龄SPF雏鸡20只，分成两组，第1组10只，每只滴鼻接种5倍稀释的含毒胚液0.05ml；第2组10只，不接种作为对照，两组在同条件下分别饲养管理，观察10日，应无不正常反应。如有非特异性死亡，免疫组与对照组均不应超过1只。

8)免疫原性对1月龄SPF雏鸡滴鼻免疫，最小免疫量应≤10^4.0EID₅₀。

9)特异性将毒种稀释至10^5.0EID₅₀/0.1ml，与等量抗鸡新城疫病毒特异性血清混合，室温中和1小时后，接种SPF鸡胚10枚，观察120h，在24～120h内不引起特异死亡且至少存活8枚，鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴性。

(2)IBV M41株病毒特性

1)病毒含量将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-73个稀释度，每个稀释度尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚各5个，每胚0.1ml，接种后置37℃继续孵育，24小时以前死亡的鸡胚弃去不计，根据接种后24～144小时的死胚数及接种后144小时胎儿具有失水、蜷缩、发育小等特异性病痕的活胚数总和，计算EID₅₀。每0.1ml病毒含量应≥10^6.5EID₅₀。

2)对鸡胚的毒力将毒种用灭菌生理盐水稀释1000倍，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，接种后24～144小时内，应全部或部分死亡，存活的鸡胚应全部出现失水、卷缩、发育小等特异性病痕，取其尿囊液，用1％鸡红细胞悬液进行血凝试验，应为阴性。

3)对雏鸡的毒力取1～7日龄SPF鸡10只，用10倍稀释的毒种滴鼻，每只1～2滴，观察10日。应至少有8只鸡出现鸡传染性支气管炎典型症状。

4)特异性用灭菌生理盐水将毒种稀释至每0.1ml含10^3.5EID₅₀，与抗鸡传染性支气管炎病毒特异性血清等量混合，在37℃作用1小时，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml。置37℃观察24～144小时，应不引起特异性死亡及鸡胚病变，且应至少有8个鸡胚健活。

5)免疫原性取毒种接种鸡胚制备IB病毒液，经甲醛溶液灭活后，按本规程油佐剂配方制成IB灭活疫苗。用3～6周龄SPF鸡20只，各点眼接种IB H120活疫苗1羽份。3～4周后，分别采血。采血后再接种用被检毒种制备的IB灭活疫苗1羽份(0.5ml)，3～4周后再分别采血。将两次血清分别做HI试验。若二免血清的HI几何平均滴度(GMT)较首免血清HI价几何平均滴度高3倍以上判合格。

2疫苗制造

(1)制苗材料的选择选发育良好的10～11日龄的健康易感鸡胚作为制苗材料。

(2)ZM10制苗用毒液的制备

1)接种取生产用毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-4或10^-5)，每胚尿囊腔内接种0.1ml。接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。

2)孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋1次，将在60h时前死亡的鸡胚弃去。60h后，每4～8h照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至96h或120h，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，立即置于2～8℃冷却。

3)收获将冷却4～24h的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混为一组。收获后的胚液置于灭菌瓶中，加入适宜的抗生素，在2～8℃冰库处理，留样后，结冻保存。在收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。

(3)IBV M41病毒液的制备

取生产用毒种，用灭菌生理盐水稀释至10^-2～10^-4，每胚尿囊腔内接种0.1ml，密封针孔，置37℃继续孵育，不必翻蛋。

接种后30h内照蛋1次，弃去死胚，以后每隔4～6h照蛋1次，将死亡的鸡胚随时取出，至40h，不论死亡与否，将全部鸡胚取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却4～24h。

将冷却的鸡胚取出，消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组，置灭菌瓶中，分别取样进行检验，置-25℃以下保存备用。

收获的病毒液，应按《中国兽药典》附录逐瓶作无菌检验及红细胞凝集试验，并抽样一份测定病毒含量(EID₅₀)，应无菌生长，对1％鸡红细胞悬液凝集试验应为阴性，每0.1ml病毒含量应≥10^6.0EID₅₀。

