CN101491674A - 鸡新城疫,传染性支气管炎二联疫苗的生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种二联疫苗的生产方法，具体地说，是鸡新城疫，传染性支气管炎二联疫苗的生产方法，包括：同胚培养之前，提高生产工艺中新城疫、传染性支气管炎种毒的纯度；在同胚培养中，调整新城疫、传染性支气管炎二联疫苗中两种抗原的浓度，以达到合理搭配。本发明方法所制备的疫苗，接种鸡群后同时产生ND、IB免疫力，无任何干扰。并且疫苗毒株合理配比，有效避免鸡新城疫活疫苗与传支活疫苗同时接种的严重干扰的问题，提高免疫质量，减少免疫次。

Description

鸡新城疫，传染性支气管炎二联疫苗的生产工艺

技术领域

本发明涉及的是一种二联疫苗的生产方法，具体地说，是鸡新城疫，传染性支气管炎二联疫苗的生产工艺，属于生物工程领域。

背景技术

新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒属(Paramyxovirus)中的一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。弱毒株仅引起鸡群呼吸道感染和产蛋量下降，但可迅速康复。人类可因接触病禽和活毒疫苗而引起结膜炎或淋巴腺炎，但很快便康复。新城疫病毒被OIE规定为A类疫病，是一种急性、高度接触性传染病，发病率和死亡率都在90％以上，1935年梁英、马闻天等首次证实我国有该病的流行[1]，现在本病被我国列为I类疫病。

新城疫病毒是ssRNA病毒，有包膜。病毒颗粒具多形性，有圆形、椭圆形和长杆状等。成熟的病毒粒子直径100～400nm。包膜为双层结构膜，由宿主细胞外膜的脂类与病毒糖蛋白结合衍生而来。包膜表面有长12～15nm的刺突，具有血凝素、神经氨酸酶和溶血素。病毒的中心是ssRNA分子与附在其上的蛋白质衣壳粒，缠绕成螺旋对称的核衣壳，直径约18nm。成熟的病毒是以出芽方式释放至细胞外。

新城疫病毒对外界环境的抵抗力较强，55℃作用45min和直射阳光下作用30min才被灭活。病毒在4℃中存放几周，在-20℃中存放几个月或在-70℃中存放几年，其感染力均不受影响。在新城疫暴发后8周之内，仍可在鸡舍、蛋巢、蛋壳和羽毛中分离到病毒。病毒对乙醚敏感。大多数去污剂能将它迅速灭活。氢氧化钠等碱性物质对它的消毒效果不稳定。3％～5％来苏尔、酚和甲酚5min内可将裸露的病毒粒子灭活。在37℃的孵卵器内，用0.1％福尔马林熏蒸6h便可把它灭活。

新城疫病毒的所有毒株都能凝集多种禽类和哺乳类动物的红细胞。大多数毒株能凝集公牛和绵羊的红细胞。在病毒的血凝试验中，鸡的红细胞最为常用。该病毒可在9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜上和尿囊腔中培养，大多数毒株也可在兔、猪、犊牛和猴的肾细胞以及鸡组织细胞等继代或传代细胞中培养。鸡胚的成纤维细胞、鸡胚和仓鼠的肾细胞常用于新城疫病毒的培养。

目前，虽然疫苗的使用使该病得到了有效控制，但由于疫苗免疫效果不理想，以及流行毒株的毒力增强和我国养鸡业水平的参差不齐，使得该病仍然是严重危害我国养禽业的疾病之一，在我国经常有非典型新城疫的发生，甚至典型新城疫的爆发。

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bornchistis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bornchistis Virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性、病毒性传染病。该病主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统等.其感染的主要特征是气管锣音、咳嗽、打喷嚏和肾脏肿大。此外，该病还可以引起蛋鸡产蛋量下降和蛋品质下降，但死亡率通常较低，雏鸡可由于呼吸道或肾脏的感染而死亡。

鸡传染性支气管炎病毒是尼多目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Conovirus)第三群禽冠状病毒的代表株，其毒粒呈中等多型性的球形或椭圆型，直径约80～120nm，是有囊膜的、不分节段的、单股正链RNA病毒。

IBV对外界环境的抵抗力不强，多数毒株56℃15min及45℃90min即被灭活，而适应于鸡胚的毒株可在此温度存活3h以上。IBV耐酸不耐碱，在pH6.0～6.5条件下培养较在pH7.0～8.0条件下稳定，在细胞培养时以pH6.0～6.5较好。IBV对乙醚、氯仿及其它脂溶剂敏感，但20％的脂溶剂只能降低病毒的滴度而不能使其完全灭活。