(4)病毒液的浓缩和灭活

1)病毒液的浓缩和浓缩效果检验将NDV、IBV病毒液用适当方法澄清，除去毒液中的大颗粒杂质，使其成为透明或半透明溶液。然后，用病毒超滤浓缩系统分别将NDV、IBV病毒液浓缩2倍。

NDV毒液：分别取浓缩前的病毒原液、浓缩病毒液及浓缩过程中排出的超滤液进行红细胞凝集价测定，超滤液HA为0，浓缩病毒液HA比浓缩前病毒原液高2倍。

IBV毒液的浓缩效果检验：分别取浓缩前的病毒原液、浓缩病毒液及浓缩过程中排出的超滤液进行病毒含量测定，超滤液的病毒含量应≤10^2.0EID₅₀/0.1ml，浓缩病毒液的病毒含量比浓缩前病毒原液高2倍。

2)病毒灭活将检验合格的浓缩的NDV、IBV病毒液，分别加入10％甲醛溶液，使其甲醛溶液的终浓度均为0.2％，边加边摇，使其充分混合，然后放37℃条件下灭活，从抗原液温度升至37℃开始计时，灭活16小时。灭活完毕后，分别对灭活后的病毒液取样，进行无菌检验及灭活检验，取样后置2～8℃保存，备用。

5)半成品检验

无菌检验按现行《中国兽药典》附录，分别对浓缩及灭活后的NDV、IBV病毒液进行无菌检验，应无菌生长。

灭活检验

NDV：取灭活后的病毒原液，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml，37℃下继续孵育，剔除24小时内死亡鸡胚，观察5日，非特异性死亡鸡胚应不超过2个，收获所有鸡胚的胚液，然后观察鸡胚胎儿病变，应全部为阴性。将收获的鸡胚液混合，以上述相同方法进行盲传，取传代鸡胚的鸡胚液进行HA试验，应全部为阴性。

IBV：取灭活后的病毒原液，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml，37℃下继续孵育，剔除24小时内死亡鸡胚，观察6日，非特异性死亡鸡胚应不超过2个，收获所有鸡胚的胚液，然后观察病变，应全部为阴性。将收获的鸡胚液混合，以同样方法进行盲传，如果传代接种后的鸡胚仍未出现鸡胚病变，则可判定病毒完全灭活。

6)油佐剂灭活疫苗的制备

1)油相制备取注射用白油(按现行《中国兽药典》附录)94份，加硬脂酸铝2份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-80 6份，混合后，高压灭菌备用。

2)水相制备将浓缩灭活的NDV、IBV病毒液以适当比例(通常为3∶2)混合，使每羽份终产品中的NDV抗原含量≥10^8.3EID₅₀、IBV抗原含量≥10^6.3EID₅₀。

取混合后的抗原液96份，加入灭菌的吐温-804份，充分摇动，直到吐温-80完全溶解。

3)乳化将7份油相注入乳化罐内，慢速搅拌同时缓缓加入3份水相，加完后，中速混合，然后高速乳化。在乳化终止前加入1％硫柳汞液，使其终浓度为0.01％。乳化后，取疫苗5ml加入离心管中，以3500r/min离心15min，应不出现分层，若有分层现象，应重复搅拌一次。制成鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗。

3成品检验

(1)性状

外观白色均匀乳剂。

剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

黏度用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25℃左右的疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，应在8s以内。

稳定性用长度为100mm、直径为10mm的小圆底试管，加入5ml疫苗，以3500r/min离心15min，应不出现明显分层。

(2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。

(3)安全检验用3～5周龄SPF鸡10只，每只颈背部皮下或胸部肌肉注射疫苗2羽份(1.0ml)，观察14日，应不出现由疫苗引起的局部和全身反应。

(4)效力检验

1)鸡新城疫部分采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行效力检验。

血清学方法用3～6周龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl(1/25羽份)，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不小于4log₂，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应不大于2log₂，疫苗鸡新城疫部分判合格。

免疫攻毒法用3～6周龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl(1/25羽份)，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株(CVCC AV1611株)10⁵ELD₅₀，观察14日，对照组全部死亡，免疫组至少保护7只，疫苗鸡新城疫部分判合格。

2)鸡传染性支气管炎部分用3～6周龄SPF鸡10只，点眼接种鸡传染性支气管炎活疫苗(H120)1羽份，接种后21日，分别采血，各皮下或肌肉注射灭活疫苗1羽份，21～28日后再分别采血。将两次血清分别做HI试验。若二免血清的HI几何平均滴度较首免血清HI几何平均滴度高3倍以上时，疫苗鸡传染性支气管炎部分判合格。

4作用与用途用于预防鸡新城疫、传染性支气管炎。免疫接种后14～21日产生免疫力。免疫期为6个月。

5用法与用量开产前(16～20周龄)产蛋鸡，颈部皮下或肌肉注射，每只0.5ml。

本发明的积极意义

本发明涉及一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗及其制造方法，本发明所涉及的疫苗含有经灭活的鸡新城疫病毒ZM10株、传染性支气管炎病毒M41株病毒液和常规油佐剂。用本发明的疫苗接种鸡能安全有效的预防鸡新城疫和鸡传染性支气管炎；本发明是用鸡新城疫病毒ZM10株、传染性支气管炎病毒M41株分别接种鸡胚培养，收获感染胚液，经浓缩后，用甲醛溶液灭活、混合，加常规油佐剂乳化制成。

实施例

本发明的实施例为进一步说明本发明，但这些实施例不构成对本发明的限制。

实施例1两种病毒液浓缩后EID₅₀和HA效价检测结果比较

按本发明提供的方法制备并经冷冻保存的鸡新城疫病毒液(ZM10株)和鸡传染性支气管炎病毒液(M41株)融化后，除去毒液中的大颗粒物质，使其成为透明或半透明溶液。采用病毒超滤浓缩系统，分别将病毒液浓缩4倍，检测浓缩后的病毒含量。结果见表1。

表1病毒液浓缩4倍前后EID₅₀和HA效价检测结果比较

注：“/”表示未做，“-”表示灭活完全。

实施例2二联灭活的疫苗安全性

1.单剂量重复接种安全试验将不同批次二联苗(本发明人制备)分别接种4周龄SPF鸡(由山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡场提供)，颈部皮下注射0.5ml/只，每组10只，免疫2周后颈部皮下注射0.5ml/只，间隔2周后再颈部皮下注射0.5ml/只，观察鸡只反应。设非免疫对照5只。接种鸡精神、饮水和采食均无异常反应，观察2周，解剖观察注射部位，疫苗基本完全吸收，无坏死或硬结。详细结果见表2。

表2单剂量重复接种安全性检验结果

注：分子表示安全检验有异常的试验鸡数量，分母为试验鸡数量。

2.单剂量重复接种安全性检验将不同批次二联苗分别接种4周龄SPF鸡，颈部皮下注射0.5ml/只，每组10只，免疫2周后颈部皮下注射0.5ml/只，间隔2周后再颈部皮下注射0.5ml/只，观察鸡只反应。设非免疫对照5只。接种鸡精神、饮水和采食均无异常反应，观察2周，解剖观察注射部位，疫苗基本完全吸收，无坏死或硬结。详细结果见表3。

表3单剂量重复接种安全性检验结果

注：分子表示安全检验有异常的试验鸡数量，分母为试验鸡数量。

3.不同接种剂量安全性试验取3周龄SPF鸡，分别以不同剂量(0.5ml、1ml、1.5ml和2ml)颈部皮下注射，每组接种10只鸡，观察14日，解剖观察注射部位有无异常。设非免疫对照5只。试验结果表明鸡只无全身不良反应，注射部位吸收较好，结果见表4。

表4疫苗不同接种剂量安全性检验结果

注：分子表示安全检验有异常的试验鸡数量，分母为试验鸡只数。

4.二联苗对产蛋鸡生产性能的影响试验将不同批次二联苗分别接种28周龄高产蛋鸡(由山东槐荫种鸡场提供)各500只，每只肌肉注射0.5ml。另设空白对照组各500只，在相同条件下饲养，观察2周，记录每组每天产蛋量和临床表现，产蛋率结果显示，接种二联苗和对照疫苗，各组在注射疫苗后的各种生产性能指标无明显差异，表明疫苗接种鸡群对疫苗的应激反应很小。