IBV应避免在-20℃保存，但感染性尿囊液-30℃保存多年仍然存活，冻干尿囊液可保存30年，IBV本身没有血凝作用，但经1％胰蛋白酶、卵磷酷C、魏氏梭菌液及乙醚等处理后，常可凝集鸡、家兔、仓鼠、鹅及小鼠等多种动物及人的红细胞。

IBV能在9～11日龄的鸡胚中生长，初代分离毒接种鸡胚，多数鸡胚存活，但随传代次数的增加，对鸡胚的毒力增强，到第10代时，可引起80％的鸡胚死亡。胚体出现特征性的变化如发育受阻，胚体卷曲成球形，脚变形压在头部，羊膜增厚，紧贴胚体，卵黄囊缩小，尿囊液增多，中肾尿酸盐沉积。IBV能在10～18日龄的鸡胚肾细胞、肺细胞、肝细胞、成纤维细胞培养物上生长，其中以鸡胚肾细胞(Chick embryo kidney，CEK)和鸡肾细胞(Chicken kidney，CK)最好，IBV也能在非洲绿猴肾细胞株(Vero)中连续传代，有的毒株还可在BHK-21中生长，可产生细胞病变，使细胞出现空斑，产生的空斑大小因毒株不同而有差异。

虽然疫苗的使用对IB的流行起到了一定的预防和控制作用，但由于IBV血清型众多，不同血清型毒株之间具有较小的交叉保护性甚至无交叉保护性。因此，IB目前仍在免疫鸡群和非免疫鸡群发生和传播，给养禽业造成了严重的经济损失。

近年来，伴随畜禽养殖规模的不断扩大，生物制品行业也得到了迅速发展，尤其是生物技术的不断更新使疫苗产品的种类显著增加，且品种多样，如多联疫苗，多价疫苗，基因工程疫苗，重组病毒载体疫苗等，而这其中，多联疫苗的使用，扩大了一次接种的防病范围，提高了接种效率，减少了接种用器材及劳务费用，有利于免疫计划的安排，为广大养殖场(户)所欢迎。我国现有兽用多联疫苗品种很多，如“新城疫，传染性支气管炎二联疫苗”“新城疫，传染性支气管炎，禽流感三联疫苗”等等，虽然品种很多，但很多多联疫苗只是多种单苗的简单组合，几种抗原的配比混乱，相容性不好，存在免疫反应的相互干扰的现象，并不能达到预期的目的；而且很多多联疫苗生产工艺简单，生产技术粗糙，造成部分产品污染，抗原组合物中某些抗原效价降低，不能单到生产规程的要求。“新城疫，传染性支气管炎二联疫苗”中传染性支气管病毒(IBV)对新城疫病毒(NDV)存在干扰，目前在我国兽药生物制品厂所生产的鸡新城疫与传染性支气管炎二联活疫苗(以下简称“新支二联苗”)基本上都是采用不同鸡胚培养增殖病毒，然后将收获感染的尿囊液混合制备而成，这样就会费时费力，而且提高了成本，虽然也有部分企业同胚增殖两种病毒，但由于两种病毒的特异性干扰作用，使最终得抗原产量降低，还要经过浓缩等工序提高抗原浓度，这样也就间接地提高了成本。

因此，针对现有的鸡新城疫与传染性支气管炎二联活疫苗的生产方法，需要改进“新城疫、传染性支气管炎”二联疫苗的组分搭配以及生产工艺中的缺陷，使“新城疫、传染性支气管炎”二联疫苗的免疫效果达到单苗的效果，甚至超过单苗的免疫效果，切实达到一针防多病的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡新城疫与传染性支气管炎二联活疫苗的生产方法，步骤包括：

1)在同胚培养之前，提高生产工艺中新城疫、传染性支气管炎种毒的纯度；

2)在同胚培养中，调整新城疫、传染性支气管炎二联疫苗中两种抗原的浓度，使得新城疫病毒液的稀释度为100-10000倍，传染性支气管炎病毒液的稀释度为100-10000倍，以达到合理搭配；

3)弃去24小时以内死亡鸡胚，48-120小时以内收获所有死亡和未死亡鸡胚，经效力检验、无菌检验等后，合格半成品加冻干保护剂进行冻干、压帽贴签，成品经过相关检验合格后，包装、入库，-20℃保存。