5.结论

(1)通过颈部皮下和肌肉注射接种5周龄SPF鸡，每只2羽份，证实疫苗是安全的。

(2)疫苗单剂量重复接种3次，接种鸡精神、采食和饮水均无异常反应，说明单剂量重复接种本疫苗也是安全的。

(3)以1～4个羽份疫苗剂量接种SPF鸡，结果表明是安全的。

(4)通过对高产期蛋鸡接种，证实该疫苗对高产期蛋鸡是安全的。

实施例3二联灭活疫苗的免疫效力检验

1.新城疫

血清学方法：4周龄SPF鸡10只，各颈部皮下接种二联灭活疫苗(本发明人制备)1/25羽份(20ul)，接种后3～4周，连同5只对照SPF鸡(由山东省农业科学院家禽研究所提供)，分别采血，按《中国兽药典》提供的方法进行HI抗体效价测定。各批次HI效价均超过了4log2，结果见表5

攻毒法：4周龄SPF鸡10只，各接种待检成品1/25羽份(20μl)，接种后3～4周，连同相同条件下SPF鸡5只作为对照，各肌肉注射鸡新城疫强毒北京株(CVCCAV1611株)(10^5.0ELD₅₀)，观察14日，记录发病情况。结果见表6。

2.传染性支气管炎

3周龄SPF鸡10只，各点眼接种H120活疫苗1羽份。21日后，分别采血，接种待检疫苗0.5ml(1羽份)。21日后再分别采血。将2次血清分别做HI试验，比较抗体增加倍数。试验中用二联苗免疫后HI几何平均值是IB-H120基础免疫HI几何效价的3倍以上，结果见表5。

表5免疫后HI效价检测(GMT、log2)

表6鸡新城疫攻毒保护效力试验

3.小结

实验室制备的四批鸡新城疫、传染性支气管炎、二联灭活疫苗(ZM10株+M41株)效力合格，达到单价疫苗规程要求。

实施例4二联疫苗中鸡传染性支气管炎抗体滴度及其攻毒保护效果的影响

1.3周龄SPF鸡攻毒保护试验

(1)取3周龄SPF鸡125只，首先用H120弱毒疫苗(由齐鲁动物保健品有限公司提供)滴鼻点眼免疫，每只1个羽份；免疫3周后，取10只采血，留5只弱毒苗免疫鸡作为对照，其余随机分为12组，每组10只鸡，分别用四批二联苗(本发明人制备)的1个羽份、1/2和1/4羽份免疫。免疫3周后，另取5只相同日龄SPF对照鸡，分别翅静脉采血0.5ml，测定HI效价(检验用IB抗原由山东省农业科学院家禽研究所提供)。相同剂量免疫后，抗体滴度基本是一致的。不同免疫剂量对血清HI抗体增加的倍数有较大影响。1羽份剂量免疫21日后IB抗体几何平均效价比首免抗体效价增加8.57～10.56倍；采用1/2羽份剂量，抗体效价可增加6.06～6.96倍；采用1/4羽份剂量，抗体效价仅增加3.48～4.92倍(结果见表7)。

表7疫苗不同接种剂量SPF鸡IB抗体检测结果

注：“/”表示未进行比较。

(2)攻毒以上试验鸡分别气管内接种IBV-M41株强毒(由中国兽药监察所提供)，每只0.3ml(含3×10^6.0EID₅₀)，攻毒后第4天取气管棉拭子，进行病毒分离(结果见表8)。

表8各组攻毒鸡病毒分离结果

注：分子为分离出病毒鸡只数，分母为实验鸡数。

综合攻毒试验结果：1羽份免疫组病毒分离率为0(0/40)，1/2羽份免疫组病毒分离率为2.5％(1/40)，1/4羽份免疫组病毒分离率为10％(4/40)，而对照组病毒分离率为90％(9/10)，单独使用IB-H120弱毒疫苗6周后攻毒，病毒分离率在40％。

2.23周龄普通低免蛋鸡试验

(1)每批次疫苗试验需用实验鸡100只，分别用四批二联苗的1个羽份免疫。同时设空白对照组和攻毒对照组各100只。接种3周后产蛋鸡群IB几何平均抗体效价的检测结果见表9.

表9接种3周后产蛋鸡群IB几何平均抗体效价

(2)攻毒免疫3周后，对上述各组实验鸡分别取30只气管内接种IBV-M41株强毒，每只0.3ml(含3×10^6.0EID₅₀)，并记录攻毒10周内产蛋情况。对照组鸡攻毒后第3天开始出现一定程度的呼吸道症状，第5天开始出现畸形蛋、砂皮蛋、软皮蛋或拉出水样蛋白与卵黄，打开鸡蛋后蛋清稀薄与蛋黄分离，产蛋率最低时较空白对照组下降了近22.9％(由93.0％降低到70.1％)，此后产蛋率缓慢上升，但其生产性能始终低于免疫组，详细结果见表10。

表10IBV-M41攻毒对鸡群产蛋性能的影响

(3).结论

1)用IBV-H120活疫苗作基础免疫，然后接种不同剂量二联疫苗，3周龄SPF鸡1羽份免疫21日后IB抗体几何平均效价比首免抗体效价增加8.57～10.56倍；采用1/2羽份剂量，抗体效价可增加6.06～6.96倍；采用1/4羽份剂量，抗体效价仅增加3.48～4.92倍。

2)商品鸡免疫1羽份后抗体效价为8.4～8.7log2，1/2羽份为7.8～8.2log2，1/4羽份为7.2～7.5log2。攻毒结果表明，1/2、1/4和1羽份接种组产蛋率和蛋品质与空白对照组无差异，且保护效果与血清抗体水平呈正相关。

3)综合比较表明，血清抗体滴度与免疫剂量呈正相关，高抗体水平具有较好的保护性。

实施例5二联灭活疫苗与相应单苗免疫对比试验

利用研制的二联灭活苗和相应的新城疫、传染性支气管炎二种单价油乳剂灭活疫苗，分别免疫SPF鸡进行效力检验，比较其免疫效果。

1.ND效力检验4周龄SPF鸡40只(由山东省农业科学院家禽研究所提供)，随机分为4组，分别颈部皮下接种三批本发明人制备的二联灭活疫苗及ND单苗(国内商品疫苗)20μl，另设相同SPF鸡对照5只。3周后分别采血，进行HI抗体效价测定(新城疫血凝抑制试验抗原购自青岛易邦生物工程有限公司)，然后每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株(CVCCAV1611株，购自国家兽医微生物菌种保藏中心)1ml(含10^5.0ELD₅₀)，观察14日。新城疫抗体检测结果见表11。

表11二联苗和新城疫单苗免疫效力检测结果

二联疫苗与ND单苗以20μl免疫3周后，HI抗体效价为5.7～6.0log2无差异，对强毒的保护率均为100％，对照组5只鸡全部死亡。

2.IB效力检验3周龄SPF鸡40只，随机分为4组，分别滴鼻点眼免疫H120弱毒疫苗1羽份，3周后采血，并免疫传染性支气管炎灭活苗和3批二联疫苗，皮下注射0.5ml/只，3周后采血，将两次血清抗体效价进行比较(传染性支气管炎(M41)血凝抗原来自山东农科院家禽研究所)。传染性支气管炎抗体检测结果见表12。

表12二联苗和传染性支气管炎单苗免疫效力检测结果

H120活疫苗免疫3周，HI抗体效价为4.1log2，再用3批二联苗或IB单苗免疫后，IB抗体滴度上升为6.8～7.2log2，各组间无明显差异，抗体增加倍数为6.50～8.57倍，H120对照鸡IB抗体3周后下降3.8log2。

3小结

进行二联疫苗和单苗的免疫效果比较的结果表明：二联疫苗中的各项抗体水平与相应单苗基本一致。

Claims (2)

1.一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗，其特征在于本品含有经灭活的鸡新城疫病毒ZM10株、传染性支气管炎病毒M41株病毒液和常规油佐剂。

2.一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制造方法，其特征在于本品系用鸡新城疫病毒ZM10株、传染性支气管炎病毒M41株分别接种鸡胚培养，收获感染胚液，经浓缩后，用甲醛溶液灭活、混合，加常规油佐剂乳化制成。