在一个具体实施方案中，其中鸡新城疫病毒弱毒株优选是LaSota，效检用强毒优选是鸡新城疫病毒强毒北京株(CVCC AVI611株)。

在另一个具体实施方案中，其中传染性支气管炎病毒株优选是H120株或H52株。

有益效果

1、通过改进“新城疫、传染性支气管炎”二联疫苗的生产工艺，使生产工艺简单化；

2、节约工时和原材料。制备过程减少了注射次数，一次注射可获得两种抗原，且每种抗原繁殖量与单独增殖每一种抗原相当；

3、操作更为简便快速；

4、可以使其进行合理搭配，并提高产品质量，降低生产成本，充分发挥其有利效应。

5、该疫苗接种鸡群后ND、IB免疫力同时产生，无任何干扰。

6、疫苗毒株合理配比，有效避免鸡新城疫活疫苗与传支活疫苗同时接种的严重干扰的问题，提高免疫质量，减少免疫次数。

具体实施方案

本发明将结合具体实施例做进一步的说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围

实施例1：新城疫单苗的制备

鸡新城疫采用LaSota株，效检用强毒优选是鸡新城疫病毒强毒北京株(CVCC AVI611株)。毒种的标准及保存方法同“中华人民共和国兽用生物制品规程”(以下均简称“规程″)中“鸡新城疫低毒力活疫苗制造及检验规程”1项的规定。二联苗安全试验、检验用鸡，均采用SPF鸡或易感鸡。

将LaSota株作为毒种，接种10日龄SPF鸡胚，弃去24小时以内死亡鸡胚，收获接种后72-120小时死亡且病变明显的鸡胚液，经效力检验、无菌检验等后，合格半成品加冻干保护剂进行冻干、压帽贴签，成品经过相关检验合格后，包装、入库，-20℃保存。按部颁标准进行病毒含量的测定，病毒含量＞10^8.0EID₅₀/0.1ml。成品检验按规程P222进行。

实施例2：传染性支气管炎单苗的制备H120株或H52株

制造本品选用H120株或H52株，检验采用标准强毒M41株，均由申请人瑞普公司提供。二联苗安全试验、检验用鸡，均采用SPF鸡或易感鸡。

其中，检验用标准强毒M₄₁株毒力及毒种标准如下：

病毒含量M₄₁株毒种对1-7日龄健康易感雏鸡，以10倍稀释的强毒滴鼻1-2滴，观察10日，至少应有80％雏鸡出现鸡传染性支气管炎典型症状。

疫苗用种毒检验标准(病毒含量、安全性、免疫原性、纯净、特异性基础种子代数)见规程P212。

成品检验标准按规程P213-214进行。

其中，对于实施例1和2，鸡胚接种、孵育与观察、病毒收获、鸡胚病毒液的检验的步骤相同，可根据下列步骤实施。

鸡胚接种将H120株或H52株和LaSota株毒种分别用灭菌生理盐水稀释至10^-2～10^-4，分别接种易感鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育，停止翻蛋。

孵育与观察鸡胚接种后，24小时照蛋1次，弃去死胚，以后每隔4～8小时照蛋一次，死亡的鸡胚随时挑出，至72小时不论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃，冷却12～24小时。

收获分别收获H120株或H52株和LaSota株鸡胚液。将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌方法剥除气室部位卵壳，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液，每若干个胚的胚液混合为一组，置于灭菌瓶中，每毫升加入青霉素、链霉素各1000单位，放2～8℃感作4～12小时。

在收获胚液的同时应逐个检查鸡胚，凡胎儿腐败，胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。

实施例3：新支二联活疫苗的制备

制造本品所用毒株为新城疫弱毒株LaSota株，效检用强毒为鸡新城疫病毒强毒北京株(CVCC AVI611株)。制造用传染性支气管炎毒株为H120株或H52株，检验采用标准强毒M41株，以上各毒株应符合鸡新城疫低毒力活疫苗和鸡传染性支气管炎活疫苗制造及检验规程中有关毒种部分的1.2和1.3项标准。

半成品及成品检验标准见规程P-224-226。

Claims (3)

1.一种鸡新城疫与传染性支气管炎二联活疫苗的生产方法，步骤包括：

1)在同胚培养之前，提高生产工艺中新城疫、传染性支气管炎种毒的纯度；

2)在同胚培养中，调整新城疫、传染性支气管炎二联疫苗中两种抗原的浓度，使得新城疫病毒液的稀释度为100-10000倍，传染性支气管炎病毒液的稀释度为100-10000倍，以达到合理搭配；

3)弃去24小时以内死亡鸡胚，48-120小时以内收获所有死亡和未死亡鸡胚，经效力检验、无菌检验等后，合格半成品加冻干保护剂进行冻干、压帽贴签，成品经过相关检验合格后，包装、入库，-20℃保存。

2.权利要求1所述的方法，其中鸡新城疫病毒弱毒株优选是LaSota，效检用强毒优选是鸡新城疫病毒强毒北京株(CVCC AVI611株)。

3.权利要求1所述的方法，其中传染性支气管炎病毒株优选是H120株或H52株。